CN105505854B - 来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用 - Google Patents
来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105505854B CN105505854B CN201610022096.0A CN201610022096A CN105505854B CN 105505854 B CN105505854 B CN 105505854B CN 201610022096 A CN201610022096 A CN 201610022096A CN 105505854 B CN105505854 B CN 105505854B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- excretion body
- cell
- human urine
- derived cell
- urine derived
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000029142 excretion Effects 0.000 title claims abstract description 86
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 title claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 83
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 claims description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100027217 CD82 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100027332 Homeobox protein SIX2 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000914469 Homo sapiens CD82 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000623903 Homo sapiens Cell surface glycoprotein MUC18 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000651912 Homo sapiens Homeobox protein SIX2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 claims description 3
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001020548 Homo sapiens LIM/homeobox protein Lhx1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000598781 Homo sapiens Oxidative stress-responsive serine-rich protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000613577 Homo sapiens Paired box protein Pax-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000613717 Homo sapiens Protein odd-skipped-related 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001098464 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase OSR1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100036133 LIM/homeobox protein Lhx1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040852 Paired box protein Pax-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040551 Protein odd-skipped-related 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000040856 WT1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 25
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract description 14
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 14
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 abstract description 3
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000002391 femur head Anatomy 0.000 abstract description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 abstract 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract 1
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 abstract 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 8
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 7
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 4
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 3
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000015813 Familial avascular necrosis of femoral head Diseases 0.000 description 2
- 208000007875 Femur Head Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010603 microCT Methods 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 210000000557 podocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010017711 Gangrene Diseases 0.000 description 1
- 206010018473 Glycosuria Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000002487 multivesicular body Anatomy 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 208000009928 nephrosis Diseases 0.000 description 1
- 231100001027 nephrosis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0687—Renal stem cells; Renal progenitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F13/00—Bandages or dressings; Absorbent pads
- A61F13/02—Adhesive bandages or dressings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种人尿液来源细胞的外泌体的获取方法，是首先分离培养人尿液来源细胞并收集培养基，将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤，以去除大的细胞残片以及其它杂质；然后离心除去细胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通过离心截留上清中的外泌体，截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。本发明的外泌体可用于制备具有抗凋亡、促进血管新生、修复缺血损伤、促进细胞生长的药物，以及用于治疗皮肤缺损、皮肤溃疡、褥疮、骨缺损、骨不连、股骨头坏死、肾损伤、缺血性损伤、脊髓损伤、胰岛损伤、糖尿病及其并发症、阿尔茨海默氏症等。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学，尤其涉及一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用。
背景技术
近年的研究显示细胞移植治疗在修复各种组织器官损伤方面具有显著的效果和广阔的应用前景。但是，直接移植细胞用于人体疾病治疗还存在安全性、免疫排斥、成瘤隐患以及运输储存困难等诸多问题。近年的研究提示细胞发挥其修复组织损伤功能主要是通过旁分泌机制实现的，而旁分泌机制中细胞分泌的外泌体可能是细胞发挥功能的关键组分。
外泌体为真核细胞的多泡体和胞膜融合后分泌到胞外的双层膜包裹的结构，它含有类似其来源细胞的胞膜成分、蛋白质及各种RNA组分，通过与细胞膜发生融合或者以靶受体的方式结合，在细胞与细胞之间传递细胞因子、蛋白质或者RNA等一系列生物活性物质，从而使靶细胞发生一系列生物学效应。最近的研究证实，人体多种细胞可分泌外泌体，人体体液中(血液、尿液、唾液、乳液)都含有外泌体，体外培养细胞的条件培养液中都存在由细胞分泌的外泌体；高效液相色谱分析证实不同细胞分泌的外泌体含有不同或不同剂量的蛋白质；芯片检测技术分析证实不同细胞分泌的外泌体含有不同或不同剂量的信使RNA和小RNA。因此，不同细胞来源的外泌体所发挥的生物学功能是不相同的，各有其独特性。
从尿液中分离培养细胞，具有来源方便、可以大量获取、取材无创等优势。目前通过培养尿液来源细胞获得其外泌体并用于修复组织损伤及治疗疾病的方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的，就是为了提供一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法，首先分离培养人尿液来源细胞并收集培养基，将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤，以去除大的细胞残片以及其它杂质；然后离心除去细胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通过离心截留上清中的外泌体，截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。
将外泌体浓缩液转移至蔗糖/重水密度垫上离心分离，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤细心管中离心分离；PBS洗涤3次，得到纯化的外泌体悬液。
所述离心除去细胞器是4℃、10000g离心30分钟。
所述离心截留上清中的外泌体是3500g离心15分钟。
所述蔗糖/重水密度垫的密度为1.210g/cm3，其中的蔗糖的重量百分含量为30％；所述转移至蔗糖/重水密度垫上离心分离是4℃、100800g离心210分钟；所述转移至可截留100KD分子的超滤细心管中离心分离是4℃、3500g离心15分钟。
所述人尿液来源细胞包括直接从尿液中分离的细胞；从尿液中分离并在体外培养的细胞；从尿液中分离并在体外培养且经过基因改造或药物处理的细胞；以及通过药物刺激引发泌尿系统细胞激活、游离至尿液中而获得的细胞。
所述外泌体的标志物为CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82以及与人尿液来源细胞特性相应的标志物。
所述与人尿液来源细胞特性相应的标志物包括CD146、CD34、CD24、CD133、SIX2、PAX2、WT1、LHX1或OSR1。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于制备具有抗凋亡、促进血管新生、修复缺血损伤、促进细胞生长药物。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于治疗皮肤缺损、皮肤溃疡、褥疮、骨缺损、骨不连、股骨头坏死、肾损伤、缺血性损伤、脊髓损伤、胰岛损伤、糖尿病及其并发症、阿尔茨海默氏症。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于制备成含有来源于人尿液细胞的外泌体的复合物，将外泌体通过锚定或注入载体表面或内部，形成形状固定、可供植入的复合物，复合物植入后，其中的外泌体缓释或可控释放；所述复合物包括各种假体或支架。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于制备成含有来源于人尿液细胞的外泌体的敷料，将外泌体通过锚定或注入载体表面或内部，形成形状固定的敷料，敷料与组织粘附后，其中的外泌体可缓释、可控释放至组织内。
来源于人尿液细胞的外泌体可用于制备成含有来源于人尿液细胞的外泌体的细胞培养添加剂，将外泌体悬液制备为细胞培养添加剂，用于细胞状态的维持或诱导分化。
附图说明
图1是外泌体的TEM照片。
图2是可控电阻脉冲传感技术测定的外泌体粒度分布。
图3是Western Blot检测到的外泌体表面标志物。
图4是复合人尿液来源细胞的外泌体的材料植入组14天后皮肤各部分组织的修复情况。
图5是对照组14天后皮肤各部分组织的修复情况。
图6是假手术组14天后皮肤各部分组织的修复情况。
图7、图8是各组大鼠尿量和UACR比较，与Normal组比较，*P<0.05；与Diabetes比较，#P<0.05。
图9-图15是流式细胞术检测HPDC凋亡结果。
图16是HPDC在高糖诱导72小时后Caspase-3的蛋白表达水平。
具体实施方式
申请人已经建立从尿液中分离、扩增细胞的方法，并收集人尿液来源细胞(Urine-derived Cells,UCs)的技术体系。本发明人尿液来源细胞的外泌体的获取方法，是使用不同孔径的膜结构、通过离心截留UCs培养基中的外泌体。培养基首先通过0.22微米孔径滤膜过滤，以去除大的细胞残片、以及其它可能存在的杂质；然后，4℃10000g离心30分钟，除去细胞器，留取上清；使用可截留100KD分子量的膜、通过离心(3500g，15min)截留上清中的外泌体。截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。将浓缩液转移至6ml 30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm3)，4℃100800g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤细心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到外泌体悬液，分装保存至-80℃环境中。
外泌体可由透射电子显微镜观察(参见图1)，其粒度分布由可控电阻脉冲传感技术测定(参见图2)，直径范围50-150nm。其在悬液中可聚集为二聚体、乃至多聚体，因而粒度分布检测结果中亦包含200-300nm数据。其膜结构表面含有CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82等标志物(参见图3)，以及与人尿液来源细胞特性相应的标志物(可包含但不限于CD146，CD34，CD24，CD133，SIX2，PAX2，WT1，LHX1，OSR1)。其膜结构内包含蛋白、肽段、核酸等具有生物活性的分子。其膜结构内可以包含分子量大于100KD的分子及复合物。
外泌体可以制备成悬液，通过静脉注射，或直接在组织损伤部位注射。
外泌体可以与载体结合，制备成为缓释释放外泌体的复合物，植入组织损伤部位。
被以各种方式植入的外泌体，通过局部释放生物活性分子，或被损伤部位细胞内吞，达到传递信号、促进修复的作用。
被以各种方式植入的外泌体，可以用于治疗以下疾病或损伤——创伤、缺血性损伤、退行性病变，包括但不限于：皮肤缺损，经久不愈的皮肤溃疡，褥疮，骨缺损，骨不连，股骨头坏死，肾损伤(包括肾缺血，肾衰，等)，缺血性损伤(包括心肌缺血，下肢缺血，坏疽，等)，脊髓损伤，胰岛损伤，糖尿病及其并发症(包括糖尿病肾病，糖尿病足，等)，阿尔茨海默氏症，等。
实施例1
复合人尿液来源细胞的外泌体的材料修复皮肤缺损
建立新西兰大白兔皮肤缺损模型，随机将其分为对照组和治疗组。治疗组采用人尿液来源细胞的外泌体局部注射移植皮肤缺损处，4、8、12、14天分别从大体观察、组织切片、免疫组织化学等进行研究，分析人尿液来源细胞的外泌体对新西兰大白兔皮肤缺损处伤口愈合的作用。结果发现治疗组创面愈合时间比对照组短，两组新西兰大白兔伤口愈合时间分别为16天和20天，结果显示局部移植人尿液来源细胞的外泌体的新西兰大白兔创面面积在4、8、12、14天明显小于对照组的(p<0.05)。组织切片结果亦显示复合人尿液来源细胞的外泌体的材料植入14天后对皮肤各部分组织的修复情况明显好于对照组(参见图4、图5、图6)。结果证实人尿液来源细胞的外泌体能促进新西兰大白兔皮肤全层缺损后伤口的愈合。
实施例2
复合人尿液来源细胞的外泌体的组织工程骨修复大段骨缺损
制作30只SD大鼠5mm股骨缺损模型，并随机分为A、B组：A组，单纯植入β-TCP；B组，植入复合有人尿液来源细胞的外泌体的β-TCP。术后4、8、12周分批处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、X线、micro-CT、组织学染色分析及免疫组织化学染色检测骨折愈合情况，比较各组修复骨缺损的效果。结果显示复合人尿液来源细胞的外泌体材料组的骨缺损能完全愈合，能明显促进大段骨缺损的修复。
实施例3
复合人尿液来源细胞的外泌体的水凝胶修复软骨缺损
制作30只新西兰大白兔后腿股骨髁关节面缺损模型，缺损直径为4.5mm，深度为3mm，并随机分为A、B组：A组，单纯植入水凝胶；B组，植入复合有人尿液来源细胞的外泌体的水凝胶。术后4、12、18周分批处死动物，行一般情况、缺损区大体观察、X线、micro-CT、组织学染色分析及免疫组织化学染色检测骨折愈合情况，比较各组修复骨缺损的效果。结果显示复合人尿液来源细胞的外泌体材料组的软骨缺损能完全愈合，能明显促进软骨缺损的修复。
实施例4
人尿液来源细胞的外泌体治疗股骨头缺血坏死
建立30只新西兰大白兔激素性股骨头缺血性坏死模型，并随机分为A、B、C三组，A组为对照组无任何治疗措施，B组行单纯髓芯减压组，C组行单纯髓芯减压联合植入人尿液来源细胞的外泌体组。术后4周、8周和12周对股骨头行组织学检查。结果：组织形态学检测发现术后8周和12周C组坏死修复区新骨面积比和新生血管数量显著高于两个对照组，差异有统计学意义(P<0.05，p＝0.034)。结论：人尿液来源细胞的外泌体可促进股骨头缺血性坏死的骨修复，对股骨头缺血性坏死有治疗作用。
实施例5
复合人尿液来源细胞的外泌体的神经组织工程修复脊髓损伤
将1×108个人尿液来源细胞的外泌体种植入30ul水凝胶，制成外泌体-水凝胶复合物。制作30只SD大鼠脑脊髓缺损模型。并随机分为A、B组：A组，单纯植入水凝胶；B组，植入复合有人尿液来源细胞的外泌体-水凝胶复合物。2、8、24周后进行组织切片，HE染色，免疫荧光检测脊髓修复情况。结果显示植入外泌体-水凝胶复合物的大鼠脊髓修复情况明显好于对照组。
实施例6
人尿液来源细胞的外泌体治疗糖尿病肾病
通过注射链脲佐菌素(STZ)制做制作30只SD大鼠糖尿病肾病模型，随机分为糖尿病组和外泌体治疗组。对照组为健康大鼠。外泌体治疗组采用含10-200ug人尿液来源细胞的外泌体尾静脉注射，糖尿病组注射等体积生理盐水。每周注射一次。4周后，治疗组大鼠的尿量、尿微量白蛋白/肌酐(urinary microalbumin-to-creatinine ratio，UACR)明显好于对照组(参见图7、图8)。12周后处死大鼠，PAS染色进行肾组织病理学检查，明显好于对照组；组织切片现实，治疗组大鼠肾脏基质增生显著弱于对照组；TUNEL检测显示治疗组大鼠肾脏内细胞凋亡明显少于对照组。结果证实人尿液来源细胞的外泌体能够治疗糖尿病肾病。
实施例7
人尿液来源细胞的外泌体抵抗高糖诱导足细胞损伤
培养人足细胞(HPDC)，并使用高糖培养基(HG)诱导其产生损伤。将细胞随机分成正常葡萄糖对照组(NG组)，甘露醇高渗对照组(MA组)，高糖组(HG)，高糖及不同浓度尿液来源细胞外泌体(HG+Exo 5ug/ml，HG+Exo 10ug/ml，HG+Exo 50ug/ml)处理组。对照组加入等体积生理盐水。诱导一定时间后，使用流式细胞术及Western Blot检测细胞凋亡情况及凋亡信号通路相关蛋白，发现处理组凋亡水平明显弱于对照组(参见图9-图16)。结果显示人尿液来源细胞的外泌体可以减轻足细胞在高糖环境中产生的凋亡，降低其早期凋亡率，抵抗高糖诱导足细胞损伤。
Claims (4)
1.来源于人尿液细胞的外泌体在制备治疗股骨头缺血坏死促进血管新生药物中的应用，
来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法为：首先分离培养人尿液来源细胞并收集培养基，将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤，以去除大的细胞残片以及其它杂质；然后离心除去细胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通过离心截留上清中的外泌体，截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将外泌体浓缩液转移至蔗糖/重水密度垫上离心分离，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤离心管中离心分离；PBS洗涤3次，得到纯化的外泌体悬液。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述人尿液来源细胞包括直接从尿液中分离的细胞；从尿液中分离并在体外培养的细胞。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述外泌体的标志物为CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82以及与人尿液来源细胞特性相应的标志物；
所述与人尿液来源细胞特性相应的标志物包括CD146、CD34、CD24、CD133、SIX2、PAX2、WT1、LHX1或OSR1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610022096.0A CN105505854B (zh) | 2016-01-14 | 2016-01-14 | 来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610022096.0A CN105505854B (zh) | 2016-01-14 | 2016-01-14 | 来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105505854A CN105505854A (zh) | 2016-04-20 |
| CN105505854B true CN105505854B (zh) | 2019-07-12 |
Family
ID=55714152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610022096.0A Active CN105505854B (zh) | 2016-01-14 | 2016-01-14 | 来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105505854B (zh) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6996502B2 (ja) * | 2016-05-19 | 2022-01-17 | 凸版印刷株式会社 | 標的分子の検出方法 |
| CN106124282B (zh) | 2016-07-26 | 2019-07-16 | 广州海力特生物科技有限公司 | 一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法 |
| CN106222126A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-12-14 | 郑州点石生物技术有限公司 | 人体体液中外泌体的提取方法 |
| US20190290689A1 (en) * | 2016-08-17 | 2019-09-26 | Orthogen Ag | Anti-ageing pharmaceutical preparation |
| CN106929467B (zh) * | 2017-02-16 | 2021-05-18 | 上海交通大学 | 一种分离高纯度尿液外泌体的方法和试剂盒 |
| CN108148809A (zh) * | 2017-09-18 | 2018-06-12 | 兰州大学 | 一种从肿瘤细胞上清液中分离外泌体的方法 |
| CN109576206A (zh) * | 2017-09-29 | 2019-04-05 | 天津大学 | 一种基于联合法分离外泌体的方法 |
| CN108570443A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-09-25 | 皓昇莱生物制药有限公司 | 一种用于培养尿液来源细胞的培养基 |
| CN108570446A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-09-25 | 皓昇莱生物制药有限公司 | 一种尿液来源细胞的培养方法 |
| CN108715830B (zh) * | 2018-05-04 | 2019-08-06 | 中南大学湘雅医院 | 尿源干细胞外泌体的提取方法及其应用 |
| CN109324186B (zh) * | 2018-11-08 | 2019-05-10 | 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 | 外泌体蛋白cd82、gpc1联合ca19-9用于胰腺癌早期诊断及疗效监控 |
| CN111363679B (zh) * | 2018-12-26 | 2023-02-28 | 浙江大学 | 一种用于刺激细胞大量分泌外泌体的方法 |
| CN109568665B (zh) * | 2018-12-28 | 2021-12-10 | 中国医科大学附属第一医院 | 负载脂肪干细胞外泌体的温敏型可注射水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN110755684A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-02-07 | 东华大学 | 负载外泌体和生长因子的微球/纳米纱复合支架及其制备方法 |
| CN112557670A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-26 | 东南大学 | 一种基于尿液外泌体pla2r检测imn的方法、试剂盒及其应用 |
| CN113046316B (zh) * | 2021-04-07 | 2022-11-22 | 中南大学湘雅医院 | M2型骨髓巨噬细胞外泌体及其应用、脊髓损伤治疗制剂 |
| CN114504595B (zh) * | 2021-12-28 | 2023-03-28 | 广东明珠生物技术有限公司 | 尿液中的cd24阳性表达细胞及其制备方法和应用 |
| CN114426950B (zh) * | 2022-01-25 | 2023-08-04 | 北京大学口腔医学院 | 一种高成骨成血管的血清外泌体及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101890050A (zh) * | 2010-07-14 | 2010-11-24 | 江苏大学 | 脐带间质干细胞来源膜性囊泡及其应用 |
| CN102171574A (zh) * | 2008-10-06 | 2011-08-31 | 莫尔豪斯医学院 | 尿液中hiv相关蛋白的检测 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012087241A1 (en) * | 2010-12-20 | 2012-06-28 | Agency For Science, Technology And Research | Method of purifying exosomes |
| CN104894062A (zh) * | 2015-05-19 | 2015-09-09 | 暨南大学 | 一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用 |
-
2016
- 2016-01-14 CN CN201610022096.0A patent/CN105505854B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102171574A (zh) * | 2008-10-06 | 2011-08-31 | 莫尔豪斯医学院 | 尿液中hiv相关蛋白的检测 |
| CN101890050A (zh) * | 2010-07-14 | 2010-11-24 | 江苏大学 | 脐带间质干细胞来源膜性囊泡及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Molecular screening of cancer-derived exosomes by surface plasmon resonance spectroscopy;Luigino Grasso et al.;《Anal Bioanal Chem》;20150430;第407卷;第5425-5432页 |
| 人尿源干细胞来源的外泌体对1型糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其机制研究;姜珍珍;《苏州大学硕士学位论文》;20151203;第9-10，20-22页 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105505854A (zh) | 2016-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105505854B (zh) | 来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用 | |
| CN109666629A (zh) | 人多能干细胞来源的外泌体、基于该外泌体的制剂及用途 | |
| DE69727817T2 (de) | Nierenprothese und ihre Verwendung zum Behandeln einer Nierenkrankheit | |
| CN105267240B (zh) | 间充质干细胞来源的外泌体的用途 | |
| WO2014181886A1 (ja) | 粒子状脱細胞化組織を含むハイブリッドゲル | |
| KR101889697B1 (ko) | 근섬유 단편을 사용한 근조직 재생 | |
| CN107224617B (zh) | 一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶及其制备方法 | |
| JP2002511284A (ja) | 三次元組織の創造 | |
| CN103079577A (zh) | 伤口修复剂组合物的制备工艺、管子及装置 | |
| Zhang et al. | Injectable composite hydrogel promotes osteogenesis and angiogenesis in spinal fusion by optimizing the bone marrow mesenchymal stem cell microenvironment and exosomes secretion | |
| US9889233B2 (en) | Method of producing native components, such as growth factors or extracellular matrix proteins, through cell culturing of tissue samples for tissue repair | |
| Wang et al. | Improved neural regeneration with olfactory ensheathing cell inoculated PLGA scaffolds in spinal cord injury adult rats | |
| CN107735113A (zh) | 用于治疗缺血性疾病或损伤的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质及其可注射制剂 | |
| WO2016140716A1 (en) | Injectable microtissue systems, devices, and methods | |
| Szarek et al. | Lizard tail spinal cord: a new experimental model of spinal cord injury without limb paralysis | |
| KR102104120B1 (ko) | 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 기반 3d 바이오프린팅 조직체 및 이의 이용 | |
| CN104056304B (zh) | 负载生长因子壳聚糖微球的dbm支架修复关节软骨材料 | |
| CN109010915A (zh) | 有序胶原支架及其在制备修复脊髓损伤的产品中的应用 | |
| RU2574017C1 (ru) | Средство для лечения ожогов и ран на основе цитокинов и факторов роста, секретируемых мезенхимными клетками человека, способ получения средства и способ лечения ожогов и ран | |
| EP1706157B1 (de) | Verfahren zur herstellung von bandscheibenzelltransplantaten und deren anwendung als transplantationsmaterial | |
| CN103007350A (zh) | 改性大鼠脱细胞脊髓支架材料及制备方法 | |
| CN105412986A (zh) | 小肠黏膜下层载药补片及其制备方法和应用 | |
| KR101617673B1 (ko) | 성체줄기세포 및 엘라스틴 유사 폴리펩타이드를 포함하는 상처 치료 촉진용 약학적 조성물 | |
| CN114832156B (zh) | 一种新型医美整形填充物改性左旋聚乳酸凝胶 | |
| US11788058B2 (en) | Protein-modified PLGA microsphere and tissue-engineered nerve constructed therewith |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220421 Address after: 201306 building 10, No. 860, Xinyang Road, Lingang New District, China (Shanghai) pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai Patentee after: Shanghai Aikesong Biotechnology Co.,Ltd. Patentee after: Wang Yang Address before: 200233 No. 600, Xuhui District, Shanghai, Yishan Road Patentee before: SHANGHAI SIXTH PEOPLE'S Hospital Patentee before: Wang Yang |
|
| TR01 | Transfer of patent right |