JP2002328130A - 免疫測定法用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】検出レベルの調整手段を備え、被検物質を迅
速、簡便に、かつ良好に検出しうる、免疫クロマトグラ
フ法に基づく免疫測定法用試験片を提供すること。 【解決手段】吸水性基材に、下記（ｉ）、（ii）及び(i
ii) ：（ｉ）被検液を滴下するための被検液受領部、
（ii）標識物質と、前記被検物質に特異的に結合しうる
第１特異的結合物質とを含有した標識複合体を、水との
接触によって吸水性基材から脱離するように保持した標
識相、(iii) 被検物質に特異的に結合しうる第２特異的
結合物質を固定化した固定相、が順に配置された試験片
であって、かつ該被検液受領部から該標識相の範囲の領
域上に、（iv）被検物質に特異的に結合しうる第３特異
的結合物質を、水との接触によって吸水性基材から脱離
するように保持させた調整相、が配置され、かつ該
（ｉ）〜（iv）が、同一またはそれぞれ異なる吸水性基
材からなる免疫測定法用試験片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検液中の被検物
質を迅速、簡便に、かつ良好に検出しうる免疫測定用試
験片に関する。より詳細には、免疫クロマトグラフ法に
基づく試薬であって、固定相において検出される被検物
質量の範囲（検出レベルともいう）を簡便に調整するこ
とができ、かつ被検物質を良好に検出しうる免疫測定法
用試験片に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料について、迅速かつ簡便に検査
を行なうための免疫測定法用試薬として免疫クロマトグ
ラフ法に基づく試薬が挙げられる。かかる試薬として
は、例えば、吸水性基材上に、被検物質と特異的に結合
しうる特異的結合物質（例えば、抗体など）を固定化し
た固定相と、該被検物質に特異的に結合しうる標識複合
体（例えば、標識抗体など）を水との接触によって脱離
しうるように保持させた標識相とを有した試験片が挙げ
られる。かかる試験片を用いる免疫クロマトグラフ法に
おいては、標識相側の一端より被検液を滴下、展開させ
ると、該被検液に被検物質が存在する場合、試験片にお
いて、被検物質と標識複合体とが結合して、〔標識複合
体−被検物質〕からなる複合体が形成され、さらに展開
が進むと該複合体は固定相の特異的結合物質に捕捉され
る。従って、前記固定相に捕捉された標識複合体に基づ
く発色の有無または該発色の強さを測定することによ
り、被検液中の被検物質を検出することができる。

【０００３】前記した免疫クロマトグラフ法は、検出可
能な被検物質の量の範囲（検出レベル）を、測定目的に
適した範囲となるように調整することが必要となる。例
えば、生化学検査における尿中アルブミン量の測定の場
合、約２０μｇ／ｍｌ以上の濃度のヒトアルブミンを検
出できるように、検出レベルが調整される。

【０００４】従来の免疫測定法用試験片の製造方法によ
れば、得られる試験片による検出レベルの範囲は、数ｎ
ｇ／ｍｌ〜数千ｎｇ／ｍｌ程度になる場合が多い。した
がって、例えば、前記尿中アルブミン量の測定の場合等
では、検出限界を調整する必要が生じる場合がある。

【０００５】検出限界の調整は、例えば、試験片の固定
相に固定化する特異的結合物質量または標識複合体量を
下げること等により行なわれる。しかしながら、この場
合、検出限界を変えることはできても、全般に発色が弱
くなり、被検物質が高濃度の場合に見られるプロゾーン
現象がより低い被検物質濃度で生じるという欠点があ
り。さらに、測定可能な被検物質濃度の範囲がせまくな
るという欠点がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、検出レベル
の調整手段を備え、被検物質を迅速、簡便に、かつ良好
に検出しうる、免疫クロマトグラフ法に基づく免疫測定
法用試験片を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、吸水性基材に、下記（ｉ）、（ii）及び(iii) ： （ｉ）被検液を滴下するための被検液受領部、（ii）標
識物質と、前記被検物質に特異的に結合しうる第１特異
的結合物質とを含有した標識複合体を、水との接触によ
って吸水性基材から脱離するように保持した標識相、(i
ii) 被検物質に特異的に結合しうる第２特異的結合物質
を固定化した固定相、が順に配置された試験片であっ
て、かつ該被検液受領部から該標識相の範囲の領域上
に、（iv）被検物質に特異的に結合しうる第３特異的結
合物質を、水との接触によって吸水性基材から脱離する
ように保持させた調整相、が配置され、かつ該（ｉ）〜
（iv）が、同一またはそれぞれ異なる吸水性基材からな
る免疫測定法用試験片に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の免疫測定法用試験片は、
固定相の上流に、検出レベルの調整手段（調整相とい
う）を有する試験片、具体的には、吸水性基材に、下記
（ｉ）、（ii）及び(iii) ： （ｉ）被検液受領部、（ii）標識相、(iii) 固定相、が
順に配置された試験片であって、かつ該被検液受領部か
ら該標識相の範囲の領域上に、（iv）調整相、が配置さ
れ、かつ該（ｉ）〜（iv）が、同一またはそれぞれ異な
る吸水性基材からなる試験片である。

【０００９】本発明の試験片は、かかる調整相を有する
ため、使用時に特別な操作（例えば、被検液の段階的希
釈液の作製など）をすることなく、固定相において捕捉
される被検物質量が、所望の検出限界および検出レベル
に調整され、かつ検出の際、良好な発色を得ることがで
きる。

【００１０】なお、調整相とは、後述のように、被検物
質に特異的に結合しうる第３特異的結合物質を、水との
接触によって吸水性基材から脱離しうるように保持させ
た領域をいう。これにより、後述の固定相に捕捉される
被検物質の量を調整することができる。

【００１１】なお、本明細書において、「上流」とは、
被検液受領部に近い一端側を意味する。

【００１２】また、本明細書において、「検出限界」と
は、検出できる最小の被検物質量を意味する。

【００１３】本明細書において、被検液とは、被検試料
を含有した溶液をいう。前記被検試料としては、例え
ば、食品；個体（ヒトを含む動物など）から得られた固
体試料；血液、血清、血漿、尿、便溶液、唾液などの液
体試料などが挙げられる。前記被検液は、前記固体試料
を適切な溶媒（例えば、緩衝液、生理的食塩水等）に溶
解または希釈して得られた溶液であってもよく、前記液
体試料を前記溶媒（例えば、緩衝液、生理的食塩水等）
により希釈して得られた溶液であってもよい。緩衝液と
しては、例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液等が挙げられる。かかる緩衝液のｐＨ
および濃度は、被検試料および被検物質の性質等に応じ
て適宜選択されうる。

【００１４】本発明の試験片により検出されうる被検物
質は、例えば、通常の免疫反応により検出可能な物質で
あればよく、タンパク質、ウイルス抗原、細菌、環境ホ
ルモン等の抗原；抗体等が挙げられる。タンパク質とし
ては、例えば、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリ
ン、ヒトヘモグロビン、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク
質）、ＦＤＰ、Ｄダイマー等が挙げられる。ウイルス抗
原としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原、
ロタウイルス抗原、アデノウイルス抗原等が挙げられ
る。細菌としては、例えば、大腸菌Ｏ１５７、サルモネ
ラ菌、黄色ブドウ球菌等が挙げられる。環境ホルモンと
しては、ダイオキシン、ＤＤＴ、ヘキサクロロベンゼ
ン、ビスフェノールＡ等が挙げられる。抗体としては、
抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢｅ抗
体等が挙げられる。

【００１５】前記第１特異的結合物質、第２特異的結合
物質及び第３特異的結合物質は、被検物質に特異的に結
合しうる物質であればよい。なお、第１特異的結合物質
とは、標識複合体に保持された特異的結合物質をいい、
第２特異的結合物質とは、固定相に固定化された特異的
結合物質をいい、第３特異的結合物質とは、調整相に水
との接触により吸水性基材から脱離可能に保持された特
異的結合物質をいう。

【００１６】被検物質が抗原である場合、特異的結合物
質として、被検物質に特異的に結合しうる抗体を用いる
ことができる。かかる抗体としては、通常の免疫測定法
に用いられる公知の抗体を適宜選択する。また、かかる
抗体は、慣用の方法により作製することができる。特異
的結合物質が抗体である場合、第１特異的結合物質、第
２特異的結合物質および第３特異的結合物質として、同
一の抗体を用いてもよく、被検物質に存在するそれぞれ
異なる抗原決定基を認識する２種以上の抗体を用いても
よい。前記抗体としては、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等由来
のポリクローナル抗体、マウス、ラット由来のモノクロ
ーナル抗体を使用することができる。また、Ｈ鎖、Ｌ
鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂ 等の断片化された抗体であ
ってもよい。

【００１７】また、被検物質が抗体である場合、特異的
結合物質として、被検物質に特異的に結合する抗原を用
いてもよく、被検物質に特異的に結合する抗原決定基を
有する物質を用いてもよい。

【００１８】本発明においては、調整相における第３特
異的結合物質の量は、目的とする検出限界に応じて、適
宜設定することができる。例えば、第３特異的結合物質
量を多くすると検出限界を高くすることができる。

【００１９】また、検出レベルは、例えば、調整相にお
ける第３特異的結合物質と、第２特異的結合物質と第３
特異的結合物質との存在量比を変えることにより、適宜
設定することができる。

【００２０】前記調整相は、該被検液受領部から該標識
相の範囲の領域上に配置される。調整相は、具体的に
は、例えば、下記〜： 被検液受領部に、第３特異的結合物質を水との接触に
よって脱離し得る形態で、第３特異的結合物質を保持さ
せること、 標識相と調整相とが同一の箇所となるように、標識複
合体と共に水との接触によって脱離し得る形態で第３特
異的結合物質を保持させること、および 被検液受領部より下流であって、かつ標識相よりも上
流の領域上に第３特異的結合物質を水との接触によって
脱離し得る形態で、第３特異的結合物質を保持させるこ
とにより作製されうる。前記は、第３特異的結合物質
と被検物質との反応時間を十分に確保したい場合（例え
ば、第３特異的結合物質の反応性が低い場合、検出感度
を大幅に下げたい場合）に有利である。前記は、標識
相と調整相を同時に作製できるので、製造上有利であ
る。前記は、第３特異的結合物質と被検物質の混合・
反応を十分に行なうことができ、第３特異的結合物質と
被検物質との反応を先行して行なうことができるので、
検出レベルを下げる効果が得られうることが期待でき
る。

【００２１】調整相の作製方法としては、例えば、水溶
性重合体もしくは及び糖類溶液中に第３特異的結合物質
を分散させ、該分散液を吸水性基材上に塗布して乾操さ
せる方法が挙げられる。前記水溶性重合体としては、例
えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、
セルロースエステル等が好適である。また、糖類として
は、例えば、サッカロース、ラフィノース、トレハロー
ス等が好適である。

【００２２】前記の場合、調整相の位置は、特に限定
されるものではない。

【００２３】前記の場合、調整相は、後述の標識相に
適した位置に配置される。この場合、水溶性重合体もし
くは糖類溶液中に第３特異的結合物質と後述の標識複合
体とを分散させ、該分散液を吸水性基材上に塗布して乾
操させる方法により、調整相を作製することができる。

【００２４】調整相の大きさは、被検液受領部から固定
相の範囲内であればよい。

【００２５】本発明に用いられる吸水性性基材として
は、被検液を吸収及び展開できるものであればよい。本
発明においては、前記吸水性基材は、迅速な測定が行な
え、かつ固定相での捕捉を十分に行なうことができる程
度の吸水性を呈する吸水性基材であればよく、吸水性基
材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断した吸水
性基材の片端部に水を浸漬し、１分間経過後の吸水距離
が０．５〜５ｃｍ程度のものが望ましい。

【００２６】好ましい具体例としては、適度な吸水速度
を有する観点から、例えば、ニトロセルロース多孔質
膜、ナイロン多孔質膜、ガラス繊維濾紙、不織布、濾紙
等が挙げられる。さらに本発明においては、吸水性基材
として、同一材料からなる基材を用いてもよいし、ある
いは異種の材料からなる基材を任意の接着手段によって
連結して得られた連続した基材を用いることもできる。
具体的には、後述の調整相、被検液受領部、標識相およ
び固定相のそれぞれ同一基材上に配置させてもよく、異
なる基材に設け、連結してもよい。

【００２７】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、吸水性基材の表面に親水性重合体、タンパク質
（例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン等）、スキム
ミルク、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０等）を
被覆することもでき、基材に親水性重合体（例えば、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロ
ース等）、タンパク質、界面活性剤を含浸させることも
できる。

【００２８】吸水性基材の形状は、前記被検液等の液体
を展開できる形状であればよく、例えば、矩形のシート
状やロッド状等が好ましい。

【００２９】被検液受領部は、被検液を滴下するための
部位である。かかる被検液受領部は、試験片の上流側末
端側にあることが望ましい。また、被検液受領部の大き
さは、検出に必要な被検液量を含浸できる大きさが望ま
しい。従って、被検液受領部には不織布やガラス繊維濾
紙等を用い、これを吸水性基材と連結することが望まし
い。

【００３０】標識相は、吸水性基材の一端の被検液受領
部と固定相との間に設けられた、標識複合体を、水との
接触によって吸水性基材から脱離するように保持した部
位である。

【００３１】標識相の作製方法としては、例えば、水溶
性重合体及び／又は糖類溶液中に標識複合体を分散さ
せ、該分散液を吸水性基材上に塗布して乾操させる方法
が挙げられる。前記水溶性重合体としては、例えば、ポ
リビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロー
スエステル等が好適である。また、糖類としては、例え
ば、サッカロース、ラフィノース、トレハロース等が好
適である。また、必要に応じて界面活性剤を添加、混合
してから塗布、乾燥してもよい。

【００３２】標識相は、前記調整相、前記被検液受領部
および後述の固定相と同一基材上に配置させてもよく、
異なる基材に設け、それぞれ前記した順になるように連
結してもよい。標識相に用いる基材としては、前記吸水
性基材が挙げられる。

【００３３】前記標識複合体としては、標識物質と、前
記被検物質に特異的に結合しうる第１特異的結合物質と
を含有した複合体が挙げられる。

【００３４】前記標識物質としては、免疫測定分野で用
いられる公知の物質、例えば、着色粒子、酵素、蛍光物
質等が挙げられるが、測定操作、検出の簡便性から着色
粒子が特に好ましい。

【００３５】着色粒子としては、肉眼で色が検出可能な
ものであればよく、例えば、金コロイド粒子等の金属コ
ロイド粒子；スダンブルー、スダンレッドIV、スダンII
I 、オイルオレンジ、キニザリングリーン等に代表され
る染料、顔料等でラテックス粒子を着色した着色ラテッ
クス粒子等が挙げられる。前記着色粒子の平均粒子径
は、発色の良好性の観点から、約０．０１μｍ以上、好
ましくは０．０５μｍ以上であり、着色粒子の僅かな凝
集に起因する吸水性基材の目詰まりを防ぐ観点から、約
３μｍ以下、好ましくは、約０．５μｍ以下であること
が望ましい。具体的には、約０．０１〜３μｍ、好まし
くは、約０．０５〜０．５μｍの範囲であることが望ま
しい。

【００３６】酵素としては、例えば、ペルオキシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステ
ラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられる。よ
り高感度で安定な検出を達成することが可能なペルオキ
シダーゼまたはアルカリホスファターゼが好ましい。

【００３７】また、蛍光物質としては、例えば、フルオ
レセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン
イソチオシアネート、フルオレセイン、ローダミン等が
挙げられる。

【００３８】さらに、本発明においては、前記標識複合
体は、水分散型高分子粒子等を担体とし、該担体に、標
識物質（前記酵素または蛍光物質）と第１特異的結合物
質とを固定化された複合体であってもよい。

【００３９】前記水分散型高分子粒子としては、例え
ば、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリ
ロニトリル−ブタジエン共重合体等の種々のスチレン共
重合体からなるエマルジョン等のスチレンまたはその誘
導体を単量体成分とする単独重合体や共重合体のエマル
ジョン；（メタ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルま
たはその誘導体を単量体成分とする単独重合体、該単量
体成分と（メタ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル
酸エチル、グリシジル（メタ）アクリレート等との共重
合体；前記したスチレンまたはその誘導体と、（メタ）
アクリレートエステルやその誘導体との共重合体；ゴ
ム、ナイロン、ポリウレタン、微結晶質セルロース等が
挙げられる。

【００４０】前記標識複合体は、慣用方法により、第１
特異的結合物質と標識物質とを結合させること、または
第１特異的結合物質および標識物質と担体とを結合させ
ることにより作製されうる。

【００４１】前記標識複合体における第１特異的結合物
質量は、乾燥重量として、検出感度の観点から、担体の
乾燥重量１ｇ当たり０．１ｍｇ以上、好ましくは０．５
ｍｇ以上であり、担体表面積や経済性の観点から、２０
０ｍｇ以下、好ましくは１００ｍｇ以下であることが望
ましい。

【００４２】また、着色粒子のかわりに前記担体と標識
物質とを用いる場合、具体的には、例えば、標識物質に
酵素を用いる場合、前記標識複合体における標識物質量
は、乾燥重量として、検出の迅速性や感度、再現性の観
点から、１ｍｇ以上、好ましくは１０ｍｇ以上であり、
担体の表面積およびバックグラウンド発色の観点から、
１００ｍｇ以下、好ましくは５０ｍｇ以下であることが
望ましい。例えば、標識物質に蛍光物質を用いる場合、
担体１個（１分子）当たり、蛍光物質の分子を５，００
０〜１，０００，０００、好ましくは５０，０００〜５
００，０００の分子（数）を固定する。

【００４３】前記標識相の位置は、調整相と固定相との
間の範囲内であればよい。

【００４４】固定相は、ベロ毒素１型のＢサブユニット
またはベロ毒素２型のＢサブユニットに特異的に結合し
うる第２特異的結合物質を固定化した領域である。

【００４５】本発明において、第２特異的結合物質を吸
水性基材上に固定化する方法（固定相の作製方法）とし
ては、公知の物理的吸着法及び共有結合法が挙げられ
る。例えば、吸水性基材がニトロセルロースフィルター
である場合、第２特異的結合物質の水溶液を塗布して乾
燥するだけで固定化することができる。吸水性基材がガ
ラス繊維濾紙の場合は、特異的結合物質とポリビニルア
ルコールとの混合溶液を該吸水性基材に塗布した後、得
られた基材をアルコールに浸漬して乾燥することにより
強固に固定化することができる。

【００４６】固定相における第２特異的結合物質の固定
化量は、第２特異的結合物質の検出感度の観点から、
０．００５ｍｇ／ｃｍ² 以上、好ましくは０．０１ｍｇ
／ｃｍ ² 以上であり、経済性の観点から、１０ｍｇ／ｃ
ｍ² 以下、好ましくは５ｍｇ／ｃｍ² 以下であることが
望ましい。

【００４７】固定相の大きさは、〔ベロ毒素−第１特異
的結合物質（標識複合体）〕からなる複合体を捕捉でき
るものであればよく、０．１〜５ｍｍ、好ましくは０．
５〜２ｍｍの幅であることが望ましい。

【００４８】本発明の試験片の具体例としては、例え
ば、図１および図３に対応する試験片が挙げられる。図
１に対応する試験片は、被検液受領部１を配置した吸水
性基材と、調整相２と標識相３とを配置した吸水性基材
と、固定相４を配置した吸水性基材と、吸水性パッド５
とが、順に、それぞれの端部が１ｍｍずつ重なるよう
に、片面に粘着剤が付いたプラスチック板６に貼付する
ことにより連結された試験片である。また、図３に対応
する試験片は、被検液受領部１と調整相２とを配置した
吸水性基材と、標識相３と固定相４とを配置した吸水性
基材と、吸水性パッド５とが、順に、それぞれの端部が
１ｍｍずつ重なるように、片面に粘着剤が付いたプラス
チック板６に貼付することにより連結された試験片であ
る。さらに、本発明の試験片には、同一の吸水性基材上
に、被検液受領部１と調整相２と標識相３と固定相４と
が順に配置された試験片、および被検液受領部１と標識
相３と固定相４とが順に配置され、かつ該標識相３が調
整相２を包含するものである試験片も含まれる。

【００４９】本発明の試験片を用いた免疫測定法の一例
を図１を参照して説明する。まず、試験片の一端の被検
液受領部１に、被検液を滴下する。ついで、被検液は、
吸水性基材中を展開、移動して、調整相２および標識相
３に到達する。調整相２および標識相３においては、被
検液が、標識複合体と第３特異的結合物質とを吸水性基
材から脱離させる。被検液中に被検物質が存在する場
合、第３特異的結合物質と標識複合体とは、競合的に被
検物質に特異的に結合し、〔第３特異的結合物質−被検
物質〕または〔標識複合体−被検物質〕からなる複合体
を形成する。ついで、吸水性基材中の被検液の移動と共
に、前記複合体は、固定相４に到達し、〔第３特異的結
合物質−被検物質〕複合体、〔標識複合体−被検物質〕
複合体は、固定相４に固定化された第２特異的結合物質
に競合的に捕捉される。この後、標識物質として酵素を
用いている場合は、該酵素の基質又は該基質と発色剤の
溶液とを試験片に滴下し、展開させる。これにより、固
定相４上に捕捉された着色粒子の色、酵素反応により生
じる発色または蛍光の有無または強度を、肉眼観察又は
光学的に測定することにより、被検液中に検出限界以上
の被検物質の有無を知ることができる。

【００５０】

【実施例】実施例１ （１）標識複合体の作製 スチレン／アクリル酸共重合体ラテックス粒子にスダン
ブルーで着色した着色粒子（平均粒径約０．２μｍ、粒
子表面カルボキシル基量５μｍｏｌ／ｍ² ）を１０ｍＭ
−ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）に固形分濃度５重量％と
なるように分散し、ラテックス粒子分散液を得た。前記
分散液３ｍｌに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２ｍｇ／ｍ
ｌ）１ｍｌと、抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体
（日本バイオテスト研究所製）の１０ｍＭ−ホウ酸緩衝
液（ｐＨ７．５）溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌとを添加
し、１０℃で５時間反応させた。得られた反応物を、１
０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて遠心洗浄
し、固形分濃度５重量％になるように再分散させ、抗ヒ
トヘモグロビン抗体を固定化した着色粒子含有液（標識
複合体含有液）を得た。

【００５１】（２）標識相及び調整相の作製 前記（１）で得られた標識複合体含有液（５重量％）
０．５μ１とサッカロース水溶液（１０重量％）１５μ
１と、抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体（日本バ
イオテスト研究所製）の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）溶液（１６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、０ｍｇ
／ｍｌ）０．５μｌ〔第３特異的結合物質〕とを混合し
て得られた混合物をレーヨン不織布（５×１０ｍｍ）に
不織布のほぼ全体が塗布液で含浸されるようにして塗布
した。ついで、３７℃で１２時間乾燥させて、標識相及
び調整相を配置した吸収性基材を得た。なお、検出可能
な範囲は、ヒトヘモグロビン濃度２００〜２００，００
ｎｇ／ｍｌの範囲で陽性と判定されるように設定した。

【００５２】（３）固定相の作製 抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体（日本バイオテ
スト研究所製）の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を、ニトロセルロース膜（ワ
ットマン製、孔径３μｍ、支持体付き、５×２０ｍｍ）
の一端から１０ｍｍの部位にライン状に１μｌ塗布し
た。この膜を３７℃で３時間乾燥した後、１重量％ウシ
血清アルブミン及び０．１重量％ツイーン２０の水溶液
に１０分間浸漬した。ついで、３７℃で３時間乾燥させ
て、固定相を配置した吸水性基材を得た。

【００５３】（４）試験片の作製 被検液受領部としてのレーヨン不織布（５×２０ｍｍ）
と、（２）で得られた吸水性基材（標識相及び調整相を
設けた不織布）と、（３）で得られた吸水性基材（固定
相を設けたニトロセルロース膜）と、吸水パッドとして
のガラス繊維濾紙（ワットマン製、ＧＦ／Ｂ、５×２０
ｍｍ）とを、順に、図１に示すように、それぞれの端部
が１ｍｍづつ重なるように連結し、粘着剤付のプラスチ
ック板に貼付してヒトヘモグロビン検出用試験片を得
た。

【００５４】比較例１ （１）固定相の作製 抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体（日本バイオテ
スト研究所製）の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／
ｍｌ）を、ニトロセルロース膜（ワットマン製、孔径３
μｍ、支持体付き、５×２０ｍｍ）の一端から１０ｍｍ
の部位にライン状に１μｌ塗布した。この膜を３７℃で
３時間乾燥した後、１重量％ウシ血清アルブミン及び
０．１重量％ツイーン２０の水溶液に１０分間浸漬し
た。ついで、３７℃で３時間乾燥させて、固定相を配置
した吸収性基材を得た。

【００５５】（２）標識相の作製 実施例１の（１）と同様にして作製した標識複合体含有
液（５重量％）０．５μ１と、サッカロース水溶液（１
０重量％）１５μ１とを混合して、得られた混合物をレ
ーヨン不織布（５×１０ｍｍ）に塗布した。ついで、３
７℃にて１２時間乾燥させ、標識相を配置した吸収性基
材を得た。

【００５６】（３）試験片の作製 被検液滴下部としてのレーヨン不織布（５×２０ｍｍ）
と、前記（２）で得られた標識相を配置した吸収性基材
と、前記（１）で得られた固定相を配置した吸収性基材
と、吸水パッドとしてのガラス繊維濾紙（ワットマン
製、ＧＦ／Ｂ、５×２０ｍｍ）とを、順に、図２に示す
ように、それぞれの端部が１ｍｍづつ重なるように連結
し、粘着剤付のプラスチック板に貼付してヒトヘモグロ
ビン検出用試験片を得た。

【００５７】試験例１ ヒトヘモグロビンの検出 表１に示す各濃度となるように、ヒトヘモグロビンを生
理食塩水に溶解させ、被検液１００μｌを得た。得られ
た被検液を、実施例１の試験片および比較例１の試験片
の被検液受領部１に滴下して展開した。１０分後、固定
相４における発色を目視で観察した。結果を表１および
２に示す。なお、表１および２における判断基準は、以
下の通りである。 ＋ ：強い発色が見られる ＋ｗ：弱い発色が見られる − ：発色が見られない

【００５８】

【表１】

【００５９】

【表２】

【００６０】表２に示すように、調整相を持たない比較
例１の試験片を用いた場合、検出限界の設定はできる
が、固定相４における抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇ
Ｇ抗体濃度が低くなる程、全般に発色が弱くなり、検出
できる最大ヒトヘモグロビン量が低くなることがわか
る。

【００６１】一方、表１に示すように、調整相２を有す
る実施例１の試験片を用いた場合、調整相２に保持させ
る抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体（第３特異的
結合物質）量を高くすることにより、ヒトヘモグロビン
の検出レベルを設定することができ、検出の際、被検物
質を良好に検出できることがわかる。

【００６２】実施例２ （１）固定相の作製 抗ヒトトランスフェリン・ウサギＩｇＧ抗体（ダコ製）
の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液（２ｍｇ
／ｍｌ）を、ニトロセルロース膜（ワットマン製、孔径
３μｍ、支持体付き、５×３５ｍｍ）の一端から１０ｍ
ｍの部位にライン状に１μｌ塗布した。この膜を３７℃
で３時間乾燥した後、０．５重量％スキムミルク及び
０．１重量％ツイーン２０の水溶液に１０分間浸漬し、
３７℃で３時間乾燥させ、固定相を配置した吸水性基材
を得た。

【００６３】（２）標識複合体の作製 実施例１の（１）に記載のラテックス粒子分散液３ｍｌ
に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌと
抗ヒトトランスフェリン・ウサギＩｇＧ抗体（ダコ製）
の１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）溶液（４ｍｇ
／ｍｌ）２ｍｌとを添加し、１０℃で５時間反応させ
た。得られた反応物を、１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ
７．５）溶液により遠心洗浄し、固形分濃度５重量％に
なるように再分散させ、抗ヒトトランスフェリン抗体を
固定化した標識複合体含有液を得た。

【００６４】（３）標識相の作製 前記（２）で得られた標識複合体含有液（５重量％）
０．５μ１とサッカロース水溶液（１０重量％）５μ１
とを混合して得られた混合物を、前記（２）で得られた
固定相を配置した吸水性基材の固定相に近い側の端部か
ら２５ｍｍの部位に塗布した。得られた膜を３７℃で１
２時間乾燥させ、固定相と標識相とを配置した吸水性基
材を得た。

【００６５】（４）調整相及び被検液受領部の作製 抗ヒトトランスフェリン・ウサギＩｇＧ抗体（ダコ製）
の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液（６ｍｇ
／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、０ｍｇ／ｍｌ）２μｌとサッカ
ロース水溶液（２０重量％）２μ１とを混合して得られ
た液をレーヨン不織布（５×１０ｍｍ）の一端付近に塗
布した。ついで、３７℃で１２時間乾燥させ、調整相と
被検液受領部とを配置した吸水性基材を得た。

【００６６】（５）試験片の作製 前記（４）で得られた調整相と被検液受領部とを配置し
た吸水性基材と、（３）で得られた固定相と標識相とを
配置した吸水性基材と吸水パッドとしてのガラス繊維濾
紙（ワットマン製、ＧＦ／Ｂ、５×２０ｍｍ）とを、順
に、図３に示すように、それぞれの端部が１ｍｍづつ重
なるように連結してヒトトランスフェリン検出用試験片
を得た。

【００６７】試験例２ ヒトトランスフェリンの検出 表３に示す各濃度となるように、ヒトトランスフェリン
を生理食塩水に溶解させ、被検液８０μｌを得た。得ら
れた被検液を前記（５）で得られた試験片の被検液受領
部１に滴下して展開した。１０分後、固定相４における
発色を目視で観察した。結果を表３に示す。なお、表３
における判断基準は、以下の通りである。 ＋ ：強い発色が見られる ＋ｗ：弱い発色が見られる − ：発色が見られない

【００６８】

【表３】

【００６９】表３に示すように、調整相２に保持させる
抗ヒトトランスフェリン・ウサギＩｇＧ抗体（第３特異
的結合物質）量を高くすることにより、ヒトトランスフ
ェリンの検出レベルの範囲を設定することができ、かつ
検出の際、被検物質を良好に検出できることがわかる。

【００７０】

【発明の効果】本発明の試験片によれば、調整相を有す
るため、使用時に特別な操作（例えば、被検液の段階的
希釈液の作製など）をすることなく、検出限界および検
出レベルの範囲が設定され、かつ検出の際、良好な発色
を得ることができるという優れた効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、調整相を有する試験片の各部材の貼付
け前の状態を示す概略図である。

【図２】図２は、調整相を持たない試験片の各部材の貼
付け前の状態を示す概略図である。

【図３】図３は、調整相を有する試験片の各部材の貼付
け前の状態を示す概略図である。

【符号の説明】

１ 被検液受領部 ２ 調整相 ３ 標識相 ４ 固定相 ５ 吸水パッド ６ 粘着剤付きプラスチック板

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松縄 彩子 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 吸水性基材に、下記（ｉ）、（ii）及び
   (iii) ： （ｉ）被検液を滴下するための被検液受領部、（ii）標
   識物質と、前記被検物質に特異的に結合しうる第１特異
   的結合物質とを含有した標識複合体を、水との接触によ
   って吸水性基材から脱離するように保持した標識相、(i
   ii) 被検物質に特異的に結合しうる第２特異的結合物質
   を固定化した固定相、が順に配置された試験片であっ
   て、かつ該被検液受領部から該標識相の範囲の領域上
   に、（iv）被検物質に特異的に結合しうる第３特異的結
   合物質を、水との接触によって吸水性基材から脱離する
   ように保持させた調整相、が配置され、かつ該（ｉ）〜
   （iv）が、同一または異なる吸水性基材からなる免疫測
   定法用試験片。
2. 【請求項２】 標識物質が着色粒子である、請求項１記
   載の免疫測定法用試験片。