JP6996502B2 - 標的分子の検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、標的分子の検出方法及び標的分子検出キットに関する。
本願は、２０１６年５月１９日に日本に出願された特願２０１６－１００２３１号、および、２０１６年１２月１３日に日本に出願された特願２０１６－２４１０２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
生体試料中の標的分子を定量的に検出することにより、疾患の早期発見や投薬の効果予測が行われている。従来、タンパク質の定量は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等により行われ、核酸の定量はリアルタイムＰＣＲ法等により行われてきた。
近年、疾患をより早期に発見する等の目的で、標的分子をより精度よく検出するニーズが高まっている。標的分子を精度よく検出する手法として、例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献１等には、多数の微小区画内で酵素反応を行う技術が記載されている。
これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。
デジタル計測では、試料溶液を極めて多数の微小溶液に分割する。そして、各微小溶液からの信号を２値化し、標的分子が存在するか否かのみを判別して、標的分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
デジタル計測においては、標的分子に対するモノクローナル抗体等の特異的結合物質を用いて標的分子の存在を検出する場合がある。しかしながら、特異的結合物質を用いた標的分子の検出では、特異的結合物質が、標的分子と類似構造を有するタンパク質上の相同エピトープの誤認識、非特異的な認識等の誤認識を生じ、標的物質の検出精度が低下してしまう場合がある。
この問題を解決するために、例えば特許文献３には、ターゲット分子と、前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消光物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、前記複合体と、を反応させて、前記蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出手順と、蛍光波長の異なる二以上の蛍光の検出信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理する解析手順と、を含むターゲット分子の検出方法が記載されている。
日本国特許第５５５１７９８号公報 日本国特表２０１４－５０３８３１号公報 国際公開第２０１６／０４７０６８号パンフレット
Kim S. H., et al., Large-scale femtoliter droplet array fordigital counting of single biomolecules., Lab on a Chip, 12 (23), 4986-4991, 2012.
しかしながら、特許文献３に記載された方法には改良の余地がある。例えば、特許文献３に記載された方法では、酵素が基質を切断し、蛍光を検出する過程にシグナル増幅反応が含まれない。また、抗体分子に標識することができる酵素分子の数は、分子の大きさにもよるが、抗体１分子あたり数個であることが多い。このため、特許文献３に記載された方法で蛍光を検出するためには、少なくとも数十分間の反応時間が必要である。
そこで、本発明は、標的分子を迅速に、かつ、精度よく検出できる技術を提供することを目的とする。
また、本発明の他の目的は、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出できる技術を提供することを目的とする。
本発明の第一態様に係る標的分子の検出方法は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させる標識物質を有する複数の核酸断片で標識され、かつ、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質と、複数種類の第一の標的分子と、を準備する工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、前記複数種類の前記第一の標的分子を前記複数種類の前記特異的結合物質に応じた複数の前記蛍光シグナルにより判断する工程と、を備える。
前記特異的結合物質の１分子に対して前記複数の核酸断片が数個～数十個結合してもよい。
前記特異的結合物質が抗体であってもよい。
前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つを有する第二の標的分子を準備し、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つの検出を介して前記第二の標的分子を検出してもよい。
前記第二の標的分子がエクソソームであってもよい。
前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つが前記エクソソームの膜表面上に存在していてもよい。
前記複数種類の前記第一の標的分子が疾患マーカータンパク質であってもよい。
複数のウェルを有する基板を備えた検出デバイスを準備し、前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程の後に、前記複数のウェルにおいて１つのウェルに１つの前記第二の標的分子を導入する工程をさらに備えていてもよい。
同時に前記複数種類の前記第一の標的分子を検出してもよい。
本発明の第二態様に係る標的分子の検出方法は、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質のうち２種以上が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断する工程と、を備える。
前記標的分子の検出が１分子単位で行われてもよい。
前記複数種類の特異的結合物質の少なくとも１種が核酸断片で標識されていてもよい。
前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程が、シグナル増幅反応を含んでいてもよい。
同時に複数種類の標的分子を検出してもよい。
本発明の第二態様に係る標的分子検出キットは、標的分子に対する特異的に結合し、認識するエピトープが互いに異なり、互いに識別可能に標識された複数種類の特異的結合物質を備える。
前記複数種類の特異的結合物質が、互いに異なる核酸断片で標識されていてもよい。
本発明の上記態様によれば、標的分子を迅速に、かつ、精度よく検出できる技術を提供することができる。
また、本発明の上記態様によれば、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出できる技術を提供することができる。
図１Ａは、微小区画内で標的分子を検出する従来の方法を説明する模式断面図である。 図１Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する従来の方法を説明する模式断面図である。 デジタル計測により標的分子を検出する様子を説明する模式断面図である。 図３Ａは、微小区画内で標的分子を検出する方法の第１実施形態を説明する模式断面図である。 図３Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する方法の第１実施形態を説明する模式断面図である。 図４Ａは、微小区画内で標的分子を検出する方法の第２実施形態を説明する模式断面図である。 図４Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する方法の第２実施形態を説明する模式断面図である。 図５Ａは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｂは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｃは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｄは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｅは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｆは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｇは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｈは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 実施例２の結果を示すグラフである。 比較例２の結果を示すグラフである。 実施例４に係るデジタルインベーダーによる培養上清中におけるエクソソーム検出結果である。 実施例４に係るデジタルインベーダーによる血清中におけるエクソソーム検出結果である。
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［従来の検出方法］
まず、従来の標的分子の検出方法の代表的な例について説明する。図１Ａ及び図１Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する従来の方法を説明する模式断面図である。図１Ａでは、標的分子１００と、標的分子捕捉粒子１１０と、標的分子１００に対する特異的結合物質１２０との複合体１３０が、基板２１０の表面に形成されたウェル２４０に収容されている。標的分子捕捉粒子１１０には、特異的結合物質１１１が固定化されている。また、特異的結合物質１２０は標識（標識分子）１２１を有している。図１Ａにおいて、標的分子捕捉粒子１１０に固定化された特異的結合物質１１１及び特異的結合物質１２０は、標的分子１００のエピトープを正しく認識している。
これに対し、図１Ｂでは、特異的結合物質１１１又は特異的結合物質１２０の少なくとも一方が、標的分子ではない分子１４０を誤認識し、複合体１５０を形成している。
ここで、標識１２１の存在を指標として標的分子１００が存在すると判断した場合、特異的結合物質１２０は標識１２１を有しているため、標的分子１００が存在すると判断される。
このように、従来の検出方法では、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じると、標的分子を正確に検出することができない場合がある。
特異的結合物質による標的分子の誤認識の原因としては、標的分子と類似構造を有するタンパク質又はペプチド上の相同エピトープの存在が挙げられ、一定の頻度で起こる。従来の検出方法であるＥＬＩＳＡでは、ごく一部の特異的結合物質が誤認識しても測定誤差はわずかであるが、デジタル計測においては標的分子の低濃度領域を正確に測定する必要があるため、抗体の誤認識は測定誤差に影響を及ぼす。
［標的分子の検出方法］
本発明の１実施形態は、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる工程と、複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、複数種類の前記特異的結合物質のうち２種以上が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断する工程と、を備える、標的分子の検出方法を提供する。以下、本実施形態に係る検出方法について説明する。
（標的分子に複数種類の特異的結合物質を結合させる工程）
まず、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる。この工程は、例えばサンプルチューブ内で標的分子と特異的結合物質を接触させることにより行うことができる。ここで、特異的結合物質の種類の数は２以上であり、３以上であってもよく、４以上であってもよく、５以上であってもよい。
《標的分子》
標的分子としては特に制限されず、任意の分子を検出することができる。具体的には、例えば、生体試料中の疾患マーカータンパク質、環境試料中の特定化合物等が挙げられる。生体試料としては特に制限されず、血清、血漿、尿等が挙げられる。また、環境試料としては、例えば、河川の水、工場排水等が挙げられる。
《特異的結合物質》
特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に標的分子又は標的分子の断片を抗原として免疫反応させることによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
アプタマーとは、標的分子に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的分子に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的分子に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
（複数種類の特異的結合物質をそれぞれ検出する工程）
続いて、複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する。図２は、一例として、検出デバイス２００を用いたデジタル計測により標的分子を検出する様子を説明する模式断面図である。
図２に示すように、検出デバイス２００は、基板２１０と、流路２２０と、蓋体２３０とを備えており、基板２１０の表面には複数のウェル２４０が形成されている。
まず、標的分子をウェル２４０に収容する。標的分子をウェル２４０に収容する方法は特に制限されず、例えば、標的分子に対する特異的結合物質を固定化した標的分子捕捉粒子を上記の標的分子に接触させることにより、標的分子捕捉粒子上に標的分子を捕捉し、続いて、標的分子捕捉粒子を検出デバイス２００の流路２２０内に導入してウェル２４０に収容することが挙げられる。
ここで、標的分子捕捉粒子、標的分子、上述した複数種類の特異的結合物質は、いずれの順序で接触させてもよい。例えば、標的分子捕捉粒子と標的分子と複数種類の特異的結合物質とを同時に接触させてもよい。あるいは、標的分子捕捉粒子と標的分子とを接触させた後に、複数種類の特異的結合物質を接触させてもよい。あるいは、標的分子と複数種類の特異的結合物質とを接触させた後に、標的分子捕捉粒子を更に接触させてもよい。
ここで、標的分子捕捉粒子１個に標的分子が０分子又は１分子捕捉される条件で標的分子捕捉粒子と標的分子とを接触させることが好ましい。更に、１つのウェル２４０には、標的分子捕捉粒子が０個又は１個収容されるように構成されることが好ましい。これによりデジタル計測が可能となる。すなわち、本実施形態に係る検出方法において、標的分子の検出は１分子単位で行われてもよい。
《標的分子捕捉粒子》
標的分子捕捉粒子は、標的分子を捕捉することができる粒子である。例えば、上述した、標的分子に対する特異的結合物質を固定化した標的分子捕捉粒子が挙げられるがこれに限定されない。
粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子、ガラス粒子等を利用することができる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理を施してある粒子が好ましい。
特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法としては、特に制限されず、物理吸着による方法、化学結合による方法、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法、プロテインＧ又はプロテインＡと抗体との結合を利用する方法等が挙げられる。中でも、安定性が高いことから化学結合が好ましい。
物理吸着による方法としては、疎水的相互作用、静電的相互作用により、特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法が挙げられる。化学結合による方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。例えば、粒子の表面が水酸基を有する場合、特異的結合物質が有するカルボキシル基に架橋剤を反応させて活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることにより、特異的結合物質を粒子表面に固定化させることができる。また、特異的結合物質による標的分子の認識能を阻害しないよう、特異的結合物質と粒子表面との間にスペーサーを設けることが好ましい。
（複数種類の特異的結合物質を結合させる工程の一例）
図２では、ウェル２４０が０個又は１個の標的分子捕捉粒子１１０又は１１２を収容している。また、流路２２０は封止液で満たされており、各ウェル２４０に収容された溶液は液滴（独立した反応室）を形成している。図１Ａおよび図１Ｂにおいて、標的分子捕捉粒子１１０は標的分子を１分子捕捉しており、標的分子捕捉粒子１１２は標的分子を捕捉していない。また、標的分子には認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質が結合している。
続いて、上記の複数種類の特異的結合物質をそれぞれ検出する。複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する方法としては特に制限されず、例えば、複数種類の特異的結合物質が、互いに識別可能に標識されており、当該標識をそれぞれ検出することにより、標的分子に結合した複数種類の特異的結合物質をそれぞれ検出することができる。
特異的結合物質は、直接標識されていてもよく、間接的に標識されていてもよい。例えば、特異的結合物質及び標識分子を固定化した粒子を、標識された特異的結合物質として使用してもよい。ここで、粒子としては、上述したものと同様の粒子を用いることができる。
互いに識別可能な標識分子としては、例えば、互いに異なる核酸断片、互いに異なる酵素、互いに異なる蛍光色素等が挙げられる。これらの標識は組み合わせて用いられてもよい。
標識分子が互いに異なる核酸断片であった場合には、核酸断片の塩基配列の相違を利用して特異的結合物質を検出することができる。例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、インベーダー法等を利用して、核酸断片の塩基配列の相違をシグナルに変換し、特異的結合物質を検出することができる。特異的結合物質を核酸断片で標識する方法としては、特に制限されず、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法、架橋剤を使用する方法等が挙げられる。
シグナルとしては特に制限されず、例えば、蛍光、発光、発色、ｐＨの変化、電位変化等を利用することができる。
また、標識分子が互いに異なる酵素であった場合には、それぞれの酵素に対応する蛍光基質等を反応させて、特異的結合物質を検出することができる。また、標識分子が互いに異なる蛍光色素であった場合には、１分子蛍光検出等により、特異的結合物質を直接検出することができる。
特異的結合物質を検出する工程が、シグナル増幅反応を含む場合、検出感度を向上させることができ、検出に要する時間を短縮することができる。シグナル増幅反応としては、例えば酵素反応が挙げられる。
標的分子１分子に複数種類の特異的結合物質を結合させ、複数種類の特異的結合物質をそれぞれ検出し、２種以上、好ましくは全ての種類の特異的結合物質が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断すれば、標的分子を精度よく検出することができる。これは、複数の当該特異的結合物質のうち２種以上が誤認識する確率が低いためである。
複数種類の特異的結合物質の全てが核酸断片で標識されていてもよい。また、複数種類の特異的結合物質を、インベーダー法を利用して検出する構成としてもよい。この場合、１種類の酵素（クリベース）を用いて、全ての核酸断片の塩基配列の相違を検出することができる。このような方法によれば、使用する酵素が１種類でよいことから、反応系を、使用する酵素に最適な条件に調整することができる。
また、インベーダー法はシグナル増幅反応を含むことから、複数種類の特異的結合物質を検出するのに要する時間を数分以内に短縮することができる。
また、例えば抗体分子に核酸断片を標識する場合、核酸断片は比較的分子が小さいことから、抗体１分子あたり例えば数個～数十個の核酸断片を標識することができる。抗体１分子あたりの核酸断片の数を増加させることにより、複数種類の特異的結合物質を検出するのに要する時間を更に短縮することができる。また、抗体分子に核酸断片を標識する場合、抗体１分子あたり数個～数百個の核酸断片を標識してもよい。
本実施形態によれば、例えば、核酸検出反応(例えばインベーダー反応)に係る時間が１分～３０分程度であり、迅速な核酸検出が可能となる。
これに対し、例えば特許文献３に記載された方法では、基質特異性が互いに異なる２種類の酵素を使用する。このため、これらの酵素の最適な反応条件が異なっている場合、反応系を、使用する酵素の全てに最適な条件に調整することは困難である。
また、特許文献３に記載された方法では、酵素が基質を切断し、蛍光を検出する過程にシグナル増幅反応が含まれない。また、抗体分子に標識することができる酵素分子の数は、分子の大きさにもよるが、抗体１分子あたり数個であることが多い。このため、特許文献３に記載された方法で蛍光を検出するためには、少なくとも数十分間の反応時間が必要である。
図２では、各ウェル２４０が０個又は１個の標的分子捕捉粒子を収容している。そして、標的分子を捕捉した標的分子捕捉粒子１１０を収容したウェルからは、複数種類の特異的結合物質に由来するシグナル２５０が検出されている。シグナル２５０は、複数種類の前記特異的結合物質の全ての種類が検出されていることを示す。
これに対し、標的分子捕捉粒子を収容していないウェル２４０、又は標的分子を捕捉していない標的分子捕捉粒子１１２を収容したウェル２４０からはシグナル２５０は検出されない。したがって、シグナル２５０が検出されたウェル２４０の数を数えることにより、標的分子の濃度を正確に測定することができる。
ここで、検出デバイス２００の構造についてより詳細に説明する。ウェル２４０は基板２１０の表面に整列配置されており、例えば、直径が５μｍ、深さが５μｍの有底円柱形状の空間であってもよい。
例えば、ウェル２４０は、基板２１０表面の縦横５ｍｍの矩形の領域に、当該領域の各辺に沿って格子状に配列されていてもよい。各ウェル２４０間の隙間の大きさは、各ウェル２４０のシグナルを独立して検出できる分解能に応じて設定すればよい。
ウェル２４０の容積は適宜設定することができるが、特異的結合物質を検出する工程がシグナル増幅反応を伴う場合には、ウェル２４０の容積が小さい方がシグナル検出可能となるまでの反応時間を短縮することができる。例えば、ウェル２４０の容積は、１００ピコリットル又は１００ピコリットル以下であってもよい。
例えば、十分な強度のシグナルを発生させるのに要する時間を短縮する目的においては、標的分子が１ウェルに１つ以下となる液量に基づいてウェル２４０の容積を設定してもよい。
この際、１つのウェル２４０の大きさが標的分子の体積の３倍以下となるように検出デバイス２００を構成してもよい。
また、標的分子が１つのウェルに１つ以下となるように導入されるように検出デバイス２００を製造する以外にも、標的分子（第一の標的分子）を有する他の標的分子（第二の標的分子）（例えば、後述する第一の標的分子としてのタンパク質を有する第二の標的分子としてのエクソソーム等）を1つのウェルに１つ以下となるように導入されるように検出デバイス２００を製造してもよい。また、標的分子が1つのウェルに１つ以下となるように検出デバイスを製造する以外に、標的分子の濃度を希釈することによって標的分子が１つのウェルに１つ以下となるように標的分子をウェルに導入してもよい。
複数のウェル２４０を有する基板２１０を備えた検出デバイス２００を準備し、複数種類の前記特異的結合物質を複数の第一の標的分子に結合させる工程の後に、複数のウェルにおいて１つのウェルに１つの第二の標的分子（第一の標的分子を有する第二の標的分子）を導入する工程をさらに備えていてもよい。
この際、ウェル２４０の容積は、１００ピコリットル又はそれ１００ピコリットル以下であってもよい。
また、ウェル２４０の大きさは、選択される第二の標的分子に応じて、１つの第二の標的分子が導入されるように構成してもよく、例えば、１つのウェル２４０の大きさが第二の標的分子の体積の３倍以下となるように検出デバイス２００を構成してもよい。
例えば、１つのデバイスの各ウェルに第一の標的分子、または、第一の標的分子を有する第二の標的分子が小分けに捕捉されるような（例えば、１つのウェルに１つの第一の標的分子が導入されるような、または、１つのウェルに１つの第二の標的分子が導入されるような）構成を備えることによって、蛍光標識された核酸が多数存在しても、標識された核酸同士の蛍光シグナルが干渉せずに、精度よく標的分子（第一の標的分子、第二の標的分子）の検出が可能となる。
基板２１０は、例えば樹脂を用いて形成される。樹脂の種類は特に限定されないが、試薬及び液滴を形成する際の封止液に対し耐性のある樹脂を用いることが好ましい。また、シグナルを蛍光観察する場合には、自家蛍光の少ない樹脂を選ぶことが好ましい。例えば、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、フッ素樹脂等を選ぶことができる。
（第１実施形態）
第１実施形態に係る標的分子の検出方法について説明する。図３Ａ及びＢは、微小区画内で標的分子を検出する本実施形態に係る方法を説明する模式断面図である。図３Ａでは、標的分子１００と、標的分子捕捉粒子１１０と、標的分子１００に対する特異的結合物質１２０と、特異的結合物質１２０とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１２２との複合体１６０が、基板２１０の表面に形成されたウェル２４０に収容されている。特異的結合物質１２０は標識１２１を有している。特異的結合物質１２２は標識１２３を有している。図３Ａにおいて、標的分子捕捉粒子１１０に固定化された特異的結合物質１１１、特異的結合物質１２０及び特異的結合物質１２２は、標的分子１００のエピトープを正しく認識している。標識１２１及び標識１２３は互いに識別可能である。例えば、標識１２１及び標識１２３は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させることができる。
これに対し、図３Ｂでは、特異的結合物質１１１又は特異的結合物質１２０の少なくとも一方が、標的分子ではない分子１４０を誤認識し、複合体１５０を形成している。
ここで、分子１４０には、特異的結合物質１２２が結合していないため、複合体１５０中には標識１２３が存在しない。このため、複合体１５０においては、標識１２１に由来するシグナルは検出されるものの、標識１２３に由来するシグナルは検出されない。
したがって、複合体１５０中の特異的結合物質は、標的分子を誤認識していると特定することができる。その結果、標的分子を正しく認識した複合体１６０を収容したウェルの数のみを計測することにより、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出することが可能になる。
（第２実施形態）
第２実施形態に係る標的分子の検出方法について説明する。本実施形態に係る検出方法は、同時に複数種類の標的分子（複数種類の第一の標的分子）を精度よく検出する方法である。図４Ａ及び図４Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する本実施形態に係る方法を説明する模式断面図である。図４Ａでは、標的分子１００と、標的分子捕捉粒子１１０と、標的分子１００に対する特異的結合物質１２０と、特異的結合物質１２０とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１２２との複合体１６０が、基板２１０の表面に形成されたウェル２４０に収容されている。特異的結合物質１２０は標識１２１を有している。特異的結合物質１２２は標識１２３を有している。図４Ａにおいて、標的分子捕捉粒子１１０に固定化された特異的結合物質１１１、特異的結合物質１２０及び特異的結合物質１２２は、標的分子１００のエピトープを正しく認識している。標識１２１及び標識１２３は互いに識別可能である。例えば、標識１２１及び標識１２３は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させることができる。本実施形態においては、例えば、複数の標識からそれぞれ得られる蛍光シグナルが可視光であれば、種々の色を利用した検出（多色検出）が可能になる。
また、図４Ｂでは、標的分子１８０と、標的分子捕捉粒子１１３と、標的分子１８０に対する特異的結合物質１２４と、特異的結合物質１２４とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１２５との複合体１７０が、基板２１０の表面に形成されたウェル２４０に収容されている。特異的結合物質１２４は標識１２１を有している。特異的結合物質１２５は標識１２６を有している。図４Ｂにおいて、標的分子捕捉粒子１１３に固定化された特異的結合物質１１４、特異的結合物質１２４及び特異的結合物質１２５は、標的分子１８０のエピトープを正しく認識している。標識１２１及び標識１２６は互いに識別可能である。例えば、標識１２１及び標識１２６は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させることができる。
ここで、図４Ａと図４Ｂでは、検出されるシグナルが識別可能である。すなわち、図４Ａの複合体１６０からは標識１２１に由来するシグナル及び標識１２３に由来するシグナルが検出される。また、図４Ｂの複合体１７０からは標識１２１に由来するシグナル及び標識１２６に由来するシグナルが検出される。
このため、本実施形態に係る検出方法によれば、試料中に混合して存在する標的分子１００と標的分子１８０とを識別して同時に高精度に検出することができる。
続いて、複数種類の標的分子を同時に検出する場合の特異的結合物質及び標識の組み合わせの例について説明する。図５Ａ～図５Ｈは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。
図５Ａでは、標的分子１００を検出するために、標的分子１００に、特異的結合物質１２０及び特異的結合物質１２２を結合させる。特異的結合物質１２０は標識１２１を有している。また、特異的結合物質１２２は標識１２３を有している。特異的結合物質１２０と特異的結合物質１２２は、認識するエピトープが互いに異なる。また、標識１２１及び標識１２３は互いに識別可能である。
図５Ｂは、図５Ａの複合体に、標的分子捕捉粒子１１０が更に結合した例を示す図である。標的分子捕捉粒子１１０には、特異的結合物質１２０及び特異的結合物質１２２とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１１１が固定化されている。
上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を０分子又は１分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
図５Ｃでは、標的分子１８０を検出するために、標的分子１８０に、特異的結合物質１２４及び特異的結合物質１２５を結合させる。特異的結合物質１２４は標識１２１を有している。また、特異的結合物質１２５は標識１２６を有している。特異的結合物質１２４と特異的結合物質１２５は、認識するエピトープが互いに異なる。また、標識１２１及び標識１２６は互いに識別可能である。
図５Ｄは、図５Ｃの複合体に、標的分子捕捉粒子１１３が更に結合した例を示す図である。標的分子捕捉粒子１１３には、特異的結合物質１２４及び特異的結合物質１２５とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１１４が固定化されている。
上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を０分子又は１分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
図５Ｅでは、標的分子１８２を検出するために、標的分子１８２に、特異的結合物質１９０及び特異的結合物質１９１を結合させる。特異的結合物質１９０は標識１２３を有している。また、特異的結合物質１９１は標識１２６を有している。特異的結合物質１９０と特異的結合物質１９１は、認識するエピトープが互いに異なる。また、標識１２３及び標識１２６は互いに識別可能である。
図５Ｆは、図５Ｅの複合体に、標的分子捕捉粒子１１５が更に結合した例を示す図である。標的分子捕捉粒子１１５には、特異的結合物質１９０及び特異的結合物質１９１とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１１６が固定化されている。
上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を０分子又は１分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
図５Ｇでは、標的分子１８４を検出するために、標的分子１８４に、特異的結合物質１９２、特異的結合物質１９３及び特異的結合物質１９４を結合させる。特異的結合物質１９２は標識１２１を有している。また、特異的結合物質１９３は標識１２３を有している。また、特異的結合物質１９４は標識１２６を有している。特異的結合物質１９２、特異的結合物質１９３及び特異的結合物質１９４は、認識するエピトープが互いに異なる。また、標識１２１、標識１２３及び標識１２６は互いに識別可能である。
図５Ｈは、図５Ｇの複合体に、標的分子捕捉粒子１１７が更に結合した例を示す図である。標的分子捕捉粒子１１７には、特異的結合物質１９２、特異的結合物質１９３及び特異的結合物質１９４とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１１８が固定化されている。上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を０分子又は１分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
このように、図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｅ及び図５Ｇ（あるいは、図５Ｂ、図５Ｄ、図５Ｆ及び図５Ｈ）では、標的分子に結合した標識の組み合わせがそれぞれ異なっているため、試料中に混合して存在する標的分子１００、１８０、１８２及び１８４を識別して同時に高精度に検出することができる。同時に識別可能な標的分子の種類の数は、識別可能な標識の組み合わせの種類の数に依存し、更に増加させることもできる。
なお、上記第２実施形態に係る標的分子の検出方法の図５Ａ～図５Ｈの例示においては、１つの標的分子に２つ以上の標識を結合させる例を示したが、１つの標的分子に１つの標識が結合される場合を考慮した使用も可能である。
本実施形態に係る標的分子の検出方法は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させる標識物質を有する複数の核酸断片で標識され、かつ、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質と、複数種類の第一の標的分子と、を準備する工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、前記複数種類の前記第一の標的分子を前記複数種類の前記特異的結合物質に応じた複数の前記蛍光シグナルにより判断する工程と、を備える、標的分子の検出方法を提供することができる。
また、本実施形態に係る標的分子の検出方法においては、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つを有する第二の標的分子を準備し、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つの検出を介して前記第二の標的分子を検出してもよい。
本実施形態に係る標的分子の検出方法は、例えば、標的分子として、タンパク質、細胞外小胞（Ｅｘｏｓｏｍｅ、エクソソーム）、小胞体、ウイルス、細胞等の分析に応用可能であり、小胞体、ウイルス、細胞等の表面膜タンパクの分析等にも応用可能である。
具体的には、本実施形態に係る標的分子の検出方法は、リキッドバイオプシー中の代表的なバイオマーカーである細胞外小胞（Ｅｘｏｓｏｍｅ、エクソソーム）等の検出、および、エクソソームの膜表面上のタンパク質の検出にも応用可能である。
エクソソームは、ガンを代表とした疾患の発症、悪性化、進行、及び転移等に様々な場面に深く係わりを持つバイオマーカーである。
また、エクソソームは、ほとんどの細胞で分泌される直径４０ｎｍ～１５０ｎｍ程度の膜小胞である。
生体では唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水等の体液中で観察され、培養細胞からも分泌される。近年、エクソソームは、離れた細胞や組織に情報を伝達するための役割を担っている可能性が指摘されている。エクソソームには様々なタンパク質や脂質、核酸が含まれており、別の細胞に運搬されることによって機能的変化や生理的変化を引き起こすと考えられている。その具体例としては、感染性病原体や腫瘍に対する適応免疫応答の媒介、組織修復、神経伝達や病原性タンパク質の運搬等の役割を持つことが示唆されている。
また、近年の研究においては、エクソソームの膜表面上に存在するタンパク質が、人によって、または、ガンの種類によって変化することが知られており、生体試料中におけるこれらのタンパク質の分布もガンの種類によって変化することが知られている。また、エクソソームの膜表面上に存在するタンパク質としては、例えば、エクソソームのバイオマーカーとなるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のタンパク質が存在することが知られている。
そのため、これらエクソソーム膜表面上におけるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のタンパク質の分布や挙動を調査することにより、ガンの種類やガンの発生の可能性、ガンの進行度合いの調査や検査等に応用できる可能性がある。
本実施形態に係る標的分子の検出方法によれば、１つのエクソソームの膜表面上に現れるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のタンパク質に特異的に結合する標識された特異的結合物質（例えば、抗体）を利用することにより、エクソソーム膜表面上のタンパク質の検出が可能である。
例えば、ＣＤ９のエピトープを認識する抗体、ＣＤ６３のエピトープを認識する抗体、およびＣＤ８１のエピトープを認識する抗体において、各抗体に結合される標識が異なる蛍光シグナルを発するように構成することにより、エクソソームの存在を検出できるとともに、エクソソーム膜表面上のＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１の存在の有無および分布を多色により色別に判定することができる。
例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１のうち１つを有するエクソソームや、ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１のうち２つを有するエクソソーム、ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１のうち３つを有するエクソソームを色差によって分析、判定することができ、色差によって各エクソソームの分布を観察することができる。
すなわち、本実施形態に係る標的分子の検出方法によれば、生体試料中のエクソソームの膜表面上に存在するバイオマーカーとなるタンパク質の分布や挙動を観察でき、迅速かつ精度のよい各タンパク質の定性分析、定量分析への応用が可能である。
本実施形態に係る標的分子の検出方法は、上述のようなエクソソーム表面上のタンパク質の分析を例示したが、上述の例示に限定されず、ウイルス、細胞等の膜表面上に存在するタンパク質の分析、ガンの可能性を示すバイオマーカーの評価および検出等に応用可能である。
［標的分子検出キット］
本発明の１実施形態は、標的分子に対する特異的結合物質であって、認識するエピトープが互いに異なり、互いに識別可能に標識された複数種類の特異的結合物質を備える、標的分子検出キットを提供する。
本実施形態に係るキットにおいて、標的分子、特異的結合物質、標識については上述したものと同様である。特異的結合物質は、互いに異なる核酸断片で標識されていてもよい。
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
［実験例１］
（標的分子捕捉粒子の作製（ＰＳＡ））
標的分子として前立腺癌マーカーの一つであるｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）を捕捉する、標的分子捕捉粒子を作製した。
まず、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（型式「１Ｈ１２」、Ｈｙｔｅｓｔ社）をビオチン化した。ビオチン化には、市販のキット（商品名「ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ」、サーモサイエンティフィック社）を使用した。具体的には、１．５ｍＬチューブ中で、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈した抗ＰＳＡモノクローナル抗体に抗体の５０倍モル量のＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（０．２ｍｇ／ｍＬを５００μＬ）を添加した。続いて、氷上で２時間静置して、抗体のビオチン化を行った。
続いて、反応後の混合液から未反応のＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ及び反応副生成物を除くため、ゲルろ過カラム（型式「Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ」、サーモサイエンティフィック社）を使用してビオチン化抗体を精製した。カラム精製後、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイによりタンパク質量の測定を行い、収量を求めた。
続いて、ビオチン化した抗ＰＳＡ抗体に、分散させたストレプトアビジン標識ビーズ（型式「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ」、ＪＳＲ社）を混合し、１０分間室温下で混和し、１×結合バッファー中でビオチン及びストレブトアビジンを結合させた。続いて、磁気スタンドに１分間セットしてビーズを集めて上清を捨て、１×結合バッファーで３回洗浄し、標的分子捕捉粒子を得た。
［実験例２］
（標的分子捕捉粒子の作製（ＣＥＡ））
標的分子として消化器系癌マーカーの一つであるｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）を捕捉する、標的分子捕捉粒子を作製した。抗体として、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（型式「１０－１３９２」、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）を使用した点以外は実験例１と同様にして標的分子捕捉粒子を作製した。
［実験例３］
（核酸標識抗ＰＳＡ抗体の作製）
抗ＰＳＡモノクローナル抗体（型式「５Ａ６」、Ｈｙｔｅｓｔ社）及び抗ＰＳＡモノクローナル抗体（型式「８Ａ６」、Ｈｙｔｅｓｔ社）に、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片１）及び配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片２）をそれぞれ結合させ、核酸標識抗ＰＳＡ抗体を作製した。ＤＮＡ断片の結合には、市販のキット（商品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｏｌｉｇｏ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」、ソルリンク社）を用いた。なお、核酸標識抗ＰＳＡ抗体は、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
［実験例４］
（核酸標識抗ＣＥＡ抗体の作製）
実験例３と同様にして、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（型式「１０－１３９３」、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）及び抗ＣＥＡモノクローナル抗体（型式「１０－７８８３」、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）に、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片３）及び配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片４）をそれぞれ結合させ、核酸標識抗ＣＥＡ抗体を作製した。
なお、核酸標識抗ＣＥＡ抗体は、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
［実験例５］
（標的分子含有試料の調製）
標的分子として、ＰＳＡ（型式「ＰＳＡキャリブレータ」、ｓｙｓｍｅｘ社）及びＣＥＡ（型式「ＨＩＳＣＬ ＣＥＡキャリブレータ」、カイノス社）を５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）－１×ＰＢＳ溶液で、０、０．０１、０．０５、０．１、０．５ｎｇ／ｍＬの濃度にそれぞれ希釈し、標的分子含有試料を調製した。
［実験例６］
（検出デバイスの作製）
０．５ｍｍ厚のガラス製の基板にＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子製）をスピンコートした後、１８０℃で１時間ベークした。形成されたＣＹＴＯＰの厚みは３μｍであった。
続いて、ポジティブフォトレジストをコートし、フォトマスクを用いてウェルパターンを形成した。その後、Ｏ２プラズマによりＣＹＴＯＰをドライエッチングした。続いて、表面に残ったフォトレジストを除去するためにアセトンとエタノールで表面を洗浄しリンスした。
上記の操作により、基板上の所定の領域内に１００ブロックのウェルアレイを形成した。また、各々のブロックは１００００個のウェルを有していた。したがって、上記の領域内に合計１００万個のウェルが形成された。また、ＣＹＴＯＰによって形成されたウェル（微小区画）の直径は５μｍであり、インベーダー反応によるシグナル検出が数分で可能な体積を有していた。
続いて、送液ポートを有するガラス製の板（蓋体）と上記の基板とを、１００μｍの厚みを有し流路形状に加工された両面テープを用いて接着し、検出デバイスを作製した。ガラス製の板と上記の基板とは、上記のウェルが形成された領域が流路内に配置されるように接着した。
［実施例１］
（ＰＳＡの検出１）
ＰＳＡを標的分子として実験を行った。サンプルチューブ（タンパク質非吸着、エッペンドルフ社）に、様々な濃度のＰＳＡを含む溶液５０μＬをそれぞれ添加した。続いて、各チューブに、１０６個の標的分子捕捉粒子、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体５０μＬ、及び配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体５０μＬをそれぞれ添加し、シェーカー上で撹拌しながら室温で１時間反応させ、複合体を形成させた。
続いて、未反応の核酸標識抗ＰＳＡ抗体を除くため、遠心、上清の除去及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）を加える操作を３回繰り返して洗浄し、最後に上清を除去して複合体を得た。
続いて、実験例６で作製した検出デバイスの送液ポートに、上記の複合体とインベーダー反応試薬とを混合した溶液２０μＬを送液した。これにより、２０μＬの溶液の一部が基板上のウェル内に配分された。インベーダー反応試薬は、１μＭアレルプローブ１（配列番号５）、１μＭアレルプローブ２（配列番号６）、１μＭインベーダーオリゴ１（配列番号７）、１μＭ ＦＲＥＴ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＦＡＭ）（ホロジック社製）、１μＭ ＦＲＥＴ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）（ホロジック社製）、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬクリベース及びＴｗｅｅｎ２０を含んでいた。
アレルプローブ１は、核酸標識抗ＰＳＡ抗体に結合した配列番号１のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＦＡＭが蛍光を発する。
また、アレルプローブ２は、核酸標識抗ＰＳＡ抗体に結合した配列番号２のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤが蛍光を発する。
検出デバイスのウェルでＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの双方の蛍光が観察されることは、当該ウェルにＰＳＡが少なくとも１分子含まれていることを示す。
続いて、封止液としてフッ素系オイルであるＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ送液した。これにより、ウェルの上部が封止液により覆われた。その結果、各ウェルは、上記の複合体及びインベーダー反応試薬が封入された独立した反応室となった。続いて、６３℃のホットプレート上で１５分間加熱し、インベーダー反応を実施した。
続いて、蛍光顕微鏡（オリンパス製）を使用し、各ウェルにおけるＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの蛍光を検出した。露光時間は２０００ミリ秒とした。
その結果、５％ＢＳＡ－１×ＰＢＳ溶液で０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈したＰＳＡを検出できることが明らかとなった。また、本実施例におけるインベーダー反応に要する加熱時間は１５分間であり、ＰＳＡを迅速に検出できることが明らかとなった。
［比較例１］
実施例１で使用したＰＳＡ溶液を用いて同様の実験を行ったが、核酸標識ＰＳＡ抗体として、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体のみを使用した。
その結果、抗ＰＳＡ抗体の誤認識により、実施例１で検出可能であったＰＳＡ濃度の下限と比較して、検出可能なＰＳＡ濃度の下限が高値となることが明らかとなった。
［実施例２］
（ＰＳＡの検出２）
ＰＳＡを標的分子として実験を行った。試料中のＰＳＡの濃度を０ｐｇ／ｍＬ（０ｆＭ）、０．１ｐｇ／ｍＬ（３ｆＭ）、１ｐｇ／ｍＬ（３０ｆＭ）、１０ｐｇ／ｍＬ（３００ｆＭ）にした以外は実施例１と同様の反応を行い、ＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの双方の蛍光を検出した。
上述したように、検出デバイスのウェルでＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの双方の蛍光が観察されることは、当該ウェルにＰＳＡが少なくとも１分子含まれていることを示す。
図６は、各濃度のＰＳＡ試料を反応させ、ＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの双方の蛍光が観察されたウェルの数を計測した結果を示すグラフである。その結果、０ｐｇ／ｍＬ（０ｆＭ）及び０．１ｐｇ／ｍＬ（３ｆＭ）の濃度のＰＳＡ溶液を明確に区別できることが明らかとなった。
また、本実施例においても、インベーダー反応に要する加熱時間は１５分間であり、ＰＳＡを迅速に検出できることが明らかとなった。
［比較例２］
実施例２でＰＳＡを検出したデバイスのウェルについて、ＦＡＭの蛍光が観察されたウェルの数のみを計測した。これにより、１種類の抗ＰＳＡ抗体のみを用いてＰＳＡを検出したのと同様の結果を得ることができる。
図７は、各濃度のＰＳＡ試料を反応させ、ＦＡＭの蛍光が観察されたウェルの数を計測した結果を示すグラフである。その結果、０ｐｇ／ｍＬ（０ｆＭ）、０．１ｐｇ／ｍＬ（３ｆＭ）及び１ｐｇ／ｍＬ（３０ｆＭ）の濃度のＰＳＡ溶液を明確に区別することは困難であった。
この結果は、抗ＰＳＡ抗体の誤認識により、実施例２で検出可能であったＰＳＡ濃度の下限と比較して、検出可能なＰＳＡ濃度の下限がはるかに高値となることを示す。いいかえると、複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させ、２種以上の特異的結合物質を検出することにより、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子の検出精度を顕著に向上させることができることを示す。また、本実施例によれば、従来の方法と比較して、ＰＳＡを迅速に検出できることが明らかとなった。抗体（抗体一分子）に対して蛍光シグナルの反応起点となる複数の核酸が修飾されるように核酸標識抗ＰＳＡ抗体を調製したためと考えられる。さらに、デバイスの各ウェルに標的分子が小分けに捕捉されるような構成を備えることによって、標識された核酸が多数存在しても、標識された核酸同士が干渉せずに、標的分子の検出が可能であったと考えられる。
［実施例３］
（ＰＳＡ及びＣＥＡの検出）
ＰＳＡ及びＣＥＡの混合物を標的分子として実験を行った。サンプルチューブ（タンパク質非吸着、エッペンドルフ社）に、０．０１ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ及び０．０１ｎｇ／ｍＬのＣＥＡを体積比１：２で混合した溶液５０μＬを添加した。続いて、上記のチューブに、１０６個の標的分子捕捉粒子、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体５０μＬ、配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体５０μＬ、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＣＥＡ抗体５０μＬ、配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＣＥＡ抗体５０μＬをそれぞれ添加し、シェーカー上で撹拌しながら室温で１時間反応させ、複合体を形成させた。
なお、核酸標識抗ＰＳＡ抗体は、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
また、核酸標識抗ＣＥＡ抗体は、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
続いて、実験例６で作製した検出デバイスの送液ポートに、上記の複合体とインベーダー反応試薬とを混合した溶液２０μＬを送液した。インベーダー反応試薬は、１μＭアレルプローブ１（配列番号５）、１μＭアレルプローブ２（配列番号６）、１μＭアレルプローブ３（配列番号８）、１μＭアレルプローブ４（配列番号９）、１μＭインベーダーオリゴ１（配列番号７）、１μＭインベーダーオリゴ２（配列番号１０）、１μＭ ＦＲＥＴ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＦＡＭ）（ホロジック社製）、１μＭ ＦＲＥＴ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）（ホロジック社製）、１μＭ ＦＲＥＴ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＴＡＭＲＡ）（ホロジック社製）、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、６．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬクリベース及びＴｗｅｅｎ２０を含んでいた。
アレルプローブ１は、核酸標識抗ＰＳＡ抗体に結合した配列番号１のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＦＡＭが蛍光を発する。
また、アレルプローブ２は、核酸標識抗ＰＳＡ抗体に結合した配列番号２のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤが蛍光を発する。
また、アレルプローブ３は、核酸標識抗ＣＥＡ抗体に結合した配列番号３のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＦＡＭが蛍光を発する。
また、アレルプローブ４は、核酸標識抗ＣＥＡ抗体に標識された配列番号４のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＴＡＭＲＡで検出可能な蛍光を発色する。
検出デバイスのウェルでＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの双方の蛍光が観察されることは、当該ウェルにＰＳＡが少なくとも１分子含まれていることを示す。また、ＦＡＭ及びＴＡＭＲＡの双方の蛍光が観察されることは、当該ウェルにＣＥＡが少なくとも１分子含まれていることを示す。
続いて、封止液としてフッ素系オイルであるＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ送液した。続いて、６３℃のホットプレート上で１５分間加熱し、インベーダー反応を実施した。
続いて、蛍光顕微鏡（オリンパス社）を使用し、各ウェルにおけるＦＡＭ、Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ及びＴＡＭＲＡの蛍光を検出した。露光時間は２０００ミリ秒とした。
その結果、ＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの双方の蛍光が観察されたチャンバーの数と、ＦＡＭ及びＴＡＭＲＡの双方の蛍光が観察されたチャンバーの数から算出されたＰＳＡ及びＣＥＡの濃度比は１：２であると計算された。また、本実施例におけるインベーダー反応に要する加熱時間は１５分間であり、ＰＳＡおよびＣＥＡを迅速に検出できることが明らかとなった。
［実施例４］
＜試薬調製＞
（エクソソーム含有試料）
エクソソームを含む培養上清は大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６をＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ社）:Ｅｘｏ－ＦＢＳ(ＳＢＩ社):ペニシリンストレプトマイシン溶液（和光純薬社）を９０：１０:１で混合した培地で３日間培養した培養上清を用いた。培養上清を３００×ｇ、１０分で細胞を除去した。さらに培養上清を２０００×ｇ、１０分でデブリスを除去した。さらに培養上清を１００００×ｇ、３０分でさらに細かいデブリスを除去した。最後に培養上清を０．２２μｍのフィルターユニット（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過した。
エクソソームを含む血清はヒト血清（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ＡＢ、コージンバイオ社製)を用いた。
（抗体固定化磁性ビーズの調製）
抗体を磁性ビーズに固定化するため、カルボキシル基修飾磁性ビーズ（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ、ＬＣ３００、ＪＳＲ社）溶液に、抗エクソソーム抗体（型式「ＣＤ９」、コスモバイオ社)を添加し１００μＬに混合し、ローテーターにて３０分反応させ、さらに縮合剤ＥＤＣを加え３時間反応させ、抗体のカルボキシル磁性ビーズへの固定化を行った。
反応後未反応の抗体と試薬を取り除くため、マグネットスタンドを用いて抗体固定化カルボキシル磁性ビーズを磁気捕集、および、ＰＢＳ－Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）による洗浄を３回繰り返し、抗体固定化カルボキシル磁性ビーズ（ＣＤ９ビーズ）を調製した。
（抗体修飾用核酸及び検出用核酸）
抗体修飾用及び核酸検出反応用の核酸としては、以下に示す核酸を用いた。
・ＤＮＡ断片５：配列番号１１に示す塩基配列を有する。
・ＤＮＡ断片６：配列番号１２に示す塩基配列を有する。
・アレルプローブ３：配列番号８に示す塩基配列を有する。
・アレルプローブ５：配列番号１３に示す塩基配列を有する。
・インベーダーオリゴ２：配列番号１０に示す塩基配列を有する。
（核酸修飾抗体の調製）
実験例３と同様にして、抗エクソソーム抗体２種（型式「ＣＤ６３」、型式「ＣＤ８１」、コスモバイオ社）に、ＤＮＡ断片５、６をそれぞれ結合させ核酸修飾抗体（ＤＮＡ断片５－ＣＤ６３、ＤＮＡ断片６－ＣＤ８１）を調製した。
核酸修飾抗体は、ＤＮＡ断片５－ＣＤ６３、ＤＮＡ断片６－ＣＤ８１のいずれも、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
（核酸検出試薬の調製）
デジタルインベーダー反応による核酸修飾抗体検出を行うため、核酸検出試薬として、インベーダー反応試薬を調製した。本実施例におけるインベーダー反応試薬の試薬組成は以下の通りである。
実施例４におけるインベーダー反応試薬は、０．１μＭアレルプローブ３（配列番号８）、０．１μＭアレルプローブ５（配列番号１３）、１μＭインベーダーオリゴ２（配列番号１０）、２μＭ ＦＲＥＴ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＦＡＭ）（ホロジック社製）、２μＭ ＦＲＥＴ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ）（ホロジック社製）、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１０００Ｕ／μＬクリベースを含んでいた。
なお、これらのインベーダー反応試薬における各成分の濃度は、実施例４に係るインベーダー反応試薬における終濃度である。
＜抗原、抗体固定化ビーズ及び核酸修飾抗体の反応＞
サンプルチューブに、１０６個の抗体固定化カルボキシル磁性ビーズ（ＣＤ９ビーズ）、０または５０％となるようにそれぞれ調整した培養上清あるいは血清、０．１ｎｇ／ｍＬに調整した核酸修飾抗体２種（ＤＮＡ断片５－ＣＤ６３、ＤＮＡ断片６－ＣＤ８１）を全量が１００μＬとなるように混合し、ローテーター上で室温３時間反応させ、複合体を形成させた。
反応後、マグネットスタンドを用いて得られた磁性ビーズを磁気捕集し、上清の除去及び０．１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）を加える操作を５回繰り返して洗浄し、最後に上清を除去して複合体を得た。
得られた複合体を洗浄後ＰＢＳにて希釈し、反応混合液１を調製した。
＜フローセルの組み立て＞
流路の高さは１００μｍ、幅は６～７ｍｍになるように下記３部材を組み立てた。
・ＣＯＰチャンバー（φ５μｍ、深さ３．５μｍの微小孔を形成、ＳＴＲＡＴＥＣ社）
・両面テープ（膜厚１００μｍ、宝洋社）
・ＣＯＰ送液用流路ストリップ（カーボンブラック添加着色、送液及び廃液ポート付、荒川樹脂社）
＜反応混合溶液の送液＞
フローセルに、上記の複合体とインベーダー反応試薬とを混合した溶液２０μＬを送液した。続いて、封止液としてＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ送液し、各チャンバーを封止した。
＜核酸検出反応＞
上記フローセルをホットプレート上にセットし、６６℃１５分反応させた。
＜チャンバーの観察＞
上記フローセルを冷却後、蛍光顕微鏡ＢＺ－７１０（ＫＥＹＥＮＣＥ社）で各ウェルにおけるＦＡＭ、Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの蛍光を検出した。露光時間として、ＦＡＭは１２００ｍ秒、Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤは１０００ｍ秒とした。
血清５０％含有サンプル溶液中の反応を蛍光顕微鏡にて観察し、各蛍光画像を重ね合わせた結果を図９の右側に示す。なお、図９の左側は、血清を添加しない場合（血清０％）の画像である。
その結果、サンプル中の培養上清及び血清の含有割合に応じて、蛍光チャンバー数が変化している事が確認された。
これらの結果から、エクソソーム抗体を用いたデジタルインベーダーによってエクソソーム膜表面タンパク質が認識され、培養上清及び血清中に含まれるエクソソームを検出できている事が示唆された。
また、各サンプル含有溶液を用いた反応における、１ブロック内で磁性ビーズが封入されたチャンバー数、磁性ビーズと蛍光シグナルの両方が検出されたチャンバー数、蛍光シグナルのみが検出されたチャンバー数をカウントした結果を表１に示す。
Figure 0006996502000001
表１に示すように、培養上清、血清ともに検出による蛍光シグナルのほとんどがビーズと重なっており、磁性ビーズ上でエクソソームが検出されている事が示唆された。
なお、アレルプローブ３は、ＣＤ６３に結合した配列番号１１のＤＮＡ断片５とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＦＡＭが蛍光を発する。
例えば、図８の右側、図９の右側においては、ＦＡＭは緑色の蛍光を発していた。
また、ＦＡＭの蛍光が観察されることは、エクソソーム膜表面上に存在するタンパク質であるＣＤ６３が検出できたと考えられる。
また、アレルプローブ５は、ＣＤ８１に結合した配列番号１２のＤＮＡ断片６とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤが蛍光を発する。
例えば、図８の右側、図９の右側においては、Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤは赤色の蛍光を発していた。
また、Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの蛍光が観察されることは、エクソソーム膜表面上に存在するタンパク質であるＣＤ８１が検出できたと考えられる。
また、図８の右側、図９の右側においては、ＦＡＭ由来の蛍光である緑色と、Ｒｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤ由来の赤色の蛍光との両方の蛍光が得られた際の蛍光シグナルと考えられる黄色の蛍光が観察された。
また、ＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ ＲＥＤの双方由来の蛍光（黄色）が観察されることは、エクソソームのうち、エクソソーム膜表面上にＣＤ６３、ＣＤ８１の２つのタンパク質が存在するエクソソームを検出できたと考えられる。
さらに、図８の右側の蛍光画像、および、図９の右側の蛍光画像の結果より、緑色、赤色、黄色の蛍光シグナルによって、膜表面上にＣＤ６３を有するエクソソーム、膜表面上にＣＤ８１を有するエクソソーム、および膜表面上にＣＤ６３およびＣＤ８１の両者を有するエクソソームの存在を確認できたと考えられる。
すなわち、複数種類の第一の標的分子としてのＣＤ６３、ＣＤ８１の検出を介して、第二の標的分子としてのエクソソームを検出できることを確認できた。
また、本実施例によれば、緑色、赤色、黄色のような複数の蛍光シグナルの検出によって、生体試料中におけるエクソソームに存在するＣＤ６３、ＣＤ８１の分布を判定することができたと考えられる。
さらに、本実施例によれば、緑色、赤色、黄色のような複数の蛍光シグナルの分布を検出することによって、生体試料中において膜表面上にＣＤ６３を有するエクソソーム、膜表面上にＣＤ８１を有するエクソソーム、および膜表面上にＣＤ６３およびＣＤ８１の両者を有するエクソソームの分布を観察することができたと考えられる。
核酸修飾抗体によるデジタルインベーダー反応により、エクソソーム膜表面上の複数のタンパク質を認識し、かつ、検出できていることから、多くの反応開始物質を有する場合（本実施例のように抗体に対して多くの核酸断片が修飾されるような場合、蛍光シグナルの基点となる物質がたくさん結合しているような場合）においても、デジタル計測によって短時間で複数項目の定量検出が可能である事が示唆された。
これはタンパク質を認識する抗体に、蛍光標識された核酸断片を多く結合させているためである。
また、本実施例においては、１つのウェルに１つ以下のエクソソーム（第一の標的分子としてのタンパク質を有する第二の標的分子）が導入されるように、ウェルのサイズを構成したため、フローセル中に蛍光標識された核酸断片を有する抗体が多数存在しても、余剰の抗体由来の蛍光の干渉等を受けずに、エクソソームが有するタンパク質を検出できたと考えられる。
一方、従来の標的の核酸を増幅するデジタルＰＣＲでは検出に要する反応時間は多くかかるため短時間での検出は困難である。
また、従来の抗体を蛍光標識したフローサイトメトリーでは、標的となるエクソソームやタンパク質が小さいため、検出のために蛍光標識ビーズ等を用いて分離しなければならなくなり、高感度検出は困難である。
さらに、従来の核酸修飾抗体を用いたイムノＰＣＲでは、検出のために核酸の標識量を制御しなければならなくなり、定量検出は困難である。
このように、従来の方法によれば、迅速かつ精度よく標的分子を検出することは困難であると考えられる。
本実施例に係る標的分子の検出方法によれば、１つのフローセルに生体試料を流す場合においても、同時に複数の蛍光シグナルを検出する多色検出により、短時間で複数項目の標的分子の定量検出が可能である事が示唆された。
また、本実施例に係る標的分子の検出方法によれば、エクソソーム等の生体試料の表面上に存在するタンパク質等の検出が可能であり、多色検出により、これらのタンパク質等の分布を観察し、ガンに関連するバイオマーカーとなるタンパク質等の挙動や分布を調査する等、定性的な分析に応用することも可能であることが考えられる。
本発明によれば、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出できる技術を提供することができる。
１００，１８０，１８２，１８４…標的分子、１１０，１１２，１１３，１１５，１１７…標的分子捕捉粒子、１１１，１１４，１１６，１１８，１２０，１２２，１２４，１２５，１９０，１９１，１９２，１９３，１９４…特異的結合物質、１２１，１２３，１２６…標識（標識分子）、１３０，１５０，１６０，１７０…複合体、１４０…標的分子ではない分子、２００…検出デバイス、２１０…基板、２２０…流路、２３０…蓋体、２４０…ウェル、２５０…シグナル。

Claims (6)

  1. 標的分子の検出方法であって、
    複数のウェルを有する基板を備えた検出デバイスと、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させる複数の核酸断片で標識され、かつ、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質と、複数種類の第一の標的分子のうち少なくとも１つを有する第二の標的分子と、を準備する工程と、
    前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程と、
    前記複数のウェルにおいて１つのウェルに１つの前記第二の標的分子を導入する工程と、
    前記複数種類の前記特異的結合物質を、インベーシブ・クリベージ反応によりそれぞれ検出する工程と、
    前記複数種類の前記第一の標的分子を前記複数種類の前記特異的結合物質に応じた複数の前記蛍光シグナルにより判断する工程と、
    前記複数種類の前記第一の標的分子の検出を介して前記第二の標的分子を検出する工程と、
    を備える、
    標的分子の検出方法。
  2. 前記特異的結合物質の１分子に対して前記複数の核酸断片が数個～数十個結合している、請求項１に記載の検出方法。
  3. 前記特異的結合物質が抗体である、請求項２に記載の検出方法。
  4. 前記第二の標的分子が、タンパク質、エクソソーム、小胞体、ウイルス、および細胞からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 前記第二の標的分子が、エクソソーム、小胞体、ウイルス、および細胞からなる群から選択される少なくとも一つであり、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つが前記第二の標的分子の膜表面上に存在する、請求項４に記載の検出方法。
  6. 前記複数種類の前記第一の標的分子が疾患マーカータンパク質である、請求項５に記載の検出方法。
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