JP2001013145A - 標識複合体とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】非特異的反応を低減させ、精度の高い検出を可
能にする標識複合体およびその製造方法を提供するこ
と。 【解決手段】（ａ）水分散型高分子粒子からなる担体に
酵素を固定させる工程、および（ｂ）工程（ａ）で得ら
れた酵素固定化担体に被検物質に対する特異的結合物質
を固定させる工程を含む、標識複合体の製造方法、なら
びに水分散型高分子粒子からなる担体に酵素を固定さ
せ、ついで被検物質に対する特異的結合物質を固定させ
てなる標識複合体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、非特異的反応を低
減させうる、担体として水分散型高分子粒子を用いて標
識化された標識複合体に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年問題となっている大腸菌Ｏ１５７を
はじめ、微生物等の食品中や個体からの検出に多くの日
数、煩雑な操作を要する場合がある。さらに疾患によっ
てはより迅速な診断が要求される場合も多い。これらの
診断には、標識化免疫測定法等の種々の免疫測定法（イ
ムノアッセイ）が好適に用いられている。近年、迅速か
つ簡便にイムノアッセイが行える方法として、免疫クロ
マトグラフ法が注目されているが、簡便性、迅速性、感
度等の点において十分なものが得られていないのが現状
である。

【０００３】免疫学的成分により被検物質を検出する場
合、検出条件によっては被検物質以外の物質を非特異的
に検出することがあるという欠点を有する。また、担体
表面に酵素および免疫学的成分を固定化した標識複合体
を使用し、被検物質を検出する場合も、非特異的に被検
物質以外の物質が捕捉されることにより、被検物質の有
無を正しく判定することができなくなるという欠点を有
する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、非特異的反
応を低減させ、精度の高い検出を可能にする標識複合体
およびその製造方法を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 （ａ）水分散型高分子粒子からなる担体に酵素
を固定させる工程、および（ｂ）工程（ａ）で得られた
酵素固定化担体に被検物質に対する特異的結合物質を固
定させる工程を含む、標識複合体の製造方法、ならびに
〔２〕 水分散型高分子粒子からなる担体に酵素を固定
させ、ついで被検物質に対する特異的結合物質を固定さ
せてなる標識複合体、に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の標識複合体の製造方法
は、（ａ）水分散型高分子粒子からなる担体に酵素を固
定させる工程、および（ｂ）工程（ａ）で得られた酵素
固定化担体に被検物質に対する特異的結合物質を固定さ
せる工程を含む。本発明の製造方法により得られる標識
複合体においては、担体に固定化されている酵素と吸水
性基材上に固定相として固定されている抗体との非特異
的な結合、または該酵素と吸水性基材上に非特異的に捕
捉された他の物質（被検物質を除く物質）との非特異的
な結合が抑制される。したがって、本発明の標識複合体
によれば、非特異的反応が抑制され、より精度の高い被
検物質の検出を可能にする。

【０００７】本発明の標識複合体の製造方法において
は、まず、水分散型高分子粒子からなる担体に酵素を固
定させる（以下工程（ａ）という）。

【０００８】本発明に用いられる担体は、水分散型高分
子粒子であり、かかる水分散型高分子粒子は、該粒子表
面に酵素および特異的結合物質を固定させうる物質であ
ればよい。

【０００９】前記水分散型高分子粒子は、不飽和二重結
合を有する少なくとも１種の単量体の乳化重合によって
調製される。かかる単量体としては、例えば、エチレ
ン、プロピレンなどのオレフィン系単量体、酢酸ビニ
ル、塩化ビニルなどのビニル系単量体、スチレン、メチ
ルスチレン、クロロスチレンなどのスチレン系単量体、
アクリル酸メチルなどのメタクリル酸エステル系単量
体、ブタジエンなどのジエン系単量体などが挙げられ
る。

【００１０】水分散型高分子粒子は、上記単量体の単独
重合体や共重合体のほか、得られる粒子に官能基やイオ
ン性基を付与し、または粒子の水性媒体中での分散安定
性を高めるなどの目的で、改質用単量体を共重合するこ
ともできる。このような改質用単量体としては、例え
ば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフル
オロエチルメチルメタクリレートなどのフッ素化メタク
リル酸エステル、アクリロニトリル、メタクリロニトリ
ル、アクリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、
スルホプロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、Ｎ
−ビニル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチルアク
リレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリ
シジルメタクリレートなどが挙げられる。

【００１１】また本発明においては、市販されている種
々の水分散型高分子粒子を用いてもよい。市販されてい
る水分散型高分子粒子としては、例えば、スチレンまた
はその誘導体、例えば、ｐ−クロロスチレンを単量体成
分とする単独重合体または共重合体、スチレン−ブタジ
エン共重合体、スチレン−アクリロニトリル−ブタジエ
ン共重合体などの種々のスチレン共重合体からなるエマ
ルジョンなどが挙げられる。また、本発明においては、
（メタ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルまたはその
誘導体を単量体成分とする単独重合体や、該単量体と
（メタ）アクリル酸メチルやエチル、グリシジル（メ
タ）アクリレートなどとの共重合体も用いられる。上述
したスチレンまたはその誘導体と、（メタ）アクリレー
トエステルまたはその誘導体との共重合体も用いられ
る。また、ゴム、ナイロン、ポリウレタン、微結晶質セ
ルロースなども挙げられる。

【００１２】個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子粒子を担体として使用された標識複合体
が、その使用時や保存時に融着、凝集を起こさないよう
に、当該高分子粒子が所要のガラス転移点を有するよう
に選ばれる。水分散型高分子粒子のガラス転移点は、好
ましくは１０℃以上、特に室温以上が好ましい。

【００１３】上記水分散型高分子粒子のうち、粒子の安
定性の点から、スチレン系単量体を主成分とする重合体
が好ましく、また、特異的結合物質と酵素を固定するた
めに、アクリル酸やメタクリル酸などのカルボキシル基
を有する単量体を共重合した高分子粒子が好ましい。

【００１４】前記水分散型高分子粒子は、色を有する粒
子であってもよい。色を有する担体を用いた場合、被検
物質の濃度が高いと酵素反応を行う前に着色の程度によ
り判定が可能となる。ここで用いる色を有する粒子とし
ては、肉眼で色を検出することができる粒子であれば特
に限定されないが、例えば、スダンブルーやスダンレッ
ドIV、スダン III、オイルオレンジ、キニザリングリー
ンなどに代表される顔料や染料などで着色された水分散
型高分子粒子などを用いることができる。目視確認性の
点からは、青色、赤色、緑色またはオレンジ色に呈色し
た水分散型高分子粒子が好ましい。分散安定性や被検物
質の検出感度の調整し易さなどの点から青色または赤色
などに呈色したラテックスが望ましい。

【００１５】前記水分散型高分子粒子は、表面への特異
的結合物質および酵素の固定、スペーサーの導入、ある
いは水分散状態での安定性の向上のために官能基を有し
ていてもよい。このような官能基としては、例えばカル
ボキシル基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、ホルミ
ル基、カルバモイル基、イソチオシアナート基、アジド
カルボニル基、ヒドラジド基、酸無水物基などを挙げる
ことができ、好ましくはカルボキシル基が導入される。
これらの官能基を有する水分散型高分子粒子を調製する
には、単量体成分として、例えば、アクリル酸、メタク
リル酸のようなカルボキシル基を有する単量体、例えば
ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチル
メタクリレートのような水酸基を有する単量体、例え
ば、グリシジルメタクリレートのようなグリシジル基を
有する単量体を、必要に応じて、他の共重合性単量体と
乳化共重合させることによって、それぞれカルボキシル
基、水酸基およびグリシジル基を有する粒子を得ること
ができる。また、所要の単量体成分を重合させた後、得
られた粒子に官能基を導入することもできる。

【００１６】担体の粒子径は、分散性、ならびに酵素、
特異的結合物質などの固定性の観点から、好ましくは３
μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以下であり、得られ
た標識複合体の精製の容易性の観点から、好ましくは
０．０１μｍ以上、さらに好ましくは０．１μｍ以上で
ある。

【００１７】酵素は、イムノアッセイなどにおける酵素
標識に用いられる酵素が挙げられ、例えば、ペルオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エ
ステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼなどが挙げられ
る。より高感度で安定な検出を行う観点から、好ましく
はペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼであ
る。

【００１８】担体と酵素との固定は、疎水結合（物理的
吸着）、イオン結合、共有結合を介した固定などが利用
でき、安定性の観点から、共有結合を介した固定が好ま
しい。また、本発明においては、共有結合を介して固定
させる際に、必要に応じて、酵素の当該高分子粒子上で
の自由度を高めるために、スペーサー基を介在させるこ
とができる。スペーサー基は、予め水分散型高分子粒子
に結合させた後、酵素と結合させてもよく、予め酵素に
結合させ、これを水分散型高分子粒子に結合させてもよ
い。更に、必要に応じて、水分散型高分子粒子および酵
素の両者に予めスペーサー基を結合させ、これらを相互
に結合させることもできる。

【００１９】スペーサー基として用い得る化合物は、少
なくとも二官能性の有機化合物であり、特に炭素数１〜
１２の炭素鎖基を有する二官能性の有機化合物が好まし
い。このようなスペーサー基として機能する化合物とし
ては、特に限定されないが、例えば、ヘキサメチレンジ
アミン、ドデカメチレンジアミン、キシリレンジアミン
等のジアミン類、グリシン、β−アミノプロピオン酸、
γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、ε−アミノカ
プリル酸等のアミノアルキルカルボン酸、リジン、グル
タミン酸、β−アラニン、アルギニン、グリシルグリシ
ン等のアミノ酸類等が好ましい。

【００２０】水分散型高分子粒子に直接またはスペーサ
ー基を介して酵素を共有結合にて固定させるための方法
は、特に限定されず、慣用の方法が挙げられる。好まし
い方法としては、例えば、結合試薬として水溶性カルボ
ジイミドを用いる方法が挙げられる。例えば、アミノア
ルキルカルボン酸をスペーサー基として用いる場合であ
れば、水溶性カルボジイミドを用いて、アミノアルキル
カルボン酸を水分散型高分子粒子に結合させ、次いで、
当該水分散型高分子粒子に結合したアミノアルキルカル
ボン酸に水溶性カルボジイミドを用いて同様にして、酵
素を共有結合を介して固定させることができる。

【００２１】かかる方法において用いる水溶性カルボジ
イミドとしては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シク
ロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイ
ミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート等を挙げること
ができる。このような水溶性カルボジイミドを用いて、
スペーサー基を介するまたは直接的な、共有結合による
酵素と水分散型高分子粒子との固定は、慣用の方法およ
び条件により行なうことができる。本発明において、酵
素の担体への結合は、両者の結合を同時に行なってもよ
く、別々に行なってもよい。

【００２２】担体における酵素の固定量は、被検物質の
迅速かつ高感度な検出の観点から、水分散型高分子粒子
の乾燥重量１ｇあたり１ｍｇ以上、好ましくは１．５ｍ
ｇ以上であり、非特異的結合の低減の観点から、１５０
ｍｇ以下、好ましくは１００ｍｇ以下である。

【００２３】ここで、担体の「乾燥重量」とは、一定量
の担体を１２０℃で２時間乾燥した後の重量をいう。

【００２４】担体における酵素の固定量は、色素結合法
などの慣用のタンパク質定量法により測定し、タンパク
質の量として算出されうる。

【００２５】担体における酵素の固定量は、酵素活性と
しても表すことができる。かかる酵素活性は、用いる酵
素の種類、その基質、温度など種々の条件によって異な
る。酵素がペルオキシダーゼである場合、活性は以下の
方法で測定する。基質である、ＴＭＢ（３，３’，５，
５’−テトラメチルベンジジン）０．２ｍｇ／ｍｌと過
酸化水素０．０１％とを含む０．１Ｍ−クエン酸緩衝液
（ｐＨ４．５）３．３ｍｌに、標識複合体０．０１２５
％懸濁液を１００μｌ混合して、２５℃で反応、５８０
ｎｍの波長での吸光度を経時的に測定し、１分間に当該
吸光度を１増加させる酵素活性を１Ｕ（ユニット）とし
て換算する。

【００２６】例えば、ペルオキシダーゼの場合、被検物
質の迅速かつ高感度な検出の観点から、水分散型高分子
粒子の乾燥重量１ｇあたり、酵素活性が、５，０００Ｕ
以上、好ましくは１０，０００Ｕ以上、より好ましくは
５０，０００Ｕ以上であり、吸水性基材上の固定相にお
ける酵素による発色の相対的な向上（バックグラウンド
の低減）の観点から、３００，０００Ｕ以下である。具
体的には、５，０００〜３００，０００Ｕ、好ましく
は、１０，０００〜３００，０００Ｕ、より好ましくは
５０，０００〜３００，０００Ｕである。

【００２７】前記酵素は、特異的結合物質１モルに対し
て、被検物質の迅速かつ高感度な検出の観点から、０．
３モル以上、好ましくは０．６モル以上、非特異的反応
の低減の観点から、６０モル以下、好ましくは４０モル
以下である。具体的には、特異的結合物質１モルに対し
て、０．３〜６０モル、好ましくは０．６〜４０モルで
ある。

【００２８】ついで、工程（ａ）で得られた酵素固定化
担体に被検物質に対する特異的結合物質を固定させる
（以下、工程（ｂ）という）。

【００２９】酵素固定化担体と被検物質に対する特異的
結合物質との固定は、前記工程（ａ）における酵素と担
体との固定と同様に行うことができ、安定性の観点か
ら、共有結合を介した固定が好ましい。

【００３０】担体における特異的結合物質の固定量は、
被検物質との結合確率の観点から、水分散型高分子粒子
の乾燥重量１ｇあたり３〜５０ｍｇであり、好ましく
は、５〜３５ｍｇである。

【００３１】本発明において、被検物質とは、免疫化学
的反応（すなわち抗原抗体反応）によりサンドイッチ免
疫複合体を形成し得るものであれば特に制限されない。
例えば、細菌〔特に大腸菌Ｏ１５７、メチシリン耐性黄
色ブドウ球菌等の病原性細菌〕、放線菌、酵母、かび、
ウイルス（特に、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等）などの微
生物またはそれらに対する抗体、細菌等が産生する毒
素、あるいは腫瘍マーカー抗原などの生体試料中の抗原
性ペプチド、タンパク質、多糖類、脂質、核酸などに代
表される天然抗原；化学物質に代表されるハプテンなど
が挙げられる。前記被検物質は、例示された物質に、さ
らに種々の修飾を有する物質も含まれる。前記被検物質
は、例えば、血清、血液、尿、便、唾液などの被検物に
含まれていてもよい。

【００３２】被検物質に対する特異的結合物質として
は、被検物質に特異的に結合する物質であればよく、例
えば、抗原、ハプテン、抗体、核酸、エフェクター、レ
セプター、酵素、酵素補助因子、酵素阻害剤などが挙げ
られる。なお、被検物質が核酸である場合、核酸を除く
特異的結合物質が用いられる。本発明においては、なか
でも、抗原、ハプテン、抗体等が好ましい。

【００３３】前記特異的結合物質が抗原またはハプテン
の場合、当該抗原およびハプテンとしてはクラミジア・
トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・
ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキ
ソプラズマ・ゴンディ、ボレリア等の各種微生物抗原、
マイコプラズマ脂質抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢ
ｅ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原および前
記抗原に由来するハプテン等が挙げられる。

【００３４】前記特異的結合物質が抗体の場合、当該抗
体としてはモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を
使用することができる。具体的には、抗大腸菌抗体、抗
大腸菌Ｏ１５７抗体、抗サルモネラ菌抗体、抗ブドウ球
菌抗体、抗カンピロバクター菌抗体、抗ウェルシュ菌抗
体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒ
トトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒ
ト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗
ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラ
ミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンＯ抗
体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗
体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗
体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗体、抗ＲＦ抗体等
が挙げられる。

【００３５】前記特異的結合物質が核酸の場合、該核酸
としては、前記抗原として例示された各種微生物、マイ
コプラズマ、各種ウイルスに由来する核酸成分に相補的
なオリゴヌクレオチド等が挙げられる。

【００３６】工程（ａ）の後に工程（ｂ）を行うことに
より得られる標識複合体を免疫クロマトグラフ法に用い
た場合、酵素と特異的結合物質とを同時に固定化した従
来の酵素−特異的結合物質固定化担体または特異的結合
物質を固定化したのち酵素を固定化して得られた酵素−
特異的結合物質固定化担体と比べて、非特異的反応をよ
り低減しうる。非特異的反応を低減できる理由は、標識
複合体を製造する際に酵素をまず担体に固定化した後、
抗体を固定化することにより、酵素の周りを抗体で覆う
ように固定化されるので、標識複合体に固定化されてい
る酵素による非特異的反応が抑制されるためであると推
定される。

【００３７】本発明の標識複合体は、水分散型高分子粒
子からなる担体に酵素を固定させ、ついで被検物質に対
する特異的結合物質を固定させた酵素−特異的結合物質
固定化担体であり、前記製造方法により得ることができ
る。本発明の標識複合体によれば、前記したように、非
特異的な結合を抑制するため、より精度の高い被検物質
の検出を可能にする。かかる標識複合体は、免疫クロマ
トグラフ法に好適である。

【００３８】

【実施例】以下、実施例および実験例を挙げ、さらに具
体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定
されるものではない。

【００３９】実施例１：標識複合体の作製（酵素−抗体
固定化担体） １）水分散型高分子粒子懸濁液の作製 スチレン５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエチレング
リコールジメタクリレート０．２ｇ、蒸留水４４０ｇか
らなる混合液を窒素ガス雰囲気下で７５℃に維持、攪拌
しながら、重合開始剤としての過硫酸カリウム０．２５
ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１０時間重
合を行った。その結果、カルボキシル化された水分散型
高分子粒子としてカルボキシル化ポリスチレンラテック
ス粒子（平均粒子径は０．２μｍ）を得た。得られたカ
ルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子を０．０１Ｍ
−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）に固形分濃度が５重量％
になるように分散した。

【００４０】２）固定化 ｉ）酵素の固定 本実施例では特異的結合物質として酵素を上記１）で作
製したラテックス粒子に以下のようにして固定化した。
上記ラテックス粒子の分散液３ｍｌに、水溶性カルボジ
イミド〔DOJIN 社製、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍ
ｌ（０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）〕１ｍ
ｌ、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ〔以下ＨＲＰと略
す：和光純薬社製、１２ｍｇ／ｍｌ（０．０１Ｍ−ホウ
酸緩衝液、ｐＨ８．２）〕２ｍｌを加えて１０℃で３時
間反応させたのち、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩
衝液ｐＨ８．２を用いて遠心分離洗浄を行い、同緩衝液
で固形分濃度５重量％に調整した。

【００４１】ii）特異的結合物質の固定 次いで特異的結合物質として抗体を以下のようにして固
定した：上記で作製した酵素固定化ラテックス粒子懸濁
液３ｍｌに、水溶性カルボジイミド〔DOJIN 社製、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ（０．０１Ｍ−ホウ酸緩
衝液、ｐＨ８．２）〕０．５ｍｌ、ヤギ抗E. coli O15
7:H7 ポリクロナール抗体〔Kirkegaard & Perry Labora
tories Inc.社製、１ｍｇ／ｍｌ（０．０１Ｍ−ホウ酸
緩衝液、ｐＨ８．２）〕２ｍｌを加えて１０℃で３時間
反応させた後、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．２）を用いて遠心分離洗浄を行った。同緩衝
液で固形分濃度２重量％に調整し、ＨＲＰおよびヤギ抗
E. coli O157:H7 ポリクロナール抗体を固定化したラテ
ックス粒子を作製した。

【００４２】実施例２ 抗体の固定化の際、２．０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した
ヤギ抗E. coli O157:H7 ポリクロナール抗体を用いる以
外は全て実施例１と同様にしてＨＲＰおよびヤギ抗E. c
oli O157:H7 ポリクロナール抗体を固定化した。

【００４３】実施例３ 抗体の固定の際、４ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したヤギ抗
E. coli O157:H7 ポリクロナール抗体を用いる以外は全
て実施例１と同様にしてＨＲＰおよびヤギ抗E.coli O15
7:H7 ポリクロナール抗体を固定化したラテックス粒子
を作製した。

【００４４】実験例１ 酵素および抗体の固定量の測定 実施例１〜３で作製したヤギ抗E. coli O157:H7 ポリク
ロナール抗体およびＨＲＰを固定化したラテックス粒子
について、抗体および酵素の各固定後の上清をタンパク
定量し、その値からラテックス粒子の乾燥重量１ｇあた
りの各固定量を算出した。

【００４５】固定化抗体、酵素量の定量は、市販キット
である『Coomassie Protein AssayReagent 』(PIERCE
社製) を使用し、Coomassie Brilliant Blue G-250によ
る色素結合法により行った。測定法は附属の手順書に従
った。

【００４６】検量線は、濃度既知の該抗体、該酵素溶液
を用いて上記の試薬にて発色した後、５９５ｎｍの吸光
度を測定して作成した。適宜希釈した各固定化後の上清
を、上記の試薬にて発色させた後、５９５ｎｍの吸光度
を測定し、検量線から当該抗体および当該酵素の濃度を
算出した。

【００４７】測定時は室温（２５℃）で行った。反応時
間は、発色後９０分以内に吸光度測定を実施した。

【００４８】その結果、酵素の固定量は各実施例とも２
０．０ｍｇであり、抗体の固定量は実施例１では９．９
ｍｇ、実施例２では１１．０ｍｇ、実施例３では２５ｍ
ｇである。また、抗体１モルに対する酵素の量は、実施
例１では、８．１モル、実施例２では７．３モル、実施
例３では３．２モルである。

【００４９】実験例２ 酵素−抗体固定化ラテックス粒
子の酵素活性測定 実施例１〜３で作製したＨＲＰおよびヤギ抗E. coli O1
57:H7 ポリクローナル抗体を固定化したラテックス粒子
について、その酵素活性を測定した。当該酵素活性は以
下のようにして測定した。

【００５０】（ラテックス粒子の酵素活性測定法）TMB
(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) Membrane Peroxida
se Substrate System (Kirkegaard & Perry Laboratori
es Inc. 社製、ｐＨ４．５）を基質液として使用する。

【００５１】キュベット内で、上記の基質液３．３ｍｌ
に０．０１２５重量％に希釈した酵素−抗体固定化ラテ
ックス粒子分散液０．１ｍｌを混合し２５℃で反応さ
せ、分光光度計で５８０ｎｍにおける１分間の吸光度上
昇を測定する。

【００５２】５８０ｎｍにおける吸光度を１分間に１上
昇させる活性を１Ｕ（ユニット）と定義し、ラテックス
粒子の乾燥重量１ｇあたりの活性で表現する。

【００５３】その結果、酵素活性は、ラテックス粒子の
乾燥重量１ｇあたり実施例１では５２，４８０Ｕ、実施
例２では５３，２４０Ｕ、実施例３では５４，４８０Ｕ
であった。

【００５４】比較例１：酵素・抗体同時固定担体 青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分
散液（固形分濃度５重量％、平均粒子径０．１μｍ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０）に水溶性カル
ボジイミド〔DOJIN 社製、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ
／ｍｌ（０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８）〕０．５
ｍｌ、ヤギ抗E. coli O157:H7 ポリクロナール抗体〔Ki
rkegaard &Perry Laboratories Inc.社製、１ｍｇ／ｍ
ｌ（０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）〕２．０
ｍｌおよびＨＲＰ２５ｍｇを加えて１０℃で３時間反応
させた後、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．２）を用いて遠心分離洗浄を行った。同緩衝液で
固形分濃度２．０重量％に調整し、ＨＲＰとヤギ抗E.co
li O157:H7 ポリクロナール抗体を固定化したラテック
ス粒子を作製した。

【００５５】実験例３：免疫クロマトグラフ型試験片へ
の使用 １）試験片の作製 ニトロセルロースメンブレン（孔径８μｍ、６ｍｍ×６
０ｍｍ）の一端から３０ｍｍの箇所にヤギ抗E. coli O1
57:H7 ポリクロナール抗体〔１ｍｇ／ｍｌ（０．１Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．４）〕を１．５μｌ、ディスペンサ
ーを用いてライン状に塗布した（固定相）。

【００５６】このメンブレンをウシ血清アルブミン（オ
リエンタル酵母社製、１重量％）およびポリオキシエチ
レン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業
社製、０．１重量％）からなる水溶液中に１０分間浸漬
させてのち、４０℃で２時間乾燥させた。次いで、この
メンブレンの裏側（抗体塗布面の反対側）にポリエステ
ルフィルム（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて貼り
合わせた。

【００５７】抗体塗布箇所の反対端から０〜８ｍｍの箇
所にポリエステル不織布（６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ２．５
ｍｍ）を貼り合わせた。

【００５８】さらに、上記ポリエステル不織布を貼り合
わせた反対端０〜１０ｍｍの箇所に吸水用のパッドとし
てパルプ不織布（１０ｍｍ×１０ｍｍ、厚さ５ｍｍ）を
貼り合わせて試験片を作製した。当該試験片を４つ作製
して、以下の測定に用いた。

【００５９】２）測定 ０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐ
Ｈ７．４）に、E. coli O157:H7 を表１に示した濃度で
分散させた被検試料を調製した。

【００６０】この被検試料に対して、実施例１〜３で作
製した、ＨＲＰとヤギ抗E. coli O157:H7 ポリクローナ
ル抗体とを固定化したラテックス粒子ならびに比較例１
で作製した抗体・酵素固定化ラテックス粒子を、それぞ
れ固形分濃度０．０２重量％となるように個別に混合し
た後、各混合液６０μｌを上記１）で作製した各試験片
のポリエステル不織布部に個々に滴下した。５分後、
０．１Ｍリン酸緩衝液６０μｌを同不織布部に滴下して
洗浄を行い、さらに５分後、６０μｌのＴＭＢを同不織
布部に滴下し、１０分後の発色の有無を目視観察した。

【００６１】結果を表１に示す。なお、表１における判
定基準は以下の通りである。 ＋：固定相にライン状の発色が見られる。 ±：固定相にごくわずかにライン状の発色が見られる。 −：固定相にライン状の発色が見られない。

【００６２】

【表１】

【００６３】従来の、酵素および抗体を同時に固定化し
た着色ラテックスを用いた酵素免疫クロマトグラフ法
は、被検物質である菌体の存在しない場合 (０細胞／ｍ
ｌ) でも、ごく僅かにライン状の発色が検出されるが、
本発明の酵素を固定化した後抗体を固定化したラテック
スを用いた酵素免疫クロマトグラフ法の場合は、被検物
質が存在しない場合にライン状の発色は見られず、非特
異的な反応を抑制することができた。

【００６４】

【発明の効果】本発明の標識複合体の製造方法によれ
ば、担体に固定化されている酵素と吸水性基材上に固定
相として固定されている抗体との非特異的な結合、また
は該酵素と吸水性基材上に非特異的に捕捉された他の物
質（被検物質を除く物質）との非特異的な結合を抑制す
ることが可能な標識複合体を得ることができる。また、
本発明の標識複合体によれば、より精度の高い被検物質
の検出を可能にするという優れた効果を奏する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 雜賀 健 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内 (72)発明者 田中 康進 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）水分散型高分子粒子からなる担体
   に酵素を固定させる工程、および（ｂ）工程（ａ）で得
   られた酵素固定化担体に被検物質に対する特異的結合物
   質を固定させる工程を含む、標識複合体の製造方法。
2. 【請求項２】 特異的結合物質および／または酵素と担
   体との固定が共有結合を介した固定である請求項１記載
   の製造方法。
3. 【請求項３】 担体における酵素の量が、水分散型高分
   子粒子の乾燥重量１ｇあたり１〜１５０ｍｇである請求
   項１記載の製造方法。
4. 【請求項４】 担体における酵素の量が、特異的結合物
   質１モルに対して、０．３〜６０モルである請求項１〜
   ３いずれか記載の製造方法。
5. 【請求項５】 酵素が、ペルオキシダーゼおよびアルカ
   リホスファターゼからなる群より選ばれた少なくとも１
   種である請求項１〜４いずれか記載の製造方法。
6. 【請求項６】 酵素がペルオキシダーゼであって、水分
   散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあたりの酵素活性が、
   ５，０００〜３００，０００Ｕである請求項１〜５いず
   れか記載の製造方法。
7. 【請求項７】 水分散型高分子粒子からなる担体に酵素
   を固定させ、ついで被検物質に対する特異的結合物質を
   固定させてなる標識複合体。