CN118362716A - 微粒上的单分子的直接检测 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了使用荧光剂和大缀合物分析生物样品中的目标分析物的方法，所述大缀合物包含含有交联的聚合物或蛋白的核心、标签、特异性结合成员或其片段以及任选载体蛋白。还提供了在单一测定中使用微粒和包含不同荧光团标记物的检测缀合物分析生物样品中的两种或更多种目标分析物、获取微粒的透射光和荧光图像并使用定制的图像分析过程来分析获取的图像的方法。

Description

微粒上的单分子的直接检测
本申请是申请日为2019年12月27日，申请号为201980093275.5，发明名称为“微粒上的单分子的直接检测”的发明专利申请的分案申请。
本专利申请要求2018年12月28日提交的美国临时专利申请号62/785,796和2018年12月28日提交的美国临时专利申请号62/785,798(两者均通过引用并入本文)的权益。
技术领域
本申请涉及体外诊断(IVD)领域，并且具体涉及在单一测定中使用微粒和包含不同荧光团标记物的检测缀合物分析生物样品中的两种或更多种目标分析物、获取微粒的透射光和荧光图像并使用定制的图像分析过程来分析获取的图像的方法。
背景技术
常规的免疫诊断测定涉及整体测量，其中通过记录累积信号来鉴定反应小瓶中的靶标分子。更近来，已经开发可以对单个分析物分子进行计数的免疫测定，其在本领域中已知为“数字免疫测定”。一种这种方法涉及用酶标记检测抗体并将单个微粒捕获在纳米孔中。假设在低样品浓度下，与抗体-酶缀合物结合并被限制在纳米孔中的微粒捕获的单个分析物分子可以将足够的底物转化为荧光状态，在合理的时间范围内变得可检测。空纳米孔以及具有未捕获分析物和/或缀合物的微粒的纳米孔保持黑暗。该方法的本质取决于大量非荧光、含有微粒的孔的存在，以满足单分子计数统计的规则。这些灵敏的技术在本领域中也经常被称为单分子酶联免疫吸附分析(smELISA)。然而，与标准免疫测定相比，它们需要额外的步骤和试剂、笨重的检测装置并且耗时。它们也不太适合在计数(数字)和平均(模拟)模式之间转换，这降低检测动态范围。
免疫诊断测定的另一个问题是在单一测定中测量来自一个样品的两种或多种分析物的能力，另外称为“多重分析”，在体外诊断(IVD)领域内受到高度追捧(Marquette等人,Bioanalysis,4: 927-936 (2012))。与单重免疫测定相比，多重免疫测定提供更高的通量、每个结果更少的时间、更少的耗材和更低的成本。然而，试剂复杂性、非特异性结合以及试剂之间的干扰可能在多重免疫测定中产生不准确的结果和低灵敏度。为了解决这些问题，已经开发了多重免疫测定，其使用多色珠粒来区分样品中的单独分析物(例如，LUMINEX® 100/200™ (Luminex Corp., Austin, TX)。然而，许多此类多色珠粒形式仍然受困于低于最佳的灵敏度和在多种分析物之间的信号干扰的问题。
因此，需要在宽动态范围内进行高度灵敏的数字免疫测定的替代方法和装置，以及需要具有高灵敏度和低试剂干扰的多重免疫测定方法和系统。
发明内容
本公开提供了分析生物样品中的目标分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在结合表面上捕获目标分析物，所述结合表面包含与之固定的结合所述分析物的多个特异性结合成员；(b)使多个大缀合物与捕获的分析物反应；其中每个大缀合物包含：(i)包含交联的蛋白或聚合物，或纳米颗粒的核心，所述聚合物包含多糖、树枝状聚合物、聚醚化合物；(ii)多个特异性结合成员、其片段或其组合；(iii)多个标签或可检测标记物，其中当所述大缀合物包含多个标签时，所述方法包括使多个荧光剂与所述标签反应，其中每个荧光剂包含能够结合标签和可检测标记物的分子；和任选地(iv)多个载体蛋白；和(c)对所述结合表面进行成像并分析图像。
还提供了分析生物样品中的目标分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在结合表面上捕获目标分析物，所述结合表面包含与之固定的结合所述分析物的多个特异性结合成员；(b)使多个大缀合物与捕获的分析物反应；其中每个大缀合物包含：(i)包含交联的蛋白或聚合物，或纳米颗粒的核心，所述聚合物包含多糖、树枝状聚合物、聚醚化合物；(ii)共价附接至所述核心周围的位置的多个载体蛋白；(iii)共价附接至所述载体蛋白的多个特异性结合成员、其片段或其组合；和(iv)共价附接至所述多个载体蛋白或所述多个特异性结合成员的多个标签；(c)使多个荧光剂与所述大缀合物反应，其中每个荧光剂包含能够结合标签和可检测标记物的分子；和(d)对所述结合表面进行成像并分析图像。
本公开还提供了在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法。所述方法包括：(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒(i)包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员，且(ii)用第一荧光团标记；(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，且(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员；(c)使捕获的第一目标分析物与第一缀合物反应，其中所述第一缀合物包含用第二荧光团标记并结合所述第一分析物的特异性结合成员；(d)使捕获的第二分析物与第二缀合物反应，其中所述第二缀合物包含用第三荧光团标记并结合所述第二分析物的特异性结合成员，且其中所述第一、第二和第三荧光团是不同的；(e)获得所述第一和第二微粒的透射光图像；(f)获得分别对应于所述第一、第二和第三荧光团的第一和第二微粒的分开荧光图像；和(g)使用定制的图像分析过程分析所述图像。
本公开进一步提供了在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法，所述方法包括：(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员；(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员，且(iii)所述第一微粒和所述第二微粒的尺寸和/或形状不同；(c)使捕获的第一目标分析物与第一缀合物反应，其中所述第一缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员包含第一荧光团并结合所述第一分析物；(d)使捕获的第二分析物与第二缀合物反应，其中所述第二缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员包含第二荧光团并结合所述第二分析物，且其中所述第一和第二荧光团是不同的；(e)获得所述第一和第二微粒的透射光图像；(f)获得分别对应于所述第一和第二荧光团的第一和第二微粒的分开荧光图像；和(g)使用定制的图像分析过程分析所述图像。
附图说明
图1是举例说明示例性大缀合物的图，其中葡聚糖是交联聚合物，牛血清白蛋白(BSA)是载体蛋白，生物素是捕获标签，且多个Fab是抗体片段。
图2是举例说明如本文所述的结合表面(例如，微粒)的透射光和荧光图像的分析的图。透射光图像用于定位目标区域并确定目标区域面积(或总面积)。荧光图像用于确定(i)来自目标区域的总荧光，和/或(ii)位于目标区域上的亮峰数量。从这些数据计算模拟和数字模式结果。
图3A是从实施例2中描述的HCV核心抗原检测测定法(0-80fM的HCV)获取的一系列透射光图像(顶部小图)、荧光图像(中心小图)和荧光图像的强度概况(底部小图)。图3B是模拟模式(左)和数字模式(右)下的HCV测定的校准曲线的图。
图4A是举例说明实施例3中描述的HIV P24测定的校准曲线的图。图4B是0和6.5pg/ml的HIV P24测定的一系列透射光图像(左小图)、荧光图像(中小图)和强度概况(右小图)。
图5显示使用SA-APC作为荧光剂的HIV P24测定的校准曲线，如实施例3中所述。
图6是举例说明HIV P24测定的模拟模式下的图像分析的图。
图7是显示将来自数字模式的信号和来自模拟模式的信号组合成单个复合信号的标准的示意图。
图8是举例说明实施例6中描述的雌二醇检测测定的结果的图。
图9是举例说明根据本公开的双重免疫夹心测定的分析的图。该测定包括用于分析物1(即微粒1“MP1”和缀合物1)和分析物2 (MP2和缀合物2)的试剂。MP1用第一荧光团(颜色A)染色。缀合物1用第二荧光团(颜色B)标记，且缀合物2用第三荧光团(颜色C)标记。
图10是举例说明由本文描述的测定方法提供的减少的试剂干扰的图。
图11是举例说明如实施例7中所述的图像分析顺序的图。
图12是举例说明实施例7中描述的免疫测定对于HCV/HIV-阴性样品的结果的一系列图像。左上小图是所有微粒的透射光图像；右上小图是对应于用颜色A染色的微粒的荧光图像(HCV MP)；左下小图是对应于来自MP1的信号的荧光图像(HCV MP，颜色B，由于阴性样品而暗淡)；右下小图是对应于来自MP2的信号的荧光图像(HIV MP，颜色C，由于阴性样品而暗淡)。
图13是举例说明实施例7中描述的免疫测定对于HIV阳性样品的结果的一系列图像。左上小图是所有微粒的透射光图像；右上小图是对应于用颜色A染色的微粒的荧光图像(HCV MP)；左下小图是对应于来自MP1的信号的荧光图像(HCV MP，颜色B，由于阴性样品而暗淡)；右下小图是对应于来自MP2的信号的荧光图像(HIV MP，颜色C，由于阳性样品而明亮)。
图14是举例说明实施例7中描述的免疫测定对于HCV阳性样品的结果的一系列图像。左上小图是所有微粒的透射光图像；右上小图是对应于用颜色A染色的微粒的荧光图像(HCV MP)；左下小图是对应于来自MP1的信号的荧光图像(HCV MP，颜色B，由于阳性样品而明亮)；右下小图是对应于来自MP2的信号的荧光图像(HIV MP，颜色C，由于阴性样品而暗淡)。
图15是举例说明使用实施例7中描述的双重测定形式在HCV通道中测量的140个正常人样品、阳性HCV校准物和阳性HIV校准物的分布的图。
图16是举例说明使用实施例7中描述的双重测定形式在HIV通道中测量的140个正常人样品、阳性HCV校准物和阳性HIV校准物的分布的图。
具体实施方式
本公开至少部分地基于以下发现：在免疫测定中使用大缀合物和荧光剂允许在不需要酶扩增和纳米孔的情况下直接显现和分析单个免疫复合物，并且与透射光和荧光图像分析组合的使用包含不同荧光团标记物的微粒和检测缀合物的单个多重分析物测定导致分析物和试剂之间的干扰减少。与采用基于流式细胞术的检测方法的其他已知方法相比，本文所述的图像分析还增加多重测定的灵敏度。
定义
为了便于理解本技术，下面定义许多术语和短语。额外定义记载于整个详述中。
如本文所用，术语“生物样品”、“样品”和“测试样品”可互换使用，并且是指含有或怀疑含有目标分析物的物质。生物样品可以源自任何合适的来源。例如，生物样品的来源可以是合成的(例如，在实验室中产生的)，或者获得自或源自例如环境(例如，空气、土壤、流体样品，例如水源等)、动物(例如，哺乳动物)、植物或另一种生物的天然存在的物质。在一个实施方案中，生物样品的来源是人体物质(例如，体液、血液、血清、血浆、尿液、唾液、汗液、痰液、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便、组织、器官等)。人组织可以包括但不限于骨骼肌组织、肝组织、肺组织、肾组织、心肌组织、脑组织、骨髓、子宫颈组织、皮肤等。在一些实施方案中，样品来源可以是活检样品，其可以通过组织分解/细胞裂解而溶解。所述样品可以是液体样品、固体样品的液体提取物、流动的微粒固体或固体颗粒的流体悬浮液。
术语“分析物”、“靶标分析物”和“目标分析物”在本文中可互换使用并且是指在所公开的方法中被测量的物质。可以使用本公开的方法检测和任选地定量可以被特异性结合成员特异性结合的任何分析物。
如本文所用的术语“结合表面”是指可以将特异性结合成员(例如，如本文所讨论的抗体)固定至其上且可以进行分析物检测测定的任何表面。在本公开的上下文中，可以使用任何合适的结合表面。在一些实施方案中，所述结合表面包含多个(例如，2个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、1,000个或更多个、或5,000个或更多个)微粒。
如本文所用的术语“目标区域(ROI)”是指图像中被选择用于进一步分析的区域，例如一组像素。在图像中，区域可以是连续的或不连续的。术语“目标区域(ROI)面积”、“总面积”或“总结合面积”在本文中可互换使用以指所选区域的面积。当通过像素定义区域时，术语“目标区域面积”、“总面积”或“总结合面积”也可以指目标区域中像素的总数或总和。
如本文所用的术语“接触”是指任何类型的组合行为，其使结合成员与样品中的目标分析物足够密切接近，使得如果样品中存在对于结合成员特异性的目标分析物，则将发生结合相互作用。
如本文所用的术语“大缀合物”是指包含两个或更多个与彼此特异性结合的分子的复合物。例如，大缀合物可以包含与彼此特异性结合的三个或更多个(例如，4、5、6、7、8、9或10或更多个)分子。
术语“特异性结合配偶体”和“特异性结合成员”在本文中可互换使用并且是指两种或更多种不同分子之一，与对其他分子的识别显著较少相比，其特异性识别另一分子。两个不同分子之一在表面上或空腔中具有区域，其特异性结合另一分子的特定空间和极性结构，且由此被定义为与另一分子的特定空间和极性结构互补。分子可以是特异性结合对的成员。例如，特异性结合成员可以包括但不限于蛋白，诸如受体、酶和抗体。
如本文所用的术语“可检测标记物”是指可以产生可通过视觉或仪器手段检测的信号的部分。可检测标记物可以是例如产生信号的物质，诸如色原、荧光化合物、酶、化学发光化合物、放射性化合物等。在一个实施方案中，所述可检测标记物可以是荧光化合物。
如本文所用，术语“空间信息”是指对发出信号的位置的鉴别。
如本文所用的术语“像素”是指数字图像中的单个点，或显示装置中最小的可寻址屏幕要素。像素是可以被描绘或控制的最小图片单位。每个像素都具有其自己的地址。像素的地址对应于其空间坐标。像素通常排列在二维网格中，并且经常使用点或正方形描绘。每个像素都是原始图像的样品；更多的样品通常提供更准确的原件描绘。每个像素的强度通常是可变的，并且图像中的像素总数可以变化。数字图像中像素数量的代表性实例是1024×1024。
如本文所用的术语“强度”是指每单位面积或体积的电、光、热或声音的强度的量或程度。更具体地，关于本文描述的方法，术语“强度”是指每单位时间每单位面积计数的光子数。例如，每单位面积1000个光子可以记录为单个像素中的500个计数，而每单位面积80个光子记录为单个像素中的40个计数。特定的转换取决于所使用的相机系统。强度与计数的光子数成正比。
如本文所用的术语“光子”是指代表光或其他电磁辐射的量子的粒子。光子携带与辐射频率成正比的能量，但静止质量为零。
如本文所用的术语“数字模式”是指一种图像分析类型，其中目标区域被鉴定并且计数一个或多个结合表面上的高强度峰(例如，高强度荧光峰)的总数。在一些实施方案中，可以确定高强度峰的总数与目标区域面积的比率，并表示为“每个面积的峰”或“PPA”。在结合表面鉴定的每个高强度峰对应于单个免疫夹心复合物。峰可以是强度高于预定义阈值的单个像素或像素簇。选择的预定阈值将尤其取决于目标分析物和所使用的可检测标记物。
如本文所用的术语“模拟模式”是指一种图像分析类型，其中在一个或多个荧光图像中计算目标区域中的总像素强度。如果在模拟模式下计算的信号值低于预设值，则可以在数字模式下分析荧光图像(即，分析从模拟模式切换至数字模式)。分析的数字和模拟模式在图2中示意性举例说明。
术语“掩模”和“图像掩模”在本文中可互换使用以指用于区分图像部分的工具，可以在所述图像部分上进行指定特征的进一步检查。掩模可以在空间上区分目标区域的面积并排除可能混淆分析的其他图像面积。例如，掩模可以将特定的免疫夹心和/或微粒与背景或非特异性荧光区分开。目标特征可以被分配数字“1”或白色，而非目标特征可以被分配数字“0”或黑色。
如本文所用的术语“转换因子”是指用于组合校准曲线的数字和模拟部分的系数。它是使用重叠间隔计算的，在所述重叠间隔中可以清楚地确定数字和模拟信号二者。这些转换因子是测定特异性的，并且应当在生成校准曲线时设置。
生物样品
可以提供任何合适体积的样品。应理解，稀有靶标的灵敏检测需要大样品体积，范围为100 µL至约2 mL。对于更丰富的靶标，单分子(SM)检测方法可以用较小的样本体积进行操作。在这方面，生物样品的体积可以为约10 μl至约50 μl(例如，10 μl、15 μl、20 μl、25 μl、30 μl、35 μl、40 μl或50 μl)。在另一个实施方案中，所述生物样品的体积可以是约10 μl至约30 μl(例如，10 μl、11 μl、12 μl、13 μl、14 μl、15 μl、16 μl、17 μl、18 μl、19μl、20 μl、21 μl、22 μl、23 μl、24 μl、25 μl、26 μl、27 μl、28 μl、29 μl、30 μl或由上述值中的任何两个定义的范围)。
在一些实施方案中，液体生物样品可以在用于测定之前进行稀释。例如，在其中生物样品是人体体液(例如，血液或血清)的实施方案中，可以用适当的溶剂(例如，PBS缓冲液)稀释体液。在使用之前，流体样品可以稀释约1-倍、约2-倍、约3-倍、约4-倍、约5-倍、约6-倍、约10-倍、约100-倍或更多。
在其他实施方案中，所述样品可以经历分析前处理。分析前处理可以提供额外的功能，诸如非特异性蛋白去除、分析物富集和/或有效但便宜的可实施混合功能。分析前处理的一般方法包括，例如，使用电动捕获、AC电动、表面声波、等速电泳、介电泳、电泳和本领域中已知的其他预浓缩技术。在一些情况下，液体样品可以在用于测定之前进行浓缩。例如，在其中生物样品是人体体液(例如，血液、血清)的实施方案中，可以通过沉淀、蒸发、过滤、离心或其组合来浓缩体液。在使用之前，流体样品可以浓缩约1-倍、约2-倍、约3-倍、约4-倍、约5-倍、约6-倍、约10-倍、约100-倍或更多。
分析物
在一些实施方案中，所述分析物可以是生物分子。合适的生物分子的实例包括但不限于大分子，诸如蛋白、脂质和碳水化合物。其他生物分子包括，例如，激素、抗体、生长因子、寡核苷酸、多核苷酸、半抗原、细胞因子、酶、受体(例如，神经、激素、营养物和细胞表面受体)或其配体、癌症标志物(例如，PSA、TNF-α)、心肌梗塞标志物(例如，BNP、肌钙蛋白、肌酸激酶等)、毒素、代谢剂(例如，维生素)等。合适的蛋白分析物包括例如肽、多肽、蛋白片段、蛋白复合物、融合蛋白、重组蛋白、磷蛋白、糖蛋白、脂蛋白等。
在某些实施方案中，所述分析物可以是翻译后修饰的蛋白(例如，磷酸化、甲基化、糖基化的蛋白)并且特异性结合成员可以是对翻译后修饰特异性的抗体。修饰的蛋白可以结合至固定在固体支持物上的特异性结合成员，其中特异性结合成员结合修饰的蛋白而不是未修饰的蛋白。
可以通过本文公开的方法分析的分析物的非限制性列表包括Aβ42淀粉样β-蛋白、胎球蛋白-A、tau、分泌粒蛋白II、朊病毒蛋白、α-突触核蛋白、tau蛋白、NSE、S100B、NF-L、ApoA1、BDNF、MBP、肌酐钠、BUN、AMPAR、朊病毒蛋白、神经丝轻链、帕金蛋白(parkin)、PTEN诱导的推定激酶1、DJ-1、富含亮氨酸的重复激酶2、突变的ATP13A2、Apo H、铜蓝蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α (PGC-1α)、甲状腺素运载蛋白、维生素D-结合蛋白、促凋亡激酶R (PKR)及其磷酸化PKR (pPKR)、CXCL13、IL-12p40、CXCL13、IL-8、Dkk-3(精液)、p14内皮细胞特异性分子(endocan)片段、血清、ACE2、针对CD25的自身抗体、hTERT、CAI25 (MUC 16)、VEGF、sIL-2、骨桥蛋白、人附睾蛋白4 (HE4)、甲胎蛋白、白蛋白、白蛋白尿、微量白蛋白尿、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、白介素18 (IL-18)、肾损伤分子-1 (KIM-1)、肝脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、LMP1、BARF1、IL-8、癌胚抗原(CEA)、BRAF、CCNI、EGRF、FGF19、FRS2、GREB1、LZTS1、α-淀粉酶、癌胚抗原、CA 125、IL8、硫氧还蛋白、β-2微球蛋白、肿瘤坏死因子-α受体、CA15-3、促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、T-细胞淋巴瘤侵袭和转移1 (TIAM1)、N-钙粘蛋白、EC39、双调蛋白、dUTPase、分泌性凝溶胶蛋白(pGSN)、前列腺特异性抗原(PSA)、胸腺素β15、胰岛素、血浆C-肽、糖化血红蛋白(HBA1c)、C-反应蛋白(CRP)、白介素-6 (IL-6)、Rho GDP-解离抑制剂2 (ARHGDIB)、丝切蛋白-1(CFL1)、抑制蛋白-1 (PFN1)、谷胱甘肽S-转移酶P (GSTP1)、蛋白S100-A11(S100A11)、过氧化物氧还蛋白-6 (PRDX6)、10 kDa热休克蛋白、线粒体(HSPE1)、溶菌酶C前体(LYZ)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)、组蛋白H2A 2-A型(HIST2H2AA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、基底膜特异性硫酸肝素蛋白聚糖核心蛋白前体(HSPG2)、半乳糖凝集素-3-结合蛋白前体(LGALS3BP)、组织蛋白酶D前体(CTSD)、载脂蛋白E前体(APOE)、Ras GTP酶激活样蛋白(IQGAP1)、铜蓝蛋白前体(CP)、和IGLC2、PCDGF/GP88、EGFR、HER2、MUC4、IGF-IR、p27(kip1)、Akt、HER3、HER4、PTEN、PIK3CA、SHIP、Grb2、Gab2、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDK-1)、TSC1、TSC2、mTOR、ERBB受体反馈抑制剂1 (MIG-6)、S6K、src、KRAS、丝裂原活化蛋白激酶1(MEK)、cMYC、拓扑异构酶(DNA) II α170 kDa、FRAP1、NRG1、ESR1、ESR2、PGR、CDKN1B、MAP2K1、NEDD4-1、FOXO3A、PPP1R1B、PXN、ELA2、CTNNB1、AR、EPHB2、KLF6、ANXA7、NKX3-1、PITX2、MKI67、PHLPP、脂联素(ADIPOQ)、纤维蛋白原α链(FGA)、瘦素(LEP)、高级糖基化终产物特异性受体(AGER或RAGE)、α-2-HS-糖蛋白(AHSG)、血管生成素(ANG)、CD14、铁蛋白(FTH1)、胰岛素样生长因子结合蛋白1 (IGFBP1)、白介素2受体α (IL2RA)、血管细胞粘附分子1 (VCAM1)、血管性血友病因子(VWF)、髓过氧化物酶(MPO)、IL1α、TNFα、核周抗中性粒细胞胞质抗体(p-ANCA)、乳铁蛋白、钙防卫蛋白、威尔姆氏肿瘤-1蛋白、水通道蛋白-1、MLL3、AMBP、VDAC1、大肠杆菌肠毒素(不耐热外毒素、热稳定肠毒素)、流感HA抗原、破伤风毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、志贺样毒素I、志贺样毒素II、艰难梭菌毒素A和B、滥用药物(例如，可卡因)、蛋白生物标志物(包括但不限于核仁素、核因子-kB必需调节剂(NEMO)、CD-30、蛋白酪氨酸激酶7 (PTK7)、MUC1糖型、免疫球蛋白μ重链(IGHM)、免疫球蛋白E、αvβ3整联蛋白、α-凝血酶、HIV gp120、HIV p24、NF-κB、E2F转录因子、纤溶酶原激活剂抑制剂、肌腱蛋白C、CXCL12/SDF-1和前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
所述分析物可以是细胞，诸如例如胃癌细胞(例如，HGC-27细胞)；非小细胞肺癌(NSCLC)细胞、结肠直肠癌细胞(例如，DLD-1细胞)、H23肺腺癌细胞、Ramos细胞、T-细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)细胞、CCRF-CEM细胞、急性髓性白血病(AML)细胞(例如，HL60细胞)、小细胞肺癌(SCLC)细胞(例如，NCI-H69细胞)、人胶质母细胞瘤细胞(例如，U118-MG细胞)、前列腺癌细胞(例如，PC-3细胞)、过表达HER-2的人乳腺癌细胞(例如，SK-BR-3细胞)、胰腺癌细胞(例如，Mia-PaCa-2))。在其他实施方案中，所述分析物可以是感染剂，诸如细菌(例如，结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌O8和肠炎沙门氏菌)、病毒(例如，逆转录病毒(诸如HIV)、疱疹病毒、腺病毒、慢病毒、丝状病毒(例如，西尼罗河病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒)、肝炎病毒(例如，A、B、C、D和E)；HPV、细小病毒等)、寄生虫或真菌孢子。
结合表面
在一些实施方案中，公开的方法包括在一个或多个结合表面上捕获目标分析物。在其他实施方案中，本公开提供了一种方法，其包括在第一和第二(以及任选第三、第四、第五和后续)微粒的表面上捕获目标的第一和第二分析物(以及任选第三、第四、第五和后续分析物)。在一个实施方案中，所述第一微粒(i)包含固定在其表面上的结合第一分析物的多个特异性结合成员并且(ii)用第一荧光团标记，并且第二微粒包含固定在其表面上的结合第二分析物的多个特异性结合成员。在另一个实施方案中，所述第一微粒和所述第二微粒的大小和/或形状不同(例如，圆形和椭圆形微粒)。
在一些实施方案中，所述微粒可以是约0.1 nm至约10微米、约50 nm至约5微米、约100 nm至约1微米、约0.1 nm至约700 nm、约500 nm至约10微米、约500 nm至约5微米、约500nm至约3微米、约100 nm至700 nm或约500 nm至700 nm。例如，所述微粒可以是约4-6微米、约2-3微米、约0.5-1.5微米或约1微米。小于约500 nm的颗粒有时被认为是纳米颗粒。因此，所述微粒任选地可以是约0.1 nm至约500 nm、约10 nm至约500 nm、约50 nm至约500 nm、约100 nm至约500 nm、约100 nm、约150 nm、约200 nm、约250 nm、约300 nm、约350 nm、约400nm、约450 nm或约500 nm的纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述结合表面(例如，微粒)可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。示例性铁磁材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO、NiO/Fe。亚铁磁性材料的实例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4 (或FeO.Fe2O3)。所述结合表面可以具有实心部分，所述实心部分是磁性的并且被一个或多个非磁性层包围。或者，所述磁性部分可以是围绕非磁性核心的层。磁性结合表面，诸如微粒，可以以干燥形式或液体形式储存。磁性结合表面可以在与含有分析物的样品接触之前或之后经受磁场。
在某些实施方案中，结合表面(例如，微粒)还可以包含保护层、阻挡层或钝化层，其可以消除或最小化在测定期间非捕获组分(例如，分析物分子、结合成员)与结合表面的非特异性附着，所述非特异性附着可能导致检测期间的假阳性信号或信号丢失。在某些实施方案中可用于形成钝化层的材料的实例包括但不限于聚合物，诸如聚(乙二醇)，其排斥蛋白的非特异性结合；具有该特性的天然存在的蛋白，诸如血清白蛋白和酪蛋白；表面活性剂，例如两性离子表面活性剂，诸如磺基甜菜碱；天然存在的长链脂质；聚合物刷子，和核酸，诸如鲑鱼精子DNA。
所述结合表面(例如，一个或多个微粒)可以使用本领域中已知的任何合适的方法与一定体积的样品接触。接触可以各种不同的方式实现，所述方式包括将样品与结合成员组合，通过引入结合成员与分析物密切接近，使靶标分析物暴露于结合成员，等等。所述接触可以根据需要重复多次。
无论使用何种方法，所述结合表面(例如，第一和第二微粒)都可以在如下条件下与一定体积的样品接触，所述条件使样品中存在的任何分析物结合固定在结合表面(诸如微粒的表面)上的特异性结合成员。在一个实施方案中，所述结合表面和所述样品体积之间的接触保持(即，孵育)足够的时间段，以允许发生特异性结合成员和分析物之间的结合相互作用。在一个实施方案中，该样品体积在结合表面上孵育至少30秒且至多10分钟。例如，所述样品可以与微粒孵育约1、2、3、4、5、6、7、8或9分钟。在一个实施方案中，所述样品可以与结合表面孵育约2分钟。此外，孵育可以在促进特异性结合相互作用的结合缓冲剂(诸如例如白蛋白(例如，BSA)、非离子去污剂(Tween-20、TritonX-100)和/或蛋白酶抑制剂(例如，PMSF))中进行。在测定中，可以通过改变结合缓冲液操纵或改变特异性结合成员的结合亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，结合亲和力和/或特异性可以通过改变结合缓冲液来增加。在一些实施方案中，结合亲和力和/或特异性可以通过改变结合缓冲液来降低。结合相互作用的其他条件，诸如例如温度和盐浓度，也可以凭经验确定或可以基于制造商的说明。例如，所述接触可以在室温(21℃-28℃，例如23℃-25℃)、37℃或4℃下进行。
如上所讨论，本文公开的某些方法适用于检测多于两种不同的分析物。因此，在一些实施方案中，所述方法可以包括在第三、第四或后续微粒的表面上捕获第三、第四或后续目标分析物，其中(i)所述第三、第四和后续分析物各自不同于彼此且不同于第一和第二分析物，且(ii)所述第三、第四或后续微粒包含固定在其表面上的结合所述第三、第四或后续分析物的多个特异性结合成员。所述方法可以进一步包括：使捕获的第三、第四或后续分析物与第三、第四或后续缀合物反应，其中所述第三、第四或后续缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员用第四、第五或后续荧光团标记且结合所述第三、第四或随后分析物，且其中所述第四、第五和后续荧光团不同于彼此且不同于所述第一、第二和第三荧光团中的每一种。
特异性结合成员
如上所讨论，所述结合表面(例如，第一微粒)可以具有多个(例如，2或更多个、50或更多个、100或更多个、1,000或更多个、或5,000或更多个)特异性结合成员，其各自都特异性结合固定在其表面上的分析物。
应当理解，特异性结合成员(例如，第一、第二、第三、第四或后续结合成员)的选择将取决于待分析的一种或多种分析物。各种各样的靶标分子的结合成员是已知的或者可以使用已知技术容易地发现或开发。例如，当靶标分析物是蛋白时，所述结合成员可以包括肽、蛋白，特别是抗体或其片段(例如，抗原结合片段(Fab)、Fab'片段和F(ab')2片段)、全长单克隆或多克隆抗体、抗体样片段、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv (“scFv”)、单链抗体、单结构域抗体、诸如源自骆驼科中的动物的可变重链结构域(“VHH”；也已知为“VHH片段”) (参见，例如，Gottlin等人,Journal of Biomolecular Screening,14:77-85 (2009))、重组VHH单结构域抗体、VNAR片段、二硫化物-连接的Fv (“sdFv”)、抗独特型(“抗-Id”)抗体和前述任一种的功能活性表位结合片段。所述结合成员也可以是其他蛋白，诸如受体蛋白、蛋白A、蛋白C等。当分析物是小分子、诸如类固醇、后胆色素、类维生素A或脂质时，第一和/或第二特异性结合成员可以是支架蛋白(例如，脂质运载蛋白)或受体。在一些实施方案中，蛋白分析物的特异性结合成员可以是肽。在另一个实施方案中，当靶标分析物是酶时，合适的结合成员可以包括酶底物和/或酶抑制剂，诸如肽、小分子等。在一些情况下，当靶标分析物是磷酸化物质时，所述结合成员可以包含磷酸结合剂。例如，所述磷酸结合剂可以包含金属离子亲和介质，诸如美国专利7,070,921和美国专利申请公开2006/0121544中描述的那些。
当分析物是碳水化合物时，潜在合适的特异性结合成员(如本文所定义)包括例如抗体、凝集素和选择素。如本领域普通技术人员将理解，可以与目标靶标分析物特异性结合的任何分子都可以潜在地用作结合成员。
在某些实施方案中，合适的靶标分析物/结合成员复合物可以包括但不限于抗体/抗原、抗原/抗体、受体/配体、配体/受体、蛋白/核酸、酶/底物和/或抑制剂、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素和/或选择素、蛋白/蛋白、蛋白/小分子等。
某些实施方案利用作为蛋白或多肽的结合成员。如本领域中已知，可以使用任何多种技术将多肽附接至固体表面或支持物，诸如微粒。已知用于向蛋白添加反应性部分的各种各样技术，诸如例如美国专利5,620,850中描述的方法。用于将蛋白附接至表面的方法也描述于，例如，Heller,Acc. Chem. Res.,23: 128 (1990)。
如本文所述，特异性结合成员和分析物之间的结合是特异性的，例如当结合成员和分析物是结合对的互补部分时。例如，在一个实施方案中，所述结合成员可以是特异性结合分析物上的表位的抗体。根据一个实施方案，所述抗体可以是能够特异性结合目标分析物的任何抗体。例如，适当的抗体包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体(dAb)(例如，诸如描述于Holt等人,Trends in Biotechnology,21: 484-490(2014))、单结构域抗体(sdAb)(其为天然存在的，例如如在软骨鱼类和骆驼科动物中，或是合成的，例如纳米抗体、VHH或其他结构域结构)、合成抗体(有时称为抗体模拟物)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为“抗体缀合物”)及其片段。在另一个实施方案中，分析物分子可以是抗体并且结合成员可以是特异性结合抗体的肽。
在一些实施方案中，所述特异性结合成员可以是化学程序化抗体(cpAb) (Rader,Trends in Biotechnology,32:186-197 (2014))，双特异性cpAb，抗体募集分子(ARMs)(McEnaney等人,ACS Chem. Biol., 7: 1139-1151 (2012))，支化捕获剂，诸如三配体捕获剂(Millward等人,J. Am. Chem. Soc.,133: 18280-18288 (2011))，源自非抗体支架的工程改造的结合蛋白，诸如单体(源自人纤连蛋白的第十个纤连蛋白III型结构域)、亲和体(源自免疫球蛋白结合蛋白A)、DARPins (基于锚蛋白重复模块)、anticalins (源自脂质运载蛋白后胆色素-结合蛋白和人脂质运载蛋白2)和半胱氨酸结肽(knottins)(Gilbreth和Koide,Current Opinion in Structural Biology,22:1-8 (2012); Banta等人,Annu. Rev. Biomed. Eng.,15: 93-113 (2013))，WW结构域(Patel等人,Protein Engineering, Design&Selection, 26(4): 307-314 (2013))，重新利用的受体配体，affitins (Béhar等人,Protein Engineering, Design&Selection,26: 267-275 (2013))和/或Adhirons(Tiede等人,Protein Engineering, Design&Selection,27: 145-155 (2014))。
在其中分析物是细胞(例如，哺乳动物、鸟类、爬行动物、其他脊椎动物、昆虫、酵母、细菌、细胞等)的实施方案中，所述特异性结合成员可以是对细胞表面抗原(例如，细胞表面受体)具有特异性亲和力的配体。在一个实施方案中，所述特异性结合成员可以是粘附分子受体或其部分，其对在靶标细胞类型表面上表达的细胞粘附分子具有结合特异性。所述粘附分子受体与靶标细胞的细胞外表面上的粘附分子结合，由此固定或捕获细胞。然后可以通过使用可以与第一结合成员相同或可以结合在细胞表面上表达的不同分子的第二结合成员来检测结合的细胞。
在一些实施方案中，分析物分子和特异性结合成员之间的结合亲和力应当足以在测定条件下保持结合，包括去除非特异性结合的分子或颗粒的洗涤步骤。在一些实施方案中，例如，在某些生物分子的检测中，分析物分子与其互补结合成员的结合常数可以是至少约104至约106M-1、至少约105至约109M-1、至少约107至约109M-1、大于约109M-1。
可以使用任何合适的方法(其中各种方法是本领域中已知的)将特异性结合成员附接至结合表面(例如，微粒)。例如，特异性结合成员可以经由键附接至结合表面，所述键可以包含促进结合成员与微粒的附接的微粒和/或结合成员的任何部分、官能化或修饰。结合成员和结合表面之间的键可以包括一个或多个化学或物理键和/或提供这种键的化学间隔基(例如，经由范德华力的非特异性附接、氢键键合、静电相互作用、疏水性/亲水性相互作用；等)。可以使用任何多种技术将多肽附接至各种各样的固体支持物，诸如描述于美国专利5,620,850和Heller,Acc. Chem. Res.,23: 128 (1990)中的那些。
在结合表面(例如，第一和第二微粒)和样品之间孵育足够时间后，样品中存在的目标分析物理想地经由固定在微粒表面上的特异性结合成员被捕获在结合表面上。
大缀合物
在结合表面(诸如多个微粒)上捕获目标分析物后，本文公开的方法可以包括使多个(例如，2或更多个、50或更多个、100或更多个、1,000或更多个、或5,000或更多个)大缀合物与捕获的分析物反应。在一个实施方案中，所述大缀合物各自包含：(i)包含交联的蛋白或聚合物，或纳米颗粒的核心，所述聚合物包含多糖、树枝状聚合物、聚醚化合物；(ii)多个特异性结合成员(例如，抗体)、其片段或其组合；(iii)多个标签或可检测标记物，和任选地(iv)多个载体蛋白。当所述大缀合物包含多个标签时，本文所述的方法包括使多个荧光剂与所述标签反应，其中每个荧光剂包含能够结合标签和可检测标记物的分子。
在其他实施方案中，所述大缀合物各自包含：(i)包含交联的蛋白或聚合物，或纳米颗粒的核心，所述聚合物包含多糖、树枝状聚合物、聚醚化合物；(ii)(例如，随机)共价附接至所述核心周围的位置的多个载体蛋白；(iii)共价附接至所述载体蛋白的多个特异性结合成员(例如，抗体)、其片段或其组合；和(iv)共价附接至所述多个载体蛋白或所述多个抗体的多个标签。一种或多种荧光剂可以与大缀合物反应，使得荧光剂直接或经由上述标签共价结合大缀合物核心。
应当理解，当一种蛋白或聚合物链诸如通过共价键或离子键与另一蛋白或聚合物链连接时，形成“交联”蛋白或聚合物。交联聚合物可以包含合成聚合物链或天然聚合物链(例如，蛋白或多糖)。多糖可以是由通过糖苷键结合在一起的单糖单元的长链构成的任何合适的聚合碳水化合物分子。合适的多糖包括但不限于纤维素、淀粉、糖原、葡聚糖(glucans)、藻酸盐、凝胶多糖、葡聚糖(dextran)、结冷胶、透明质酸(hyalouran)、果聚糖、黄原胶和普鲁兰多糖。在一个实施方案中，所述多糖是葡聚糖、氨基葡聚糖或其组合。如本文所用的术语“树枝状聚合物”是指纳米级、径向对称的分子，其具有充分定义的、均质的和单分散结构，其由树状臂或分枝组成(Abassi等人,Nanoscale Res Lett.,9(1): 247(2014))。各种不同的树枝状聚合物是本领域中已知的并且展现生物学特性，诸如多价、自组装、静电相互作用、化学稳定性、低细胞毒性和溶解性。可用于所公开方法中的合适树枝状聚合物的实例包括但不限于DNA树枝状聚合物(参见，例如，Fu等人,J Gene Med.,9(12):1334-1342 (2008); 和Fu等人,J Gene Med.,9(3): 181-188 (2007))以及聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物(Esfand等人,Drug Discovery Today,6(8): 427-436 (2001))。如本文所用的术语“聚醚”是指其中重复单元含有尤其源自醛或环氧化物的碳-氧键的一组聚合物中的任一种。在一个实施方案中，所述聚醚可以是聚乙二醇(PEG)。如本文所用的术语“纳米颗粒”是指大小在1至100纳米(nm)之间的无机颗粒，其在其传输和特性方面作为整体单元发挥功能。无论使用何种聚合物或蛋白，应理解交联聚合物或蛋白作为支架发挥功能，本文所述的复合物的其他元件附接至所述支架上。
所述大缀合物可以进一步包含多个(例如，2或更多个、50或更多个、100或更多个、1,000或更多个、或5,000或更多个)(例如，随机地)共价附接至核心周围位置的载体蛋白。如本文所用的术语“载体蛋白”是指改进大缀合物的溶解性、稳定性、反应性和/或特异性的蛋白。可以共价附接至核心的任何合适的蛋白都可以用作载体蛋白。在一个实施方案中，所述载体蛋白是血清白蛋白。血清白蛋白是由肝脏产生的球状蛋白，并且是哺乳动物中最丰富的血液蛋白。所述血清白蛋白可以是人血清白蛋白或牛血清白蛋白。在其他实施方案中，所述载体蛋白可以是抗原或抗体。载体蛋白在核心周围的附接可能是“随机的”，因为它在没有特异性或模式的情况下发生。多种载体蛋白与核心的共价附接可以通过本领域中已知的任何合适的方法实现，所述方法诸如描述于例如Mattson et al.,Molecular Biology Reports,17: 167-183 (1993); 和Hermanson, G.T. (编),Bioconjugate Techniques,第3版, Academic Press (2013))中的那些。
所述大缀合物还可以包含与载体蛋白共价附接的多个(例如，2或更多个、50或更多个、100或更多个、1,000或更多个、或5,000或更多个)特异性结合成员(例如，抗体、其片段或其组合)。所述多个特异性结合成员或其片段(例如，抗体或抗体片段)特异性结合分析物，其导致大缀合物与捕获的分析物的缀合以及免疫夹心(在本文中也称为“免疫夹心复合物”)的形成。特异性结合成员和/或其片段可以是完整抗体或任何合适的抗体片段，诸如上文所述和本领域中已知的那些。在一个实施方案中，标记的免疫夹心复合物包含抗体片段，诸如抗原结合片段(Fab)。
所述大缀合物可以进一步包含与大缀合物核心、多个载体蛋白和/或多个特异性结合成员共价附接的多个(例如，2或更多个、50或更多个、100或更多个、1,000或更多个、或5,000或更多个)标签。如本文所用的术语“标签”是指可以将荧光剂结合(即，附接)至大缀合物的分子或化合物。所述标签可以是聚合物(例如，阴离子或阳离子聚合物)、不干扰测定的蛋白(例如，球状蛋白)、多核苷酸(例如，DNA或RNA)或纳米颗粒。在一些实施方案中，所述标签可以是亲和标签。如本文所用的术语“亲和标签”是一种类型的表位标签，所述表位标签与蛋白的N-或C-末端重组融合，其通常促进蛋白的亲和纯化。亲和标签的尺寸通常是小的且为惰性，以限制与可能存在于培养基中的蛋白或其他蛋白的任何潜在相互作用。亲和标签的实例包括但不限于生物素、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、聚(His)标签、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和FLAG标签。在一个实施方案中，所述标签包含生物素。在另一个实施方案中，所述标签包含结合荧光剂的分子或化合物。例如，所述标签可以包含特异性结合荧光团或适体的抗体(例如，抗荧光素抗体)。如本文所用的术语“适体”是指可以以高亲和力和特异性结合预选择的靶标(包括小分子、蛋白和肽等)的寡核苷酸或肽分子。结合荧光团和/或适体的抗体是本领域中已知的并且可以从多种来源商业获得(例如，ThermoFisherScientific和Bio-Rad Laboratories, Inc.)。多个标签可以使用本文描述和本领域中已知的交联方法或通过使用可切割的接头分子(诸如例如国际专利申请公开WO2017/004463A1中描述的那些)共价附接至大缀合物、多个载体蛋白和/或多个抗体。
示例性大缀合物示意性描绘于图1中。免疫夹心形成可以在足以使分析物和抗体或抗体片段之间发生结合相互作用的条件下进行。在分析物与抗体或抗体片段反应(例如，经由大缀合物)后，可以去除未与分析物结合的任何抗体、抗体片段或大缀合物的组分，随后是任选的洗涤步骤。任何未结合的抗体、抗体片段或大缀合物的组分可以通过任何合适的方式从免疫夹心分离，所述方法诸如例如，微滴驱动、电泳、电润湿、介电泳、静电驱动、电场介导、电极介导、毛细管力、色谱、离心、抽吸或基于表面声波(SAW)的洗涤方法。
当所述方法包括在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物时，在第一和第二目标分析物分别被捕获在第一和第二微粒的表面上之后，所述方法包括使捕获的第一目标分析物与第一缀合物反应并使第二目标分析物与第二缀合物反应，其中第一缀合物包含用第二荧光团标记并结合第一分析物的特异性结合成员，并且第二缀合物包含用第三荧光团标记并结合第二分析物的特异性结合成员。如本文所用的术语“缀合物”是指包含特异性结合对成员和可检测标记物的复合物。所述特异性结合对成员可以是如本文所讨论的抗体或抗体片段。因此，缀合物的结合对成员特异性结合分析物，这导致缀合物与捕获的分析物的连接以及免疫夹心的形成。
荧光剂
在一些实施方案中，所述大缀合物包含共价附接至大缀合物核心或多个特异性结合成员的多个荧光剂。在其他实施方案中，本文所述的方法包括使多个荧光剂与大缀合物反应。每个荧光剂包含(1)能够结合大缀合物核心或标签的分子和(2)可检测标记物。在一些实施方案中，多个荧光剂可以同时结合单个大缀合物，允许直接检测微粒上的单个免疫夹心。荧光剂中使用的分子的选择将取决于大缀合物中使用的标签。在某些实施方案中，所述分子是蛋白。在其中标签是生物素的实施方案中，链霉抗生物素蛋白可以是荧光剂中能够结合大缀合物核心或标签的蛋白。在其中标签是抗体的实施方案中，则荧光剂中的分子可以是荧光团、适体或特异性结合抗体的抗原。
在一些实施方案中，如上所述的第一微粒包含第一荧光团，而第一和第二缀合物的特异性结合成员分别用第二和第三荧光团标记。在该实施方案中，所述第一、第二和第三荧光团是不同的。在第一和第二捕获的分析物与第一和第二缀合物反应后，可以去除未与捕获的分析物结合的任何特异性结合成员(例如，抗体或抗体片段)，或缀合物组分，随后是任选的洗涤步骤。任何未结合的抗体、抗体片段或缀合物的组分可以通过任何合适的方式与免疫夹心分离，所述方式诸如例如，微滴驱动、电泳、电润湿、介电电泳、静电驱动、电场介导、电极介导、毛细管力、色谱法、离心、抽吸或基于表面声波(SAW)的洗涤方法。
本领域中已知的任何合适的荧光化合物都可用作可检测标记物。合适的荧光化合物的实例包括但不限于5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻胆蛋白、藻红蛋白、R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白)、量子点(例如，硫化锌加帽的硒化镉)、测温标记物或免疫聚合酶链式反应标记物。具体而言，藻红蛋白(PE)和别藻蓝蛋白(APC)是可以包含在荧光剂中的高荧光化合物的实例。R-藻红蛋白或PE在本领域中用作基于荧光的指示剂，用于在各种应用中标记抗体或其他分子。R-藻红蛋白在约566 nm处强烈吸收(其中次要峰在496和545 nm处)，并且在575nm处强烈发射。R-藻红蛋白是曾经鉴定的最亮的荧光染料。与PE类似，APC是一种高荧光蛋白，但在680 nm处发射。在一个实施方案中，所述标签包含生物素，并且多种荧光剂包含链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白缀合物(SAPE)或链霉抗生物素蛋白-别藻蓝蛋白(SAAPC)缀合物。SAPE包含与R-藻红蛋白共价附接的生物素-结合蛋白链霉抗生物素蛋白，而SAAPC包含与别藻蓝蛋白共价附接的链霉抗生物素蛋白。SAPE和SAAPC两者均可从各种来源商业得到，诸如例如ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)和ProZyme(Hayward, CA)。
可检测标记物、标记程序和标记物的检测描述于Polak和Van Noorden,Introduction to Immunocytochemistry, 第2版, Springer Verlag, N.Y. (1997)以及Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(1996),Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon中。
应理解，上述分析物捕获和免疫夹心形成方法的不同构造在本公开的范围内。实际上，上述大缀合物和荧光剂的各种组分可以以任何合适的组合、构造或形式排列或利用。
可以使用本领域中已知的任何合适方法来确定(例如，定量)样品中存在的目标分析物的存在或量。此类方法包括但不限于免疫测定。可以利用任何合适的免疫测定，诸如例如夹心免疫测定(例如，单克隆-多克隆夹心免疫测定、竞争性抑制免疫测定(例如，正向和反向)、竞争性结合测定、异质测定和飞行中捕获(capture on the fly)测定)。在一些实施方案中，一个标签附接至捕获抗体和检测抗体。可用于所公开方法中的免疫测定组分和技术进一步描述于例如国际专利申请公开号WO2016/161402和WO 2016 /161400中。
公开的方法可以包括质量控制组分。在本文所述的免疫测定和试剂盒的上下文中的“质量控制组分”包括但不限于校准物、对照和灵敏度组。可以使用“校准物”或“标准品”(例如，一种或多种，例如多种)以建立用于内插分析物(诸如抗体)的浓度的校准(标准)曲线。或者，可以使用接近参考水平或控制水平(例如，“低”、“中”或“高”水平)的单一校准物。可以结合使用多种校准物(即，多于一种校准物或各种量的校准物)来构成“灵敏度组”。所述校准物是任选的，并且优选是一系列校准物的一部分，其中每种校准物与该系列中的其他校准物的不同在于，诸如例如浓度或检测方法(例如，比色或荧光检测)。
多重化
公开的方法可以包括两个或更多个(例如，2、3、4、5个或更多个)微粒和特异性结合成员以检测样品中的两个或更多个(例如，2、3、4、5个或更多个)靶标分析物，在本文中称为“多重免疫测定”或“多重测定”。每个特异性结合成员结合不同分析物，并且每个特异性结合成员和/或微粒可以包含不同的可检测标记物。事实上，在一个实施方案中，本公开提供了一种方法，其包括：(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒(i)包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员，且(ii)用第一荧光团标记；(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，且(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员。在另一个实施方案中，所述方法包括：(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员；(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员，且(iii)所述第一微粒和所述第二微粒的尺寸和/或形状不同。
成像和分析
传统上已经使用荧光、化学发光或响应于分析物生成信号的其他方式进行免疫测定。许多免疫测定通过测量反应混合物的总体积中生成的光信号的强度来进行。生成的光信号可以通过光学装置测量，其中生成的光信号由大量分子发射。通常，如本文所述，免疫测定可以涉及将怀疑含有抗原的样品与包含与固体支持物例如平面表面(例如，平板或生物芯片)、珠粒或微粒结合的第一抗体的试剂组合, 以形成反应混合物。抗原(如果存在于样品中)特异性结合第一抗体。将包含具有与之附接的标记物的第二抗体的缀合物引入反应混合物并特异性结合抗原，所述抗原特异性结合第一抗体，如前所述，所述第一抗体与固相支持物结合。然后，在从反应混合物去除未结合的缀合物(通常通过进行洗涤步骤)后，测量可归因于标记物的信号。测量源自反应混合物的总体积的信号，且然后与校准曲线进行比较以建立样品中存在的抗原浓度。
可以使用发光二极管(LED)和/或激光器和检测器来测量光强度，其可以提供样品特性(诸如颜色、体积和样品层分离)的定性评价。二维检测系统，诸如例如电荷耦合装置(CCD)相机，也用于检测样品的荧光或化学发光。市售系统具有光学成像系统，或图像增强器和CCD相机的组合，所述光学成像系统通过使用透镜光学器件将提供有化学发光标志物或荧光标志物的结合表面投射到CCD传感器上。对于固定在平面表面(例如，生物芯片)上的物质的空间分辨的荧光光学检测，可以使用“扫描仪”，其使用聚焦激光束扫描芯片的表面，允许检测发射的荧光。示例性荧光扫描仪描述于例如美国专利号5,837,475和5,945,679。其中将共聚焦激发和检测系统集成到落射荧光显微镜中的扫描仪也是已知的。扫描仪中用于检测发射荧光的系统通常是“单通道系统”，即，例如，单独的光电池或二次电子倍增器(光电倍增器)。
在本文所述的方法中，与包含来自样品的分析物的单独免疫夹心复合物相关的空间信息和/或信息相比于常规方法提高测定的灵敏度。通过并入常规配体-受体结合测定中不包含的空间信息，例如可以从生成的信号消除试剂的聚集和非特异性结合，并且可以对样品中的分析物进行定性并同时或随后定量。例如，关于定性，可以在使用强度信息之前检查和去除与固相、诸如例如微粒相关的不期望的背景信号。
在这方面，本文所述的方法进一步包括如上所述对其上已经形成免疫夹心的结合表面(例如，一个或多个微粒)成像，并分析所得图像。在一些实施方案中，含有免疫夹心的表面在任何固体支持物(例如，任何平面(平坦)表面，诸如例如检测载片上的微流体通道)上成像。适用于本文所述的方法中的成像系统可以是能够获取图像的任何系统，使得可以分辨单独结合表面(例如，微粒)和/或与单独免疫夹心复合物相关的信息。适用于本文所述的方法的成像装置包括但不限于光学显微镜、扫描显微镜、荧光成像扫描仪等。
在使用本发明的原理的一个实施方案中，捕获一个或多个结合表面的一个或多个荧光图像并计算荧光图像的强度。
在另一个实施方案中，对结合表面(诸如微粒的表面)成像涉及获取微粒的透射光图像和对应于荧光剂的一个或多个荧光图像。透射光图像可用于定位含有结合表面(例如微粒表面)的所有图像区域。然后获取荧光图像以确定直接结合至结合表面的荧光剂的位置和/或强度。荧光图像使用颜色(例如，红色、绿色、蓝色)，在一些实施方案中，其对应于第一、第二和第三荧光团。然后可以使用任何合适的方法分析所得的透射光和荧光图像，在一些实施方案中，所述方法包括图像掩模的生成(参见图2)。
所述掩模通常定义当进行分析时的目标区域和待忽略的区域。在图2中显示的一个实施方案中，含有结合表面的所有图像区域被定义为待分析的目标区域(即，浅色部分(参见图2中的虚线白色箭头))并且忽略其余区域(即，深色部分)(参见图2中的白色实心箭头))。对于目标区域，计算目标区域面积。然后将掩模应用于一个或多个荧光图像以确定来自目标区域的总荧光强度。在一个实施方案中，总荧光强度可以被测量为强度的总“计数”，并且可以以像素为单位测量目标区域。因此，可以以模拟模式计算每像素计数(“CPP”)。在一些实施方案中，可以以数字模式和/或模拟模式分析一个或多个获取的荧光图像。如果以模拟模式计算的信号值，诸如CPP，低于预定值，则图像分析可以从模拟模式切换至数字模式。也可以使用本领域中已知的用于确定模拟和/或数字模式的其他方法。如上所述，数字模式涉及使用目标区域并计算结合表面上高强度峰的总数。然后可以确定高强度峰的总数与目标区域的面积之比并将其表示为“每个面积的峰”或“PPA”。在结合表面鉴定的每个高强度峰对应于单个免疫夹心复合物。高强度峰可以是强度高于预定阈值的单个像素或像素簇。选择的预定阈值(在本文中也称为“预设值”)将尤其取决于目标分析物和所使用的可检测标记物。该分析在图2中示意性举例说并且也描述于实施例2中(其中使用的预设值为1000；然而，在替代实施方案中，预设值可以小于1000或大于1000)。在一些实施方案中，如果目标区域中的平均像素强度小于预定值，则分析图像包括：(i)对目标区域中的高荧光强度峰进行计数；(ii)测定一个或多个荧光图像中的峰与目标区域面积的比率；和(iii)使用转换因子计算复合信号以组合对于不同分析物浓度获得的数据点。
在多重化方法中，可以使用涉及图像减法的定制的图像分析过程来分析图像。图像分析过程是“定制的”，因为它可以根据公开的方法中采用的特定分析物、样品和测定条件来构建或修改。在一个实施方案中，定制的图像分析过程包括使用如上所述获取的透射光和荧光图像生成一系列图像“掩模”。例如，所述图像通过如下分析：(i)基于透射光图像生成总图像掩模；(ii)基于对应于第一荧光团的荧光图像生成第一图像掩模；和(iii)从总图像掩模减去所述第一图像掩模以生成第二图像掩模。例如，当获取一个透射光图像和对应于第一、第二和第三荧光团的三个荧光图像(总共四个图像)时，总的图像掩模基于对比度并包括在单一测定中利用的所有微粒。具有第一荧光团的颜色的荧光图像可用于生成第一图像掩模(“掩模1”)并且仅包括第一微粒，具有或不具有第一捕获的分析物。然后可以通过从总图像掩模减去第一图像掩模来生成第二图像掩模(“掩模2”)并且仅包括包含第二捕获的分析物的第二微粒。在生成所述图像掩膜后，所述方法进一步包括：使用所述第一图像掩模计算从所述第二荧光团发射的信号，由此检测所述第一分析物，和使用所述第二图像掩模计算从所述第三荧光团发射的信号，由此检测所述第二分析物。在多重免疫测定中生成和分析图像掩模以检测第一和第二目标分析物在图9和图10中示意性举例说明。应理解，根据通过特定多重免疫测定评价的靶标分析物的总数，可以如上所述生成和分析额外的图像掩模。在其中样品(例如阴性样品)中不存在目标分析物的实施方案中，唯一可检测的信号将是用第一荧光团标记的第一微粒的信号，但在一些实施方案中可能发生非特异性结合，导致可检测到，尽管微弱的信号。
可以测量分析的结合表面的每个像素的强度的平均值，以便将强度与建立分析物浓度作为强度函数的校准曲线进行比较。合格微粒的每像素强度的平均值可以使用例如能够测量光强度的CCD相机或互补金属氧化物半导体(CMOS)相机来确定。强度的测量值可以被转换成以计数为单位指定的参数。每个像素都具有对应于在该像素处测量的光强度的数字。从荧光剂的标记物测量的信号量决定分析物的浓度。
在其他实施方案中，本文所述的方法可以与用于在单分子水平上分析(例如，检测和/或定量)分析物的方法学结合使用。用于分析单分子和单分子相互作用的任何合适的技术可以在本公开的上下文中使用，其中多种是本领域已知的。此类单分子(SM)检测技术包括但不限于单分子荧光共振能量转移(FRET)(参见，例如，Keller 等人,J. Am. Chem. Soc.,136: 4534-4543 (2014); 和Kobitski 等人,Nucleic Acids Res.,35: 2047-2059,(2007))，实时单分子共免疫沉淀法(参见，例如，Lee 等人,Nat. Protoc.,8: 2045-2060(2013))，单分子电子转移(参见，例如，Yang 等人,Science,302: 262-266 (2003); 和Min等人,Phys. Rev. Lett.,94: 198302 (2005))；单分子力光谱方法(参见，例如，Capitanio, M.&Pavone, F.S.,Biophys. J.,105: 1293-1303 (2013);和Lang 等人,Biophys. J., 83: 491-501 (2009))，细胞提取物下拉测定(参见，例如，Jain 等人,Nature,473: 484-488, (2011); 和Jain 等人,Nat. Protoc., 7: 445-452 (2012))，使用分子马达(参见，例如，Yildiz 等人,Science,300(5628): 2061-2065 (2003))；和活细胞中的单分子成像(参见，例如，Sako 等人,Nat. Cell. Biol.,2(3): 168-172 (2000))，纳米孔(nanopore)技术(参见，例如，国际专利申请公开WO 2016/161402)，纳米孔(nanowell)技术(例如，参见，参见，例如，国际专利申请公开WO 2016/161400)和单分子全内反射荧光(TIRF)显微镜(参见，例如，Reck-Peterson 等人,Cold Spring Harb. Protoc., 2010(3):pdb.top73. doi: 10.1101/pdb.top73 (March 2010); 和Kukalkar等人,Cold Spring Harb. Protoc., 2016(5):pdb.top077800. doi: 10.1101/pdb.top077800 (May 2016))。
方法的变型
公开的确定样品中存在的两种或更多种目标分析物的存在或量的方法可以如本文所述。考虑到用于分析分析物的其他方法，还可以调整所述方法。众所周知的变型的实例包括但不限于免疫测定，诸如夹心免疫测定(例如，单克隆-单克隆夹心免疫测定，单克隆-多克隆夹心免疫测定，包括酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争性抑制免疫测定(例如，正向和反向)、酶倍增免疫测定技术(EMIT)、竞争性结合测定、生物发光共振能量转移(BRET)、一步抗体检测测定、均质测定、异质测定、飞行中捕获测定、单分子检测测定等。此类方法公开于例如美国专利号6,143,576; 6,113,855; 6,019,944; 5,985,579; 5,947,124; 5,939,272; 5,922,615; 5,885,527;5,851,776; 5,824,799; 5,679,526; 5,525,524; 和5,480,792; 国际专利申请公开WO 2016/161402和WO 2016/161400; 以及Adamczyk等人,Anal. Chim. Acta,579(1): 61-67 (2006)。
用于分析物分析的装置
本文所述的方法可以使用适合于分析物分析的任何装置进行，所述装置中的各种是本领域已知的，并且包括例如蠕动泵系统(例如，FISHERBRAND™可变流蠕动泵,ThermoFisher Scientific, Waltham, MA；和可得自MilliporeSigma,Burlington, MA的蠕动泵系统)，自动/机器人样品递送系统(可购自例如Hamilton Robotics, Reno, NV ；和ThermoFisherScientific, Waltham, MA)，微流体装置，基于微滴的微流体装置，数字微流体装置(DMF)，基于表面声波的微流体(SAW)装置或电介质上的电润湿(EWOD)数字微流体装置(参见，例如，Peng 等人,Lab Chip,14(6): 1117-1122 (2014)；和Huang 等人,PLoS ONE,10(5): e0124196 (2015))和其他自动化系统、诸如Kingfisher™仪器(ThermoFisherScientific, Waltham, MA)、ARCHITECT™分析仪(Abbott, Abbott Park, IL)和本领域中已知的其他自动化仪器。
在一个实施方案中，本文所述的方法可以使用微流体装置、诸如数字微流体(DMF)装置进行。本领域已知的任何合适的微流体装置可以用于进行本文所述的方法。可用于本方法中的示例性微流体装置包括例如国际专利申请公开号WO 2007/136386、WO 2009/111431、WO 2010/040227、WO2011/137533、WO 2013/066441、WO 2014/062551和WO 2014/066704以及美国专利8,287,808中描述的那些。在某些情况下，所述装置可以是芯片上实验室装置(lab-on-chipdevice)，其中分析物分析可以在含有或怀疑含有分析物的样品的微滴中实施。
在一个实施方案中，在数字微流体装置中实施本文所述的方法的至少两个步骤(例如，2个、3个或所有步骤)。术语“数字微流体(DMF)”、“数字微流体模块(DMF模块)”或“数字微流体装置(DMF装置)”在本文中可互换使用，并且是指利用数字的或基于微滴的微流体技术来提供分散的且小体积的微滴形式的液体的操纵的模块或装置。数字微流体利用乳液科学原理在通道中产生流体-流体分散体(主要是油包水乳液)，并允许产生具有非常低多分散性的单分散液滴/气泡。数字微流体基于可重构网络内不连续液滴的显微操作。通过组合微滴形成、易位、分拆和合并的基本操作，可以将复杂指令程序化。
数字微流体操作离散体积的流体，其可以由二元电信号操纵。通过使用离散的单位体积微滴，可以将微流体操作定义为一组重复的基本操作，即，使一个单位的流体移动一个单位的距离。可以使用液体的表面张力性质形成微滴。微滴的驱动是基于由电极产生的静电力的存在，所述电极放在所述微滴所位于的底表面下方。可以使用不同类型的静电力来控制微滴的形状和运动。可以用于建立前述静电力的一种技术是基于介电电泳，其依赖于微滴和周围介质之间的电容率差异，且可以利用高频率AC电场。可以用于建立前述静电力的另一种技术是基于电润湿，其依靠存在于表面上的液体微滴和所述表面之间的表面张力对施加于所述表面的电场的依赖性。
在另一个实施方案中，本文所述的方法可以结合基于表面声波(SAW)的微流体装置来实施，作为前端测定处理方法。如本文所用的术语“表面声波(SAW)”通常是指在沿着表面的方向传播声波。“移动表面声波”(TSAW)能够实现表面声波向液体中的耦合。在一些实施方案中，所述耦合可以呈表面声波向液体中的穿透或泄漏的形式。在其他实施方案中，所述表面声波是Rayleigh波(参见，例如，Oliner, A.A.(编), Acoustic Surface Waves.Springer (1978))。表面声波的传播可以以多种不同的方式和通过使用不同的材料，包括由换能器(诸如系列或多个电极)产生电势，或通过使表面声波流过液体来进行。
在一些实施方案中，通过基于卷对卷的印刷电子方法来制造DMF装置或SAW装置。此类装置的实例描述于国际专利申请公开号2016/161402和WO 2016/161400中。
上述装置中的许多允许检测目标分析物的单一分子。本领域已知的允许一种或多种目标分析物的单一分子检测的其他装置和系统也可以用于本文所述的方法中。此类装置和系统包括，例如，Quanterix SIMOA™ (Lexington, MA)技术，Singulex的单分子计数(SMC™)技术(Alameda, CA，参见，例如，美国专利号9,239,284)，以及在例如美国专利申请公开号2017/0153248和2018/0017552中描述的装置。
试剂盒和筒
本文中还提供了用于进行上述方法的试剂盒。所述试剂盒可以与公开的装置一起使用。在试剂盒中包括的说明书可以附连到包装材料，或可以作为包装插页来包含。所述说明书可以是书写的或印刷的材料，但不限于此。本公开考虑能够存储此类说明书并将它们传递给最终使用者的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁碟、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文所用，术语“说明书”可以包括提供所述说明书的因特网站点的地址。
所述试剂盒可以包括筒，所述筒包括微流体模块。在一些实施方案中，微流体模块可以集成在筒中。所述筒可以是一次用弃的。所述筒可以包括一种或多种可用于实施上面公开的方法的试剂。所述筒可以包括一个或多个容器，所述容器容纳所述试剂，其作为一种或多种单独的组合物，或者任选地，在试剂的相容性将允许的情况下，作为混合物。所述筒还可以包括从用户观点看可能希望的其他材料，诸如缓冲液、稀释剂、标准品(例如，校准物和对照)和/或可用于样品处理、洗涤或进行测定的任意其他步骤的任意其他材料。所述筒可以包括一种或多种如上所述的特异性结合成员。
所述试剂盒还可以包含用于定量目标分析物的参考标准品。所述参考标准品可以用于建立标准曲线以内插和/或外推目标分析物浓度。所述试剂盒可以包括在浓度水平方面变化的参考标准品。例如，所述试剂盒可以包括具有高浓度水平、中浓度水平或低浓度水平的一种或多种参考标准品。关于参考标准品的浓度范围，这可以根据测定进行优化。参考标准品的示例性浓度范围包括但不限于，例如：约10 fog/mL、约20 fg/mL、约50fg/mL、约75fg/mL、约100 fg/mL、约150 fg/mL、约200fg/mL、约250 fg/mL、约500 fg/mL、约750 fg/mL、约1000fg/mL、约10 pg/mL、约20 pg/mL、约50 pg/mL、约75pg/mL、约100 pg/mL、约150 pg/mL、约200 pg/mL、约250pg/mL、约500 pg/mL、约750 pg/mL、约1 ng/mL、约5ng/mL、约10 ng/mL、约12.5 ng/mL、约15 ng/mL、约20ng/mL、约25 ng/mL、约40 ng/mL、约45 ng/mL、约50ng/mL、约55 ng/mL、约60 ng/mL、约75 ng/mL、约80ng/mL、约85 ng/mL、约90 ng/mL、约95 ng/mL、约100ng/mL、约125 ng/mL、约150 ng/mL、约165 ng/mL、约175ng/mL、约200 ng/mL、约225 ng/mL、约250 ng/mL、约275ng/mL、约300 ng/mL、约400 ng/mL、约425 ng/mL、约450ng/mL、约465 ng/mL、约475 ng/mL、约500 ng/mL、约525ng/mL、约550 ng/mL、约575 ng/mL、约600 ng/mL、约700ng/mL、约725 ng/mL、约750 ng/mL、约765 ng/mL、约775ng/mL、约800 ng/mL、约825 ng/mL、约850 ng/mL、约875ng/mL、约900 ng/mL、约925 ng/mL、约950 ng/mL、约975ng/mL、约1000 ng/mL、约2µg/mL、约3µg/mL、约4µg/mL、约5µg/mL、约6µg/mL、约7µg/mL、约8µg/mL、约9µg/mL、约10µg/mL、约20µg/mL、约30µg/mL、约40µg/mL、约50µg/mL、约60µg/mL、约70µg/mL、约80µg/mL、约90µg/mL、约100µg/mL、约200µg/mL、约300µg/mL、约400µg/mL、约500µg/mL、约600µg/mL、约700µg/mL、约800µg/mL、约900µg/mL、约1000µg/mL、约2000µg/mL、约3000µg/mL、约4000µg/mL、约5000µg/mL、约6000µg/mL、约7000µg/mL、约8000µg/mL、约9000µg/mL或约10000µg/mL。
所述试剂盒可以包括用于标记特异性结合成员的试剂、用于检测特异性结合成员和/或用于标记分析物的试剂和/或用于检测分析物的试剂。所述试剂盒还可以包括引起标签的切割的组分，诸如介导切割的试剂。例如，介导切割的试剂可以包括还原剂，诸如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧基乙基)膦(TCEP)。特异性结合成员、校准物和/或对照可以提供在单独容器中或预分配在适当的测定形式或筒中。
所述试剂盒还可以包括质量控制组分(例如，灵敏度组、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备是本领域众所周知的，且描述在多种免疫诊断产品的插页上。灵敏度组成员任选地用于确立测定性能特征，并且是试剂盒试剂的完整性和测定的标准化的有用指示剂。
所述试剂盒还可以任选地包括进行诊断测定或促进质量控制评估所需的其他试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等。所述试剂盒中还可以包括其他组分，诸如用于分离和/或处理测试样品的缓冲液和溶液(例如预处理试剂)。所述试剂盒可以额外包括一种或多种其他对照。可以冻干所述试剂盒的一种或多种组分，在所述情况下，所述试剂盒可以进一步包含适于重构冻干组分的试剂。所述组分中的一种或多种可以呈液体形式。
所述试剂盒的各种组分任选地根据需要提供在合适的容器中。所述试剂盒还可以包括用于容纳或储存样品的容器(例如，用于尿、唾液、血浆、脑脊液或血清样品的容器或筒，或用于储存、运输或处理组织，从而建立组织抽吸物的适当容器)。在适当的情况下，试剂盒任选地可以含有反应容器、混合容器和促进试剂或试验样品的制备的其他组分。所述试剂盒还可以包括一个或多个用于辅助获得试验样品的样品收集/获取器械，诸如各种血液收集/转移装置(例如微取样装置、微针或其他最小侵袭性的无痛血液收集方法；血液收集试管；柳叶刀；毛细管血液收集试管；其他刺破单个指尖的血液收集方法；口腔拭子，鼻/喉拭子；16-号或其他尺寸的针，用于冲孔活组织检查的环形刀片(例如，1-8 mm或其他适当的尺寸)，外科手术刀或激光(例如，特别是手持式)，注射器，无菌容器，或插管，其用于获取、储存或抽吸组织样品；等)。所述试剂盒可以包括一个或多个用于辅助关节抽吸、锥形活组织检查、冲孔活组织检查、细针抽吸活组织检查、图像引导的经皮针吸活组织检查、支气管肺泡灌洗、内窥镜活组织检查和腹腔镜活组织检查的器械。
以下实施例进一步举例说明了本发明，但是，当然，不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例1
本实施例展示了如本文所公开的分析生物样品中的目标分析物的方法。
已经显示，可以使用全内反射荧光(TIRF)显微镜在低背景表面(例如，特殊处理的玻璃或一些聚合物)上检测单个常规荧光团(例如荧光素、罗丹明等) (Skinner, J.P.和S.Y. Tetin,Microsc Res Tech.,78(4): 309-16 (2015))。然而，由于灵敏度问题和微粒的荧光背景，难以用常规的荧光显微镜检测微粒上的单个常规荧光团。因此，检测由具有荧光缀合物的微粒捕获的单个分析物分子需要明亮的信号生成分子(例如，亮度是背景荧光的至少5倍)。作为纳米球的替代品，测试链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(SAPE)。藻红蛋白(PE)已知为最亮的荧光蛋白，(例如，单个PE具有20个Cy3染料分子的亮度)。然而，尽管PE的亮度与微粒的背景荧光处于同一数量级，但难以检测到捕获的单个分析物分子。因此，SAPE簇(ProZyme, CA(PJRS34))用于微粒上的单个分析物分子检测。每个SAPE簇含有多个链霉抗生物素蛋白和PE分子。葡聚糖-SAPE簇是内部生成的。当在简单系统中测试时，生物素包被的微粒与SAPE簇反应，并在微粒上检测单个SAPE簇，并在数字模式下进行分析，其中LOD低至150 aM，如表1中所示(BiophysicalJournal, Vol. 112, Issue 3, p295a (2017))。
表1
SAPE光泽浓度(fM) 每个面积的峰(PPA)
12 0.26
4 0.08
1.33 0.02
0.44 0.0081
0.15 0.004
0.05 0.0008
0 0
然而，当在其他测定系统中测试时，SAPE簇的非特异性结合(NSB)压倒来自结合分析物的特异性信号。表2显示在不存在分析物和/或检测抗体的情况下，各种SAPE簇浓度下微粒上的平均像素强度。平均像素强度表示为每像素计数(CPP)。
表2
与SAPE簇 (PJRS34)反应的微粒 平均像素强度(CPP)
380 pM SAPE簇 35294
190 pM SAPE簇 33529
95 pM SAPE簇 26719
仅缓冲液 0
或者，当使用非簇状SAPE(1:1交联，PJR39S，Prozyme Inc)时，NSB低，如表3中所示。
表3
与单体SAPE (PJR39S)反应的微粒 CPP
800 pM SAPE <50
仅缓冲液 0
总之，单个SAPE簇(PJRS34)可以在微粒上检测到，但引起高度非特异性结合，且因此不能用于免疫测定中。相比之下，非簇状SAPE (PJR39S)不引起NSB，但其亮度与微粒背景相似。
本文描述的方法提供了用于直接检测微粒上的单个分析物分子的解决方案。具体地，由与多个BSA分子、多个Fab和多个生物素分子交联的葡聚糖构成的大缀合物导致低NSB，且因此可用于单分子分析物成像。平均而言，每个大缀合物含有一个葡聚糖(150kDa)、15个BSA分子、15个Fab和50-100个生物素分子(示意性描绘于图1中)，其可以与多个非簇状SAPE分子复合。这些大缀合物表现出低NSB和高结合效率，并允许超灵敏的单分子分析物检测，如下文进一步举例说明。
实施例2
本实施例描述了根据本文所述的方法检测HCV抗原的免疫测定。
来自市售试剂盒(分别为HCV核心Ag试剂盒，Ref 6L47-29和HCV校准物组，Ref6L47-02，Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)的微粒和HCV校准物用阴性人血浆(NHP)稀释。制备如图1中所示的葡聚糖BSA-生物素-Fab簇。链霉抗生物素蛋白藻红蛋白(SAPE, PJR39S)购自Prozyme (Hayward, CA)。
该测定以三个步骤进行：
步骤1：首先将100 μL范围为0-20000 fM的HCV校准物与微粒混合。微粒在37℃下孵育，且然后洗涤。
步骤2：将100 μL葡聚糖BSA-生物素-Fab簇添加至微粒。将微粒孵育且然后洗涤。
步骤3：添加100 μL SA-PE。将微粒孵育，洗涤，且然后在显微镜上成像。
成像和分析：对于每个样品，在倒置的Olympus IX83荧光显微镜上用EM-CCD相机拍摄4-9组图像。每组图像由透射光图像和对应于荧光团颜色的荧光图像组成。图像分析示意性描绘于图2中。使用预设值在数字模式和模拟模式两者下同时分析来自每个样品的图像(参见表4)。在本实施例中，预设(或“预定”)值为1000(取决于仪器/相机)。因此，对于小于40 fM(即，信号<1000)的校准物，应当使用“PPA”值，因此在数字模式下进行测量；对于大于40fM的校准物，应当使用“平均像素强度”值，因此在模拟模式下进行测量。尽管本实施例中的预设值为1000，但本领域技术人员会认识到，预设值可以低于或高于1000，这取决于仪器/相机和反应条件。
表4
图3A显示在0、1fM、10fM和80fM的HCV处的测定图像的实例，以及荧光图像的强度概况。在低分析物浓度(例如<40fM)下，每个微粒上最可能形成零或一个免疫夹心复合物，并且可以使用固定强度阈值直接计数单个荧光强度峰值。结果显示，在低分析物浓度(<40fM)下，CPP在阴性对照的3个标准偏差(SD)内。相比之下，在数字模式下，1fM容易与阴性对照区分开。该测定的校准曲线(数字和模拟模式)显示于图3B中。
还使用替代缀合物葡聚糖-BSA-PE-Fab(其允许步骤2和步骤3的组合)进行上述测定，其结果显示于表5中。
表5
HCV Ag 模拟模式 数字模式
0 646 0.0040
80fM 691 0.05
600fM 945 0.37
实施例3
本实施例描述了根据本文所述的方法检测HIV的免疫测定。
该测定中使用的微粒使用Abbott内部抗体经由EDAC化学法包被，并且校准物由市售试剂盒(HIV试剂盒, 25258L100, 65pg/ml, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)制备并用阴性人血浆(NHP)进一步稀释。制备葡聚糖BSA-生物素-Fab簇。链霉抗生物素蛋白藻红蛋白(SAPE)购自Prozyme (Hayward, CA)。
该测定以两个步骤进行：
步骤1：首先将100 μL范围为0-6.5 pg/ml的HIV样品与微粒、测定特异性稀释剂和葡聚糖BSA-生物素-Fab簇混合，并在37℃下孵育10分钟后，洗涤微粒。
步骤2：添加100 μL SAPE，孵育后洗涤微粒，且然后在具有EM-CCD相机的显微镜上成像。
如实施例2中所述进行成像采集和分析。以数字模式分析图像大大地改进测定S/N比，如表6和图4A-4B中所示。
表6
pg/ml 数字模式 模拟模式
0.00 0.006 852
0.24 0.04 855
0.72 0.1 888
2.17 0.24 934
6.50 0.35 1004
SA-APC (Prozyme, Hayward, CA)用作替代荧光剂。如实施例2中所述进行免疫测定和图像分析。结果显示于表7和图5中。
表7
HIV (pg/ml) 数字模式 模拟模式
0.00 0.01 249
0.24 0.03 248
0.72 0.07 249
2.17 0.18 256
6.50 0.37 273
实施例4
本实施例表明，当完全以模拟模式分析图像时，实施例3中描述的方法也能够检测高浓度的HIV抗原。
测定中使用的微粒使用Abbott内部抗体经由EDAC化学法包被。分析物组(2000pg/ml–4.7pg/ml)由具有高P24值的患者样品制备，并用阴性人血浆(NHP)进行系列稀释。制备葡聚糖BSA-生物素-Fab簇。链霉抗生物素蛋白藻红蛋白(SAPE)购自Prozyme (Hayward,CA)。
该测定以两个步骤进行：
步骤1：首先将100 μL的每个HIV样品与微粒、测定特异性稀释剂和葡聚糖BSA-生物素-Fab簇混合。在37℃下孵育10分钟后，洗涤微粒。
步骤2：添加100 μL SAPE，在5分钟孵育后洗涤微粒，且然后在具有PCO sCMOS相机的显微镜上成像。
如实施例2中所述进行成像采集和分析，除了由于相对高的分析物浓度而使用模拟模式进行分析(参见图6和表8)。
表8
P24 (pg/ml) CPP SD CV
2000 9585 285.0 3%
1500 7199 128.9 2%
1000 5127 185.5 4%
500 2503 103.4 4%
250 1166 72.8 6%
125 577 30.5 4%
75 344 8.94 2%
38 166 8.07 3%
18.8 79 2.09 1%
9.4 30 3.67 2%
4.7 13 0.42 0%
0.0 0 0.92 1%
实施例5
本实施例描述了一种免疫测定方法，其能够在宽浓度范围内检测促甲状腺激素(TSH)，并将来自数字模式和模拟模式的信号组合成单个复合信号。
测定中使用的微粒使用Abbott内部抗体经由EDAC化学法包被，分析物组(100mIU/L-0.0001mIU/L，或715pM-0.0007pM)从具有高TSH值的患者样品制备，并用测定特异性稀释剂系列稀释。制备葡聚糖BSA-生物素-Fab簇。链霉抗生物素蛋白藻红蛋白(SAPE)购自Prozyme (Hayward, CA)。
该测定以三个步骤进行：
步骤1：首先将150 µL每个TSH样品与微粒混合；在37℃孵育10分钟后洗涤微粒。
步骤2：添加80 μL葡聚糖BSA-生物素-Fab大缀合物；孵育5分钟后洗涤微粒。
步骤3：添加80 µL SAPE，孵育5分钟后洗涤微粒，且然后在具有PCOsCMOS相机的显微镜上成像。两种不同的曝光时间(10 ms和100 ms)用于荧光图像以扩展动态范围。
表8显示由成像分析软件产生的初始数据和处理后的最终复合信号。对于每个样品，存在来自初始数据的三个信号值(PPA、CPP 100ms、CPP 10ms)。只有一个信号值将最好地反映每个样品浓度。如图7中所示设置标准。
一旦选择适当的信号值，就使用相应的转换因子来计算复合信号。通过使用CPP(100ms)值接近于5000或20的样品浓度计算转换因子。这些转换因子是测定特异性的，并且应当在生成校准曲线时设置。在本实施例中，在0.781 mIU/L的TSH时，CPP (100ms)为“5880”，且CPP(10ms)为“694”，因此转换因子为8.47。在另一个实例中，在0.003mIU/L时，PPA为“0.1886”，且CPP为“19”，因此转换因子为100.74。
构建复合校准曲线的实例：
· 在25 mIU/L，CPP (100ms)信号为“15064”，其大于5000，因此使用来自CPP(10ms)的信号值“9000”，最终复合信号为：
· 在0.195 mIU/L，CPP (100ms)为“1413”，其在20和5000之间，因此使用来自CPP(100ms)的信号值“1413”，最终复合信号为：
· 在0.00076 mIU/L，CPP (100ms)为“10”，其小于20，因此使用来自PPA的信号值“0.0504”，最终复合信号为：。
表9. 由成像分析软件产生的原始TSH测定数据和处理后的最终复合信号。基于值选择标准和转换因子，使用粗体信号构建复合信号
PPA CPP (100ms) CPP (10ms) 转换因子 复合信号
mIU/L
100 0.0422 8472 12758 8.47 108063
50 0.1460 8606 11993 8.47 101584
25 0.0687 15064 9000 8.47 76230
12.5 0.0374 26265 6267 8.47 53081
6.25 0.0081 29822 4047 8.47 34278
3.125 0.0109 18617 2358 8.47 19973
1.562 0.0210 10653 1281 8.47 10854
0.781 0.0357 5880 694 8.47 5880
0.390 0.1687 2956 344 1 2956
0.195 0.5156 1431 168 1 1431
0.0976 0.2723 701 81 1 701
0.0488 0.0408 352 41 1 352
0.0244 0.4983 163 19 1 163
0.0122 0.9575 84 10 1 84
0.0061 0.5046 41 5 1 41
0.0030 0.1886 19 2 100 19
0.0015 0.0890 12 1 100 8.9
0.00076 0.0504 10 1 100 5
0.00038 0.0244 3 0 100 2.4
0.00019 0.0167 4 0 100 1.7
9.53E-05 0.0079 1 0 100 0.8
4.7E-05 0.0055 1 0 100 0.5
2.4E-05 0.0041 1 0 100 0.4
0 0.0046 0 0 100 0.5
本实施例的结果表明模型TSH测定能够进行范围为0.00019 mIU/L至12 mIU/L(其对应于100pM-1fM(5个数量级)的线性动态范围)的线性TSH检测。
实施例6
本实施例描述根据本文所述的方法检测雌二醇的免疫测定。
测定中使用的微粒使用Abbott内部抗体经由EDAC化学法包被。该测定以三个步骤进行：
步骤1：将100 μL的每种雌二醇校准物与微粒混合并在37℃下孵育10分钟。孵育后洗涤微粒。
步骤2：添加80 μL雌二醇-生物素；孵育5分钟后洗涤微粒。
步骤3：添加100 μL SAPE并孵育5分钟，孵育后洗涤微粒，且然后在具有sCMOS相机的显微镜上成像。
成像采集和分析如图2中所示仅使用模拟模式进行。测定的结果显示于图8中。
实施例7
本实施例描述检测样品中HCV和HIV抗体的多重免疫测定。
在该测定中使用两种类型的微粒：链霉抗生物素蛋白包被的微粒和gp41包被的微粒。微粒与HCV试剂和HIV试剂反应。HCV试剂含有生物素-标记的HCV NS3抗原和Cy3-标记的NS3抗原的混合物。HIV试剂含有Cy5-标记的HIV肽和AlexaFluro405-生物素的混合物。
测定在自动化仪器(KINGFISHER™)上运行，其中步骤列于表10中。
表10
步骤1 结合20分钟 100 μl样品，5μl MP(2 MP总共0.1%)+5μl HCV试剂
步骤2 洗涤(一次) 1分钟(200μl洗涤缓冲液)
步骤3 结合20分钟 100 μl HIV试剂
步骤4 洗涤(5次) 1分钟(200μl洗涤缓冲液)
在反应之后，对于每个样品获取九组图像并根据图11中所示的图表进行分析。每组图像包括一张透射光图像和三张荧光图像。HCV/HIV-阴性样品、HIV阳性样品和HCV阳性样品的测定结果分别显示于图12、13和14中。表11显示来自单次测定运行同时检测HIV和HCV的信号。灵敏度与ARCHITECT®测定等效。
表11
HCV通道 HIV通道
阴性对照 50 2
HCV阳性对照 1130 17
HIV阳性对照 120 2085
使用上述双重测定形式测量的140个正常人样品、阳性HCV校准物和阳性HIV校准物的分布显示于图15和16中。
本文引用的所有参考文献、包括出版物、专利申请和专利在此处通过引用并入，其程度等同于单独地或具体地指出每个参考文献通过引用并入并且在本文以其整体记载。
在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”和“该/所述(the)”和“至少一个/种”和类似指示物应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文以其他方式指明或与上下文明显矛盾。在一个/种或多个/种项目的列表之前使用的术语“至少一个/种”(例如，“A和B中的至少一个/种”)应理解为意指选自所列项目的一个/种项目(A或B)或所列项目中两个/种或更多个/种的任何组合(A和B)，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括，但不限于”)，除非另有说明。除非本文另有说明，否则本文的值的范围的记载仅仅意欲充当单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，且每个单独值如同其在本文中单独记载地并入本说明书。本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有指明或另外与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅意欲更好地举例说明本发明，并且不构成对本发明的范围的限制，除非另有请求保护。本说明书中的语言不应解释为指示任何未请求保护的要素对实施本发明是必不可少的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。阅读上述描述后，那些优选实施方案的变化对于本领域普通技术人员可变得显而易见。本发明人预期技术人员适当时采用此类变化，且本发明人意欲本发明以不同于本文中具体描述的其他方式实施。因此，如适用法律所允许，本发明包括其随附权利要求中所述的主题的所有修改和等同方案。此外，本发明涵盖上述要素在其所有可能的变化中的任何组合，除非本文另有指明或以其他方式与上下文明显矛盾。
出于完整性的原因，在以下编号条款中描述本发明的各个方面：
条款1. 分析生物样品中的目标分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在结合表面上捕获目标分析物，所述结合表面包含与之固定的结合所述分析物的多个特异性结合成员；(b)使多个大缀合物与捕获的分析物反应；其中每个大缀合物包含：(i)包含交联的蛋白或聚合物，或纳米颗粒的核心，所述聚合物包含多糖、树枝状聚合物、聚醚化合物；(ii)多个特异性结合成员、其片段或其组合；(iii)多个标签或可检测标记物，其中当所述大缀合物包含多个标签时，所述方法包括使多个荧光剂与所述标签反应，其中每个荧光剂包含能够结合标签和可检测标记物的分子；和任选地(iv)多个载体蛋白；和(c)对所述结合表面进行成像并分析图像。
条款2. 分析生物样品中的目标分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在结合表面上捕获目标分析物，所述结合表面包含与之固定的结合所述分析物的多个特异性结合成员；(b)使多个大缀合物与捕获的分析物反应；其中每个大缀合物包含：(i)包含交联的蛋白或聚合物，或纳米颗粒的核心，所述聚合物包含多糖、树枝状聚合物、聚醚化合物；(ii)共价附接至所述核心周围的位置的多个载体蛋白；(iii)共价附接至所述载体蛋白的多个特异性结合成员、其片段或其组合；和(iv)共价附接至所述多个载体蛋白或所述多个特异性结合成员的多个标签；(c)使多个荧光剂与所述大缀合物反应，其中每个荧光剂包含能够结合标签和可检测标记物的分子；和(d)对所述结合表面进行成像并分析图像。
条款3. 条款1或条款2的方法，其中，作为使所述大缀合物与多个荧光剂反应的结果，所述大缀合物发射比背景荧光高至少5倍(例如，比背景荧光高6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍)的荧光信号。
条款4. 条款1或条款2的方法，其中所述多糖是葡聚糖、氨基葡聚糖或其组合。
条款5. 条款1或条款2的方法，其中所述树枝状聚合物是PAMAM树枝状聚合物或DNA树枝状聚合物。
条款6. 条款1或条款2的方法，其中所述聚醚化合物是聚乙二醇。
条款7. 条款1-6中任一项的方法，其中所述载体蛋白是血清白蛋白。
条款8. 条款7的方法，其中所述血清白蛋白是牛血清白蛋白。
条款9. 条款1-8中任一项的方法，其中所述标签包含生物素。
条款10. 条款1-9中任一项的方法，其中所述特异性结合成员包括多种抗体。
条款11. 条款1-9中任一项的方法，其中所述特异性结合成员的片段包含多种抗体片段。
条款12. 条款1-11中任一项的方法，其中所述荧光剂中的分子是链霉抗生物素蛋白。
条款13. 条款1-12中任一项的方法，其中所述荧光剂中的可检测标记物是藻红蛋白或别藻蓝蛋白。
条款14. 条款13的方法，其中所述荧光剂包括链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白缀合物(SAPE)或链霉抗生物素蛋白-别藻蓝蛋白(SAAPC)缀合物。
条款15. 条款1-14中任一项的方法，其中所述结合表面在固体支持物的平坦光滑表面上成像。
条款16. 条款1-15中任一项的方法，其中对结合表面成像涉及获取所述结合表面的透射光图像和对应于所述荧光剂的一个或多个荧光图像。
条款17. 条款16的方法，其中分析图像进一步包括：计算一个或多个荧光图像中结合表面上的平均像素强度。在一些实施方案中，如果目标区域中的平均像素强度小于预定值，则分析图像包括：(i)对目标区域中的高荧光强度峰进行计数；和(ii)测定一个或多个荧光图像中的峰与目标区域面积的比率。
条款18. 条款17的方法，其中将所述结合表面上的平均像素强度与预定值进行比较。
条款19. 前述条款中任一项的方法，其中，如果所述结合表面上的平均像素强度小于预定值，则分析图像包括：(i)鉴定所述结合表面上的目标区域面积；(ii)对所述结合表面上的高荧光强度峰进行计数；(iii)测定一个或多个荧光图像中的峰与目标区域面积的比率；和(iv)使用转换因子计算复合信号以组合对于不同分析物浓度获得的数据点。
条款20. 条款19的方法，其中如果所述结合表面上的平均像素强度小于所述预定值，则分析图像涉及：鉴定所述结合表面上的目标区域面积，对所述结合表面上的高强度峰进行计数，和测定一个或多个荧光图像中的峰与目标区域面积的比率。
条款21. 条款1至20中任一项的方法，其中所述结合表面包含一个或多个微粒。
条款22. 条款21的方法，其中所述一个或多个微粒各自具有大于1微米的尺寸。
条款23. 在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法，所述方法包括：(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒(i)包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员，且(ii)用第一荧光团标记；(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，且(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员；(c)使捕获的第一目标分析物与第一缀合物反应，其中所述第一缀合物包含用第二荧光团标记并结合所述第一分析物的特异性结合成员；(d)使捕获的第二分析物与第二缀合物反应，其中所述第二缀合物包含用第三荧光团标记并结合所述第二分析物的特异性结合成员，且其中所述第一、第二和第三荧光团是不同的；(e)获得所述第一和第二微粒的透射光图像；(f)获得分别对应于所述第一、第二和第三荧光团的第一和第二微粒的分开荧光图像；和(g)使用定制的图像分析过程分析所述图像。
条款24. 条款23的方法，其中所述第一分析物和所述第二分析物各自是抗原或抗体。
条款25. 条款23或条款24的方法，其中所述第一、第二和第三荧光团选自AlexaFluor405、AlexaFluor488、Alexa Fluor546、Cy3、Cy5、藻红蛋白和别藻蓝蛋白。
条款26. 条款23-25中任一项的方法，其中所述微粒在固体支持物的平坦光滑表面上成像。
条款27. 条款23-26中任一项的方法，其中所述定制的图像分析过程包括：(i)基于透射光图像生成总图像掩模；(ii)基于对应于第一荧光团的荧光图像生成第一图像掩模；(iii)从总图像掩模减去所述第一图像掩模以生成第二图像掩模；(iv)使用所述第一图像掩模计算从所述第二荧光团发射的信号，由此检测所述第一分析物；和(v)使用所述第二图像掩模计算从所述第三荧光团发射的信号，由此检测所述第二分析物。
条款28. 条款26的方法，其中步骤(iv)和(v)中的信号计算包括计算分别对应于所述第二和第三荧光团的荧光图像中微粒上的平均像素强度。
条款29. 在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法，所述方法包括：(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员；(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员，且(iii)所述第一微粒和所述第二微粒的尺寸和/或形状不同；(c)使捕获的第一目标分析物与第一缀合物反应，其中所述第一缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员包含第一荧光团并结合所述第一分析物；(d)使捕获的第二分析物与第二缀合物反应，其中所述第二缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员包含第二荧光团并结合所述第二分析物，且其中所述第一和第二荧光团是不同的；(e)获得所述第一和第二微粒的透射光图像；(f)获得分别对应于所述第一和第二荧光团的第一和第二微粒的分开荧光图像；和(g)使用定制的图像分析过程分析所述图像。
条款30. 条款23-29中任一项的方法，其进一步包括分析多于两种目标分析物。
条款31. 条款30的方法，其包括：(a)在第三、第四或后续微粒的表面上捕获第三、第四或后续目标分析物，其中(i)所述第三、第四和后续分析物各自不同于彼此且不同于第一和第二分析物，且(ii)所述第三、第四或后续微粒包含固定在其表面上的结合所述第三、第四或后续分析物的多个特异性结合成员；(b)使捕获的第三、第四或后续分析物与第三、第四或后续缀合物反应，其中所述第三、第四或后续缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员用第四、第五或后续荧光团标记且结合所述第三、第四或随后分析物，且其中所述第四、第五和后续荧光团不同于彼此且不同于所述第一、第二和第三荧光团中的每一种；(c)获得所述第三、第四和后续微粒的透射光图像；(d)获得分别对应于所述第四、第五和后续荧光团的所述第三、第四和后续微粒的分开荧光图像，和(e)使用定制的图像分析过程分析所述图像。
条款32. 条款31的方法，其中所述第三、第四或后续微粒各自用不同的荧光团标记和/或具有不同的尺寸或形状。
条款33. 条款23-32中任一项的方法，其中所述第一分析物和所述第二分析物各自是抗原或抗体。
条款34. 条款29-33中任一项的方法，其中所述荧光团选自AlexaFluor405、AlexaFluor488、Alexa Fluor546、Cy3、Cy5、藻红蛋白和别藻蓝蛋白。
条款35. 条款23-34中任一项的方法，其中所述微粒具有大于1微米的尺寸。
条款36. 条款23-35中任一项的方法，其中所述第一和第二分析物各自由相同的生物体产生。
条款37. 条款23-35中任一项的方法，其中所述第一和第二分析物各自由不同的生物体产生。

Claims (15)

1.如下所述的微粒和缀合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法，所述方法包括：
(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒(i)包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员，且(ii)用第一荧光团标记；
(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，且(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员；
(c)使捕获的第一目标分析物与第一缀合物反应，其中所述第一缀合物包含用第二荧光团标记并结合所述第一分析物的特异性结合成员；
(d)使捕获的第二分析物与第二缀合物反应，其中所述第二缀合物包含用第三荧光团标记并结合所述第二分析物的特异性结合成员，且其中所述第一、第二和第三荧光团是不同的；
(e)获得所述第一和第二微粒的透射光图像；
(f)获得分别对应于所述第一、第二和第三荧光团的第一和第二微粒的分开荧光图像；和
(g)使用定制的图像分析过程分析所述图像。
2.权利要求1的用途，其中所述第一分析物和所述第二分析物各自是抗原或抗体。
3.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述第一、第二和第三荧光团选自AlexaFluor405、AlexaFluor488、AlexaFluor546、Cy3、Cy5、藻红蛋白和别藻蓝蛋白。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述微粒在固体支持物的平坦光滑表面上成像。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述定制的图像分析过程包括：
(i)基于透射光图像生成总图像掩模；
(ii)基于对应于第一荧光团的荧光图像生成第一图像掩模；
(iii)从总图像掩模减去所述第一图像掩模以生成第二图像掩模；
(iv)使用所述第一图像掩模计算从所述第二荧光团发射的信号，由此检测所述第一分析物；和
(v)使用所述第二图像掩模计算从所述第三荧光团发射的信号，由此检测所述第二分析物。
6.权利要求5的用途，其中步骤(iv)和(v)中的信号计算包括计算分别对应于所述第二和第三荧光团的荧光图像中微粒上的平均像素强度。
7.如下所述的微粒和缀合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行在单一测定中分析生物样品中的两种或更多种目标分析物的方法，所述方法包括：
(a)在第一微粒的表面上捕获第一目标分析物，其中所述第一微粒包含固定在其表面上的结合所述第一分析物的多个特异性结合成员；
(b)在第二微粒的表面上捕获第二目标分析物，其中(i)所述第一分析物不同于所述第二分析物，(ii)所述第二微粒包含固定在其表面上的结合所述第二分析物的多个特异性结合成员，且(iii)所述第一微粒和所述第二微粒的尺寸和/或形状不同；
(c)使捕获的第一目标分析物与第一缀合物反应，其中所述第一缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员包含第一荧光团并结合所述第一分析物；
(d)使捕获的第二分析物与第二缀合物反应，其中所述第二缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员包含第二荧光团并结合所述第二分析物，且其中所述第一和第二荧光团是不同的；
(e)获得所述第一和第二微粒的透射光图像；
(f)获得分别对应于所述第一和第二荧光团的第一和第二微粒的分开荧光图像；和
(g)使用定制的图像分析过程分析所述图像。
8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述方法进一步包括分析多于两种目标分析物。
9.权利要求8的用途，其中所述方法包括：
(a)在第三、第四或后续微粒的表面上捕获第三、第四或后续目标分析物，其中(i)所述第三、第四和后续分析物各自不同于彼此且不同于第一和第二分析物，且(ii)所述第三、第四或后续微粒包含固定在其表面上的结合所述第三、第四或后续分析物的多个特异性结合成员；
(b)使捕获的第三、第四或后续分析物与第三、第四或后续缀合物反应，其中所述第三、第四或后续缀合物包含特异性结合成员，所述特异性结合成员用第四、第五或后续荧光团标记且结合所述第三、第四或随后分析物，且其中所述第四、第五和后续荧光团不同于彼此且不同于所述第一、第二和第三荧光团中的每一种；
(c)获得所述第三、第四和后续微粒的透射光图像；
(d)获得分别对应于所述第四、第五和后续荧光团的所述第三、第四和后续微粒的分开荧光图像，和
(e)使用定制的图像分析过程分析所述图像。
10.权利要求9的用途，其中所述第三、第四或后续微粒各自用不同的荧光团标记和/或具有不同的尺寸或形状。
11.权利要求1-10中任一项的用途，其中所述第一分析物和所述第二分析物各自是抗原或抗体。
12.权利要求7-11中任一项的用途，其中所述荧光团选自AlexaFluor405、AlexaFluor488、AlexaFluor546、Cy3、Cy5、藻红蛋白和别藻蓝蛋白。
13.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述微粒具有大于1微米的尺寸。
14.权利要求1-13中任一项的用途，其中所述第一和第二分析物各自由相同的生物体产生。
15.权利要求1-13中任一项的用途，其中所述第一和第二分析物各自由不同的生物体产生。
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