CN110028557A - 一种Ce6标记的双链抗菌肽及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种Ce6标记的双链抗菌肽及其合成方法和应用，该抗菌肽为双链多肽，其氨基酸序列为：

Description

一种Ce6标记的双链抗菌肽及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有抗菌性能以及光动力治疗潜力的新型抗菌剂。
背景技术
自青霉素于20世纪40年代首次引入医疗实践以来，已开发出大量各种抗生素以成功地抑制临床中的细菌感染疾病。然而，在医学治疗中已广泛报道了细菌对大多数抗生素产生抗性，并且目前已成为对公众健康的严重威胁。因此，迫切需要设计新型抗微生物剂和替代治疗策略，其可有效杀死具有强效耐药性的细菌菌株。
微生物灭活的一种是基于光动力抗菌化学疗法(PACT)有希望的方法，当使用Ce6作为光敏剂(PS)激活活性氧时(暴露在合适的波长)。活化的单线态氧物质可以用作高反应性氧化剂，并且能够破坏紧密接近的细胞壁和膜，从而导致细胞死亡。
抗菌肽是生物体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000～7000左右，由20～60个残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。抗菌肽的抑菌机理与抗生素不同，它是通过物理渗透作用于细菌细胞膜，破坏膜上磷脂双分子层，从而使膜内物质外流，导致细菌死亡，因此，抗菌肽不产生耐药性。此外，抗菌肽本身是一种多肽类物质，能够在生物体内有效降解，不存在残留性问题，所以抗菌肽是抗生素最理想的替代物，具有极为广阔的市场应用前景。但现有天然抗菌肽在动物体内含量极微，且从动物体内提取抗菌肽产量低、耗时长、工艺复杂、成本高，这限制了天然抗菌肽进入应用。
发明内容
近年来，人工合成多肽的医疗效果引起了人们的高度关注。其中抗菌肽可以作为一种新型的抗生素，把细胞膜作为主要靶点，通过在细胞膜上聚集使其丧失其屏蔽功能，进而导致细胞死亡。
本发明的目的在于：为了解决现有技术中的不足，提供了一种结构简单，抗菌活性高的双链抗菌肽的合成方法及其应用，本发明合成的双链抗菌肽具有较好的抗菌效果，在抑菌、杀菌以及光动力抗菌化学疗法(PACT)等领域均有广泛的应用前景。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供的抗菌肽的氨基酸序列为：
本发明还提供了抗菌肽的合成方法，包括：
(1)采用固相合成法合成双链抗菌肽；
(2)Ce6标记抗菌肽(AMP-Ce6)。
抗菌肽的合成方法具体为：
1、基本材料：
固相Fmoc法选择的树脂为Rink-Amide-MBHA-Resin树脂。这种树脂成本低廉且具有非常好的溶胀性，可以使肽链之间更好地进行缩合反应，且有足够的网络空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子，将多肽分子固定到树脂上。
2、反应步骤：
第一步，树脂预处理。
取100mg树脂(MBHA)和DMF于反应容器中，混合1h后，抽滤。用20％哌啶(溶于DMF)切割保护基团。
第二步，将第一个氨基酸共价连接到树脂上。
准备上述树脂5倍摩尔当量的氨基酸、HOBT与HBTU于反应品瓶中，使它们充分溶解于2mL DMF，再加入0.2mL DIEPA。将所得混合物加入有树脂的反应容器中进行反应，使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定；
第三步，去保护
采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。
第四步，激活和交联
采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成肽键。
在合成第五个氨基酸时，本发明采用的氨基酸是Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，此氨基酸具有两个Fmoc保护基团，并用20％哌啶(溶于DMF)切割此保护基团。切掉两个Fmoc后，后面接的氨基酸形成双链。
第六步，重复第三步和第四步，反复循环添加单体氨基酸，直到合成完成。
3、合成后处理：
(1)将上述合成的双链抗菌肽进行Ce6标记；
具体的标记方法为：称取相当于带有多肽(步骤2合成的双链多肽)的树脂3倍摩尔量的Ce6、HOBT、EDC溶解于DMF中，加入DIEA避光过夜反应。
(2)洗脱和脱保护：用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上切割下来，并脱除保护基；
(3)HPLC分析纯化，冻干。
本发明合成的双链多肽本身具有抗菌效果，再引入光敏剂Ce6进行PACT抗菌，利用它在激光的照射下，产生活性氧(ROS)，导致微生物生物分子的氧化并导致细胞损伤和死亡，与抗菌肽(AMP)产生协同作用，抗菌效果更好。
本发明双链抗菌肽作用机制以及抗细菌活性不同于传统抗生素，对实验的金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌作用，拟开发为一种抗耐药菌药物。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明双链抗菌肽制备简单，成本低廉，为本发明的大规模制备奠定了基础。
(2)本发明合成的新的双链抗菌肽在细菌菌株表面上具有更高的亲和力，所述双链抗菌肽与单链抗菌肽相比，抗菌效果显著强于单链抗菌肽。
附图说明
图1为双链抗菌肽的HPLC图；
图2为双链抗菌肽的质谱图；
图3为光敏剂Ce6的紫外吸收标准曲线图；
图4为单链抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC90)的柱状图；
图5为双链抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC90)的柱状图；
图6为不同浓度(从左往右：0μM、0.4μM、0.8μM、1.2μM、1.6μM、2.0μM、2.4μM、2.8μM、3.2μM、3.6μM)双链抗菌肽(4A)抗菌效果图；
图7为单双链抗菌肽和双链抗菌肽抗菌效果对比图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细阐述，但这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为对本发明实施的限制。
实施例1
本发明所述的方法采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸。
1、基本材料：
固相Fmoc法选择的树脂为Rink-Amide-MBHA-Resin树脂。这种树脂成本低廉且具有非常好的溶胀性，可以使肽链之间更好地进行缩合反应，且有足够的网络空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子，将多肽分子固定到树脂上。
2、反应步骤：
第一步，树脂预处理。
取100mg树脂(MBHA)和DMF于反应容器中，混合1h后，抽滤。用20％哌啶(溶于DMF)切割保护基团。
第二步，将第一个氨基酸共价连接到树脂上。
准备上述树脂5倍摩尔当量的氨基酸、HOBT与HBTU于反应品瓶中，使它们充分溶解于2mL DMF，再加入0.2mL DIEPA。将所得混合物加入有树脂的反应容器中进行反应，使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定；
第三步，去保护
采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。
第四步，激活和交联
采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成肽键。
在合成第五个氨基酸时，我们采用的氨基酸是Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，此氨基酸具有两个Fmoc保护基团，并用20％哌啶(溶于DMF)切割此保护基团。切掉两个Fmoc后，后面接的氨基酸形成双链。
第六步，重复第三步和第四步，反复循环添加单体氨基酸，直到合成完成。
3、合成后处理：
(1)将上述合成的双链抗菌肽进行Ce6标记；
具体的标记方法为：称取相当于带有多肽(序列为
)的树脂3倍摩尔量的Ce6、HOBT、EDC溶解于DMF中，加入DIEA避光过夜反应。
(2)洗脱和脱保护：用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上切割下来，并脱除保护基；
(3)HPLC分析纯化，冻干。
4、最小抑菌浓度检测
通过测定抗菌肽90％抑菌浓度(MIC90)来反映其抗菌效果，最小抑菌浓度为检测到细菌生长不超过对照组10％的最低样品浓度。进行细菌实验之前，通过酶标仪测量被Ce6标记的抗菌肽在660nm处的吸光度值来确定样品的浓度。实验中需用到S.aureus细菌，首先将细菌放入TSB培养基中培养过夜，然后设置样品浓度梯度进行涂板实验，确定了双链抗菌肽S.aureus细菌的最小抑菌浓度(MIC90)为2.8μmol/L，单链抗菌肽S.aureus细菌的最小抑菌浓度(MIC90)为12μmol/L。
5、涂板实验
首先合成了荧光标记的多肽，将制备的荧光标记肽按照单链MIC50的浓度，设置同样浓度的双链抗菌肽进行对照，结果显示双链抗菌肽抑菌效果显著强于单链抗菌肽。
对比实施例1
采用常规的固相Fmoc法合成GKRWWKWWRRC序列，反复循环添加单体氨基酸，使肽链从C末端向N末端延伸，直到合成完成。合成后对此单链多肽同样进行Ce6进行标记，其他步骤同实施例1。
该单链多肽具有抗菌性，但抗菌活力远不及此发明中的双链抗菌肽。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。

Claims (5)

1.一种Ce6标记的双链抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为：
2.一种如权利要求1所述的双链抗菌肽的合成方法，其特征在于，所述合成方法步骤如下：
(1)采用固相合成法合成双链抗菌肽；
(2)采用Ce6标记抗菌肽(AMP-Ce6)。
3.如权利要求2所述的双链抗菌肽的合成方法，其特征在于，所述双链抗菌肽的合成方法为：采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸链接到树脂上，使肽链从C末端向N末端延伸，在合成第五个氨基酸时，采用氨基酸(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)，并用溶于DMF的20％哌啶切割此保护基团，切掉两个Fmoc后，后面接的氨基酸形成双链，反复循环添加单体氨基酸，直到合成完成。
4.如权利要求2所述的双链抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述Ce6标记抗菌肽的方法为：称取相当于带有双链多肽的树脂3倍摩尔量的Ce6、HOBT、EDC溶解于DMF中，加入DIEA避光过夜反应；用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上切割下来，并脱除保护基；HPLC分析纯化，冻干。
5.一种如权利要求1所述的双链抗菌肽的应用，其特征在于，所述Ce6标记的双链抗菌肽用于抑菌、杀菌以及光动力抗菌化学疗法领域。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112121226A (zh) * 2020-09-17 2020-12-25 常州大学 一种促伤口愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100016208A1 (en) * 2005-11-15 2010-01-21 The General Hospital Corporation Photoactivatable antimicrobial agents
CN102405053A (zh) * 2009-01-06 2012-04-04 C3剑股份有限公司 靶向抗微生物部分
CN107596368A (zh) * 2017-10-11 2018-01-19 华南师范大学 一种细菌靶向纳米粒子的制备及其抑杀细菌的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100016208A1 (en) * 2005-11-15 2010-01-21 The General Hospital Corporation Photoactivatable antimicrobial agents
CN102405053A (zh) * 2009-01-06 2012-04-04 C3剑股份有限公司 靶向抗微生物部分
CN107596368A (zh) * 2017-10-11 2018-01-19 华南师范大学 一种细菌靶向纳米粒子的制备及其抑杀细菌的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AI-NV ZHANG ET AL: "A Versatile Bacterial Membrane-Binding Chimeric Peptide withEnhanced Photodynamic Antimicrobial Activity", 《JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY B》 *
CARLOS MAS-MORUNO ET AL: "Multifunctional Coatings and Nanotopographies: Toward Cell Instructive and Antibacterial Implants", 《ADV. HEALTHCARE MATER.》 *
GREGORY A. JOHNSON ET AL: "Photoinduced Membrane Damage of E. coli and S. aureus by the Photosensitizer-Antimicrobial Peptide Conjugate Eosin-(KLAKLAK)2", 《PLOS ON》 *
XIAOLING LEI ET AL: "Antibacterial photodynamic peptides for staphylococcal skininfection", 《BIOMATERIALS SCIENCE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112121226A (zh) * 2020-09-17 2020-12-25 常州大学 一种促伤口愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用
CN112121226B (zh) * 2020-09-17 2022-04-26 常州大学 一种促伤口愈合的复合水凝胶及其制备方法和应用

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