JPWO2017200070A1 - 標的分子の検出方法及び標的分子検出キット - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年5月19日に日本に出願された特願2016−100231号、および、2016年12月13日に日本に出願された特願2016−241023号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。
そこで、本発明は、標的分子を迅速に、かつ、精度よく検出できる技術を提供することを目的とする。
また、本発明の他の目的は、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出できる技術を提供することを目的とする。
前記特異的結合物質の1分子に対して前記複数の核酸断片が数個〜数十個結合してもよい。
前記特異的結合物質が抗体であってもよい。
前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも1つを有する第二の標的分子を準備し、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも1つの検出を介して前記第二の標的分子を検出してもよい。
前記第二の標的分子がエクソソームであってもよい。
前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも1つが前記エクソソームの膜表面上に存在していてもよい。
前記複数種類の前記第一の標的分子が疾患マーカータンパク質であってもよい。
複数のウェルを有する基板を備えた検出デバイスを準備し、前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程の後に、前記複数のウェルにおいて1つのウェルに1つの前記第二の標的分子を導入する工程をさらに備えていてもよい。
同時に前記複数種類の前記第一の標的分子を検出してもよい。
本発明の第二態様に係る標的分子の検出方法は、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質のうち2種以上が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断する工程と、を備える。
前記標的分子の検出が1分子単位で行われてもよい。
前記複数種類の特異的結合物質の少なくとも1種が核酸断片で標識されていてもよい。
前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程が、シグナル増幅反応を含んでいてもよい。
同時に複数種類の標的分子を検出してもよい。
本発明の第二態様に係る標的分子検出キットは、標的分子に対する特異的に結合し、認識するエピトープが互いに異なり、互いに識別可能に標識された複数種類の特異的結合物質を備える。
前記複数種類の特異的結合物質が、互いに異なる核酸断片で標識されていてもよい。
また、本発明の上記態様によれば、標的分子に対する特異的結合物質が誤認識を生じる場合においても標的分子を精度よく検出できる技術を提供することができる。
まず、従来の標的分子の検出方法の代表的な例について説明する。図1A及び図1Bは、微小区画内で標的分子を検出する従来の方法を説明する模式断面図である。図1Aでは、標的分子100と、標的分子捕捉粒子110と、標的分子100に対する特異的結合物質120との複合体130が、基板210の表面に形成されたウェル240に収容されている。標的分子捕捉粒子110には、特異的結合物質111が固定化されている。また、特異的結合物質120は標識(標識分子)121を有している。図1Aにおいて、標的分子捕捉粒子110に固定化された特異的結合物質111及び特異的結合物質120は、標的分子100のエピトープを正しく認識している。
ここで、標識121の存在を指標として標的分子100が存在すると判断した場合、特異的結合物質120は標識121を有しているため、標的分子100が存在すると判断される。
本発明の1実施形態は、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる工程と、複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、複数種類の前記特異的結合物質のうち2種以上が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断する工程と、を備える、標的分子の検出方法を提供する。以下、本実施形態に係る検出方法について説明する。
まず、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる。この工程は、例えばサンプルチューブ内で標的分子と特異的結合物質を接触させることにより行うことができる。ここで、特異的結合物質の種類の数は2以上であり、3以上であってもよく、4以上であってもよく、5以上であってもよい。
標的分子としては特に制限されず、任意の分子を検出することができる。具体的には、例えば、生体試料中の疾患マーカータンパク質、環境試料中の特定化合物等が挙げられる。生体試料としては特に制限されず、血清、血漿、尿等が挙げられる。また、環境試料としては、例えば、河川の水、工場排水等が挙げられる。
特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に標的分子又は標的分子の断片を抗原として免疫反応させることによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Fab、F(ab’)2、Fab’、一本鎖抗体(scFv)、ジスルフィド安定化抗体(dsFv)、2量化体V領域断片(Diabody)、CDRを含むペプチド等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
続いて、複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する。図2は、一例として、検出デバイス200を用いたデジタル計測により標的分子を検出する様子を説明する模式断面図である。
標的分子捕捉粒子は、標的分子を捕捉することができる粒子である。例えば、上述した、標的分子に対する特異的結合物質を固定化した標的分子捕捉粒子が挙げられるがこれに限定されない。
図2では、ウェル240が0個又は1個の標的分子捕捉粒子110又は112を収容している。また、流路220は封止液で満たされており、各ウェル240に収容された溶液は液滴(独立した反応室)を形成している。図1Aおよび図1Bにおいて、標的分子捕捉粒子110は標的分子を1分子捕捉しており、標的分子捕捉粒子112は標的分子を捕捉していない。また、標的分子には認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質が結合している。
標識分子が互いに異なる核酸断片であった場合には、核酸断片の塩基配列の相違を利用して特異的結合物質を検出することができる。例えば、LAMP法、PCR法、インベーダー法等を利用して、核酸断片の塩基配列の相違をシグナルに変換し、特異的結合物質を検出することができる。特異的結合物質を核酸断片で標識する方法としては、特に制限されず、アビジン−ビオチンの結合を利用する方法、架橋剤を使用する方法等が挙げられる。
シグナルとしては特に制限されず、例えば、蛍光、発光、発色、pHの変化、電位変化等を利用することができる。
本実施形態によれば、例えば、核酸検出反応(例えばインベーダー反応)に係る時間が1分〜30分程度であり、迅速な核酸検出が可能となる。
この際、1つのウェル240の大きさが標的分子の体積の3倍以下となるように検出デバイス200を構成してもよい。
また、標的分子が1つのウェルに1つ以下となるように導入されるように検出デバイス200を製造する以外にも、標的分子(第一の標的分子)を有する他の標的分子(第二の標的分子)(例えば、後述する第一の標的分子としてのタンパク質を有する第二の標的分子としてのエクソソーム等)を1つのウェルに1つ以下となるように導入されるように検出デバイス200を製造してもよい。また、標的分子が1つのウェルに1つ以下となるように検出デバイスを製造する以外に、標的分子の濃度を希釈することによって標的分子が1つのウェルに1つ以下となるように標的分子をウェルに導入してもよい。
複数のウェル240を有する基板210を備えた検出デバイス200を準備し、複数種類の前記特異的結合物質を複数の第一の標的分子に結合させる工程の後に、複数のウェルにおいて1つのウェルに1つの第二の標的分子(第一の標的分子を有する第二の標的分子)を導入する工程をさらに備えていてもよい。
この際、ウェル240の容積は、100ピコリットル又はそれ100ピコリットル以下であってもよい。
また、ウェル240の大きさは、選択される第二の標的分子に応じて、1つの第二の標的分子が導入されるように構成してもよく、例えば、1つのウェル240の大きさが第二の標的分子の体積の3倍以下となるように検出デバイス200を構成してもよい。
例えば、1つのデバイスの各ウェルに第一の標的分子、または、第一の標的分子を有する第二の標的分子が小分けに捕捉されるような(例えば、1つのウェルに1つの第一の標的分子が導入されるような、または、1つのウェルに1つの第二の標的分子が導入されるような)構成を備えることによって、蛍光標識された核酸が多数存在しても、標識された核酸同士の蛍光シグナルが干渉せずに、精度よく標的分子(第一の標的分子、第二の標的分子)の検出が可能となる。
第1実施形態に係る標的分子の検出方法について説明する。図3A及びBは、微小区画内で標的分子を検出する本実施形態に係る方法を説明する模式断面図である。図3Aでは、標的分子100と、標的分子捕捉粒子110と、標的分子100に対する特異的結合物質120と、特異的結合物質120とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質122との複合体160が、基板210の表面に形成されたウェル240に収容されている。特異的結合物質120は標識121を有している。特異的結合物質122は標識123を有している。図3Aにおいて、標的分子捕捉粒子110に固定化された特異的結合物質111、特異的結合物質120及び特異的結合物質122は、標的分子100のエピトープを正しく認識している。標識121及び標識123は互いに識別可能である。例えば、標識121及び標識123は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させることができる。
ここで、分子140には、特異的結合物質122が結合していないため、複合体150中には標識123が存在しない。このため、複合体150においては、標識121に由来するシグナルは検出されるものの、標識123に由来するシグナルは検出されない。
第2実施形態に係る標的分子の検出方法について説明する。本実施形態に係る検出方法は、同時に複数種類の標的分子(複数種類の第一の標的分子)を精度よく検出する方法である。図4A及び図4Bは、微小区画内で標的分子を検出する本実施形態に係る方法を説明する模式断面図である。図4Aでは、標的分子100と、標的分子捕捉粒子110と、標的分子100に対する特異的結合物質120と、特異的結合物質120とは認識するエピトープが互いに異なる特異的結合物質122との複合体160が、基板210の表面に形成されたウェル240に収容されている。特異的結合物質120は標識121を有している。特異的結合物質122は標識123を有している。図4Aにおいて、標的分子捕捉粒子110に固定化された特異的結合物質111、特異的結合物質120及び特異的結合物質122は、標的分子100のエピトープを正しく認識している。標識121及び標識123は互いに識別可能である。例えば、標識121及び標識123は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させることができる。本実施形態においては、例えば、複数の標識からそれぞれ得られる蛍光シグナルが可視光であれば、種々の色を利用した検出(多色検出)が可能になる。
上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を0分子又は1分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を0分子又は1分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
上述したように、標的分子捕捉粒子を使用することにより、例えば微小区画を形成するウェルに、標的分子を0分子又は1分子ずつ収容し、デジタル計測を行うことが容易になる。
本実施形態に係る標的分子の検出方法は、互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させる標識物質を有する複数の核酸断片で標識され、かつ、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質と、複数種類の第一の標的分子と、を準備する工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程と、前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、前記複数種類の前記第一の標的分子を前記複数種類の前記特異的結合物質に応じた複数の前記蛍光シグナルにより判断する工程と、を備える、標的分子の検出方法を提供することができる。
また、本実施形態に係る標的分子の検出方法においては、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも1つを有する第二の標的分子を準備し、前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも1つの検出を介して前記第二の標的分子を検出してもよい。
本実施形態に係る標的分子の検出方法は、例えば、標的分子として、タンパク質、細胞外小胞(Exosome、エクソソーム)、小胞体、ウイルス、細胞等の分析に応用可能であり、小胞体、ウイルス、細胞等の表面膜タンパクの分析等にも応用可能である。
具体的には、本実施形態に係る標的分子の検出方法は、リキッドバイオプシー中の代表的なバイオマーカーである細胞外小胞(Exosome、エクソソーム)等の検出、および、エクソソームの膜表面上のタンパク質の検出にも応用可能である。
また、エクソソームは、ほとんどの細胞で分泌される直径40nm〜150nm程度の膜小胞である。
生体では唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水等の体液中で観察され、培養細胞からも分泌される。近年、エクソソームは、離れた細胞や組織に情報を伝達するための役割を担っている可能性が指摘されている。エクソソームには様々なタンパク質や脂質、核酸が含まれており、別の細胞に運搬されることによって機能的変化や生理的変化を引き起こすと考えられている。その具体例としては、感染性病原体や腫瘍に対する適応免疫応答の媒介、組織修復、神経伝達や病原性タンパク質の運搬等の役割を持つことが示唆されている。
そのため、これらエクソソーム膜表面上におけるCD9、CD63、CD81等のタンパク質の分布や挙動を調査することにより、ガンの種類やガンの発生の可能性、ガンの進行度合いの調査や検査等に応用できる可能性がある。
本実施形態に係る標的分子の検出方法によれば、1つのエクソソームの膜表面上に現れるCD9、CD63、CD81等のタンパク質に特異的に結合する標識された特異的結合物質(例えば、抗体)を利用することにより、エクソソーム膜表面上のタンパク質の検出が可能である。
例えば、CD9のエピトープを認識する抗体、CD63のエピトープを認識する抗体、およびCD81のエピトープを認識する抗体において、各抗体に結合される標識が異なる蛍光シグナルを発するように構成することにより、エクソソームの存在を検出できるとともに、エクソソーム膜表面上のCD9、CD63、およびCD81の存在の有無および分布を多色により色別に判定することができる。
例えば、CD9、CD63、およびCD81のうち1つを有するエクソソームや、CD9、CD63、およびCD81のうち2つを有するエクソソーム、CD9、CD63、およびCD81のうち3つを有するエクソソームを色差によって分析、判定することができ、色差によって各エクソソームの分布を観察することができる。
すなわち、本実施形態に係る標的分子の検出方法によれば、生体試料中のエクソソームの膜表面上に存在するバイオマーカーとなるタンパク質の分布や挙動を観察でき、迅速かつ精度のよい各タンパク質の定性分析、定量分析への応用が可能である。
本発明の1実施形態は、標的分子に対する特異的結合物質であって、認識するエピトープが互いに異なり、互いに識別可能に標識された複数種類の特異的結合物質を備える、標的分子検出キットを提供する。
(標的分子捕捉粒子の作製(PSA))
標的分子として前立腺癌マーカーの一つであるprostate−specific antigen(PSA)を捕捉する、標的分子捕捉粒子を作製した。
(標的分子捕捉粒子の作製(CEA))
標的分子として消化器系癌マーカーの一つであるcarcinoembryonic antigen(CEA)を捕捉する、標的分子捕捉粒子を作製した。抗体として、抗CEAモノクローナル抗体(型式「10−1392」、Fitzgerald社)を使用した点以外は実験例1と同様にして標的分子捕捉粒子を作製した。
(核酸標識抗PSA抗体の作製)
抗PSAモノクローナル抗体(型式「5A6」、Hytest社)及び抗PSAモノクローナル抗体(型式「8A6」、Hytest社)に、配列番号1に示す塩基配列を有するDNA断片(DNA断片1)及び配列番号2に示す塩基配列を有するDNA断片(DNA断片2)をそれぞれ結合させ、核酸標識抗PSA抗体を作製した。DNA断片の結合には、市販のキット(商品名「Protein−Oligo Conjugation Kit」、ソルリンク社)を用いた。なお、核酸標識抗PSA抗体は、抗体(抗体一分子)に対して5〜20倍量の核酸が修飾されるように調製した。
(核酸標識抗CEA抗体の作製)
実験例3と同様にして、抗CEAモノクローナル抗体(型式「10−1393」、Fitzgerald社)及び抗CEAモノクローナル抗体(型式「10−7883」、Fitzgerald社)に、配列番号3に示す塩基配列を有するDNA断片(DNA断片3)及び配列番号4に示す塩基配列を有するDNA断片(DNA断片4)をそれぞれ結合させ、核酸標識抗CEA抗体を作製した。
なお、核酸標識抗CEA抗体は、抗体(抗体一分子)に対して5〜20倍量の核酸が修飾されるように調製した。
(標的分子含有試料の調製)
標的分子として、PSA(型式「PSAキャリブレータ」、sysmex社)及びCEA(型式「HISCL CEAキャリブレータ」、カイノス社)を5%ウシ血清アルブミン(BSA)−1×PBS溶液で、0、0.01、0.05、0.1、0.5ng/mLの濃度にそれぞれ希釈し、標的分子含有試料を調製した。
(検出デバイスの作製)
0.5mm厚のガラス製の基板にCYTOP(登録商標)(旭硝子製)をスピンコートした後、180℃で1時間ベークした。形成されたCYTOPの厚みは3μmであった。
(PSAの検出1)
PSAを標的分子として実験を行った。サンプルチューブ(タンパク質非吸着、エッペンドルフ社)に、様々な濃度のPSAを含む溶液50μLをそれぞれ添加した。続いて、各チューブに、106個の標的分子捕捉粒子、配列番号1に示す塩基配列を有するDNA断片で標識した10μg/mLの核酸標識抗PSA抗体50μL、及び配列番号2に示す塩基配列を有するDNA断片で標識した10μg/mLの核酸標識抗PSA抗体50μLをそれぞれ添加し、シェーカー上で撹拌しながら室温で1時間反応させ、複合体を形成させた。
実施例1で使用したPSA溶液を用いて同様の実験を行ったが、核酸標識PSA抗体として、配列番号1に示す塩基配列を有するDNA断片で標識した10μg/mLの核酸標識抗PSA抗体のみを使用した。
(PSAの検出2)
PSAを標的分子として実験を行った。試料中のPSAの濃度を0pg/mL(0fM)、0.1pg/mL(3fM)、1pg/mL(30fM)、10pg/mL(300fM)にした以外は実施例1と同様の反応を行い、FAM及びRedmond REDの双方の蛍光を検出した。
また、本実施例においても、インベーダー反応に要する加熱時間は15分間であり、PSAを迅速に検出できることが明らかとなった。
実施例2でPSAを検出したデバイスのウェルについて、FAMの蛍光が観察されたウェルの数のみを計測した。これにより、1種類の抗PSA抗体のみを用いてPSAを検出したのと同様の結果を得ることができる。
(PSA及びCEAの検出)
PSA及びCEAの混合物を標的分子として実験を行った。サンプルチューブ(タンパク質非吸着、エッペンドルフ社)に、0.01ng/mLのPSA及び0.01ng/mLのCEAを体積比1:2で混合した溶液50μLを添加した。続いて、上記のチューブに、106個の標的分子捕捉粒子、配列番号1に示す塩基配列を有するDNA断片で標識した10μg/mLの核酸標識抗PSA抗体50μL、配列番号2に示す塩基配列を有するDNA断片で標識した10μg/mLの核酸標識抗PSA抗体50μL、配列番号3に示す塩基配列を有するDNA断片で標識した10μg/mLの核酸標識抗CEA抗体50μL、配列番号4に示す塩基配列を有するDNA断片で標識した10μg/mLの核酸標識抗CEA抗体50μLをそれぞれ添加し、シェーカー上で撹拌しながら室温で1時間反応させ、複合体を形成させた。
なお、核酸標識抗PSA抗体は、抗体(抗体一分子)に対して5〜20倍量の核酸が修飾されるように調製した。
また、核酸標識抗CEA抗体は、抗体(抗体一分子)に対して5〜20倍量の核酸が修飾されるように調製した。
<試薬調製>
(エクソソーム含有試料)
エクソソームを含む培養上清は大腸がん細胞株HCT116をMcCoy’s 5A Medium(Lonza社):Exo−FBS(SBI社):ペニシリンストレプトマイシン溶液(和光純薬社)を90:10:1で混合した培地で3日間培養した培養上清を用いた。培養上清を300×g、10分で細胞を除去した。さらに培養上清を2000×g、10分でデブリスを除去した。さらに培養上清を10000×g、30分でさらに細かいデブリスを除去した。最後に培養上清を0.22μmのフィルターユニット(millipore社)でろ過した。
エクソソームを含む血清はヒト血清(human serum AB、コージンバイオ社製)を用いた。
(抗体固定化磁性ビーズの調製)
抗体を磁性ビーズに固定化するため、カルボキシル基修飾磁性ビーズ(Magnosphere、LC300、JSR社)溶液に、抗エクソソーム抗体(型式「CD9」、コスモバイオ社)を添加し100μLに混合し、ローテーターにて30分反応させ、さらに縮合剤EDCを加え3時間反応させ、抗体のカルボキシル磁性ビーズへの固定化を行った。
反応後未反応の抗体と試薬を取り除くため、マグネットスタンドを用いて抗体固定化カルボキシル磁性ビーズを磁気捕集、および、PBS−T(0.1%Tween20含有PBS)による洗浄を3回繰り返し、抗体固定化カルボキシル磁性ビーズ(CD9ビーズ)を調製した。
(抗体修飾用核酸及び検出用核酸)
抗体修飾用及び核酸検出反応用の核酸としては、以下に示す核酸を用いた。
・DNA断片5:配列番号11に示す塩基配列を有する。
・DNA断片6:配列番号12に示す塩基配列を有する。
・アレルプローブ3:配列番号8に示す塩基配列を有する。
・アレルプローブ5:配列番号13に示す塩基配列を有する。
・インベーダーオリゴ2:配列番号10に示す塩基配列を有する。
(核酸修飾抗体の調製)
実験例3と同様にして、抗エクソソーム抗体2種(型式「CD63」、型式「CD81」、コスモバイオ社)に、DNA断片5、6をそれぞれ結合させ核酸修飾抗体(DNA断片5−CD63、DNA断片6−CD81)を調製した。
核酸修飾抗体は、DNA断片5−CD63、DNA断片6−CD81のいずれも、抗体(抗体一分子)に対して5〜20倍量の核酸が修飾されるように調製した。
(核酸検出試薬の調製)
デジタルインベーダー反応による核酸修飾抗体検出を行うため、核酸検出試薬として、インベーダー反応試薬を調製した。本実施例におけるインベーダー反応試薬の試薬組成は以下の通りである。
実施例4におけるインベーダー反応試薬は、0.1μMアレルプローブ3(配列番号8)、0.1μMアレルプローブ5(配列番号13)、1μMインベーダーオリゴ2(配列番号10)、2μM FRET Cassette(FAM)(ホロジック社製)、2μM FRET Cassette(Redmond RED)(ホロジック社製)、10mM MOPS(pH7.9)、10mM MgCl2及び1000U/μLクリベースを含んでいた。
なお、これらのインベーダー反応試薬における各成分の濃度は、実施例4に係るインベーダー反応試薬における終濃度である。
サンプルチューブに、106個の抗体固定化カルボキシル磁性ビーズ(CD9ビーズ)、0または50%となるようにそれぞれ調整した培養上清あるいは血清、0.1ng/mLに調整した核酸修飾抗体2種(DNA断片5−CD63、DNA断片6−CD81)を全量が100μLとなるように混合し、ローテーター上で室温3時間反応させ、複合体を形成させた。
反応後、マグネットスタンドを用いて得られた磁性ビーズを磁気捕集し、上清の除去及び0.1%Tween含有PBS(PBS−T)を加える操作を5回繰り返して洗浄し、最後に上清を除去して複合体を得た。
得られた複合体を洗浄後PBSにて希釈し、反応混合液1を調製した。
流路の高さは100μm、幅は6〜7mmになるように下記3部材を組み立てた。
・COPチャンバー(φ5μm、深さ3.5μmの微小孔を形成、STRATEC社)
・両面テープ(膜厚100μm、宝洋社)
・COP送液用流路ストリップ(カーボンブラック添加着色、送液及び廃液ポート付、荒川樹脂社)
フローセルに、上記の複合体とインベーダー反応試薬とを混合した溶液20μLを送液した。続いて、封止液としてFC−40(Sigma社)を100μL送液し、各チャンバーを封止した。
上記フローセルをホットプレート上にセットし、66℃15分反応させた。
上記フローセルを冷却後、蛍光顕微鏡BZ−710(KEYENCE社)で各ウェルにおけるFAM、Redmond REDの蛍光を検出した。露光時間として、FAMは1200m秒、Redmond REDは1000m秒とした。
その結果、サンプル中の培養上清及び血清の含有割合に応じて、蛍光チャンバー数が変化している事が確認された。
これらの結果から、エクソソーム抗体を用いたデジタルインベーダーによってエクソソーム膜表面タンパク質が認識され、培養上清及び血清中に含まれるエクソソームを検出できている事が示唆された。
例えば、図8の右側、図9の右側においては、FAMは緑色の蛍光を発していた。
また、FAMの蛍光が観察されることは、エクソソーム膜表面上に存在するタンパク質であるCD63が検出できたと考えられる。
例えば、図8の右側、図9の右側においては、Redmond REDは赤色の蛍光を発していた。
また、Redmond REDの蛍光が観察されることは、エクソソーム膜表面上に存在するタンパク質であるCD81が検出できたと考えられる。
また、FAM及びRedmond REDの双方由来の蛍光(黄色)が観察されることは、エクソソームのうち、エクソソーム膜表面上にCD63、CD81の2つのタンパク質が存在するエクソソームを検出できたと考えられる。
すなわち、複数種類の第一の標的分子としてのCD63、CD81の検出を介して、第二の標的分子としてのエクソソームを検出できることを確認できた。
また、本実施例によれば、緑色、赤色、黄色のような複数の蛍光シグナルの検出によって、生体試料中におけるエクソソームに存在するCD63、CD81の分布を判定することができたと考えられる。
さらに、本実施例によれば、緑色、赤色、黄色のような複数の蛍光シグナルの分布を検出することによって、生体試料中において膜表面上にCD63を有するエクソソーム、膜表面上にCD81を有するエクソソーム、および膜表面上にCD63およびCD81の両者を有するエクソソームの分布を観察することができたと考えられる。
これはタンパク質を認識する抗体に、蛍光標識された核酸断片を多く結合させているためである。
また、本実施例においては、1つのウェルに1つ以下のエクソソーム(第一の標的分子としてのタンパク質を有する第二の標的分子)が導入されるように、ウェルのサイズを構成したため、フローセル中に蛍光標識された核酸断片を有する抗体が多数存在しても、余剰の抗体由来の蛍光の干渉等を受けずに、エクソソームが有するタンパク質を検出できたと考えられる。
また、従来の抗体を蛍光標識したフローサイトメトリーでは、標的となるエクソソームやタンパク質が小さいため、検出のために蛍光標識ビーズ等を用いて分離しなければならなくなり、高感度検出は困難である。
さらに、従来の核酸修飾抗体を用いたイムノPCRでは、検出のために核酸の標識量を制御しなければならなくなり、定量検出は困難である。
このように、従来の方法によれば、迅速かつ精度よく標的分子を検出することは困難であると考えられる。
また、本実施例に係る標的分子の検出方法によれば、エクソソーム等の生体試料の表面上に存在するタンパク質等の検出が可能であり、多色検出により、これらのタンパク質等の分布を観察し、ガンに関連するバイオマーカーとなるタンパク質等の挙動や分布を調査する等、定性的な分析に応用することも可能であることが考えられる。
Claims (16)
- 標的分子の検出方法であって、
互いに異なる蛍光波長の蛍光シグナルを発生させる標識物質を有する複数の核酸断片で標識され、かつ、認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質と、複数種類の第一の標的分子と、を準備する工程と、
前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程と、
前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、
前記複数種類の前記第一の標的分子を前記複数種類の前記特異的結合物質に応じた複数の前記蛍光シグナルにより判断する工程と、
を備える、
標的分子の検出方法。 - 前記特異的結合物質の1分子に対して前記複数の核酸断片が数個〜数十個結合している、請求項1に記載の検出方法。
- 前記特異的結合物質が抗体である、請求項2に記載の検出方法。
- 前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも1つを有する第二の標的分子を準備し、
前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも1つの検出を介して前記第二の標的分子を検出する、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の検出方法。 - 前記第二の標的分子がエクソソームである、請求項4に記載の検出方法。
- 前記複数種類の前記第一の標的分子のうち少なくとも1つが前記エクソソームの膜表面上に存在する、請求項5に記載の検出方法。
- 前記複数種類の前記第一の標的分子が疾患マーカータンパク質である、請求項6に記載の検出方法。
- 複数のウェルを有する基板を備えた検出デバイスを準備し、
前記複数種類の前記特異的結合物質を前記複数種類の前記第一の標的分子に結合させる工程の後に、前記複数のウェルにおいて1つのウェルに1つの前記第二の標的分子を導入する工程をさらに備える、
請求項4〜7のいずれか一項に記載の検出方法。 - 同時に前記複数種類の前記第一の標的分子を検出する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の検出方法。
- 標的分子の検出方法であって、
認識するエピトープが互いに異なる複数種類の特異的結合物質を標的分子に結合させる工程と、
前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程と、
前記複数種類の前記特異的結合物質のうち2種以上が検出された場合に前記標的分子が存在すると判断する工程と、
を備える、標的分子の検出方法。 - 前記標的分子の検出が1分子単位で行われる、請求項10に記載の検出方法。
- 前記複数種類の特異的結合物質の少なくとも1種が核酸断片で標識されている、請求項10又は11に記載の検出方法。
- 前記複数種類の前記特異的結合物質をそれぞれ検出する工程が、シグナル増幅反応を含む、請求項10〜12のいずれか一項に記載の検出方法。
- 同時に複数種類の標的分子を検出する、請求項10〜13のいずれか一項に記載の検出方法。
- 標的分子検出キットであって、
標的分子に対する特異的に結合し、認識するエピトープが互いに異なり、互いに識別可能に標識された複数種類の特異的結合物質を備える、標的分子検出キット。 - 前記複数種類の特異的結合物質が、互いに異なる核酸断片で標識されている、請求項15に記載の標的分子検出キット。
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