WO2017200070A1 - 標的分子の検出方法及び標的分子検出キット - Google Patents

標的分子の検出方法及び標的分子検出キット Download PDF

Info

Publication number
WO2017200070A1
WO2017200070A1 PCT/JP2017/018782 JP2017018782W WO2017200070A1 WO 2017200070 A1 WO2017200070 A1 WO 2017200070A1 JP 2017018782 W JP2017018782 W JP 2017018782W WO 2017200070 A1 WO2017200070 A1 WO 2017200070A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
target molecule
specific binding
types
target
molecule
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/018782
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
牧野　洋一
匠 平瀬
憲彰 新井
博行 野地
Original Assignee
凸版印刷株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 凸版印刷株式会社 filed Critical 凸版印刷株式会社
Priority to EP17799494.4A priority Critical patent/EP3460474B1/en
Priority to EP22160097.6A priority patent/EP4047368A1/en
Priority to JP2018518370A priority patent/JP6996502B2/ja
Priority to CN201780030808.6A priority patent/CN109477834A/zh
Publication of WO2017200070A1 publication Critical patent/WO2017200070A1/ja
Priority to US16/194,612 priority patent/US20190085385A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N2021/1738—Optionally different kinds of measurements; Method being valid for different kinds of measurement
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths

Definitions

  • the present invention relates to a target molecule detection method and a target molecule detection kit.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2016-100231 filed in Japan on May 19, 2016 and Japanese Patent Application No. 2016-24023 filed in Japan on December 13, 2016, The contents are incorporated here.
  • Quantitative detection of target molecules in a biological sample allows early detection of diseases and prediction of medication effects.
  • protein quantification has been performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or the like, and nucleic acid has been quantified by real-time PCR or the like.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Patent Document 1 Patent Document 1
  • Patent Document 2 Non-Patent Document 1 and the like describe techniques for performing enzyme reactions in a large number of microcompartments as techniques for detecting target molecules with high accuracy. These methods are called digital measurement.
  • the sample solution is divided into an extremely large number of micro solutions. Then, the signal from each minute solution is binarized, and it is determined only whether or not the target molecule exists, and the number of target molecules is measured. According to digital measurement, detection sensitivity and quantitativeness can be significantly improved as compared with conventional ELISA, real-time PCR, and the like.
  • the presence of a target molecule may be detected using a specific binding substance such as a monoclonal antibody against the target molecule.
  • a specific binding substance such as a monoclonal antibody against the target molecule.
  • the specific binding substance causes misrecognition such as misrecognition of a homologous epitope on a protein having a similar structure to the target molecule, non-specific recognition, etc. In some cases, the detection accuracy of a substance is lowered.
  • Patent Document 3 discloses that a target molecule, a carrier modified with a first antibody that specifically binds to the target molecule, a substrate that specifically binds to the target molecule, Two or more antibodies labeled with an enzyme having a cleavage activity, which are reacted with a second antibody having different substrate specificities of the enzyme, and the first antibody and the target molecule on the carrier A complex formation procedure for forming a complex consisting of the second antibody and a cleavage site of the enzyme, a fluorescent substance bound to one end of the cleavage site, and a quencher bound to the other end A detection procedure for detecting fluorescence emitted from the fluorescent substance by reacting two or more substrates with different fluorescent wavelengths of the fluorescent substance and the complex; and two or more different fluorescent wavelengths Fluorescence detection Detection method of a target molecule comprising the analysis procedure for processing the signal as a detection signal of the target molecule, a is described.
  • an object of this invention is to provide the technique which can detect a target molecule rapidly and accurately.
  • Another object of the present invention is to provide a technique capable of accurately detecting a target molecule even when a specific binding substance to the target molecule causes misrecognition.
  • the method for detecting a target molecule according to the first aspect of the present invention includes a plurality of types of specific molecules that are labeled with a plurality of nucleic acid fragments having labeling substances that generate fluorescence signals having different fluorescence wavelengths and that recognize different epitopes.
  • Preparing a binding substance and a plurality of types of first target molecules binding the plurality of types of specific binding substances to the plurality of types of first target molecules; Detecting each of the specific binding substances, and determining the plurality of types of the first target molecules based on the plurality of fluorescent signals corresponding to the plurality of types of the specific binding substances.
  • Several to several tens of the plurality of nucleic acid fragments may bind to one molecule of the specific binding substance.
  • the specific binding substance may be an antibody.
  • the second target molecule may be an exosome. At least one of the plurality of types of the first target molecules may be present on the membrane surface of the exosome.
  • the plurality of types of the first target molecules may be disease marker proteins.
  • the method for detecting a target molecule according to the second aspect of the present invention includes a step of binding a plurality of types of specific binding substances having different recognized epitopes to a target molecule, and detecting the plurality of types of the specific binding substances, respectively. And a step of determining that the target molecule is present when two or more of the plurality of types of specific binding substances are detected.
  • the target molecule may be detected in units of one molecule. At least one of the plural types of specific binding substances may be labeled with a nucleic acid fragment.
  • the step of detecting each of the plurality of types of specific binding substances may include a signal amplification reaction. Multiple types of target molecules may be detected simultaneously.
  • the target molecule detection kit comprises a plurality of types of specific binding substances that specifically bind to a target molecule, have different epitopes to be recognized, and are distinguishably labeled.
  • the plurality of types of specific binding substances may be labeled with different nucleic acid fragments.
  • FIG. 1A is a schematic cross-sectional view illustrating a conventional method for detecting a target molecule in a microcompartment.
  • FIG. 1B is a schematic cross-sectional view illustrating a conventional method for detecting a target molecule in a microcompartment. It is a schematic cross section explaining how a target molecule is detected by digital measurement.
  • FIG. 3A is a schematic cross-sectional view illustrating a first embodiment of a method for detecting a target molecule in a micro compartment.
  • FIG. 3B is a schematic cross-sectional view illustrating a first embodiment of a method for detecting a target molecule in a microcompartment.
  • FIG. 1A is a schematic cross-sectional view illustrating a conventional method for detecting a target molecule in a microcompartment.
  • FIG. 1B is a schematic cross-sectional view illustrating a conventional method for detecting a target molecule in a microcompartment. It is a schematic cross section explaining
  • FIG. 4A is a schematic cross-sectional view illustrating a second embodiment of a method for detecting a target molecule in a micro compartment.
  • FIG. 4B is a schematic cross-sectional view illustrating a second embodiment of a method for detecting a target molecule in a micro compartment.
  • FIG. 5A is a diagram illustrating an example of a combination of a specific binding substance and a label that can simultaneously detect a plurality of types of target molecules.
  • FIG. 5B is a diagram illustrating an example of a combination of a specific binding substance and a label that can simultaneously detect a plurality of types of target molecules.
  • FIG. 5C is a diagram illustrating an example of a combination of a specific binding substance and a label that can simultaneously detect a plurality of types of target molecules.
  • FIG. 5D is a diagram illustrating an example of a combination of a specific binding substance and a label that can simultaneously detect a plurality of types of target molecules.
  • FIG. 5E is a diagram illustrating an example of a combination of a specific binding substance and a label that can simultaneously detect a plurality of types of target molecules.
  • FIG. 5F is a diagram illustrating an example of a combination of a specific binding substance and a label that can simultaneously detect a plurality of types of target molecules.
  • FIG. 5G is a diagram illustrating an example of a combination of a specific binding substance and a label that can simultaneously detect a plurality of types of target molecules.
  • 5H is a diagram illustrating an example of a combination of a specific binding substance and a label that can simultaneously detect a plurality of types of target molecules.
  • 10 is a graph showing the results of Example 2.
  • 10 is a graph showing the results of Comparative Example 2. It is an exosome detection result in the culture supernatant by the digital invader which concerns on Example 4.
  • FIG. It is an exosome detection result in the serum by the digital invader which concerns on Example 4.
  • FIG. 1A and 1B are schematic cross-sectional views illustrating a conventional method for detecting a target molecule in a microcompartment.
  • a complex 130 of a target molecule 100, a target molecule capturing particle 110, and a specific binding substance 120 for the target molecule 100 is accommodated in a well 240 formed on the surface of the substrate 210.
  • a specific binding substance 111 is immobilized on the target molecule capturing particle 110.
  • the specific binding substance 120 has a label (labeled molecule) 121.
  • the specific binding substance 111 and the specific binding substance 120 immobilized on the target molecule capturing particle 110 correctly recognize the epitope of the target molecule 100.
  • At least one of the specific binding substance 111 or the specific binding substance 120 misrecognizes the molecule 140 that is not the target molecule to form a complex 150.
  • the target molecule 100 is present using the presence of the label 121 as an index, it is determined that the target molecule 100 is present because the specific binding substance 120 has the label 121.
  • the target molecule may not be detected accurately.
  • the cause of misrecognition of a target molecule by a specific binding substance is the presence of a homologous epitope on a protein or peptide having a similar structure to the target molecule, which occurs at a certain frequency.
  • ELISA which is a conventional detection method
  • the measurement error is small even if only a few specific binding substances are misrecognized, but in the digital measurement, it is necessary to accurately measure the low concentration region of the target molecule.
  • Antibody misrecognition affects measurement error.
  • One embodiment of the present invention includes a step of binding a plurality of types of specific binding substances having different recognized epitopes to a target molecule, a step of detecting each of a plurality of types of the specific binding substances, and a plurality of types of the specifics. And a step of determining that the target molecule is present when two or more of the target binding substances are detected.
  • the detection method according to the present embodiment will be described.
  • Step of binding multiple types of specific binding substances to the target molecule First, a plurality of types of specific binding substances that recognize different epitopes are bound to a target molecule. This step can be performed, for example, by bringing a target molecule and a specific binding substance into contact in a sample tube.
  • the number of types of specific binding substances is 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more.
  • the target molecule is not particularly limited, and any molecule can be detected. Specific examples include a disease marker protein in a biological sample, a specific compound in an environmental sample, and the like.
  • the biological sample is not particularly limited and includes serum, plasma, urine and the like. Moreover, as an environmental sample, river water, factory waste water, etc. are mentioned, for example.
  • Specific binding substances include antibodies, antibody fragments, aptamers and the like.
  • An antibody can be produced, for example, by causing an animal such as a mouse to immunoreact with a target molecule or a fragment of the target molecule as an antigen. Alternatively, for example, it can be prepared by screening a phage library.
  • the antibody fragment include Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, single chain antibody (scFv), disulfide stabilized antibody (dsFv), dimerized V region fragment (Diabody), and a peptide containing CDR. It is done.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. A commercially available antibody may also be used.
  • An aptamer is a substance that has a specific binding ability to a target molecule.
  • examples of aptamers include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • a nucleic acid aptamer having a specific binding ability to a target molecule can be selected by, for example, a systematic evolution of ligand by exponential enrichment (SELEX) method.
  • Peptide aptamers having specific binding ability to the target molecule can be selected by, for example, the two-hybrid method using yeast.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view for explaining how a target molecule is detected by digital measurement using the detection device 200 as an example.
  • the detection device 200 includes a substrate 210, a flow path 220, and a lid 230, and a plurality of wells 240 are formed on the surface of the substrate 210.
  • the target molecule is accommodated in the well 240.
  • the method for accommodating the target molecule in the well 240 is not particularly limited.
  • the target molecule is captured on the target molecule capturing particle by bringing the target molecule capturing particle on which a specific binding substance for the target molecule is immobilized into contact with the target molecule. Capturing the molecules and subsequently introducing the target molecule capture particles into the flow path 220 of the detection device 200 to be contained in the well 240.
  • the target molecule capturing particle, the target molecule, and the above-described plural kinds of specific binding substances may be contacted in any order.
  • the target molecule capturing particle, the target molecule, and a plurality of types of specific binding substances may be contacted at the same time.
  • a plurality of types of specific binding substances may be contacted after contacting the target molecule-capturing particle and the target molecule.
  • the target molecule capturing particles may be further contacted after contacting the target molecule with a plurality of types of specific binding substances.
  • the target molecule-capturing particle and the target molecule are brought into contact under the condition that one target molecule-capturing particle captures zero or one target molecule.
  • one well 240 is configured to accommodate zero or one target molecule capturing particle. This enables digital measurement. That is, in the detection method according to this embodiment, the target molecule may be detected in units of one molecule.
  • a target molecule capture particle is a particle that can capture a target molecule. Examples include, but are not limited to, target molecule capturing particles on which a specific binding substance for a target molecule is immobilized as described above.
  • the particles are not particularly limited, and polymer particles, magnetic particles, glass particles, and the like can be used.
  • the particles are preferably particles that have been surface treated to avoid nonspecific adsorption.
  • the method for immobilizing the specific binding substance on the particle surface is not particularly limited, and is a method using physical adsorption, a method using chemical binding, a method using avidin-biotin binding, and binding between protein G or protein A and an antibody.
  • the method of using is mentioned. Of these, chemical bonds are preferred because of their high stability.
  • Examples of the physical adsorption method include a method in which a specific binding substance is immobilized on the particle surface by hydrophobic interaction or electrostatic interaction.
  • Examples of the chemical bonding method include a method using a crosslinking agent. For example, when the surface of the particle has a hydroxyl group, the carboxyl group of the specific binding substance is reacted with a crosslinking agent to form an active ester, and then the hydroxyl group is reacted with the ester group to thereby react the specific binding substance with the particle. It can be immobilized on the surface. In addition, it is preferable to provide a spacer between the specific binding substance and the particle surface so as not to inhibit the ability of the specific binding substance to recognize the target molecule.
  • the well 240 contains zero or one target molecule capture particle 110 or 112.
  • the flow path 220 is filled with a sealing liquid, and the solution stored in each well 240 forms a droplet (independent reaction chamber).
  • the target molecule capturing particle 110 captures one target molecule, and the target molecule capturing particle 112 does not capture the target molecule.
  • a plurality of types of specific binding substances that recognize different epitopes are bound to the target molecule.
  • each of the plurality of types of specific binding substances is not particularly limited.
  • a plurality of types of specific binding substances are labeled so as to be distinguishable from each other, and the target is detected by detecting each of the labels.
  • Plural kinds of specific binding substances bound to the molecule can be detected respectively.
  • the specific binding substance may be directly labeled or indirectly labeled.
  • particles on which a specific binding substance and a labeled molecule are immobilized may be used as the labeled specific binding substance.
  • the particles the same particles as those described above can be used.
  • label molecules that can be distinguished from each other include different nucleic acid fragments, different enzymes, and different fluorescent dyes. These labels may be used in combination.
  • the specific binding substance can be detected by utilizing the difference in the base sequence of the nucleic acid fragment. For example, using LAMP method, PCR method, invader method, etc., the difference in the base sequence of the nucleic acid fragment can be converted into a signal, and the specific binding substance can be detected.
  • the method for labeling a specific binding substance with a nucleic acid fragment is not particularly limited, and examples thereof include a method utilizing avidin-biotin binding and a method using a cross-linking agent.
  • the signal is not particularly limited, and for example, fluorescence, luminescence, color development, pH change, potential change and the like can be used.
  • a specific binding substance can be detected by reacting a fluorescent substrate or the like corresponding to each enzyme.
  • the specific binding substance can be directly detected by single molecule fluorescence detection or the like.
  • the step of detecting a specific binding substance includes a signal amplification reaction
  • the detection sensitivity can be improved and the time required for detection can be shortened.
  • the signal amplification reaction include an enzyme reaction.
  • All of the multiple types of specific binding substances may be labeled with nucleic acid fragments. Moreover, it is good also as a structure which detects a multiple types of specific binding substance using an invader method. In this case, the difference in the base sequence of all the nucleic acid fragments can be detected using one kind of enzyme (chrybase). According to such a method, since only one kind of enzyme is used, the reaction system can be adjusted to the optimum conditions for the enzyme to be used.
  • the invader method includes a signal amplification reaction, the time required to detect a plurality of types of specific binding substances can be shortened within a few minutes.
  • nucleic acid fragment when labeling a nucleic acid fragment on an antibody molecule, since the nucleic acid fragment is relatively small, for example, several to several tens of nucleic acid fragments can be labeled per antibody molecule. By increasing the number of nucleic acid fragments per antibody molecule, the time required to detect multiple types of specific binding substances can be further shortened. When labeling antibody molecules with nucleic acid fragments, several to several hundred nucleic acid fragments may be labeled per antibody molecule. According to the present embodiment, for example, the time required for the nucleic acid detection reaction (for example, invader reaction) is about 1 to 30 minutes, and rapid nucleic acid detection becomes possible.
  • the nucleic acid detection reaction for example, invader reaction
  • the signal amplification reaction is not included in the process in which the enzyme cleaves the substrate and detects fluorescence.
  • the number of enzyme molecules that can be labeled on antibody molecules is often several per antibody molecule, although it depends on the size of the molecule. For this reason, in order to detect fluorescence by the method described in Patent Document 3, a reaction time of at least several tens of minutes is required.
  • each well 240 contains zero or one target molecule capture particle.
  • a signal 250 derived from a plurality of types of specific binding substances is detected from the well containing the target molecule-capturing particle 110 that has captured the target molecule.
  • the signal 250 indicates that all types of the plural specific binding substances are detected.
  • the signal 250 is not detected from the well 240 that does not contain the target molecule capturing particles or the well 240 that contains the target molecule capturing particles 112 that do not capture the target molecule. Therefore, by counting the number of wells 240 in which the signal 250 is detected, the concentration of the target molecule can be accurately measured.
  • the wells 240 are aligned on the surface of the substrate 210, and may be, for example, a bottomed cylindrical space having a diameter of 5 ⁇ m and a depth of 5 ⁇ m.
  • the wells 240 may be arranged in a lattice shape along each side of the rectangular area of 5 mm in length and width on the surface of the substrate 210. What is necessary is just to set the magnitude
  • the volume of the well 240 can be set as appropriate. However, when the step of detecting a specific binding substance involves a signal amplification reaction, the reaction time until the signal can be detected is shortened when the volume of the well 240 is small. can do.
  • the volume of the well 240 may be 100 picoliters or 100 picoliters or less.
  • the volume of the well 240 may be set based on the amount of liquid in which the target molecule is one or less per well.
  • the detection device 200 may be configured so that the size of one well 240 is three times or less the volume of the target molecule.
  • other target molecules (second target molecules) having the target molecule (first target molecule) Target device) for example, a exosome as a second target molecule having a protein as a first target molecule, which will be described later) is introduced into one well so that there is no more than one. May be.
  • the target molecule is reduced so that the target molecule is 1 or less per well by diluting the concentration of the target molecule. It may be introduced into the well.
  • the method may further comprise the step of introducing two second target molecules (second target molecules having the first target molecule). At this time, the volume of the well 240 may be 100 picoliters or less than 100 picoliters.
  • the size of the well 240 may be configured such that one second target molecule is introduced according to the selected second target molecule.
  • You may comprise the detection device 200 so that it may become 3 times or less of the volume of a 2nd target molecule.
  • a first target molecule in each well of a device or a second target molecule having a first target molecule is captured in portions (eg, one first target in one well Labeled nucleic acid even if a large number of fluorescently labeled nucleic acids are present by providing a configuration in which molecules are introduced or in which one second target molecule is introduced in one well)
  • the target molecules (first target molecule, second target molecule) can be detected with high accuracy without interference of the fluorescence signals between them.
  • the substrate 210 is formed using a resin, for example.
  • the type of the resin is not particularly limited, but it is preferable to use a resin that is resistant to the sealing liquid when forming the reagent and droplets.
  • a resin with less autofluorescence For example, a cycloolefin polymer (COP), a cycloolefin copolymer (COC), a fluororesin, etc. can be selected.
  • COP cycloolefin polymer
  • COC cycloolefin copolymer
  • fluororesin etc.
  • FIG. 3A and 3B are schematic cross-sectional views illustrating a method according to this embodiment for detecting a target molecule in a micro compartment.
  • the complex 160 of the target molecule 100, the target molecule capturing particle 110, the specific binding substance 120 for the target molecule 100, and the specific binding substance 122 that recognizes different specific epitopes from the specific binding substance 120 are shown.
  • the specific binding substance 120 has a label 121.
  • the specific binding substance 122 has a label 123.
  • the specific binding substance 111, the specific binding substance 120, and the specific binding substance 122 immobilized on the target molecule capturing particle 110 correctly recognize the epitope of the target molecule 100.
  • the sign 121 and the sign 123 are distinguishable from each other.
  • the label 121 and the label 123 can generate fluorescence signals having different fluorescence wavelengths.
  • the specific binding substance 111 or the specific binding substance 120 misrecognizes the molecule 140 that is not the target molecule and forms a complex 150.
  • the specific binding substance 122 is not bound to the molecule 140, the label 123 does not exist in the complex 150.
  • marker 121 is detected, the signal derived from the label
  • the specific binding substance in the complex 150 can be identified as misrecognizing the target molecule.
  • the specific binding substance in the complex 150 can be identified as misrecognizing the target molecule.
  • the detection method according to the present embodiment is a method for accurately detecting a plurality of types of target molecules (a plurality of types of first target molecules) simultaneously.
  • 4A and 4B are schematic cross-sectional views illustrating a method according to the present embodiment for detecting a target molecule in a microcompartment.
  • the complex 160 of the target molecule 100, the target molecule capturing particle 110, the specific binding substance 120 for the target molecule 100, and the specific binding substance 122 that recognizes different specific epitopes from the specific binding substance 120 are shown.
  • the specific binding substance 120 has a label 121.
  • the specific binding substance 122 has a label 123.
  • the specific binding substance 111, the specific binding substance 120, and the specific binding substance 122 immobilized on the target molecule capturing particle 110 correctly recognize the epitope of the target molecule 100.
  • the sign 121 and the sign 123 are distinguishable from each other.
  • the label 121 and the label 123 can generate fluorescence signals having different fluorescence wavelengths. In the present embodiment, for example, if fluorescent signals respectively obtained from a plurality of labels are visible light, detection using various colors (multicolor detection) becomes possible.
  • the target molecule 180, the target molecule capturing particle 113, the specific binding substance 124 for the target molecule 180, and the specific binding substance 125 having different epitopes recognized by the specific binding substance 124 are combined.
  • the body 170 is accommodated in a well 240 formed on the surface of the substrate 210.
  • the specific binding substance 124 has a label 121.
  • the specific binding substance 125 has a label 126.
  • the specific binding substance 114, the specific binding substance 124, and the specific binding substance 125 immobilized on the target molecule capturing particle 113 correctly recognize the epitope of the target molecule 180.
  • the sign 121 and the sign 126 are distinguishable from each other. For example, the label 121 and the label 126 can generate fluorescence signals having different fluorescence wavelengths.
  • the detected signals can be identified. That is, the signal derived from the label 121 and the signal derived from the label 123 are detected from the complex 160 in FIG. 4A. 4B, a signal derived from the label 121 and a signal derived from the label 126 are detected.
  • the target molecule 100 and the target molecule 180 existing in a mixture in the sample can be identified and simultaneously detected with high accuracy.
  • FIG. 5A to FIG. 5H are diagrams illustrating examples of combinations of specific binding substances and labels that can simultaneously detect a plurality of types of target molecules.
  • a specific binding substance 120 and a specific binding substance 122 are bound to the target molecule 100.
  • the specific binding substance 120 has a label 121.
  • the specific binding substance 122 has a label 123.
  • the specific binding substance 120 and the specific binding substance 122 differ from each other in the recognized epitope. Further, the sign 121 and the sign 123 can be distinguished from each other.
  • FIG. 5B is a diagram showing an example in which target molecule capturing particles 110 are further bound to the complex of FIG. 5A.
  • a specific binding substance 111 having different epitopes recognized by the specific binding substance 120 and the specific binding substance 122 is immobilized on the target molecule capturing particle 110.
  • the target molecule-capturing particles for example, 0 molecule or 1 molecule can be accommodated in each well forming a microcompartment to facilitate digital measurement.
  • the specific binding substance 124 and the specific binding substance 125 are bound to the target molecule 180.
  • the specific binding substance 124 has a label 121.
  • the specific binding substance 125 has a label 126.
  • the specific binding substance 124 and the specific binding substance 125 have different recognized epitopes.
  • the sign 121 and the sign 126 are distinguishable from each other.
  • FIG. 5D is a diagram showing an example in which target molecule capturing particles 113 are further bound to the complex of FIG. 5C.
  • a specific binding substance 114 having different epitopes recognized by the specific binding substance 124 and the specific binding substance 125 is immobilized on the target molecule capturing particle 113.
  • the target molecule-capturing particles for example, 0 molecule or 1 molecule can be accommodated in each well forming a microcompartment to facilitate digital measurement.
  • a specific binding substance 190 and a specific binding substance 191 are bound to the target molecule 182 in order to detect the target molecule 182.
  • the specific binding substance 190 has a label 123.
  • the specific binding substance 191 has a label 126.
  • the specific binding substance 190 and the specific binding substance 191 have different recognized epitopes. Further, the sign 123 and the sign 126 are distinguishable from each other.
  • FIG. 5F is a diagram showing an example in which target molecule capturing particles 115 are further bound to the complex of FIG. 5E.
  • the specific binding substance 190 and the specific binding substance 116 having different epitopes recognized from the specific binding substance 191 are immobilized.
  • the target molecule-capturing particles for example, 0 molecule or 1 molecule can be accommodated in each well forming a microcompartment to facilitate digital measurement.
  • the specific binding substance 192, the specific binding substance 193, and the specific binding substance 194 are bound to the target molecule 184.
  • the specific binding substance 192 has a label 121.
  • the specific binding substance 193 has a label 123.
  • the specific binding substance 194 has a label 126.
  • the specific binding substance 192, the specific binding substance 193, and the specific binding substance 194 are different from each other in the recognized epitope.
  • the sign 121, the sign 123, and the sign 126 are distinguishable from each other.
  • FIG. 5H is a diagram showing an example in which target molecule capturing particles 117 are further bound to the complex of FIG. 5G.
  • a specific binding substance 192, a specific binding substance 193, and a specific binding substance 118 having different epitopes recognized from the specific binding substance 194 are immobilized.
  • the target molecule-capturing particles for example, 0 molecule or 1 molecule can be accommodated in each well forming a microcompartment to facilitate digital measurement.
  • the combinations of the labels bound to the target molecules are different from each other.
  • the target molecules 100, 180, 182 and 184 present in a mixed state can be identified and simultaneously detected with high accuracy.
  • the number of types of target molecules that can be simultaneously identified depends on the number of types of label combinations that can be identified, and can be further increased.
  • the target molecule detection method according to this embodiment includes a plurality of types of specific binding substances that are labeled with a plurality of nucleic acid fragments having labeling substances that generate fluorescent signals having different fluorescence wavelengths, and that recognize different epitopes.
  • a method can be provided.
  • a second target molecule having at least one of the plurality of types of the first target molecules is prepared, and the plurality of types of the first targets are prepared.
  • the second target molecule may be detected via detection of at least one of the molecules.
  • the target molecule detection method according to the present embodiment can be applied to analysis of proteins, extracellular vesicles (Exosomes), endoplasmic reticulums, viruses, cells, etc. as target molecules. It can also be applied to analysis of surface membrane proteins such as cells.
  • the target molecule detection method according to the present embodiment includes detection of extracellular vesicles (Exosomes), which are typical biomarkers in liquid biopsy, and proteins on the membrane surface of exosomes. It can also be applied to detection.
  • Exosomes are biomarkers that are deeply involved in various scenes such as the onset, malignancy, progression, and metastasis of diseases such as cancer.
  • Exosomes are membrane vesicles with a diameter of about 40 nm to 150 nm that are secreted by most cells. In the living body, it is observed in body fluids such as saliva, blood, urine, amniotic fluid, and malignant ascites, and is also secreted from cultured cells. In recent years, it has been pointed out that exosomes may play a role in transmitting information to distant cells and tissues. Exosomes contain various proteins, lipids, and nucleic acids, and are thought to cause functional and physiological changes when transported to other cells. As specific examples, it has been suggested that it has a role in mediating an adaptive immune response to infectious pathogens and tumors, tissue repair, neurotransmission, and transport of pathogenic proteins.
  • proteins present on the surface of exosome membranes change depending on the type of human or cancer, and the distribution of these proteins in biological samples is also different from the type of cancer. It is known to change by. Further, as proteins existing on the exosome membrane surface, for example, proteins such as CD9, CD63, and CD81 that are biomarkers of exosome are known to exist. Therefore, by investigating the distribution and behavior of proteins such as CD9, CD63, CD81, etc. on the surface of these exosome membranes, it can be applied to investigations and examinations of cancer types, the possibility of cancer occurrence, and the degree of cancer progression There is sex.
  • a labeled specific binding substance for example, an antibody
  • a protein such as CD9, CD63, or CD81 that appears on the membrane surface of one exosome
  • the label bound to each antibody is configured to emit a different fluorescent signal. Presence can be detected, and the presence and distribution of CD9, CD63, and CD81 on the exosome membrane surface can be determined by color according to color.
  • an exosome having one of CD9, CD63, and CD81, an exosome having two of CD9, CD63, and CD81, and an exosome having three of CD9, CD63, and CD81 are analyzed and determined by color difference.
  • the distribution of each exosome can be observed by the color difference. That is, according to the method for detecting a target molecule according to the present embodiment, the distribution and behavior of a protein serving as a biomarker existing on the exosome membrane surface in a biological sample can be observed, and the qualitative characteristics of each protein can be quickly and accurately. Application to analysis and quantitative analysis is possible.
  • the method for detecting a target molecule exemplifies the analysis of the protein on the exosome surface as described above
  • the present invention is not limited to the above exemplification, and the analysis of the protein existing on the membrane surface of a virus, a cell, or the like. It can be applied to the evaluation and detection of biomarkers indicating the possibility of cancer.
  • Target molecule detection kit One embodiment of the present invention provides a target molecule detection kit comprising a plurality of types of specific binding substances that are specific binding substances for a target molecule, and that recognize different epitopes and are labeled differently from each other. .
  • the target molecule, specific binding substance, and label are the same as those described above.
  • the specific binding substance may be labeled with different nucleic acid fragments.
  • Target molecule-capturing particles that capture prostate-specific antigen (PSA), which is one of prostate cancer markers, as a target molecule were prepared.
  • an anti-PSA monoclonal antibody (type “1H12”, Hytest) was biotinylated.
  • a commercially available kit (trade name “EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin”, Thermo Scientific Co., Ltd.) was used for biotinylation.
  • 50-fold molar amount of Sulfo-NHS-LC-Biotin 500 ⁇ L of 0.2 mg / mL
  • PBS phosphate buffer
  • biotinylated anti-PSA antibody is mixed with dispersed streptavidin-labeled beads (type “Magnosphere”, JSR), mixed for 10 minutes at room temperature, and biotin and streptavidin in 1 ⁇ binding buffer. Were combined. Subsequently, the beads were collected by setting on a magnetic stand for 1 minute, and the supernatant was discarded. The particles were washed 3 times with 1 ⁇ binding buffer to obtain target molecule-capturing particles.
  • Target molecule-capturing particles that capture one of gastrointestinal cancer markers, carcinoembryonic antigen (CEA), were prepared as target molecules.
  • Target molecule-capturing particles were prepared in the same manner as in Experimental Example 1 except that an anti-CEA monoclonal antibody (type “10-1392”, Fitzgerald) was used as the antibody.
  • nucleic acid-labeled anti-CEA antibody Similar to Experimental Example 3, the anti-CEA monoclonal antibody (type “10-1393”, Fitzgerald) and the anti-CEA monoclonal antibody (type “10-7883”, Fitzgerald) have the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. A DNA fragment (DNA fragment 3) and a DNA fragment (DNA fragment 4) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 were respectively bound to prepare a nucleic acid-labeled anti-CEA antibody. The nucleic acid-labeled anti-CEA antibody was prepared so that 5 to 20 times the amount of nucleic acid was modified with respect to the antibody (one antibody molecule).
  • a positive photoresist was coated, and a well pattern was formed using a photomask. Thereafter, CYTOP was dry etched with O 2 plasma. Subsequently, in order to remove the photoresist remaining on the surface, the surface was washed and rinsed with acetone and ethanol.
  • a 100-block well array was formed in a predetermined region on the substrate.
  • Each block had 10,000 wells. Therefore, a total of 1 million wells were formed in the above region.
  • the diameter of the well (micro compartment) formed by CYTOP was 5 ⁇ m, and had a volume capable of signal detection by invader reaction in a few minutes.
  • a glass plate (lid) having a liquid feeding port and the above-mentioned substrate were bonded using a double-sided tape having a thickness of 100 ⁇ m and processed into a channel shape, thereby producing a detection device.
  • the glass plate and the substrate were bonded so that the region where the well was formed was placed in the flow path.
  • Example 1 (Detection of PSA 1) Experiments were conducted using PSA as a target molecule. 50 ⁇ L of solutions containing various concentrations of PSA were added to sample tubes (protein non-adsorbed, Eppendorf). Subsequently, 10 6 target molecule-capturing particles, 50 ⁇ L of 10 ⁇ g / mL nucleic acid-labeled anti-PSA antibody labeled with a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are placed in each tube. 50 ⁇ L of 10 ⁇ g / mL nucleic acid-labeled anti-PSA antibody labeled with the DNA fragment was added and reacted at room temperature for 1 hour with stirring on a shaker to form a complex.
  • the invader reaction reagent is 1 ⁇ M allele probe 1 (SEQ ID NO: 5), 1 ⁇ M allele probe 2 (SEQ ID NO: 6), 1 ⁇ M invader oligo 1 (SEQ ID NO: 7), 1 ⁇ M FRET Cassette (FAM) (manufactured by Hologic), 1 ⁇ M FRET Cassette. (Redmond RED) (manufactured by Hologic), 10 mM MOPS (pH 7.5), 6.25 mM MgCl 2 , 50 U / ⁇ L crystal base and Tween 20 were included.
  • the allele probe 1 hybridizes with the DNA fragment of SEQ ID NO: 1 bound to the nucleic acid-labeled anti-PSA antibody, and as a result of the invader reaction, FAM which is a fluorescent dye emits fluorescence.
  • the allele probe 2 hybridizes with the DNA fragment of SEQ ID NO: 2 bound to the nucleic acid-labeled anti-PSA antibody, and as a result of the invader reaction, Redmond RED, which is a fluorescent dye, emits fluorescence.
  • fluorescence of FAM and Redmond RED in each well was detected using a fluorescence microscope (manufactured by Olympus). The exposure time was 2000 milliseconds.
  • Example 2 (Detection of PSA 2) Experiments were conducted using PSA as a target molecule. The same reaction as in Example 1 was performed except that the concentration of PSA in the sample was changed to 0 pg / mL (0 fM), 0.1 pg / mL (3 fM), 1 pg / mL (30 fM), 10 pg / mL (300 fM), Both FAM and Redmond RED fluorescence were detected.
  • the fact that both FAM and Redmond RED fluorescence are observed in the well of the detection device indicates that the well contains at least one molecule of PSA.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of measuring the number of wells in which fluorescence of both FAM and Redmond RED was observed by reacting PSA samples of various concentrations. As a result, it was revealed that PSA solutions having concentrations of 0 pg / mL (0 fM) and 0.1 pg / mL (3 fM) can be clearly distinguished. Also in this example, the heating time required for the invader reaction was 15 minutes, and it was revealed that PSA can be detected rapidly.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the number of wells in which FAM fluorescence was observed by reacting PSA samples of various concentrations. As a result, it was difficult to clearly distinguish PSA solutions having concentrations of 0 pg / mL (0 fM), 0.1 pg / mL (3 fM), and 1 pg / mL (30 fM).
  • Example 3 (Detection of PSA and CEA) Experiments were performed using a mixture of PSA and CEA as a target molecule. 50 ⁇ L of a solution in which 0.01 ng / mL PSA and 0.01 ng / mL CEA were mixed at a volume ratio of 1: 2 was added to a sample tube (protein non-adsorbed, Eppendorf).
  • 10 6 target molecule capturing particles 50 ⁇ L of 10 ⁇ g / mL nucleic acid-labeled anti-PSA antibody labeled with a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are placed in the above tube 50 ⁇ L of 10 ⁇ g / mL nucleic acid-labeled anti-PSA antibody labeled with a DNA fragment having 50 ⁇ L of 10 ⁇ g / mL nucleic acid-labeled anti-CEA antibody labeled with a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 50 ⁇ L of 10 ⁇ g / mL nucleic acid-labeled anti-CEA antibody labeled with the DNA fragment was added and reacted at room temperature for 1 hour with stirring on a shaker to form a complex.
  • the nucleic acid labeled anti-PSA antibody was prepared so that 5 to 20 times the amount of nucleic acid was modified with respect to the antibody (one antibody molecule).
  • the nucleic acid-labeled anti-CEA antibody was prepared so that 5 to 20 times the amount of nucleic acid was modified with respect to the antibody (one antibody molecule).
  • the invader reaction reagent is 1 ⁇ M allele probe 1 (SEQ ID NO: 5), 1 ⁇ M allele probe 2 (SEQ ID NO: 6), 1 ⁇ M allele probe 3 (SEQ ID NO: 8), 1 ⁇ M allele probe 4 (SEQ ID NO: 9), 1 ⁇ M invader oligo 1 ( SEQ ID NO: 7), 1 ⁇ M Invader Oligo 2 (SEQ ID NO: 10), 1 ⁇ M FRET Cassette (FAM) (made by Hologic), 1 ⁇ M FRET Cassette (Redmond RED) (made by Hologic), 1 ⁇ M FRET Cassette (TAMRA) (made by Hologic) ) 10 mM MOPS (pH 7.5), 6.25 mM MgCl 2 , 50 U / ⁇ L Chrybase and Tween
  • the allele probe 1 hybridizes with the DNA fragment of SEQ ID NO: 1 bound to the nucleic acid-labeled anti-PSA antibody, and as a result of the invader reaction, FAM which is a fluorescent dye emits fluorescence.
  • the allele probe 2 hybridizes with the DNA fragment of SEQ ID NO: 2 bound to the nucleic acid-labeled anti-PSA antibody, and as a result of the invader reaction, Redmond RED, which is a fluorescent dye, emits fluorescence.
  • the allele probe 3 hybridizes with the DNA fragment of SEQ ID NO: 3 bound to the nucleic acid-labeled anti-CEA antibody, and as a result of the invader reaction, FAM, which is a fluorescent dye, emits fluorescence.
  • the allele probe 4 hybridizes with the DNA fragment of SEQ ID NO: 4 labeled with the nucleic acid-labeled anti-CEA antibody and, as a result of the invader reaction, develops fluorescence that can be detected with TAMRA, which is a fluorescent dye.
  • both FAM and Redmond RED fluorescence in the well of the detection device indicates that the well contains at least one molecule of PSA. Moreover, the fact that both FAM and TAMRA fluorescence are observed indicates that the well contains at least one CEA molecule.
  • FC-40 fluorinated oil
  • fluorescence of FAM, Redmond RED, and TAMRA in each well was detected using a fluorescence microscope (Olympus).
  • the exposure time was 2000 milliseconds.
  • the concentration ratio of PSA and CEA calculated from the number of chambers in which both FAM and Redmond RED fluorescence were observed and the number of chambers in which both FAM and TAMRA fluorescence were observed was 1: 2. It was calculated. Further, the heating time required for the invader reaction in this example was 15 minutes, and it was revealed that PSA and CEA can be detected rapidly.
  • Example 4 ⁇ Reagent preparation> (Exosome-containing sample)
  • the culture supernatant containing exosome was prepared by mixing the colon cancer cell line HCT116 with McCoy's 5A Medium (Lonza): Exo-FBS (SBI): Penicillin Streptomycin Solution (Wako Pure Chemical Industries) at 90: 10: 1.
  • the culture supernatant cultured for 3 days in a medium was used. Cells were removed from the culture supernatant at 300 ⁇ g for 10 minutes. Further, debris was removed from the culture supernatant at 2000 ⁇ g for 10 minutes. Further, fine debris was removed from the culture supernatant at 10000 ⁇ g for 30 minutes.
  • DNA fragment 5 has the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • DNA fragment 6 has the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • -Allele probe 3 It has the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • -Allele probe 5 It has the base sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • Invader oligo 2 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • DNA fragments 5 and 6 were respectively bound to two types of anti-exosome antibodies (type “CD63”, type “CD81”, Cosmo Bio), and nucleic acid modified antibodies (DNA fragment 5-CD63, DNA Fragment 6-CD81) was prepared.
  • the nucleic acid-modified antibody was prepared so that 5-20 times the amount of nucleic acid was modified with respect to the antibody (one antibody molecule) in both DNA fragment 5-CD63 and DNA fragment 6-CD81.
  • an invader reaction reagent was prepared as a nucleic acid detection reagent.
  • the reagent composition of the invader reaction reagent in the present example is as follows.
  • the invader reaction reagent in Example 4 is 0.1 ⁇ M allele probe 3 (SEQ ID NO: 8), 0.1 ⁇ M allele probe 5 (SEQ ID NO: 13), 1 ⁇ M invader oligo 2 (SEQ ID NO: 10), 2 ⁇ M FRET Cassette (FAM) ( Holologic), 2 ⁇ M FRET Cassette (Redmond RED) (Holologic), 10 mM MOPS (pH 7.9), 10 mM MgCl 2 and 1000 U / ⁇ L chestnut.
  • the concentration of each component in these invader reaction reagents is the final concentration in the invader reaction reagent according to Example 4.
  • ⁇ Assembly of flow cell> The following three members were assembled so that the flow path had a height of 100 ⁇ m and a width of 6 to 7 mm.
  • -COP chamber forms micro holes with a diameter of 5 ⁇ m and a depth of 3.5 ⁇ m, STRATEC
  • Double-sided tape film thickness 100 ⁇ m, Hoyosha
  • COP liquid flow path strip carbon black addition coloring, liquid supply and waste liquid port included, Arakawa Resin Co., Ltd.
  • the reaction in the sample solution containing 50% serum was observed with a fluorescence microscope, and the result of superimposing the respective fluorescence images is shown on the right side of FIG.
  • the left side of FIG. 9 is an image when no serum is added (serum 0%).
  • the number of fluorescent chambers changed according to the content of the culture supernatant and serum in the sample. From these results, it was suggested that the exosome membrane surface protein was recognized by the digital invader using the exosome antibody, and the exosome contained in the culture supernatant and serum could be detected.
  • the allele probe 3 hybridizes with the DNA fragment 5 of SEQ ID NO: 11 bound to CD63, and as a result of the invader reaction, FAM which is a fluorescent dye emits fluorescence.
  • FAM which is a fluorescent dye emits fluorescence.
  • FAM emitted green fluorescence.
  • CD63 which is a protein present on the exosome membrane surface, could be detected.
  • the allele probe 5 hybridizes with the DNA fragment 6 of SEQ ID NO: 12 bound to CD81, and as a result of the invader reaction, Redmond RED that is a fluorescent dye emits fluorescence.
  • Redmond RED emits red fluorescence on the right side of FIG. 8 and the right side of FIG.
  • the observation of fluorescence of Redmond RED is considered that CD81, which is a protein present on the exosome membrane surface, could be detected.
  • yellow fluorescence that is considered to be a fluorescence signal when both the green fluorescence that is FAM-derived fluorescence and the red fluorescence derived from Redmond RED is obtained. Observed. In addition, the fact that fluorescence (yellow) derived from both FAM and Redmond RED is observed is considered to be able to detect exosomes in which two proteins, CD63 and CD81, exist on the exosome membrane surface.
  • exosomes having CD63 on the membrane surface and exosomes having CD81 on the membrane surface are obtained by green, red, and yellow fluorescence signals. And the presence of exosomes having both CD63 and CD81 on the membrane surface could be confirmed. That is, it was confirmed that exosomes as the second target molecule could be detected through detection of CD63 and CD81 as the plurality of types of first target molecules. Moreover, according to the present Example, it is thought that the distribution of CD63 and CD81 existing in the exosome in the biological sample could be determined by detecting a plurality of fluorescent signals such as green, red, and yellow.
  • nucleic acid-modified antibody Since a plurality of proteins on the exosome membrane surface can be recognized and detected by the digital invader reaction with the nucleic acid-modified antibody, it has a large number of reaction starting materials (as compared to the antibody as in this example).
  • nucleic acid fragments When nucleic acid fragments are modified, it is suggested that multiple items can be quantitatively detected in a short time by digital measurement even in the case where a lot of substances that serve as the base point of the fluorescence signal are bound) It was. This is because many fluorescently labeled nucleic acid fragments are bound to the antibody that recognizes the protein.
  • the size of the well was configured so that one or less exosome (second target molecule having a protein as the first target molecule) was introduced into one well, Even if there are many antibodies having fluorescently labeled nucleic acid fragments, it is considered that the protein possessed by the exosome could be detected without receiving interference of excess antibody-derived fluorescence.
  • the method for detecting a target molecule even when a biological sample is passed through one flow cell, quantitative detection of a plurality of target molecules in a short time by multicolor detection that simultaneously detects a plurality of fluorescent signals. It was suggested that this is possible. Further, according to the target molecule detection method according to the present example, it is possible to detect proteins and the like present on the surface of a biological sample such as exosomes, and the distribution of these proteins and the like is observed by multicolor detection. It is also possible to apply to qualitative analysis, such as investigating the behavior and distribution of proteins that serve as biomarkers related to cancer.
  • the present invention it is possible to provide a technique capable of detecting a target molecule with high accuracy even when a specific binding substance to the target molecule causes misrecognition.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

標的分子の検出方法であって、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させる標識物質を有する複数の核酸断片で標識され、かつ、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質と、複数種類の第一の標的分子と、を準備する工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、前記複数種類の前記第一の標的分子を前記複数種類の前記特異的結合物質に応じた複数の前記蛍光シグナルにより判断する工程と、を備える。

Description

標的分子の検出方法及び標的分子検出キット
　本発明は、標的分子の検出方法及び標的分子検出キットに関する。
　本願は、２０１６年５月１９日に日本に出願された特願２０１６－１００２３１号、および、２０１６年１２月１３日に日本に出願された特願２０１６－２４１０２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生体試料中の標的分子を定量的に検出することにより、疾患の早期発見や投薬の効果予測が行われている。従来、タンパク質の定量は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等により行われ、核酸の定量はリアルタイムＰＣＲ法等により行われてきた。
　近年、疾患をより早期に発見する等の目的で、標的分子をより精度よく検出するニーズが高まっている。標的分子を精度よく検出する手法として、例えば、特許文献１、特許文献２、非特許文献１等には、多数の微小区画内で酵素反応を行う技術が記載されている。
　これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。
　デジタル計測では、試料溶液を極めて多数の微小溶液に分割する。そして、各微小溶液からの信号を２値化し、標的分子が存在するか否かのみを判別して、標的分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
　デジタル計測においては、標的分子に対するモノクローナル抗体等の特異的結合物質を用いて標的分子の存在を検出する場合がある。しかしながら、特異的結合物質を用いた標的分子の検出では、特異的結合物質が、標的分子と類似構造を有するタンパク質上の相同エピトープの誤認識、非特異的な認識等の誤認識を生じ、標的物質の検出精度が低下してしまう場合がある。
　この問題を解決するために、例えば特許文献３には、ターゲット分子と、前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消光物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、前記複合体と、を反応させて、前記蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出手順と、蛍光波長の異なる二以上の蛍光の検出信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理する解析手順と、を含むターゲット分子の検出方法が記載されている。
日本国特許第５５５１７９８号公報 日本国特表２０１４－５０３８３１号公報 国際公開第２０１６／０４７０６８号パンフレット
Kim S. H., et al., Large-scale femtoliter droplet array fordigital counting of single biomolecules., Lab on a Chip, 12 (23), 4986-4991, 2012.
　しかしながら、特許文献３に記載された方法には改良の余地がある。例えば、特許文献３に記載された方法では、酵素が基質を切断し、蛍光を検出する過程にシグナル増幅反応が含まれない。また、抗体分子に標識することができる酵素分子の数は、分子の大きさにもよるが、抗体１分子あたり数個であることが多い。このため、特許文献３に記載された方法で蛍光を検出するためには、少なくとも数十分間の反応時間が必要である。
　そこで、本発明は、標的分子を迅速に、かつ、精度よく検出できる技術を提供することを目的とする。
　また、本発明の他の目的は、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出できる技術を提供することを目的とする。
　本発明の第一態様に係る標的分子の検出方法は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させる標識物質を有する複数の核酸断片で標識され、かつ、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質と、複数種類の第一の標的分子と、を準備する工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、前記複数種類の前記第一の標的分子を前記複数種類の前記特異的結合物質に応じた複数の前記蛍光シグナルにより判断する工程と、を備える。
　前記特異的結合物質の１分子に対して前記複数の核酸断片が数個～数十個結合してもよい。
　前記特異的結合物質が抗体であってもよい。
　前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つを有する第二の標的分子を準備し、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つの検出を介して前記第二の標的分子を検出してもよい。
　前記第二の標的分子がエクソソームであってもよい。
　前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つが前記エクソソームの膜表面上に存在していてもよい。
　前記複数種類の前記第一の標的分子が疾患マーカータンパク質であってもよい。
　複数のウェルを有する基板を備えた検出デバイスを準備し、前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程の後に、前記複数のウェルにおいて１つのウェルに１つの前記第二の標的分子を導入する工程をさらに備えていてもよい。
　同時に前記複数種類の前記第一の標的分子を検出してもよい。
　本発明の第二態様に係る標的分子の検出方法は、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質のうち２種以上が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断する工程と、を備える。
　前記標的分子の検出が１分子単位で行われてもよい。
　前記複数種類の特異的結合物質の少なくとも１種が核酸断片で標識されていてもよい。
　前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程が、シグナル増幅反応を含んでいてもよい。
　同時に複数種類の標的分子を検出してもよい。
　本発明の第二態様に係る標的分子検出キットは、標的分子に対する特異的に結合し、認識するエピトープが互いに異なり、互いに識別可能に標識された複数種類の特異的結合物質を備える。
　前記複数種類の特異的結合物質が、互いに異なる核酸断片で標識されていてもよい。
　本発明の上記態様によれば、標的分子を迅速に、かつ、精度よく検出できる技術を提供することができる。
　また、本発明の上記態様によれば、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出できる技術を提供することができる。
図１Ａは、微小区画内で標的分子を検出する従来の方法を説明する模式断面図である。 図１Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する従来の方法を説明する模式断面図である。 デジタル計測により標的分子を検出する様子を説明する模式断面図である。 図３Ａは、微小区画内で標的分子を検出する方法の第１実施形態を説明する模式断面図である。 図３Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する方法の第１実施形態を説明する模式断面図である。 図４Ａは、微小区画内で標的分子を検出する方法の第２実施形態を説明する模式断面図である。 図４Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する方法の第２実施形態を説明する模式断面図である。 図５Ａは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｂは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｃは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｄは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｅは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｆは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｇは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 図５Ｈは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。 実施例２の結果を示すグラフである。 比較例２の結果を示すグラフである。 実施例４に係るデジタルインベーダーによる培養上清中におけるエクソソーム検出結果である。 実施例４に係るデジタルインベーダーによる血清中におけるエクソソーム検出結果である。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［従来の検出方法］
　まず、従来の標的分子の検出方法の代表的な例について説明する。図１Ａ及び図１Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する従来の方法を説明する模式断面図である。図１Ａでは、標的分子１００と、標的分子捕捉粒子１１０と、標的分子１００に対する特異的結合物質１２０との複合体１３０が、基板２１０の表面に形成されたウェル２４０に収容されている。標的分子捕捉粒子１１０には、特異的結合物質１１１が固定化されている。また、特異的結合物質１２０は標識（標識分子）１２１を有している。図１Ａにおいて、標的分子捕捉粒子１１０に固定化された特異的結合物質１１１及び特異的結合物質１２０は、標的分子１００のエピトープを正しく認識している。
　これに対し、図１Ｂでは、特異的結合物質１１１又は特異的結合物質１２０の少なくとも一方が、標的分子ではない分子１４０を誤認識し、複合体１５０を形成している。
　ここで、標識１２１の存在を指標として標的分子１００が存在すると判断した場合、特異的結合物質１２０は標識１２１を有しているため、標的分子１００が存在すると判断される。
　このように、従来の検出方法では、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じると、標的分子を正確に検出することができない場合がある。
　特異的結合物質による標的分子の誤認識の原因としては、標的分子と類似構造を有するタンパク質又はペプチド上の相同エピトープの存在が挙げられ、一定の頻度で起こる。従来の検出方法であるＥＬＩＳＡでは、ごく一部の特異的結合物質が誤認識しても測定誤差はわずかであるが、デジタル計測においては標的分子の低濃度領域を正確に測定する必要があるため、抗体の誤認識は測定誤差に影響を及ぼす。
［標的分子の検出方法］
　本発明の１実施形態は、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる工程と、複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、複数種類の前記特異的結合物質のうち２種以上が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断する工程と、を備える、標的分子の検出方法を提供する。以下、本実施形態に係る検出方法について説明する。
（標的分子に複数種類の特異的結合物質を結合させる工程）
　まず、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる。この工程は、例えばサンプルチューブ内で標的分子と特異的結合物質を接触させることにより行うことができる。ここで、特異的結合物質の種類の数は２以上であり、３以上であってもよく、４以上であってもよく、５以上であってもよい。
《標的分子》
　標的分子としては特に制限されず、任意の分子を検出することができる。具体的には、例えば、生体試料中の疾患マーカータンパク質、環境試料中の特定化合物等が挙げられる。生体試料としては特に制限されず、血清、血漿、尿等が挙げられる。また、環境試料としては、例えば、河川の水、工場排水等が挙げられる。
《特異的結合物質》
　特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に標的分子又は標的分子の断片を抗原として免疫反応させることによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
　アプタマーとは、標的分子に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的分子に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的分子に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
（複数種類の特異的結合物質をそれぞれ検出する工程）
　続いて、複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する。図２は、一例として、検出デバイス２００を用いたデジタル計測により標的分子を検出する様子を説明する模式断面図である。
　図２に示すように、検出デバイス２００は、基板２１０と、流路２２０と、蓋体２３０とを備えており、基板２１０の表面には複数のウェル２４０が形成されている。
　まず、標的分子をウェル２４０に収容する。標的分子をウェル２４０に収容する方法は特に制限されず、例えば、標的分子に対する特異的結合物質を固定化した標的分子捕捉粒子を上記の標的分子に接触させることにより、標的分子捕捉粒子上に標的分子を捕捉し、続いて、標的分子捕捉粒子を検出デバイス２００の流路２２０内に導入してウェル２４０に収容することが挙げられる。
　ここで、標的分子捕捉粒子、標的分子、上述した複数種類の特異的結合物質は、いずれの順序で接触させてもよい。例えば、標的分子捕捉粒子と標的分子と複数種類の特異的結合物質とを同時に接触させてもよい。あるいは、標的分子捕捉粒子と標的分子とを接触させた後に、複数種類の特異的結合物質を接触させてもよい。あるいは、標的分子と複数種類の特異的結合物質とを接触させた後に、標的分子捕捉粒子を更に接触させてもよい。
　ここで、標的分子捕捉粒子１個に標的分子が０分子又は１分子捕捉される条件で標的分子捕捉粒子と標的分子とを接触させることが好ましい。更に、１つのウェル２４０には、標的分子捕捉粒子が０個又は１個収容されるように構成されることが好ましい。これによりデジタル計測が可能となる。すなわち、本実施形態に係る検出方法において、標的分子の検出は１分子単位で行われてもよい。
《標的分子捕捉粒子》
　標的分子捕捉粒子は、標的分子を捕捉することができる粒子である。例えば、上述した、標的分子に対する特異的結合物質を固定化した標的分子捕捉粒子が挙げられるがこれに限定されない。
　粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子、ガラス粒子等を利用することができる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理を施してある粒子が好ましい。
　特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法としては、特に制限されず、物理吸着による方法、化学結合による方法、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法、プロテインＧ又はプロテインＡと抗体との結合を利用する方法等が挙げられる。中でも、安定性が高いことから化学結合が好ましい。
　物理吸着による方法としては、疎水的相互作用、静電的相互作用により、特異的結合物質を粒子表面に固定化する方法が挙げられる。化学結合による方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。例えば、粒子の表面が水酸基を有する場合、特異的結合物質が有するカルボキシル基に架橋剤を反応させて活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることにより、特異的結合物質を粒子表面に固定化させることができる。また、特異的結合物質による標的分子の認識能を阻害しないよう、特異的結合物質と粒子表面との間にスペーサーを設けることが好ましい。
（複数種類の特異的結合物質を結合させる工程の一例）
　図２では、ウェル２４０が０個又は１個の標的分子捕捉粒子１１０又は１１２を収容している。また、流路２２０は封止液で満たされており、各ウェル２４０に収容された溶液は液滴（独立した反応室）を形成している。図１Ａおよび図１Ｂにおいて、標的分子捕捉粒子１１０は標的分子を１分子捕捉しており、標的分子捕捉粒子１１２は標的分子を捕捉していない。また、標的分子には認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質が結合している。
　続いて、上記の複数種類の特異的結合物質をそれぞれ検出する。複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する方法としては特に制限されず、例えば、複数種類の特異的結合物質が、互いに識別可能に標識されており、当該標識をそれぞれ検出することにより、標的分子に結合した複数種類の特異的結合物質をそれぞれ検出することができる。
　特異的結合物質は、直接標識されていてもよく、間接的に標識されていてもよい。例えば、特異的結合物質及び標識分子を固定化した粒子を、標識された特異的結合物質として使用してもよい。ここで、粒子としては、上述したものと同様の粒子を用いることができる。
　互いに識別可能な標識分子としては、例えば、互いに異なる核酸断片、互いに異なる酵素、互いに異なる蛍光色素等が挙げられる。これらの標識は組み合わせて用いられてもよい。
　標識分子が互いに異なる核酸断片であった場合には、核酸断片の塩基配列の相違を利用して特異的結合物質を検出することができる。例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、インベーダー法等を利用して、核酸断片の塩基配列の相違をシグナルに変換し、特異的結合物質を検出することができる。特異的結合物質を核酸断片で標識する方法としては、特に制限されず、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法、架橋剤を使用する方法等が挙げられる。
　シグナルとしては特に制限されず、例えば、蛍光、発光、発色、ｐＨの変化、電位変化等を利用することができる。
　また、標識分子が互いに異なる酵素であった場合には、それぞれの酵素に対応する蛍光基質等を反応させて、特異的結合物質を検出することができる。また、標識分子が互いに異なる蛍光色素であった場合には、１分子蛍光検出等により、特異的結合物質を直接検出することができる。
　特異的結合物質を検出する工程が、シグナル増幅反応を含む場合、検出感度を向上させることができ、検出に要する時間を短縮することができる。シグナル増幅反応としては、例えば酵素反応が挙げられる。
　標的分子１分子に複数種類の特異的結合物質を結合させ、複数種類の特異的結合物質をそれぞれ検出し、２種以上、好ましくは全ての種類の特異的結合物質が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断すれば、標的分子を精度よく検出することができる。これは、複数の当該特異的結合物質のうち２種以上が誤認識する確率が低いためである。
　複数種類の特異的結合物質の全てが核酸断片で標識されていてもよい。また、複数種類の特異的結合物質を、インベーダー法を利用して検出する構成としてもよい。この場合、１種類の酵素（クリベース）を用いて、全ての核酸断片の塩基配列の相違を検出することができる。このような方法によれば、使用する酵素が１種類でよいことから、反応系を、使用する酵素に最適な条件に調整することができる。
　また、インベーダー法はシグナル増幅反応を含むことから、複数種類の特異的結合物質を検出するのに要する時間を数分以内に短縮することができる。
　また、例えば抗体分子に核酸断片を標識する場合、核酸断片は比較的分子が小さいことから、抗体１分子あたり例えば数個～数十個の核酸断片を標識することができる。抗体１分子あたりの核酸断片の数を増加させることにより、複数種類の特異的結合物質を検出するのに要する時間を更に短縮することができる。また、抗体分子に核酸断片を標識する場合、抗体１分子あたり数個～数百個の核酸断片を標識してもよい。
　本実施形態によれば、例えば、核酸検出反応(例えばインベーダー反応)に係る時間が１分～３０分程度であり、迅速な核酸検出が可能となる。
　これに対し、例えば特許文献３に記載された方法では、基質特異性が互いに異なる２種類の酵素を使用する。このため、これらの酵素の最適な反応条件が異なっている場合、反応系を、使用する酵素の全てに最適な条件に調整することは困難である。
　また、特許文献３に記載された方法では、酵素が基質を切断し、蛍光を検出する過程にシグナル増幅反応が含まれない。また、抗体分子に標識することができる酵素分子の数は、分子の大きさにもよるが、抗体１分子あたり数個であることが多い。このため、特許文献３に記載された方法で蛍光を検出するためには、少なくとも数十分間の反応時間が必要である。
　図２では、各ウェル２４０が０個又は１個の標的分子捕捉粒子を収容している。そして、標的分子を捕捉した標的分子捕捉粒子１１０を収容したウェルからは、複数種類の特異的結合物質に由来するシグナル２５０が検出されている。シグナル２５０は、複数種類の前記特異的結合物質の全ての種類が検出されていることを示す。
　これに対し、標的分子捕捉粒子を収容していないウェル２４０、又は標的分子を捕捉していない標的分子捕捉粒子１１２を収容したウェル２４０からはシグナル２５０は検出されない。したがって、シグナル２５０が検出されたウェル２４０の数を数えることにより、標的分子の濃度を正確に測定することができる。
　ここで、検出デバイス２００の構造についてより詳細に説明する。ウェル２４０は基板２１０の表面に整列配置されており、例えば、直径が５μｍ、深さが５μｍの有底円柱形状の空間であってもよい。
　例えば、ウェル２４０は、基板２１０表面の縦横５ｍｍの矩形の領域に、当該領域の各辺に沿って格子状に配列されていてもよい。各ウェル２４０間の隙間の大きさは、各ウェル２４０のシグナルを独立して検出できる分解能に応じて設定すればよい。
　ウェル２４０の容積は適宜設定することができるが、特異的結合物質を検出する工程がシグナル増幅反応を伴う場合には、ウェル２４０の容積が小さい方がシグナル検出可能となるまでの反応時間を短縮することができる。例えば、ウェル２４０の容積は、１００ピコリットル又は１００ピコリットル以下であってもよい。
　例えば、十分な強度のシグナルを発生させるのに要する時間を短縮する目的においては、標的分子が１ウェルに１つ以下となる液量に基づいてウェル２４０の容積を設定してもよい。
　この際、１つのウェル２４０の大きさが標的分子の体積の３倍以下となるように検出デバイス２００を構成してもよい。
　また、標的分子が１つのウェルに１つ以下となるように導入されるように検出デバイス２００を製造する以外にも、標的分子（第一の標的分子）を有する他の標的分子（第二の標的分子）（例えば、後述する第一の標的分子としてのタンパク質を有する第二の標的分子としてのエクソソーム等）を1つのウェルに１つ以下となるように導入されるように検出デバイス２００を製造してもよい。また、標的分子が1つのウェルに１つ以下となるように検出デバイスを製造する以外に、標的分子の濃度を希釈することによって標的分子が１つのウェルに１つ以下となるように標的分子をウェルに導入してもよい。
　複数のウェル２４０を有する基板２１０を備えた検出デバイス２００を準備し、複数種類の前記特異的結合物質を複数の第一の標的分子に結合させる工程の後に、複数のウェルにおいて１つのウェルに１つの第二の標的分子（第一の標的分子を有する第二の標的分子）を導入する工程をさらに備えていてもよい。
　この際、ウェル２４０の容積は、１００ピコリットル又はそれ１００ピコリットル以下であってもよい。
　また、ウェル２４０の大きさは、選択される第二の標的分子に応じて、１つの第二の標的分子が導入されるように構成してもよく、例えば、１つのウェル２４０の大きさが第二の標的分子の体積の３倍以下となるように検出デバイス２００を構成してもよい。
　例えば、１つのデバイスの各ウェルに第一の標的分子、または、第一の標的分子を有する第二の標的分子が小分けに捕捉されるような（例えば、１つのウェルに１つの第一の標的分子が導入されるような、または、１つのウェルに１つの第二の標的分子が導入されるような）構成を備えることによって、蛍光標識された核酸が多数存在しても、標識された核酸同士の蛍光シグナルが干渉せずに、精度よく標的分子（第一の標的分子、第二の標的分子）の検出が可能となる。
　基板２１０は、例えば樹脂を用いて形成される。樹脂の種類は特に限定されないが、試薬及び液滴を形成する際の封止液に対し耐性のある樹脂を用いることが好ましい。また、シグナルを蛍光観察する場合には、自家蛍光の少ない樹脂を選ぶことが好ましい。例えば、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、フッ素樹脂等を選ぶことができる。
（第１実施形態）
　第１実施形態に係る標的分子の検出方法について説明する。図３Ａ及びＢは、微小区画内で標的分子を検出する本実施形態に係る方法を説明する模式断面図である。図３Ａでは、標的分子１００と、標的分子捕捉粒子１１０と、標的分子１００に対する特異的結合物質１２０と、特異的結合物質１２０とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１２２との複合体１６０が、基板２１０の表面に形成されたウェル２４０に収容されている。特異的結合物質１２０は標識１２１を有している。特異的結合物質１２２は標識１２３を有している。図３Ａにおいて、標的分子捕捉粒子１１０に固定化された特異的結合物質１１１、特異的結合物質１２０及び特異的結合物質１２２は、標的分子１００のエピトープを正しく認識している。標識１２１及び標識１２３は互いに識別可能である。例えば、標識１２１及び標識１２３は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させることができる。
　これに対し、図３Ｂでは、特異的結合物質１１１又は特異的結合物質１２０の少なくとも一方が、標的分子ではない分子１４０を誤認識し、複合体１５０を形成している。
　ここで、分子１４０には、特異的結合物質１２２が結合していないため、複合体１５０中には標識１２３が存在しない。このため、複合体１５０においては、標識１２１に由来するシグナルは検出されるものの、標識１２３に由来するシグナルは検出されない。
　したがって、複合体１５０中の特異的結合物質は、標的分子を誤認識していると特定することができる。その結果、標的分子を正しく認識した複合体１６０を収容したウェルの数のみを計測することにより、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出することが可能になる。
（第２実施形態）
　第２実施形態に係る標的分子の検出方法について説明する。本実施形態に係る検出方法は、同時に複数種類の標的分子（複数種類の第一の標的分子）を精度よく検出する方法である。図４Ａ及び図４Ｂは、微小区画内で標的分子を検出する本実施形態に係る方法を説明する模式断面図である。図４Ａでは、標的分子１００と、標的分子捕捉粒子１１０と、標的分子１００に対する特異的結合物質１２０と、特異的結合物質１２０とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１２２との複合体１６０が、基板２１０の表面に形成されたウェル２４０に収容されている。特異的結合物質１２０は標識１２１を有している。特異的結合物質１２２は標識１２３を有している。図４Ａにおいて、標的分子捕捉粒子１１０に固定化された特異的結合物質１１１、特異的結合物質１２０及び特異的結合物質１２２は、標的分子１００のエピトープを正しく認識している。標識１２１及び標識１２３は互いに識別可能である。例えば、標識１２１及び標識１２３は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させることができる。本実施形態においては、例えば、複数の標識からそれぞれ得られる蛍光シグナルが可視光であれば、種々の色を利用した検出（多色検出）が可能になる。
　また、図４Ｂでは、標的分子１８０と、標的分子捕捉粒子１１３と、標的分子１８０に対する特異的結合物質１２４と、特異的結合物質１２４とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１２５との複合体１７０が、基板２１０の表面に形成されたウェル２４０に収容されている。特異的結合物質１２４は標識１２１を有している。特異的結合物質１２５は標識１２６を有している。図４Ｂにおいて、標的分子捕捉粒子１１３に固定化された特異的結合物質１１４、特異的結合物質１２４及び特異的結合物質１２５は、標的分子１８０のエピトープを正しく認識している。標識１２１及び標識１２６は互いに識別可能である。例えば、標識１２１及び標識１２６は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させることができる。
　ここで、図４Ａと図４Ｂでは、検出されるシグナルが識別可能である。すなわち、図４Ａの複合体１６０からは標識１２１に由来するシグナル及び標識１２３に由来するシグナルが検出される。また、図４Ｂの複合体１７０からは標識１２１に由来するシグナル及び標識１２６に由来するシグナルが検出される。
　このため、本実施形態に係る検出方法によれば、試料中に混合して存在する標的分子１００と標的分子１８０とを識別して同時に高精度に検出することができる。
　続いて、複数種類の標的分子を同時に検出する場合の特異的結合物質及び標識の組み合わせの例について説明する。図５Ａ～図５Ｈは、複数種類の標的分子を同時に検出することができる特異的結合物質及び標識の組み合わせの例を説明する図である。
　図５Ａでは、標的分子１００を検出するために、標的分子１００に、特異的結合物質１２０及び特異的結合物質１２２を結合させる。特異的結合物質１２０は標識１２１を有している。また、特異的結合物質１２２は標識１２３を有している。特異的結合物質１２０と特異的結合物質１２２は、認識するエピトープが互いに異なる。また、標識１２１及び標識１２３は互いに識別可能である。
　図５Ｂは、図５Ａの複合体に、標的分子捕捉粒子１１０が更に結合した例を示す図である。標的分子捕捉粒子１１０には、特異的結合物質１２０及び特異的結合物質１２２とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１１１が固定化されている。
　上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を０分子又は１分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
　図５Ｃでは、標的分子１８０を検出するために、標的分子１８０に、特異的結合物質１２４及び特異的結合物質１２５を結合させる。特異的結合物質１２４は標識１２１を有している。また、特異的結合物質１２５は標識１２６を有している。特異的結合物質１２４と特異的結合物質１２５は、認識するエピトープが互いに異なる。また、標識１２１及び標識１２６は互いに識別可能である。
　図５Ｄは、図５Ｃの複合体に、標的分子捕捉粒子１１３が更に結合した例を示す図である。標的分子捕捉粒子１１３には、特異的結合物質１２４及び特異的結合物質１２５とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１１４が固定化されている。
　上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を０分子又は１分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
　図５Ｅでは、標的分子１８２を検出するために、標的分子１８２に、特異的結合物質１９０及び特異的結合物質１９１を結合させる。特異的結合物質１９０は標識１２３を有している。また、特異的結合物質１９１は標識１２６を有している。特異的結合物質１９０と特異的結合物質１９１は、認識するエピトープが互いに異なる。また、標識１２３及び標識１２６は互いに識別可能である。
　図５Ｆは、図５Ｅの複合体に、標的分子捕捉粒子１１５が更に結合した例を示す図である。標的分子捕捉粒子１１５には、特異的結合物質１９０及び特異的結合物質１９１とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１１６が固定化されている。
　上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を０分子又は１分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
　図５Ｇでは、標的分子１８４を検出するために、標的分子１８４に、特異的結合物質１９２、特異的結合物質１９３及び特異的結合物質１９４を結合させる。特異的結合物質１９２は標識１２１を有している。また、特異的結合物質１９３は標識１２３を有している。また、特異的結合物質１９４は標識１２６を有している。特異的結合物質１９２、特異的結合物質１９３及び特異的結合物質１９４は、認識するエピトープが互いに異なる。また、標識１２１、標識１２３及び標識１２６は互いに識別可能である。
　図５Ｈは、図５Ｇの複合体に、標的分子捕捉粒子１１７が更に結合した例を示す図である。標的分子捕捉粒子１１７には、特異的結合物質１９２、特異的結合物質１９３及び特異的結合物質１９４とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質１１８が固定化されている。上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を０分子又は１分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
　このように、図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｅ及び図５Ｇ（あるいは、図５Ｂ、図５Ｄ、図５Ｆ及び図５Ｈ）では、標的分子に結合した標識の組み合わせがそれぞれ異なっているため、試料中に混合して存在する標的分子１００、１８０、１８２及び１８４を識別して同時に高精度に検出することができる。同時に識別可能な標的分子の種類の数は、識別可能な標識の組み合わせの種類の数に依存し、更に増加させることもできる。
　なお、上記第２実施形態に係る標的分子の検出方法の図５Ａ～図５Ｈの例示においては、１つの標的分子に２つ以上の標識を結合させる例を示したが、１つの標的分子に１つの標識が結合される場合を考慮した使用も可能である。
　本実施形態に係る標的分子の検出方法は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させる標識物質を有する複数の核酸断片で標識され、かつ、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質と、複数種類の第一の標的分子と、を準備する工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、前記複数種類の前記第一の標的分子を前記複数種類の前記特異的結合物質に応じた複数の前記蛍光シグナルにより判断する工程と、を備える、標的分子の検出方法を提供することができる。
　また、本実施形態に係る標的分子の検出方法においては、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つを有する第二の標的分子を準備し、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つの検出を介して前記第二の標的分子を検出してもよい。
　本実施形態に係る標的分子の検出方法は、例えば、標的分子として、タンパク質、細胞外小胞（Ｅｘｏｓｏｍｅ、エクソソーム）、小胞体、ウイルス、細胞等の分析に応用可能であり、小胞体、ウイルス、細胞等の表面膜タンパクの分析等にも応用可能である。
　具体的には、本実施形態に係る標的分子の検出方法は、リキッドバイオプシー中の代表的なバイオマーカーである細胞外小胞（Ｅｘｏｓｏｍｅ、エクソソーム）等の検出、および、エクソソームの膜表面上のタンパク質の検出にも応用可能である。
　エクソソームは、ガンを代表とした疾患の発症、悪性化、進行、及び転移等に様々な場面に深く係わりを持つバイオマーカーである。
　また、エクソソームは、ほとんどの細胞で分泌される直径４０ｎｍ～１５０ｎｍ程度の膜小胞である。
　生体では唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水等の体液中で観察され、培養細胞からも分泌される。近年、エクソソームは、離れた細胞や組織に情報を伝達するための役割を担っている可能性が指摘されている。エクソソームには様々なタンパク質や脂質、核酸が含まれており、別の細胞に運搬されることによって機能的変化や生理的変化を引き起こすと考えられている。その具体例としては、感染性病原体や腫瘍に対する適応免疫応答の媒介、組織修復、神経伝達や病原性タンパク質の運搬等の役割を持つことが示唆されている。
　また、近年の研究においては、エクソソームの膜表面上に存在するタンパク質が、人によって、または、ガンの種類によって変化することが知られており、生体試料中におけるこれらのタンパク質の分布もガンの種類によって変化することが知られている。また、エクソソームの膜表面上に存在するタンパク質としては、例えば、エクソソームのバイオマーカーとなるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のタンパク質が存在することが知られている。
　そのため、これらエクソソーム膜表面上におけるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のタンパク質の分布や挙動を調査することにより、ガンの種類やガンの発生の可能性、ガンの進行度合いの調査や検査等に応用できる可能性がある。
　本実施形態に係る標的分子の検出方法によれば、１つのエクソソームの膜表面上に現れるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のタンパク質に特異的に結合する標識された特異的結合物質（例えば、抗体）を利用することにより、エクソソーム膜表面上のタンパク質の検出が可能である。
　例えば、ＣＤ９のエピトープを認識する抗体、ＣＤ６３のエピトープを認識する抗体、およびＣＤ８１のエピトープを認識する抗体において、各抗体に結合される標識が異なる蛍光シグナルを発するように構成することにより、エクソソームの存在を検出できるとともに、エクソソーム膜表面上のＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１の存在の有無および分布を多色により色別に判定することができる。
例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１のうち１つを有するエクソソームや、ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１のうち２つを有するエクソソーム、ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１のうち３つを有するエクソソームを色差によって分析、判定することができ、色差によって各エクソソームの分布を観察することができる。
　すなわち、本実施形態に係る標的分子の検出方法によれば、生体試料中のエクソソームの膜表面上に存在するバイオマーカーとなるタンパク質の分布や挙動を観察でき、迅速かつ精度のよい各タンパク質の定性分析、定量分析への応用が可能である。
　本実施形態に係る標的分子の検出方法は、上述のようなエクソソーム表面上のタンパク質の分析を例示したが、上述の例示に限定されず、ウイルス、細胞等の膜表面上に存在するタンパク質の分析、ガンの可能性を示すバイオマーカーの評価および検出等に応用可能である。
［標的分子検出キット］
　本発明の１実施形態は、標的分子に対する特異的結合物質であって、認識するエピトープが互いに異なり、互いに識別可能に標識された複数種類の特異的結合物質を備える、標的分子検出キットを提供する。
　本実施形態に係るキットにおいて、標的分子、特異的結合物質、標識については上述したものと同様である。特異的結合物質は、互いに異なる核酸断片で標識されていてもよい。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
［実験例１］
（標的分子捕捉粒子の作製（ＰＳＡ））
　標的分子として前立腺癌マーカーの一つであるｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）を捕捉する、標的分子捕捉粒子を作製した。
　まず、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（型式「１Ｈ１２」、Ｈｙｔｅｓｔ社）をビオチン化した。ビオチン化には、市販のキット（商品名「ＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ」、サーモサイエンティフィック社）を使用した。具体的には、１．５ｍＬチューブ中で、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈した抗ＰＳＡモノクローナル抗体に抗体の５０倍モル量のＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（０．２ｍｇ／ｍＬを５００μＬ）を添加した。続いて、氷上で２時間静置して、抗体のビオチン化を行った。
　続いて、反応後の混合液から未反応のＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ及び反応副生成物を除くため、ゲルろ過カラム（型式「Ｚｅｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎ」、サーモサイエンティフィック社）を使用してビオチン化抗体を精製した。カラム精製後、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイによりタンパク質量の測定を行い、収量を求めた。
　続いて、ビオチン化した抗ＰＳＡ抗体に、分散させたストレプトアビジン標識ビーズ（型式「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ」、ＪＳＲ社）を混合し、１０分間室温下で混和し、１×結合バッファー中でビオチン及びストレブトアビジンを結合させた。続いて、磁気スタンドに１分間セットしてビーズを集めて上清を捨て、１×結合バッファーで３回洗浄し、標的分子捕捉粒子を得た。
［実験例２］
（標的分子捕捉粒子の作製（ＣＥＡ））
　標的分子として消化器系癌マーカーの一つであるｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）を捕捉する、標的分子捕捉粒子を作製した。抗体として、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（型式「１０－１３９２」、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）を使用した点以外は実験例１と同様にして標的分子捕捉粒子を作製した。
［実験例３］
（核酸標識抗ＰＳＡ抗体の作製）
　抗ＰＳＡモノクローナル抗体（型式「５Ａ６」、Ｈｙｔｅｓｔ社）及び抗ＰＳＡモノクローナル抗体（型式「８Ａ６」、Ｈｙｔｅｓｔ社）に、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片１）及び配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片２）をそれぞれ結合させ、核酸標識抗ＰＳＡ抗体を作製した。ＤＮＡ断片の結合には、市販のキット（商品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｏｌｉｇｏ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」、ソルリンク社）を用いた。なお、核酸標識抗ＰＳＡ抗体は、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
［実験例４］
（核酸標識抗ＣＥＡ抗体の作製）
　実験例３と同様にして、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（型式「１０－１３９３」、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）及び抗ＣＥＡモノクローナル抗体（型式「１０－７８８３」、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社）に、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片３）及び配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片４）をそれぞれ結合させ、核酸標識抗ＣＥＡ抗体を作製した。
　なお、核酸標識抗ＣＥＡ抗体は、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
［実験例５］
（標的分子含有試料の調製）
　標的分子として、ＰＳＡ（型式「ＰＳＡキャリブレータ」、ｓｙｓｍｅｘ社）及びＣＥＡ（型式「ＨＩＳＣＬ　ＣＥＡキャリブレータ」、カイノス社）を５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）－１×ＰＢＳ溶液で、０、０．０１、０．０５、０．１、０．５ｎｇ／ｍＬの濃度にそれぞれ希釈し、標的分子含有試料を調製した。
［実験例６］
（検出デバイスの作製）
　０．５ｍｍ厚のガラス製の基板にＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子製）をスピンコートした後、１８０℃で１時間ベークした。形成されたＣＹＴＯＰの厚みは３μｍであった。
　続いて、ポジティブフォトレジストをコートし、フォトマスクを用いてウェルパターンを形成した。その後、Ｏ２プラズマによりＣＹＴＯＰをドライエッチングした。続いて、表面に残ったフォトレジストを除去するためにアセトンとエタノールで表面を洗浄しリンスした。
　上記の操作により、基板上の所定の領域内に１００ブロックのウェルアレイを形成した。また、各々のブロックは１００００個のウェルを有していた。したがって、上記の領域内に合計１００万個のウェルが形成された。また、ＣＹＴＯＰによって形成されたウェル（微小区画）の直径は５μｍであり、インベーダー反応によるシグナル検出が数分で可能な体積を有していた。
　続いて、送液ポートを有するガラス製の板（蓋体）と上記の基板とを、１００μｍの厚みを有し流路形状に加工された両面テープを用いて接着し、検出デバイスを作製した。ガラス製の板と上記の基板とは、上記のウェルが形成された領域が流路内に配置されるように接着した。
［実施例１］
（ＰＳＡの検出１）
　ＰＳＡを標的分子として実験を行った。サンプルチューブ（タンパク質非吸着、エッペンドルフ社）に、様々な濃度のＰＳＡを含む溶液５０μＬをそれぞれ添加した。続いて、各チューブに、１０６個の標的分子捕捉粒子、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体５０μＬ、及び配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体５０μＬをそれぞれ添加し、シェーカー上で撹拌しながら室温で１時間反応させ、複合体を形成させた。
　続いて、未反応の核酸標識抗ＰＳＡ抗体を除くため、遠心、上清の除去及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）を加える操作を３回繰り返して洗浄し、最後に上清を除去して複合体を得た。
　続いて、実験例６で作製した検出デバイスの送液ポートに、上記の複合体とインベーダー反応試薬とを混合した溶液２０μＬを送液した。これにより、２０μＬの溶液の一部が基板上のウェル内に配分された。インベーダー反応試薬は、１μＭアレルプローブ１（配列番号５）、１μＭアレルプローブ２（配列番号６）、１μＭインベーダーオリゴ１（配列番号７）、１μＭ　ＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＦＡＭ）（ホロジック社製）、１μＭ　ＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤ）（ホロジック社製）、１０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、６．２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬクリベース及びＴｗｅｅｎ２０を含んでいた。
　アレルプローブ１は、核酸標識抗ＰＳＡ抗体に結合した配列番号１のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＦＡＭが蛍光を発する。
　また、アレルプローブ２は、核酸標識抗ＰＳＡ抗体に結合した配列番号２のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤが蛍光を発する。
　検出デバイスのウェルでＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの双方の蛍光が観察されることは、当該ウェルにＰＳＡが少なくとも１分子含まれていることを示す。
　続いて、封止液としてフッ素系オイルであるＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ送液した。これにより、ウェルの上部が封止液により覆われた。その結果、各ウェルは、上記の複合体及びインベーダー反応試薬が封入された独立した反応室となった。続いて、６３℃のホットプレート上で１５分間加熱し、インベーダー反応を実施した。
　続いて、蛍光顕微鏡（オリンパス製）を使用し、各ウェルにおけるＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの蛍光を検出した。露光時間は２０００ミリ秒とした。
　その結果、５％ＢＳＡ－１×ＰＢＳ溶液で０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈したＰＳＡを検出できることが明らかとなった。また、本実施例におけるインベーダー反応に要する加熱時間は１５分間であり、ＰＳＡを迅速に検出できることが明らかとなった。
［比較例１］
　実施例１で使用したＰＳＡ溶液を用いて同様の実験を行ったが、核酸標識ＰＳＡ抗体として、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体のみを使用した。
　その結果、抗ＰＳＡ抗体の誤認識により、実施例１で検出可能であったＰＳＡ濃度の下限と比較して、検出可能なＰＳＡ濃度の下限が高値となることが明らかとなった。
［実施例２］
（ＰＳＡの検出２）
　ＰＳＡを標的分子として実験を行った。試料中のＰＳＡの濃度を０ｐｇ／ｍＬ（０ｆＭ）、０．１ｐｇ／ｍＬ（３ｆＭ）、１ｐｇ／ｍＬ（３０ｆＭ）、１０ｐｇ／ｍＬ（３００ｆＭ）にした以外は実施例１と同様の反応を行い、ＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの双方の蛍光を検出した。
　上述したように、検出デバイスのウェルでＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの双方の蛍光が観察されることは、当該ウェルにＰＳＡが少なくとも１分子含まれていることを示す。
　図６は、各濃度のＰＳＡ試料を反応させ、ＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの双方の蛍光が観察されたウェルの数を計測した結果を示すグラフである。その結果、０ｐｇ／ｍＬ（０ｆＭ）及び０．１ｐｇ／ｍＬ（３ｆＭ）の濃度のＰＳＡ溶液を明確に区別できることが明らかとなった。
　また、本実施例においても、インベーダー反応に要する加熱時間は１５分間であり、ＰＳＡを迅速に検出できることが明らかとなった。
［比較例２］
　実施例２でＰＳＡを検出したデバイスのウェルについて、ＦＡＭの蛍光が観察されたウェルの数のみを計測した。これにより、１種類の抗ＰＳＡ抗体のみを用いてＰＳＡを検出したのと同様の結果を得ることができる。
　図７は、各濃度のＰＳＡ試料を反応させ、ＦＡＭの蛍光が観察されたウェルの数を計測した結果を示すグラフである。その結果、０ｐｇ／ｍＬ（０ｆＭ）、０．１ｐｇ／ｍＬ（３ｆＭ）及び１ｐｇ／ｍＬ（３０ｆＭ）の濃度のＰＳＡ溶液を明確に区別することは困難であった。
　この結果は、抗ＰＳＡ抗体の誤認識により、実施例２で検出可能であったＰＳＡ濃度の下限と比較して、検出可能なＰＳＡ濃度の下限がはるかに高値となることを示す。いいかえると、複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させ、２種以上の特異的結合物質を検出することにより、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子の検出精度を顕著に向上させることができることを示す。また、本実施例によれば、従来の方法と比較して、ＰＳＡを迅速に検出できることが明らかとなった。抗体（抗体一分子）に対して蛍光シグナルの反応起点となる複数の核酸が修飾されるように核酸標識抗ＰＳＡ抗体を調製したためと考えられる。さらに、デバイスの各ウェルに標的分子が小分けに捕捉されるような構成を備えることによって、標識された核酸が多数存在しても、標識された核酸同士が干渉せずに、標的分子の検出が可能であったと考えられる。
［実施例３］
（ＰＳＡ及びＣＥＡの検出）
　ＰＳＡ及びＣＥＡの混合物を標的分子として実験を行った。サンプルチューブ（タンパク質非吸着、エッペンドルフ社）に、０．０１ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ及び０．０１ｎｇ／ｍＬのＣＥＡを体積比１：２で混合した溶液５０μＬを添加した。続いて、上記のチューブに、１０６個の標的分子捕捉粒子、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体５０μＬ、配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＰＳＡ抗体５０μＬ、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＣＥＡ抗体５０μＬ、配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片で標識した１０μｇ／ｍＬの核酸標識抗ＣＥＡ抗体５０μＬをそれぞれ添加し、シェーカー上で撹拌しながら室温で１時間反応させ、複合体を形成させた。
　なお、核酸標識抗ＰＳＡ抗体は、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
　また、核酸標識抗ＣＥＡ抗体は、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
　続いて、実験例６で作製した検出デバイスの送液ポートに、上記の複合体とインベーダー反応試薬とを混合した溶液２０μＬを送液した。インベーダー反応試薬は、１μＭアレルプローブ１（配列番号５）、１μＭアレルプローブ２（配列番号６）、１μＭアレルプローブ３（配列番号８）、１μＭアレルプローブ４（配列番号９）、１μＭインベーダーオリゴ１（配列番号７）、１μＭインベーダーオリゴ２（配列番号１０）、１μＭ　ＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＦＡＭ）（ホロジック社製）、１μＭ　ＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤ）（ホロジック社製）、１μＭ　ＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＴＡＭＲＡ）（ホロジック社製）、１０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、６．２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０Ｕ／μＬクリベース及びＴｗｅｅｎ２０を含んでいた。
　アレルプローブ１は、核酸標識抗ＰＳＡ抗体に結合した配列番号１のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＦＡＭが蛍光を発する。
　また、アレルプローブ２は、核酸標識抗ＰＳＡ抗体に結合した配列番号２のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤが蛍光を発する。
　また、アレルプローブ３は、核酸標識抗ＣＥＡ抗体に結合した配列番号３のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＦＡＭが蛍光を発する。
　また、アレルプローブ４は、核酸標識抗ＣＥＡ抗体に標識された配列番号４のＤＮＡ断片とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＴＡＭＲＡで検出可能な蛍光を発色する。
　検出デバイスのウェルでＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの双方の蛍光が観察されることは、当該ウェルにＰＳＡが少なくとも１分子含まれていることを示す。また、ＦＡＭ及びＴＡＭＲＡの双方の蛍光が観察されることは、当該ウェルにＣＥＡが少なくとも１分子含まれていることを示す。
　続いて、封止液としてフッ素系オイルであるＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ送液した。続いて、６３℃のホットプレート上で１５分間加熱し、インベーダー反応を実施した。
　続いて、蛍光顕微鏡（オリンパス社）を使用し、各ウェルにおけるＦＡＭ、Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤ及びＴＡＭＲＡの蛍光を検出した。露光時間は２０００ミリ秒とした。
　その結果、ＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの双方の蛍光が観察されたチャンバーの数と、ＦＡＭ及びＴＡＭＲＡの双方の蛍光が観察されたチャンバーの数から算出されたＰＳＡ及びＣＥＡの濃度比は１：２であると計算された。また、本実施例におけるインベーダー反応に要する加熱時間は１５分間であり、ＰＳＡおよびＣＥＡを迅速に検出できることが明らかとなった。
［実施例４］
＜試薬調製＞
（エクソソーム含有試料）
　エクソソームを含む培養上清は大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６をＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ社）:Ｅｘｏ－ＦＢＳ(ＳＢＩ社):ペニシリンストレプトマイシン溶液（和光純薬社）を９０：１０:１で混合した培地で３日間培養した培養上清を用いた。培養上清を３００×ｇ、１０分で細胞を除去した。さらに培養上清を２０００×ｇ、１０分でデブリスを除去した。さらに培養上清を１００００×ｇ、３０分でさらに細かいデブリスを除去した。最後に培養上清を０．２２μｍのフィルターユニット（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過した。
　エクソソームを含む血清はヒト血清（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ　ＡＢ、コージンバイオ社製)を用いた。
（抗体固定化磁性ビーズの調製）
　抗体を磁性ビーズに固定化するため、カルボキシル基修飾磁性ビーズ（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ、ＬＣ３００、ＪＳＲ社）溶液に、抗エクソソーム抗体（型式「ＣＤ９」、コスモバイオ社)を添加し１００μＬに混合し、ローテーターにて３０分反応させ、さらに縮合剤ＥＤＣを加え３時間反応させ、抗体のカルボキシル磁性ビーズへの固定化を行った。
　反応後未反応の抗体と試薬を取り除くため、マグネットスタンドを用いて抗体固定化カルボキシル磁性ビーズを磁気捕集、および、ＰＢＳ－Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）による洗浄を３回繰り返し、抗体固定化カルボキシル磁性ビーズ（ＣＤ９ビーズ）を調製した。
（抗体修飾用核酸及び検出用核酸）
　抗体修飾用及び核酸検出反応用の核酸としては、以下に示す核酸を用いた。
・ＤＮＡ断片５：配列番号１１に示す塩基配列を有する。
・ＤＮＡ断片６：配列番号１２に示す塩基配列を有する。
・アレルプローブ３：配列番号８に示す塩基配列を有する。
・アレルプローブ５：配列番号１３に示す塩基配列を有する。
・インベーダーオリゴ２：配列番号１０に示す塩基配列を有する。
（核酸修飾抗体の調製）
　実験例３と同様にして、抗エクソソーム抗体２種（型式「ＣＤ６３」、型式「ＣＤ８１」、コスモバイオ社）に、ＤＮＡ断片５、６をそれぞれ結合させ核酸修飾抗体（ＤＮＡ断片５－ＣＤ６３、ＤＮＡ断片６－ＣＤ８１）を調製した。
　核酸修飾抗体は、ＤＮＡ断片５－ＣＤ６３、ＤＮＡ断片６－ＣＤ８１のいずれも、抗体（抗体一分子）に対して５～２０倍量の核酸が修飾されるように調製した。
（核酸検出試薬の調製）
　デジタルインベーダー反応による核酸修飾抗体検出を行うため、核酸検出試薬として、インベーダー反応試薬を調製した。本実施例におけるインベーダー反応試薬の試薬組成は以下の通りである。
　実施例４におけるインベーダー反応試薬は、０．１μＭアレルプローブ３（配列番号８）、０．１μＭアレルプローブ５（配列番号１３）、１μＭインベーダーオリゴ２（配列番号１０）、２μＭ　ＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＦＡＭ）（ホロジック社製）、２μＭ　ＦＲＥＴ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤ）（ホロジック社製）、１０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び１０００Ｕ／μＬクリベースを含んでいた。
　なお、これらのインベーダー反応試薬における各成分の濃度は、実施例４に係るインベーダー反応試薬における終濃度である。
＜抗原、抗体固定化ビーズ及び核酸修飾抗体の反応＞
　サンプルチューブに、１０６個の抗体固定化カルボキシル磁性ビーズ（ＣＤ９ビーズ）、０または５０％となるようにそれぞれ調整した培養上清あるいは血清、０．１ｎｇ／ｍＬに調整した核酸修飾抗体２種（ＤＮＡ断片５－ＣＤ６３、ＤＮＡ断片６－ＣＤ８１）を全量が１００μＬとなるように混合し、ローテーター上で室温３時間反応させ、複合体を形成させた。
　反応後、マグネットスタンドを用いて得られた磁性ビーズを磁気捕集し、上清の除去及び０．１％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）を加える操作を５回繰り返して洗浄し、最後に上清を除去して複合体を得た。
　得られた複合体を洗浄後ＰＢＳにて希釈し、反応混合液１を調製した。
＜フローセルの組み立て＞
　流路の高さは１００μｍ、幅は６～７ｍｍになるように下記３部材を組み立てた。
・ＣＯＰチャンバー（φ５μｍ、深さ３．５μｍの微小孔を形成、ＳＴＲＡＴＥＣ社）
・両面テープ（膜厚１００μｍ、宝洋社）
・ＣＯＰ送液用流路ストリップ（カーボンブラック添加着色、送液及び廃液ポート付、荒川樹脂社）
＜反応混合溶液の送液＞
　フローセルに、上記の複合体とインベーダー反応試薬とを混合した溶液２０μＬを送液した。続いて、封止液としてＦＣ－４０（Ｓｉｇｍａ社）を１００μＬ送液し、各チャンバーを封止した。
＜核酸検出反応＞
　上記フローセルをホットプレート上にセットし、６６℃１５分反応させた。
＜チャンバーの観察＞
　上記フローセルを冷却後、蛍光顕微鏡ＢＺ－７１０（ＫＥＹＥＮＣＥ社）で各ウェルにおけるＦＡＭ、Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの蛍光を検出した。露光時間として、ＦＡＭは１２００ｍ秒、Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤは１０００ｍ秒とした。
　血清５０％含有サンプル溶液中の反応を蛍光顕微鏡にて観察し、各蛍光画像を重ね合わせた結果を図９の右側に示す。なお、図９の左側は、血清を添加しない場合（血清０％）の画像である。
　その結果、サンプル中の培養上清及び血清の含有割合に応じて、蛍光チャンバー数が変化している事が確認された。
　これらの結果から、エクソソーム抗体を用いたデジタルインベーダーによってエクソソーム膜表面タンパク質が認識され、培養上清及び血清中に含まれるエクソソームを検出できている事が示唆された。
　また、各サンプル含有溶液を用いた反応における、１ブロック内で磁性ビーズが封入されたチャンバー数、磁性ビーズと蛍光シグナルの両方が検出されたチャンバー数、蛍光シグナルのみが検出されたチャンバー数をカウントした結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、培養上清、血清ともに検出による蛍光シグナルのほとんどがビーズと重なっており、磁性ビーズ上でエクソソームが検出されている事が示唆された。
　なお、アレルプローブ３は、ＣＤ６３に結合した配列番号１１のＤＮＡ断片５とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＦＡＭが蛍光を発する。
　例えば、図８の右側、図９の右側においては、ＦＡＭは緑色の蛍光を発していた。
　また、ＦＡＭの蛍光が観察されることは、エクソソーム膜表面上に存在するタンパク質であるＣＤ６３が検出できたと考えられる。
　また、アレルプローブ５は、ＣＤ８１に結合した配列番号１２のＤＮＡ断片６とハイブリダイズし、インベーダー反応の結果、蛍光色素であるＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤが蛍光を発する。
　例えば、図８の右側、図９の右側においては、Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤは赤色の蛍光を発していた。
　また、Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの蛍光が観察されることは、エクソソーム膜表面上に存在するタンパク質であるＣＤ８１が検出できたと考えられる。
　また、図８の右側、図９の右側においては、ＦＡＭ由来の蛍光である緑色と、Ｒｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤ由来の赤色の蛍光との両方の蛍光が得られた際の蛍光シグナルと考えられる黄色の蛍光が観察された。
　また、ＦＡＭ及びＲｅｄｍｏｎｄ　ＲＥＤの双方由来の蛍光（黄色）が観察されることは、エクソソームのうち、エクソソーム膜表面上にＣＤ６３、ＣＤ８１の２つのタンパク質が存在するエクソソームを検出できたと考えられる。
　さらに、図８の右側の蛍光画像、および、図９の右側の蛍光画像の結果より、緑色、赤色、黄色の蛍光シグナルによって、膜表面上にＣＤ６３を有するエクソソーム、膜表面上にＣＤ８１を有するエクソソーム、および膜表面上にＣＤ６３およびＣＤ８１の両者を有するエクソソームの存在を確認できたと考えられる。
　すなわち、複数種類の第一の標的分子としてのＣＤ６３、ＣＤ８１の検出を介して、第二の標的分子としてのエクソソームを検出できることを確認できた。
　また、本実施例によれば、緑色、赤色、黄色のような複数の蛍光シグナルの検出によって、生体試料中におけるエクソソームに存在するＣＤ６３、ＣＤ８１の分布を判定することができたと考えられる。
　さらに、本実施例によれば、緑色、赤色、黄色のような複数の蛍光シグナルの分布を検出することによって、生体試料中において膜表面上にＣＤ６３を有するエクソソーム、膜表面上にＣＤ８１を有するエクソソーム、および膜表面上にＣＤ６３およびＣＤ８１の両者を有するエクソソームの分布を観察することができたと考えられる。
　核酸修飾抗体によるデジタルインベーダー反応により、エクソソーム膜表面上の複数のタンパク質を認識し、かつ、検出できていることから、多くの反応開始物質を有する場合（本実施例のように抗体に対して多くの核酸断片が修飾されるような場合、蛍光シグナルの基点となる物質がたくさん結合しているような場合）においても、デジタル計測によって短時間で複数項目の定量検出が可能である事が示唆された。
　これはタンパク質を認識する抗体に、蛍光標識された核酸断片を多く結合させているためである。
　また、本実施例においては、１つのウェルに１つ以下のエクソソーム（第一の標的分子としてのタンパク質を有する第二の標的分子）が導入されるように、ウェルのサイズを構成したため、フローセル中に蛍光標識された核酸断片を有する抗体が多数存在しても、余剰の抗体由来の蛍光の干渉等を受けずに、エクソソームが有するタンパク質を検出できたと考えられる。
　一方、従来の標的の核酸を増幅するデジタルＰＣＲでは検出に要する反応時間は多くかかるため短時間での検出は困難である。
　また、従来の抗体を蛍光標識したフローサイトメトリーでは、標的となるエクソソームやタンパク質が小さいため、検出のために蛍光標識ビーズ等を用いて分離しなければならなくなり、高感度検出は困難である。
　さらに、従来の核酸修飾抗体を用いたイムノＰＣＲでは、検出のために核酸の標識量を制御しなければならなくなり、定量検出は困難である。
　このように、従来の方法によれば、迅速かつ精度よく標的分子を検出することは困難であると考えられる。
　本実施例に係る標的分子の検出方法によれば、１つのフローセルに生体試料を流す場合においても、同時に複数の蛍光シグナルを検出する多色検出により、短時間で複数項目の標的分子の定量検出が可能である事が示唆された。
　また、本実施例に係る標的分子の検出方法によれば、エクソソーム等の生体試料の表面上に存在するタンパク質等の検出が可能であり、多色検出により、これらのタンパク質等の分布を観察し、ガンに関連するバイオマーカーとなるタンパク質等の挙動や分布を調査する等、定性的な分析に応用することも可能であることが考えられる。
　本発明によれば、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出できる技術を提供することができる。
　１００，１８０，１８２，１８４…標的分子、１１０，１１２，１１３，１１５，１１７…標的分子捕捉粒子、１１１，１１４，１１６，１１８，１２０，１２２，１２４，１２５，１９０，１９１，１９２，１９３，１９４…特異的結合物質、１２１，１２３，１２６…標識（標識分子）、１３０，１５０，１６０，１７０…複合体、１４０…標的分子ではない分子、２００…検出デバイス、２１０…基板、２２０…流路、２３０…蓋体、２４０…ウェル、２５０…シグナル。

Claims (16)

  1. 　標的分子の検出方法であって、
    　互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させる標識物質を有する複数の核酸断片で標識され、かつ、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質と、複数種類の第一の標的分子と、を準備する工程と、
    　前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程と、
    　前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、
    　前記複数種類の前記第一の標的分子を前記複数種類の前記特異的結合物質に応じた複数の前記蛍光シグナルにより判断する工程と、
    　を備える、
    　標的分子の検出方法。
  2. 　前記特異的結合物質の１分子に対して前記複数の核酸断片が数個～数十個結合している、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記特異的結合物質が抗体である、請求項２に記載の検出方法。
  4. 　前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つを有する第二の標的分子を準備し、
    　前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つの検出を介して前記第二の標的分子を検出する、
    　請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　前記第二の標的分子がエクソソームである、請求項４に記載の検出方法。
  6. 　前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも１つが前記エクソソームの膜表面上に存在する、請求項５に記載の検出方法。
  7. 　前記複数種類の前記第一の標的分子が疾患マーカータンパク質である、請求項６に記載の検出方法。
  8. 　複数のウェルを有する基板を備えた検出デバイスを準備し、
    　前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程の後に、前記複数のウェルにおいて１つのウェルに１つの前記第二の標的分子を導入する工程をさらに備える、
    　請求項４～７のいずれか一項に記載の検出方法。
  9. 　同時に前記複数種類の前記第一の標的分子を検出する、請求項１～８のいずれか一項に記載の検出方法。
  10. 　標的分子の検出方法であって、
    　認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる工程と、
    　前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、
    　前記複数種類の前記特異的結合物質のうち２種以上が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断する工程と、
    　を備える、標的分子の検出方法。
  11. 　前記標的分子の検出が１分子単位で行われる、請求項１０に記載の検出方法。
  12. 　前記複数種類の特異的結合物質の少なくとも１種が核酸断片で標識されている、請求項１０又は１１に記載の検出方法。
  13. 　前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程が、シグナル増幅反応を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の検出方法。
  14. 　同時に複数種類の標的分子を検出する、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の検出方法。
  15. 　標的分子検出キットであって、
    　標的分子に対する特異的に結合し、認識するエピトープが互いに異なり、互いに識別可能に標識された複数種類の特異的結合物質を備える、標的分子検出キット。
  16. 　前記複数種類の特異的結合物質が、互いに異なる核酸断片で標識されている、請求項１５に記載の標的分子検出キット。
PCT/JP2017/018782 2016-05-19 2017-05-19 標的分子の検出方法及び標的分子検出キット WO2017200070A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17799494.4A EP3460474B1 (en) 2016-05-19 2017-05-19 Method and kit for target molecule detection
EP22160097.6A EP4047368A1 (en) 2016-05-19 2017-05-19 Method and kit for target molecule detection
JP2018518370A JP6996502B2 (ja) 2016-05-19 2017-05-19 標的分子の検出方法
CN201780030808.6A CN109477834A (zh) 2016-05-19 2017-05-19 目标分子的检测方法及目标分子检测试剂盒
US16/194,612 US20190085385A1 (en) 2016-05-19 2018-11-19 Method and kit for target molecule detection

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-100231 2016-05-19
JP2016100231 2016-05-19
JP2016-241023 2016-12-13
JP2016241023 2016-12-13

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/194,612 Continuation US20190085385A1 (en) 2016-05-19 2018-11-19 Method and kit for target molecule detection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017200070A1 true WO2017200070A1 (ja) 2017-11-23

Family

ID=60325406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/018782 WO2017200070A1 (ja) 2016-05-19 2017-05-19 標的分子の検出方法及び標的分子検出キット

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190085385A1 (ja)
EP (2) EP3460474B1 (ja)
JP (1) JP6996502B2 (ja)
CN (1) CN109477834A (ja)
WO (1) WO2017200070A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019131592A1 (ja) * 2017-12-26 2019-07-04 凸版印刷株式会社 標的分子の検出における偽陰性判定の発生を抑制する方法および検出デバイス
WO2020040308A1 (ja) * 2018-08-23 2020-02-27 富士フイルム株式会社 目的物質の検出方法
WO2020235607A1 (ja) * 2019-05-21 2020-11-26 凸版印刷株式会社 標的分子の検出方法
WO2021220928A1 (ja) * 2020-04-27 2021-11-04 国立大学法人 東京医科歯科大学 生体小胞表面バイオマーカー検出デバイス
WO2023080102A1 (ja) * 2021-11-04 2023-05-11 凸版印刷株式会社 血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キット、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110498858B (zh) * 2019-07-26 2024-01-23 深圳市达科为生物工程有限公司 一种动态检测单细胞外泌蛋白分泌情况的方法
CN112986573B (zh) * 2019-12-13 2023-05-02 深圳汇芯生物医疗科技有限公司 外泌体多组学标志物的定量检测方法
CN111235243A (zh) * 2020-03-03 2020-06-05 杭州师范大学 一种肿瘤特异性外泌体/胞外囊泡的定量方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5551798B2 (ja) 1973-12-29 1980-12-26
JP2005528103A (ja) * 2002-05-30 2005-09-22 イセアオ テクノロジーズ リミテッド 標的分子および分子相互作用を検出する方法
JP4111984B2 (ja) * 2004-11-01 2008-07-02 財団法人 東京都医学研究機構 標的物質の検出方法
JP2010525792A (ja) * 2007-01-29 2010-07-29 ホロジック インコーポレイティッド 切断反応を用いて核酸を検出するための組成物および方法
JP2014503831A (ja) 2011-01-28 2014-02-13 クワンテリクス コーポレーション 分子または粒子の超高感度検出用のシステム、デバイスおよび方法
JP5551798B2 (ja) * 2010-03-01 2014-07-16 クワンテリクス コーポレーション ビーズまたは他の捕捉物を用いた分子または粒子の超高感度検出
WO2015175856A1 (en) * 2014-05-15 2015-11-19 Meso Scale Technologies, Llc. Improved assay methods
JP2015230280A (ja) * 2014-06-06 2015-12-21 凸版印刷株式会社 分析対象物の検出方法及びラテラルフロー用テストストリップ
WO2015200139A1 (en) * 2014-06-23 2015-12-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University On-slide staining by primer extension
WO2016047068A1 (ja) 2014-09-22 2016-03-31 国立研究開発法人科学技術振興機構 ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキット
JP2016100231A (ja) 2014-11-25 2016-05-30 スタンレー電気株式会社 多灯式車両用灯具

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8956857B2 (en) * 2005-06-06 2015-02-17 Mediomics, Llc Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
CN101285833A (zh) * 2007-04-14 2008-10-15 郭良宏 电化学发光树状结构标记物及其制备方法
US20120258880A1 (en) * 2010-11-22 2012-10-11 The University Of Chicago Methods and/or Use of Oligonucleotide Conjugates for Assays and Flow Cytometry Detections
WO2012057689A1 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Proximity ligation technology for western blot applications
EP2954102B1 (en) * 2013-02-08 2018-12-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Affinity-based partition assay for detection of target molecules
AU2015229406C1 (en) * 2014-03-11 2021-01-07 President And Fellows Of Harvard College High-throughput and highly multiplexed imaging with programmable nucleic acid probes
WO2016072416A1 (ja) 2014-11-04 2016-05-12 凸版印刷株式会社 核酸導入方法、核酸検出方法、生体成分解析方法、生体成分定量用アレイデバイス、及び生体成分解析キット
CN104894062A (zh) * 2015-05-19 2015-09-09 暨南大学 一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用
CN105505854B (zh) * 2016-01-14 2019-07-12 上海市第六人民医院 来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5551798B2 (ja) 1973-12-29 1980-12-26
JP2005528103A (ja) * 2002-05-30 2005-09-22 イセアオ テクノロジーズ リミテッド 標的分子および分子相互作用を検出する方法
JP4111984B2 (ja) * 2004-11-01 2008-07-02 財団法人 東京都医学研究機構 標的物質の検出方法
JP2010525792A (ja) * 2007-01-29 2010-07-29 ホロジック インコーポレイティッド 切断反応を用いて核酸を検出するための組成物および方法
JP5551798B2 (ja) * 2010-03-01 2014-07-16 クワンテリクス コーポレーション ビーズまたは他の捕捉物を用いた分子または粒子の超高感度検出
JP2014503831A (ja) 2011-01-28 2014-02-13 クワンテリクス コーポレーション 分子または粒子の超高感度検出用のシステム、デバイスおよび方法
WO2015175856A1 (en) * 2014-05-15 2015-11-19 Meso Scale Technologies, Llc. Improved assay methods
JP2015230280A (ja) * 2014-06-06 2015-12-21 凸版印刷株式会社 分析対象物の検出方法及びラテラルフロー用テストストリップ
WO2015200139A1 (en) * 2014-06-23 2015-12-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University On-slide staining by primer extension
WO2016047068A1 (ja) 2014-09-22 2016-03-31 国立研究開発法人科学技術振興機構 ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキット
JP2016100231A (ja) 2014-11-25 2016-05-30 スタンレー電気株式会社 多灯式車両用灯具

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HANAMI, TAKESHI ET AL.: "Eprobe mediated real- time PCR monitoring and melting curve analysis", PLOS ONE, vol. 8, no. 8, 7 August 2013 (2013-08-07), XP002755207 *
KIM S. H. ET AL.: "Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules", LAB ON A CHIP, vol. 12, no. 23, 2012, pages 4986 - 4991, XP055085556, DOI: doi:10.1039/c2lc40632b
See also references of EP3460474A4

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019131592A1 (ja) * 2017-12-26 2019-07-04 凸版印刷株式会社 標的分子の検出における偽陰性判定の発生を抑制する方法および検出デバイス
WO2020040308A1 (ja) * 2018-08-23 2020-02-27 富士フイルム株式会社 目的物質の検出方法
JPWO2020040308A1 (ja) * 2018-08-23 2021-08-10 富士フイルム株式会社 目的物質の検出方法
JP7148616B2 (ja) 2018-08-23 2022-10-05 富士フイルム株式会社 目的物質の検出方法
WO2020235607A1 (ja) * 2019-05-21 2020-11-26 凸版印刷株式会社 標的分子の検出方法
WO2021220928A1 (ja) * 2020-04-27 2021-11-04 国立大学法人 東京医科歯科大学 生体小胞表面バイオマーカー検出デバイス
WO2023080102A1 (ja) * 2021-11-04 2023-05-11 凸版印刷株式会社 血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キット、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3460474B1 (en) 2022-04-06
CN109477834A (zh) 2019-03-15
JPWO2017200070A1 (ja) 2019-03-22
EP3460474A1 (en) 2019-03-27
JP6996502B2 (ja) 2022-01-17
EP3460474A4 (en) 2020-03-11
US20190085385A1 (en) 2019-03-21
EP4047368A1 (en) 2022-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6996502B2 (ja) 標的分子の検出方法
JP5551798B2 (ja) ビーズまたは他の捕捉物を用いた分子または粒子の超高感度検出
US8846415B2 (en) Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays
Rissin et al. Multiplexed single molecule immunoassays
US20100075355A1 (en) Ultra-sensitive detection of enzymes by capture-and-release followed by quantification
US20100075439A1 (en) Ultra-sensitive detection of molecules by capture-and-release using reducing agents followed by quantification
Kabe et al. Application of high-performance magnetic nanobeads to biological sensing devices
CN113454455B (zh) 微粒上的单分子的直接检测
US20090258373A1 (en) Methods of controlling the sensitivity and dynamic range of a homogeneous assay
JPWO2019098301A1 (ja) 標的分子の検出方法
US20210405033A1 (en) Analyte detection and methods therefor
US20220106648A1 (en) Method for detecting target molecule
US20230408501A1 (en) Detection of target analytes at picomolar concentrations
WO2008150873A1 (en) Ultrasensitive detection of biomolecules using immunoseparation and diffractometry
US8753870B2 (en) Device for detecting and separating target molecules and method for detecting and separating target molecules by using the same
Sonawane et al. Detection, quantification, and profiling of PSA: current microarray technologies and future directions
WO2010039179A1 (en) Ultra-sensitive detection of molecules or enzymes
WO2023080137A1 (ja) 標的物質の検出方法
Fan et al. Advances in optical counting and imaging of micro/nano single-entity reactors for biomolecular analysis
Fan et al. Single microentity analysis-based ultrasensitive bioassays: Recent advances, applications, and perspectives
KR100952891B1 (ko) 광분해성 올리고머를 이용한, 복수의 생체분자에 대한신호의 동시 검출 방법
JP2010091527A (ja) 表面プラズモンを利用したアッセイ法
WO2023080102A1 (ja) 血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出方法、血液中の脳神経細胞由来のエクソソームに結合したアミロイドβの検出用キット、及び脳内のアミロイドβの蓄積レベルを評価する方法
Zeng et al. Nonlinear Hybridization Chain Reaction Integrated with Fluorescent Immunosensor for Ultrasensitive Detection of Alpha Fetoprotein
KR20170073032A (ko) 생체물질 고정화된 퀀텀닷 나노프로브를 이용한 간암의 고감도 진단용 샌드위치 면역분석 바이오칩 및 이를 이용한 면역분석법

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018518370

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17799494

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017799494

Country of ref document: EP

Effective date: 20181219