CN105031661A - 生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为基因转染试剂或者基因治疗试剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为基因转染试剂或者基因治疗试剂的应用，该生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室为由天然来源和/或自组装技术得到，生物来源为动物、植物或微生物，所得到的生物膜是完整的或者是片段的，形态上为呈脂质双分子层结构，其组成成分主要是脂质和蛋白质，另有少量糖类通过共价键结合在脂质或蛋白质上。本发明生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室的脂质双分子结构使得其与细胞膜具有很好的相似相容性，能被细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，因而可以作为外源物质如DNA进入细胞的载体。

Description

生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为基因转染试剂或者基因治疗试剂的应用

技术领域

本发明属于生物医学和高分子材料领域，具体涉及到由天然来源和/或自组装得到的生物膜及具有生物膜性的闭合结构和细胞区室作为基因转染试剂或者基因治疗试剂的应用。

背景技术

生物膜（biomembranes）或生物性膜（biologicalmembranes）是细胞、细胞器和其环境接界的所有膜结构的总称，起着划分和分隔细胞和细胞器的作用，也是与细胞内通讯有关的重要部位。生物中除某些病毒外，都具有生物膜。真核细胞除质膜（又称细胞膜）外，还有分隔各种细胞器的膜系统，包括核膜、线粒体膜、内质网膜、溶酶体膜、高尔基体膜、叶绿体膜、液泡、过氧化酶体膜等。

生物膜形态上都呈脂质双分子层（lipidbilayer）的片层结构，其组成成分主要是脂质，另有少量的蛋白质和糖类。生物膜的这种脂质双分子层结构，使其具有以下功能：调节和控制物质进出、细胞内不同细胞器间物质的包装和运输、为某些试剂和信号物质提供特定的运输通路、以及通过形成细胞内的区室（cellularcompartment）来提供物质储存的空间。

生物膜的组分繁多，分离纯化的难度较大，因此早年为便于研究，往往采用单一或几种脂质组成的各种人工膜结构：单分子层膜、累积膜、脂质体、平板双分子层脂膜等，另外，也可将蛋白质嵌入后组成重建膜，这些膜结构泛称“人工膜”。人工膜已在实际中得到应用，如从海水等溶液相中高效地分离和浓缩物质、用作肾脏病患者的透析膜以及用于临床诊断和治疗等，近些年利用脂质体可以和细胞膜融合等特点制备脂质体载体药物是人工膜的另一项比较大的拓展。

但是，包括脂质体在内的这些人工膜，均具有在体外易氧化、渗漏、储存性不好；在体内易被一些酶类物质降解和巨噬细胞吞噬而不能到达靶组织发挥有效作用等缺点，这些都限制了其作为载体的应用。另一方面，人工合成物质的添加，使得人工膜作为高分子材料植入人体不可避免的会使机体产生排异，使用受限。

在地球上出现有生命物质和它由简单到复杂的长期演化过程中，生物膜的出现是一次飞跃，生物膜经过亿万年的进化才具有今天这般的精细结构和精妙的功能活动机制，其本身具有两个最大的特性，即膜的流动性和膜的不对称性。膜的流动性是指生物膜处于不断的运动状态，这使得膜中的脂质分子不断的交换位置，它是保证膜具有胞吞、胞吐、物质传递、细胞融合等功能的重要条件。不过也正是因为这种膜流动性导致膜的不断变形，使得组分相对天然生物膜较简单的人工膜形态结构的不稳定等因素，导致脂质体在内的人工膜作为载体稳定性和储存性差，包裹物易泄漏。此外，生物膜可分为近胞质面和非胞质面内外两层，生物膜内外二层的组分和结构有很大差异，这种差异称为生物膜的不对称性，正是这种膜的不对称性对膜的排序、细胞融合、分子间识别产生重要的影响，而这种不对称性是人工膜完全没办法具有的。

另一方面，生命是物质存在的最高形式，生命所具有的最基本的特征是：通过新陈代谢而实现自我调控、自我复制和自我装配。自组装(self-assembly)为系统之构成元素，指在不受人类外力之介入下，自行聚集、组织成规则结构的现象。自组装是各种复杂生物结构形成的基础，与生命现象密不可分，生物膜是生物体给人们提供的自组装研究的天然模型。

转基因技术是指DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。一方面该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种；另一方面，基因转染技术不仅是研究转基因和基因表达的重要工具，而且是目前基因治疗的关键步骤。理想的基因转染试剂应该具有如下特点：高效转染、安全、低细胞毒性、方法简单、省时、经济。但是，现在常用的转染试剂不是转染效率太低就是细胞毒性太大，因此，亟需寻找一种新的既能高效转染又能降低细胞毒性的转染试剂。

发明内容

为了克服目前尚存在应用缺陷的人工膜的不足之处，本发明的第一个目的是提供天然来源和/或自组装技术得到的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为基因转染试剂或者基因治疗试剂的应用。本发明和第二个目的是提供一种基因转染试剂或者基因治疗试剂组合物。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为基因转染试剂或者基因治疗试剂的应用，该生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室为天然来源和/或自组装技术得到，生物来源为动物、植物或微生物，所得到的生物膜是完整的或者是片段的，形态上为呈脂质双分子层结构，其组成成分主要是脂质和蛋白质，另有少量糖类通过共价键结合在脂质或蛋白质上。

作为优选，所述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，粒径从10nm到几十微米。

作为优选，所述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室的形状包括球状、囊泡状、杆状、螺旋状的单层或者多层、多室的多种形态结构。

作为优选，所述的生物膜包括质膜、核膜、线粒体膜、内质网膜、溶酶体膜、高尔基体膜、叶绿体膜和液泡和过氧化酶体膜一种或多种。

作为优选，所述的细胞区室是指一般的细胞器；作为再优选，所述的细胞区室为线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、溶酶体、内质网、细胞核、高尔基体及囊泡和微管的一种或多种。

作为优选，所述的应用包括基因的膜内包裹、膜内包裹、表面吸附、表面交联、膜间嵌镶和膜内包裹加靶向。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种基因转染试剂或者基因治疗试剂组合物，该组合物包括基因和生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，使用量为1~99%。

作为优选，使用量为10~80%。

作为优选，所述的基因包括从特定生物体基因组中提取得到的所需要的目的DNA/RNA片段、人工合成指定序列的DNA/RNA片段中的一种或多种。

上述任一一个技术方案所述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室的制备方法，该方法包括以下的步骤：

1）获得生物细胞；

2）将步骤1）所述的细胞在其适宜的环境下大量培养；

3）获得步骤2）所述的细胞的裂解液，并通过差速离心法、密度梯度离心法和双相萃取法方法，各种方法单独使用或者两两组合或者三者联合使用提取所需生物膜、具有生物膜性的闭合结构和细胞区室。

作为优选，所述的差速离心提取方法包括以下的步骤：

①将细胞裂解液以15,000~30,000×g，10~30min，1~6℃条件下高速离心，弃沉淀，收集上清液；

②上清液以100,000~200,000×g，30~90min，1~6℃条件下超速离心，弃上清，收集沉淀，即为所需提取的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，沉淀用含15~30%甘油的PBS/生理盐水重悬保存。

作为优选，所述的密度梯度离心提取方法包括以下的步骤：

①将细胞裂解液沉淀后重新悬浮，重悬液加入到不同浓度的蔗糖溶液中，以150,000~300,000×g，60~90min，1~6℃条件下超速离心，收集所需层；

②收集到的液体以100,000~200,000×g，30~90min，1~6℃条件下超速离心，弃上清，收集沉淀，即为所需提取的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，沉淀用含15~30%甘油的PBS/生理盐水重悬保存。

作为再优选，所述的步骤①蔗糖溶液的质量百分比浓度范围为10~70%；作为优选，所述的步骤①蔗糖溶液的不同质量百分比浓度为10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%。

作为优选，所述的双相萃取方法包括以下的特征：

①配置葡聚糖/聚乙二醇的水双相混合物，于分液漏斗中混合均匀，4℃静置过夜分层，小心分离上下层，制成新鲜的上相和下相；

②将细胞裂解液沉淀后重新悬浮并加入到水双相混合物中，上下轻轻颠倒30~40次混合均匀；

③以2,000~4.000×g，5~10min，4℃条件下离心，取上相和下相继续进入两相系统，分离三次后合并上相，稀释5倍后，在60,000~100.000×g，30~90min，4℃条件下离心，收集沉淀，即为所需提取的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，沉淀用含15~30%甘油的PBS/生理盐水重悬保存。

作为再优选，所述的双相为葡聚糖/聚乙二醇的双相混合物。

作为再优选，所述的双相包括水双相或、有机双相、水相溶液和有机相溶液，所述溶剂选自水、乙腈、丙酮、四氢呋喃、甲醇、乙醇、丙醇的任一种或其组合。

上述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室也可以通过自组装制备方法制得，该方法包括上述各个技术方案所述的制备方法，并将步骤3）获得的生物膜、具有生物膜性的闭合结构和细胞区室的材料以干燥膜的形式覆盖在容器的壁上，然后缓慢注入水或者缓冲溶液，并轻微的或剧烈的振动，自组装获得所需的生物膜、具有生物膜性的闭合结构和细胞区室。

作为优选，所述的步骤3)制得的材料溶解在氯仿溶剂中，加入到容器内，减压蒸发使得生物膜在容器表面上铺展，蒸发至恒重后加入PBS缓冲溶液并缓慢摇动0.5~3h，于100,000~200,000×g，30~90min，1~6℃条件下超速离心，弃上清，收集沉淀，即为所需的生物膜、具有生物膜性的闭合结构和细胞区室。

本发明生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室的脂质双分子结构使得其与细胞膜具有很好的相似相容性，能被细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，因而可以作为外源物质如DNA进入细胞的载体。DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体，其中一小部分DNA能从包涵体内释放并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。同时，生物膜的天然来源性，几乎不产生细胞毒性。

附图说明

图1为乙型肝炎表面抗原含量。

图2为苯乙基间苯二酚—生物膜使用效果图。

图3为不同时间下透皮吸收浓度。

图4黑色素合成抑制率。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1生物膜的提取、纯化

采用密度梯度离心法提取、纯化得到所需的生物膜。具体过程如下：

（1）将断食18-24h的新西兰大白兔处死取肝脏，去掉大的血管后，将肝脏剪成2mm³左右的小块，并用生理盐水冲洗至组织块变白；

（2）制备匀浆液：1mmol/LCaCl₂，50mmol/LHEPES(pH7.4)，1mmol/LPMSF，2μg/mL抑肽酶，2μg/mLAntipain；

（3）将肝脏组织和匀浆液按质量：体积的比例加入8倍体积的匀浆液，并在冰浴环境中用电动匀浆机15,000rpm匀浆至组织液化；

（4）将匀浆液经四层纱布过滤，滤液在1,000×g，10min，4℃条件下离心，收集沉淀；

（5）沉淀用蔗糖溶液A（0.3mol/L蔗糖，50mmol/LTris，3mmol/LMgCl₂）充分悬浮沉淀，加入9倍体积的蔗糖溶液B（2mol/L蔗糖，50mmol/LTris，3mmol/LMgCl₂），上层用蔗糖溶液C（0.25mol/L蔗糖，10mmol/LHEPES，1mmol/LEDTA）填满离心管，在90,000×g，150min，4℃条件下离心，收集上层膜层；

（6）该膜层用洗液（50mmol/LHEPES，1mmol/LPMSF，2μg/mL抑肽酶，2μg/mLAntipain）洗涤，在90,000×g，60min，4℃条件下离心，收集沉淀，即为所需的生物膜。

实施例2生物膜的提取、纯化

采用两相分配法提取、纯化得到所需的生物膜。具体过程如下：

（1）筛选饱满一致的正常玉米种子，经1%NaClO浸泡消毒10min，冲洗干净，在25℃恒温黑暗条件下催芽72h；

（2）取玉米上胚轴，以质量：体积的比例加入2倍体积的提取缓冲液（5mmol/LEDTA，25mmol/LTris，0.25mmol/L蔗糖，1mmol/LMgSO₄，0.2%（W/V）BSA，0.5%（W/V）PVP-10，10%（W/V）甘油，15mmol/Lβ-巯基乙醇，1mmol/LPMSF，1mmol/LDTT），冰浴研磨至液化；

（3）将研磨液经四层纱布过滤，滤液在12,000×g，15min，4℃条件下离心，取上清液；

（4）上清液在80,000×g，30min，4℃条件下离心，收集沉淀；

（5）沉淀用悬浮液（25mmol/LTris，0.25mmol/L蔗糖，0.2%（W/V）BSA，10%（W/V）甘露醇，1mmol/LDTT）充分悬浮沉淀；

（6）将悬浮液加入两相系统（每10g两相系统中含：1.7g蔗糖，0.003gDTT，2.25mL水，50mmol/LKCl0.5mL，1.63PEG，3.25gDextranT-500，200mmol/LPBS0.5mL），上下摇匀50次，在4,000×g，5min，4℃条件下离心，取上相和下相继续进入两相系统，分离三次后合并上相，稀释5倍后，在80,000×g，60min，4℃条件下离心，收集沉淀，即为所需的生物膜。

实施例3生物膜的提取、纯化

采用差速离心法提取、纯化得到所需的生物膜。具体过程如下：

（1）南极冰藻（Chlamydomonassubcaudata）是从南极海冰中分离纯化而来；

（2）将南极冰藻按1:100的比例接种到培养基中（每10L培养基中含21.2gNaCl，3.6gNaSO₄，0.6gKCl，0.3gNaHCO₃，0.1gKBr，0.1gH₃BO₃，0.1gNaF，9.6gMgCl₂·6H₂O，1.0gCaCl₂，0.1gSrCl₂·6H₂O），置于可控光照培养箱中培养。在-4℃，光强为1300~1900lx，光照周期12明/12暗，每天摇动4~5次条件下培养14天；

（3）将冰藻培养液在4,000rpm，20min，4℃条件下离心，收集冰藻沉淀，并用预冷的蒸馏水迅速冲洗2次，以除去细胞外黏稠物、表面盐分及培养液中的杂质；

（4）将上述收集到的冰藻沉淀按质量：体积的比例加入4倍体积的匀浆缓冲液（0.5mol/LKOH，0.5mol/L蔗糖，3mmol/LEDTA，0.6%PVP，1mmol/LPMSF，1mmol/LDTT，5mmol/L抗坏血酸，0.6%BSA），用挤压式细胞破碎仪破碎细胞；

（5）将得到的细胞匀浆液在8,000rpm，20min，4℃条件下离心，收集上清液；

（6）上清液在145,000×g，60min，4℃条件下离心，收集沉淀，即为所需的生物膜。

实施例4细胞区室的分离、纯化

采用双相萃取法分离、纯化得到所需的细胞区室。具体过程如下：

（1）水双相系统的制备：将混合物（每300g中含90g20%（W/W）DextranT-500，45g40%（W/W）PEG3350，33.9g蔗糖，7.5g0.2mmol/LPBS，0.45g2mmol/LKCl）在离心管中混合均匀，制成等浓度葡聚糖/聚乙二醇（DextranT-500/PEG3350）的水双相混合物，于分液漏斗中混合均匀，4℃静置过夜分层，小心分离上下层，制成新鲜的上相和下相，于4℃分别保存，用于后续纯化步骤；

（2）将实施例3中获得的生物膜沉淀用重悬浮缓冲液（5mmol/LPBS，0.33mol/L蔗糖，3mmol/LKCl，1mmol/LDTT，1mmol/LPMSF，0.1mmol/LEDTA）重悬浮；

（3）将上述重悬浮液以质量比1:3的比例加到步骤（1）中制备的DextranT-500/PEG3350水双相混合物中，上下轻轻颠倒30~40次混合均匀；

（4）混合液在1,500rpm，10min，4℃条件下离心，取上相液和下相液继续进入两相系统，分离三次后合并上相分离液，稀释5倍后，在100,000×g，60min，4℃条件下离心，收集沉淀，即为所需的细胞区室，且富含类囊体。

实施例5细胞区室的分离、纯化

采用密度梯度离心法分离、纯化得到所需的细胞区室。具体过程如下：

（1）选取10g生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除中脉，按质量：体积的比例加入6倍体积的提取缓冲液（50mmol/L磷酸钾缓冲液，0.3mmol/L山梨醇，2mmol/LEDTA，1mmol/LMgCl₂，1mmol/LMnCl₂，1%BSA，1mmol/LDTT），冰浴研磨；

（2）配置Percoll分层液（50mmol/LHEPES-KOH，0.3mmol/L山梨醇，2mmol/LEDTA，1mmol/LMgCl₂，1mmol/LMnCl₂，1%BSA，3%PEG6000，1%Ficoll），在30,000×g，20min，4℃条件下预先离心；

（3）将研磨液四层纱布过滤，在3,000×g，15min，4℃条件下离心，收集沉淀，沉淀用2ml提取缓冲液悬浮，并置于步骤（2）离心过的Percoll分层液上，在15,000×g，20min，4℃条件下离心，吸取下层，即为所需的细胞区室，且富含叶绿体。

实施例6生物膜的制备

采用自组装技术制备所需的生物膜。具体过程如下：

（1）将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜溶解在足量的氯仿溶剂中；

（2）将上述生物膜氯仿溶液加入到圆底烧瓶内，减压蒸发使得生物膜在烧瓶表面上铺展，蒸发至恒重后加入PBS缓冲溶液并缓慢摇动2h；

（3）将上述溶液在6,000rpm，20min，4℃条件下离心，收集沉淀，并用重悬缓冲液（20mmol/LTris，0.1mol/LNaCl，2mmol/LMgCl₂，1mmol/LDTT）重悬沉淀；

（4）将重悬液在150,000×g，60min，4℃条件下超速离心，弃上清，收集沉淀，即为通过自组装技术得到的生物膜，且具有闭合特性。

实施例7膜内包裹

采用逆向蒸发法在生物膜内进行DNA包裹，具体如下：

（1）将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜和十八胺以10:1（体积比）的比例混合，溶解在4倍体积的氯仿中，然后在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发（37℃，200rpm），除去氯仿；

（2）将含有乙肝病毒DNA的质粒溶解在20mmol/L的PBS中；

（3）加入乙醚溶解步骤（1）中的生物膜，并与上述含有质粒的PBS等体积混合，置于50℃水浴孵育20min，即为所需的包裹了乙肝病毒DNA质粒的转基因载体。

实施例8膜内包裹

采用超声乳化法在生物膜内进行化妆品的成分包裹，具体如下：

（1）在4℃条件下，将维生素C溶解在1mol/L的PBS缓冲溶液中，形成饱和溶液；

（2）将上述维生素C饱和溶液和实施例5中得到的细胞区室混合，冰浴环境中用超声波破碎仪超声乳化，超声探头的振幅为40%，工作30sec，间隔30sec，循环20次；

（3）将乳化液在100,000×g，20min，4℃条件下离心，弃上清，收集沉淀，即为所需的包裹了维生素C的化妆品载体。

实施例9表面吸附

采用静电吸附法在生物膜表面吸附病毒制备疫苗，具体如下：

（1）将实施例6中通过自组装技术得到的生物膜运用酸碱电位滴定法测算出等电点为6.8；

（2）将上述生物膜复溶于pH为5.8的PBS缓冲液中，水浴超声10min；

（3）将已知的，等电点为4.8的猪瘟病毒和上述复溶在PBS的生物膜等浓度充分混合，混匀后置于-30℃冷冻过夜，然后-60℃冷冻干燥过夜，即为所需的猪瘟疫苗。

实施例10表面交联

采用交联法在生物膜表面交联细胞制备人工器官，具体如下：

（1）将实施例6中通过自组装技术得到的生物膜经戊二醛溶液交联，制备生物膜模板；

（2）将人半月板纤维软骨细胞置于培养箱（5%CO₂，37℃）进行培养，取第二代细胞用F-12培养液（含10%小牛血清）制成细胞悬液；

（3）将经紫外线照射灭菌的生物膜干燥模板放入6孔培养板，加入上述细胞悬液并浸没之，于37℃下置于恒温培养箱内振荡2h后，将培养板取出置于CO₂培养箱（5%CO₂，37℃），培养2天，即为所需的人工半月板。

实施例11膜间嵌镶

采用高压均质法在生物膜双分子层间镶嵌药物，具体如下：

（1）将实施例4中得到的细胞区室和维甲酸于65℃熔融，用高剪切分散乳化机高剪切制得初乳；

（2）将初乳混入65℃溶有吐温-80的蒸馏水后，高压均质15次循环，均质压力为80MPa，自然冷却至室温，即为所需的包裹了维甲酸的药物载体。

实施例12膜内包裹加靶向

采用pH梯度法在生物膜内进行药物包裹，并利用生物膜上的蛋白链接靶向因子，具体如下：

（1）将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜溶解在0.3mol/L柠檬酸（pH=4）的水溶液中，然后减压旋转使得生物膜在容器壁上形成薄膜；

（2）用1mol/L的碳酸钠溶液调节上述得到的生物膜，并使混悬液的pH至7.8，使得生物膜内外形成质子梯度，可作为载体主动载药；

（3）在60℃条件下，将阿霉素溶解在1mol/L的HEPES缓冲溶液（pH=7.8）中，形成阿霉素的饱和溶液；

（4）将生物膜混悬液和阿霉素饱和溶液混合，在60℃条件下水浴孵化20min，将混合液在80,000×g，60min，4℃条件下离心，弃上清，收集沉淀，即为所需的包裹了阿霉素的药物载体；

（5）用亲和素标记靶向因子iRGD，并将上述载有阿霉素的生物膜载体修饰上生物素，通过生物素-亲和素系统，将iRGD连接到载有阿霉素的生物膜载体上，即为所需的包裹了阿霉素的药物载体，并具有靶向性。

实施例13药物载体有益效果（提高药物/化妆品稳定性）

（1）将实施例8中获得的包裹了维生素C的载体用5%TritonX-100在37℃轻轻摇晃过夜破乳，并用体积比100倍的甲醇稀释；

（2）用高效液相色谱法对维生素C进行含量测定，测算出载体中维生素C含量为8.72%；

（3）按8.72%的维生素C含量将维生素C和载体简单混合作为对照和包裹了维生素C的载体分别保存在密封的无色玻璃瓶中，进行稳定性测试：光照射9d（强度3000lx），每隔两天取样测定两组维生素C的含量变化；

（4）结果表明，被生物膜包裹的维生素C稳定性明显高于混合物。

实施例14药物载体有益效果（提高药物/化妆品溶解性）

采用超声乳化法在生物膜内进行药物包裹，具体如下：

（1）在4℃条件下，将紫杉醇溶解在乙醇中，形成饱和溶液；

（2）将上述紫杉醇饱和溶液和实施例5中得到的细胞区室混合，冰浴环境中用超声波破碎仪超声乳化，超声探头的振幅为40%，工作30sec，间隔30sec，循环20次；

（3）将乳化液在100,000×g，20min，4℃条件下离心，弃上清，收集沉淀，即为所需的包裹了紫杉醇的药物载体；

（4）将上述获得的包裹了紫杉醇的药物载体用PBS重悬至1ml，并用5%TritonX-100在37℃轻轻摇晃过夜破乳，并用体积比100倍的甲醇稀释；

（5）用高效液相色谱法对紫杉醇进行含量测定，测算出1ml溶液中载体中紫杉醇含量为9.1%；

（6）将过量的紫杉醇原料投入到PBS缓冲溶液中，37℃轻轻摇晃，每隔一段时间取样测定紫杉醇的含量变化，至浓度不再变化，采用高效液相色谱法，以外标对照法计算紫杉醇的含量为6.0ug/mL；

（7）结果表明，被生物膜包裹的紫杉醇的溶解度提高了1500倍。

实施例15药物载体有益效果（提高药物疗效）

采用逆向蒸发法在生物膜内进行药物包裹，具体如下：

（1）将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜溶解在4倍体积的氯仿中，然后在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发（37℃，200rpm），除去氯仿；

（2）将利福平溶解在PBS中，加入乙醚溶解步骤（1）中的生物膜，并与上述利福平等体积混合，置于50℃水浴孵育20min，即为所需的包裹了利福平的药物载体；

（3）将上述获得的包裹了利福平的药物载体用5%TritonX-100在37℃轻轻摇晃过夜破乳，并用体积比100倍的甲醇稀释，用高效液相色谱法对利福平进行含量测定，测算出载体中利福平含量为10.2%；

（4）取健康小白鼠20只，雌雄不限，体重25-35g，从尾静脉注入1.75×10⁸菌落形成单位（CFU）/mL的H₃₇R_V结核杆菌混悬液0.1mL使其感染，注射后14天，将小鼠随机分为A，B两组，每组10只；

（5）A组将上述获得的包裹了利福平的药物载体每三天静脉注射一次，每次10ul，B组注射相同的利福平药物剂量作为对照；

（6）注射满三周后将小鼠处死，取脾脏匀浆培养于适当浓度的罗氏培养基斜面上，六周后计算菌落数并算出CFU；

（7）结果表明，被生物膜包裹的利福平较普通利福平治疗效果提高了一倍。

实施例16药物载体有益效果（提高药物疗效，不同剂型）

（1）取健康新西兰白兔20只，雌雄不限，体重1.5~2.0kg，随机分为A，B两组，每组10只；

（2）以3%的戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉后，于颞上象限剪开球结膜，行气体压迫玻璃体术，即在角膜缘后3mm处以30号针头向玻璃体腔中央注入C₃F₈气体0.1ml，使气体膨胀时将玻璃体压向周边，3d后，以同样方法麻醉后，在原进针口处以5-0丝线做一褥式预置缝线，显微玻璃体视网膜刀刺穿巩膜，放出气体，注入L929细胞悬液，建立PVR实验模型；

（3）注入细胞后，A组将实施例11中获得的包裹了维甲酸的药物载体注入0.2ml，B组注入市面上获得的维甲酸硅油药0.2ml作为对照，结扎预置缝线；

（4）兔眼玻璃体腔注入L929细胞后，立即在后部玻璃体形成雾状混浊区，并在一周左右逐渐变为灰白色的条带，连向乳头和髓线，术后第28d，用托吡卡胺散瞳后，间接检眼镜检查玻璃体情况。将玻璃体混浊程度分为0～Ⅲ四个等级。0级：玻璃体无混浊，Ⅰ级：玻璃体轻度混浊，观察眼底不受影响，Ⅱ级：玻璃体中度混浊，透过混浊尚能看到眼底，Ⅲ级：玻璃体重度混浊，眼底看不到，将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的发生率进行统计，实验结果显示样品组与对照组相比玻璃体混浊程度轻，有统计学差异。

实施例17药物载体有益效果（减少药物毒性）

（1）取健康新西兰白兔10只，雌雄不限，体重1.5~2.0kg，随机分为A，B两组，每组5只；

（2）A组兔子左耳耳缘静脉缓慢注射实施例14中获得的包裹了紫杉醇的药物载体10mL，B组兔子左耳耳缘静脉缓慢注射相同浓度的紫杉醇注射液作为对照，两组都每天注射一次；

（3）连续注射一周后将兔子处死，剪取注射部位耳，放入10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片、HE染色、光镜下观察血管的变化和组织的坏死情况；

（4）结果表明，用生物膜包裹的紫杉醇注射后，兔子耳缘静脉注射部位血管结构完整，血管内皮细胞无肿胀、变性、坏死，管壁无炎症细胞浸润；而用普通紫杉醇注射液注射后，兔子耳缘静脉注射部位血管结构受到破坏，血管内皮细胞肿胀、部分变性及坏死，管壁有炎症细胞浸润。

实施例18药物载体有益效果（提高长效性）

采用逆向蒸发法在生物膜内进行药物包裹，具体如下：

（1）将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜溶解在4倍体积的氯仿中，然后在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发（37℃，200rpm），除去氯仿；

（2）将降钙素溶解在PBS中，加入乙醚溶解步骤（1）中的生物膜，并与上述降钙素等体积混合，置于50℃水浴孵育20min，即为所需的包裹了降钙素的药物载体；

（3）将上述获得的包裹了降钙素的药物载体用体积比500倍的甲醇超声溶解，37℃氮吹后用PBS复溶，用免疫发光法对降钙素进行含量测定，测算出载体中降钙素含量为8.6%；

（4）取健康新西兰白兔10只，雌雄不限，体重1.5~2.0kg，随机分为A，B两组，每组5只；

（5）A组静脉注射上述获得的包裹了降钙素的药物载体10ml，B组注射相同药物剂量的降钙素作为对照；

（6）结果表明，用生物膜包裹的降钙素在体内药物半衰期为4小时，而普通的降钙素半衰期为2小时，长效性提高了一倍。

实施例19药物载体有益效果（药物被动靶向性/降低毒性）

采用超声乳化法在生物膜内进行药物包裹，具体如下：

（1）在4℃条件下，将两性霉素B溶解在乙醇中，形成饱和溶液；

（2）将上述两性霉素B饱和溶液和实施例5中得到的细胞区室混合，冰浴环境中用超声波破碎仪超声乳化，超声探头的振幅为45%，工作30sec，间隔30sec，循环20次；

（3）将乳化液在100,000×g，20min，4℃条件下离心，弃上清，收集沉淀，即为所需的包裹了两性霉素B的药物载体；

（4）将上述获得的包裹了两性霉素B的药物载体用5%TritonX-100在37℃轻轻摇晃过夜破乳，并用体积比100倍的甲醇稀释，用高效液相色谱法对两性霉素B进行含量测定，测算出载体中两性霉素B的含量为8.3%；

（5）取健康小鼠30只，雌雄不限，体重18-22g，随机分为A，B两组，每组15只；

（6）A组小鼠尾静脉注射上述包裹了两性霉素B的药物载体0.2mg，B组小鼠注射相同药物剂量的两性霉素B作为对照，分别于给药后0.5、1.0、1.5、2.0和5.0h各组取3只小鼠心脏采血后处死，并取出肝、肾、脾等脏器进行两性霉素B含量测定；

（7）结果表明，用生物膜包裹的两性霉素B在肾脏内的药物分布明显少于普通的两性霉素B，有效的降低了肾毒性。

表不同时间小鼠血清及脏器中两性霉素B浓度（ug/g）

实施例20药物载体有益效果（药物主动靶向性）

（1）将人肝癌细胞株BEL-7402接种于BALB/C裸鼠背部皮下，待肿瘤直径约1cm时，取鱼肉样新鲜瘤组织切成1mm*2mm瘤块，用眼科镊植入裸鼠左外叶包膜下的隧道内，棉签轻压止血后缝合关腹；

（2）造模后第12d剖腹探察，挑选瘤体大小基本一致的20只模型鼠随机分为A，B两组，每组10只，A组将实施例12中获得的具有靶向性的阿霉素药物载体每天腹腔注射给药0.2ml，B组将市面上获得的阿霉素作为对照每天腹腔注射给药0.2ml；

（3）10d后，将模型鼠开腹测量肿瘤大小，并将肿瘤组织用于病理切片以及点经观察，结果显示样品组的肿瘤抑制率高于对照组。

实施例21转基因有益效果（转基因有效性）

（1）接种CHO细胞于6孔板，用DMEM完全培养基（含血清）在37℃，5%CO₂条件下培养24h；

（2）将实施例7中获得的包裹了乙肝病毒DNA质粒的转基因载体加入到无血清的DMEM培养基中，并轻轻混合均匀；

（3）将上述含有乙肝病毒DNA转基因载体的无血清DMEM培养液均匀的涂于CHO细胞上，在细胞培养箱中（37℃，5%CO₂）培养6h后再添加含有20%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48h后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液换液；

（4）细胞转染48h后，培养液中可检测到乙型肝炎表面抗原，转基因成功。

实施例22转基因有益效果（提高转基因效率）

（1）将含有乙肝病毒DNA的质粒溶解在20mmol/L的PBS中，并与市售脂质体转染试剂混合；

（2）将实施例21中用含有乙肝病毒DNA转基因载体转染的CHO细胞作为A组，B组为上述步骤（1）中获得的含有与A组同量乙肝病毒DNA的脂质体转染的CHO细胞；

（3）细胞转染48h后，检测培养液中乙型肝炎表面抗原的含量；

（4）如图1的结果表明，用生物膜作为转基因的转染试剂，能有效的提高转基因效率。

实施例23转基因有益效果（减少细胞毒性）

（1）将实施例22中A组和B组的细胞转染72h后用胰酶消化，PI染色后经流式细胞术检测不同转染组细胞凋亡情况；

（2）结果表明，用生物膜作为转基因的转染试剂，细胞凋亡率明显小于脂质体作为转染试剂，能有效减少细胞毒性。

实施例24化妆品添加剂有益效果（保湿）

（1）随机挑选十人，每人在左右手背正中挑选10cm×10cm的位置，任意一边的手涂抹实施例3中获得的复溶于500ul体积PBS中的生物膜，一边涂抹同体积的PBS作为对照；

（2）两只手相同位置连续涂抹两周后，用皮肤水份测试仪测试两边皮肤的含水量；

（3）结果显示，涂抹生物膜的手背平均皮肤含水量为48%，涂抹PBS的手背平均皮肤含水量为43%，生物膜作为化妆品添加剂能有效的进行皮肤保湿。

实施例25化妆品添加剂有益效果（美白）

（1）以0.5mmol/LL-DOPA为底物，在1mL0.05mol/L磷酸缓冲液的测活体系中，先加20uL实施例4中获得的生物区室（溶于DMSO溶液）于1.5mL的梨形管中，再加400uL预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，用缓冲溶液将体积补充到970uL，然后加30uL酪氨酸酶水溶液，立刻混匀，以PBS为对照，在30℃恒温下测定1min内波长为475nm时的吸光值随时间的增长直线，从直线斜率求得酶活力；

（2）结果表明，生物区室对酪氨酸酶的抑制活性为37%，而对照组的酪氨酸酶的抑制活性几乎不明显，生物膜作为化妆品添加剂能有效的促进美白。

实施例26化妆品添加剂有益效果（抗衰老）

（1）随机挑选四十五岁至五十五岁年龄段十人，每人在左右手背正中挑选10cm×10cm的位置，任意一边的手涂抹实施例3中获得的复溶于500ul体积PBS中的生物膜，一边涂抹同体积的PBS作为对照；

（2）两只手相同位置连续涂抹四周后，用皮肤弹性测试仪测试两边皮肤的抗衰老状况；

（3）结果显示，涂抹生物膜的手背平均皮肤弹性为30%，涂抹PBS的手背平均皮肤弹性为27%，生物膜作为化妆品添加剂能有效的抗衰老。

实施例27化妆品载体有益效果（提高功能性成分的稳定性）

同实施例13。

实施例28化妆品载体有益效果（提高功能性成分的溶解性）

（1）在4℃条件下，将姜黄提取物溶解在丁二醇中，形成饱和溶液；

（2）将上述姜黄素饱和溶液和实施例5中得到的细胞区室混合，冰浴环境中用超声波破碎仪超声乳化，超声探头的振幅为40%，工作30sec，间隔30sec，循环20次；

（3）将乳化液在100,000×g，20min，4℃条件下离心，弃上清，收集沉淀，即为所需的包裹了姜黄素的药物载体；

（4）将上述获得的包裹了姜黄素的药物载体用PBS重悬至1ml，并用5%TritonX-100在37℃轻轻摇晃过夜破乳，并用体积比100倍的甲醇稀释；

（5）用高效液相色谱法对姜黄素进行含量测定，测算出1ml溶液中载体中姜黄素含量为10.9%；

（6）将过量的姜黄素投入到PBS缓冲溶液中，37℃轻轻摇晃，每隔一段时间取样测定姜黄素的含量变化，至浓度不再变化，采用高效液相色谱法，以外标对照法计算姜黄素的含量为4.0ug/mL；

（7）结果表明，被生物膜包裹的姜黄素的溶解度提高了2000倍以上。

实施例29化妆品载体有益效果（提高功能性成分的长效性）

采用逆向蒸发法在生物膜内进行药物包裹，具体如下：

（1）将上述实施例1或实施例2或者实施例3中得到的生物膜溶解在4倍体积的氯仿中，然后在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发（37℃，200rpm），除去氯仿；

（2）将苯乙基间苯二酚溶解在乙醇中，加入乙醚溶解步骤（1）中的生物膜，并与上述苯乙基间苯二酚以1:10的体积比混合，置于50℃水浴孵育20min，即为所需的包裹了苯乙基间苯二酚的化妆品载体；

（3）将上述获得的包裹了苯乙基间苯二酚的化妆品载体用破乳后用高效液相色谱法对苯乙基间苯二酚的进行含量测定，用PBS稀释至浓度为0.5%；

（4）选取一处10cm×10cm的皮肤，涂抹上述步骤（3）获得的包裹了苯乙基间苯二酚的化妆品载体1ml，每天涂抹，早晚各一次；

（5）如图2所示，结果表明，用生物膜包裹的苯乙基间苯二酚能长效美白。

实施例30化妆品载体有益效果（提高功能性成分的透皮率）

（1）将大鼠用2.5%戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉后，用电动剃刀小心剃去背部毛发，取下已去毛的皮肤，剔除皮下脂肪和肌肉，制备好的离体鼠皮用打孔器制成直径22mm的皮肤样本，置于Frnaz扩散池，表皮面向供给池，接受池体积为14.5mL，有效渗透面积0.785cm²，接受液为0.9%Nacl溶液；

（2）将生物膜通过静电表面吸附法吸附胶原蛋白加入到供给池中，相同含量的胶原蛋白作为对照；

（3）实验过程中保持37℃恒温，接收池中有磁力搅拌器搅拌，搅拌速度200r/min，分别在1、2、3、5、7、9h从接收池吸取200ul样本，同时立即补充相同体积的新鲜接受液；

（4）用荧光光度计测量样本荧光值，代入回归方程计算药物不同时段的透皮浓度；

（5）如图3所示，结果表明，用生物膜作为载体包裹胶原蛋白，能明显提高其透皮吸收率。

实施例31化妆品载体有益效果（提高功能性成分的有效性）

（1）将B16黑色素细胞接种于6孔板，用DMEM完全培养基（含血清）在37℃，5%CO₂条件下培养24h，弃上清；

（2）将实施例8中获得的包裹了维生素C的载体加入到无血清的DMEM培养基中，并轻轻混合均匀，普通维生素C作为对照；

（3）将上述含有维生素C载体的无血清DMEM培养液均匀的涂于B16黑色素细胞上，在细胞培养箱中（37℃，5%CO₂）培养3d后，弃上清，PBS洗涤，每孔加胰腺消化细胞5min，分别对每组细胞计数；

（4）细胞悬液在20,000×g，15min，4℃条件下离心，弃上清，沉淀加1mol/LNaOH溶液，80℃加热30min，用分光光度计检测475nm下的吸光度；

（5）通过公式：黑色素合成抑制率=【1-（药物孔吸光度值/药物孔细胞数）/（对照孔吸光度值/对照孔细胞数）】×100%，计算出实施例8中获得的包裹了维生素C的载体黑色素合成抑制率为38.5%。（图4）

实施例32疫苗载体及佐剂有益效果（安全性）

为确定生物膜作为疫苗的载体或者免疫佐剂是否存在能引起过敏反应的物质，确保生物膜疫苗接种的安全性，本发明进行了动物过敏试验。

（1）将实施例1，实施例2，实施例3，实施例4，实施例5中获得的生物膜分别接种豚鼠，每组2只，每只豚鼠皮下接种1mL，间隔一周，皮下接种第二次，使豚鼠致敏，三周后以相同样品每只静脉注射500ul；

（2）结果判定：静脉注射后，豚鼠全都没有出现烦躁不安、休克、或者死亡的现象，说明注射物质对豚鼠并无过敏反应。

实施例33疫苗的应用（预防病毒疫苗，皮下剂型）

（1）选取一批42d，健康、大小均匀的三元杂小猪头，随机分成A，B两组，每组20头；

（2）将实施例9中获得的包裹了猪瘟病毒的载体免疫A组，用市面上常规猪瘟疫苗免疫B组作为对照，两组试验猪在相同的饲养管理条件下饲养，42d后逐头静脉采血3ml，分离血清；

（3）血清进行猪瘟抗体ELISA的检测（如下表），免疫率为95%。

实施例34疫苗的应用（基因疫苗，肌肉注射剂型）

（1）选取比格犬10只，平均体重3kg（2.5~3.5kg），雌雄不限，随机分为A，B两组，每组3只；

（2）将包裹了犬瘟热病毒DNA质粒的生物膜肌肉注射A组，每只注射500ul质粒DNA浓度为1ug/u1的生物膜疫苗，B组注射相同DNA浓度的犬瘟热病毒DNA质粒作为对照，每隔两周注射一次疫苗；

（3）第三次免疫两周后用双抗处理过的犬瘟热发病犬脑组织匀浆1:10的稀释液，对所有实验犬进行2ml每只的攻毒实验，其中1ml滴鼻，1ml为肌肉注射；

（4）攻毒后每天测其直肠温度，详细记录实验犬的发病和死亡情况，观察动物的临床症状变化；

（5）攻毒后B组2只实验犬出现死亡情况，剩下1只出现轻微神经症状，最高体温达41℃，然后慢慢转归正常。生物膜注射组体温也出现不同程度的升高，最高达39.4℃，但没有出现神经症状以及死亡；

（6）结果表明，生物膜作为基因疫苗的载体和免疫佐剂有很强的免疫效果。

实施例35疫苗的应用（肿瘤疫苗，口服剂型）

（1）取健康小鼠10只，雌雄不限，体重18-22g，随机分为A，B两组，每组5只；

（2）免疫及接种前，小鼠禁食水12小时以上，接种前30min先经口喂饲150ul0.01mol/LNaHCO₃溶液以中和胃酸，将包裹了幽门杆菌重组蛋白的生物膜载体疫苗经口喂饲A组，每只饲喂100ul幽门杆菌重组蛋白浓度为10ul的生物膜疫苗，B组饲喂100ulPBS，其中含幽门杆菌重组蛋白10ul作为对照；

（3）实验组及对照组在第0、7、14、21天各免疫一次，免疫1小时后恢复食水，距末次免疫2周后（第35天）各组均用10⁸CFU/次的幽门杆菌攻击，隔日一次，共三次，距末次攻击4周后处死小鼠；

（4）处死小鼠后立即剖腹取胃、取脾脏，沿大弯侧剪开，以无菌生理盐水冲洗胃内容物，沿纵轴取胃组织，涂片后置96孔板行快速尿素酶试验；

（5）尿素酶试验显示，生物膜疫苗组和对照组比较，能有效的保护实验鼠不受幽门杆菌的感染，由于幽门杆菌的感染是胃癌、胃粘膜组织淋巴瘤等疾病的重要致病因素，因此，使用生物膜作为幽门杆菌重组蛋白的疫苗载体和佐剂能有效的预防胃癌等疾病。

实施例36疫苗载体及佐剂有益效果（强效体液免疫性）

同实施例33

实施例37疫苗载体及佐剂有益效果（强效细胞免疫性）

（1）将实施例35中获得的小鼠脾脏进行脾淋巴细胞INF-γ和IL-4mRNA的表达进行比较；

（2）结果显示，使用生物膜作为幽门杆菌重组蛋白的疫苗载体和佐剂，小鼠脾淋巴细胞出现以Th1细胞(INF-γ)为主的增生，INF-γ水平较对照组比较有显著性差异。

实施例38人造器官的应用

（1）选取2月龄比格犬10只，平均体重2.5kg（2~3kg），雌雄不限，随机分为A，B两组，每组5只；

（2）将比格犬右膝从外侧切开膝关节囊，不切断侧副韧带，在外侧半月板上作一三角形缺损（底边在周缘、尖端向内至半月板体部宽度的一半），再于缺血区作一纵行缺损；

（3）A组将实施例10中获得的人工半月板植入缺损，B组将市面上获得的以胶原为支架的人工半月板植入缺损作为对照，两组都以5-0可吸收线缝合固定，完毕后缝合切口，术后笼养；

（4）术后于12周处死动物，取膝关节标本观察：A组可见缺损处愈合良好，缺损区有白色的新生组织生长，其质地、色泽与周围正常的半月板组织相似其无明显的分界，B组可见植入物周边质地、色泽与正常半月板相近，缺损区可见白色纤维瘢痕样组织，相对应的股骨及胫骨关节面略显粗糙。

Claims (10)

1.生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为基因转染试剂或者基因治疗试剂的应用；所述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室为天然来源和/或自组装技术得到，生物来源为动物、植物或微生物，所得到的生物膜是完整的或者是片段的，形态上为呈脂质双分子层结构，其组成成分主要是脂质和蛋白质，另有少量糖类通过共价键结合在脂质或蛋白质上。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，粒径从10nm到几十微米。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室的形状包括球状、囊泡状、杆状、螺旋状的单层或者多层、多室的多种形态结构。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的生物膜包括质膜、核膜、线粒体膜、内质网膜、溶酶体膜、高尔基体膜、叶绿体膜和液泡和过氧化酶体膜一种或多种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的细胞区室是指一般的细胞器；作为优选，所述的细胞区室为线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、溶酶体、内质网、细胞核、高尔基体及囊泡和微管的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用包括基因的膜内包裹、膜内包裹、表面吸附、表面交联、膜间嵌镶和膜内包裹加靶向。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基因包括从特定生物体基因组中提取得到的所需要的目的DNA/RNA片段、人工合成指定序列的DNA/RNA片段中的一种或多种。

8.一种基因转染试剂或者基因治疗试剂组合物，其特征在于：该组合物包括基因和生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室，使用量为1~99%。

9.根据权利要求8所述的基因转染试剂或者基因治疗试剂组合物，其特征在于：使用量为10~80%。

10.根据权利要求8或9所述的一种基因转染试剂或者基因治疗试剂组合物，其特征在于：所述的基因包括从特定生物体基因组中提取得到的所需要的目的DNA/RNA片段、人工合成指定序列的DNA/RNA片段中的一种或多种。