JP2002328129A - 免疫測定法用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】検出レベルの調整手段を備え、被検物質を迅
速、簡便に、かつ良好に検出しうる、免疫クロマトグラ
フ法に基づく免疫測定法用試験片を提供すること。 【解決手段】吸水性基材に、下記（ｉ）、（ii）及び(i
ii) ： （ｉ）被検液を滴下するための被検液受領部、（ii）標
識物質と、前記被検物質に特異的に結合しうる第１特異
的結合物質とを含有した標識複合体を、水との接触によ
って吸水性基材から脱離するように保持した標識相、(i
ii) 被検物質に特異的に結合しうる第２特異的結合物質
を固定化した固定相、が順に配置された試験片であっ
て、かつ被検液受領部上の領域又は該被検液受領部と該
標識相との間（ただし、標識相は含まない）の領域に、
（iv）被検物質に特異的に結合しうる第３特異的結合物
質を固定化した調整相、が配置され、かつ該（ｉ）〜
（iv）が、同一又は異なる吸水性基材上に設けられてな
るものである、免疫測定法用試験片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検液中の被検物
質を迅速、簡便に、かつ良好に検出しうる免疫測定用試
験片に関する。より詳細には、固定相において検出され
る被検物質量の範囲（検出レベルともいう）を簡便に調
整することができる、免疫クロマトグラフ法に基づく免
疫測定法用試験片に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料について、迅速かつ簡便に検査
を行なうための免疫測定法用試薬として免疫クロマトグ
ラフ法に基づく試薬が挙げられる。かかる試薬として
は、例えば、吸水性基材上に、被検物質と特異的に結合
しうる特異的結合物質（例えば、抗体など）を固定化し
た固定相と、該被検物質に特異的に結合しうる標識複合
体（例えば、標識抗体など）を水との接触によって脱離
しうるように保持させた標識相とを有した試験片が挙げ
られる。かかる試験片を用いる免疫クロマトグラフ法に
おいては、標識相側の一端より被検液を滴下、展開させ
ると、該被検液に被検物質が存在する場合、試験片にお
いて、被検物質と標識複合体とが結合して、標識複合体
−被検物質からなる複合体が形成され、さらに展開が進
むと該複合体は固定相の特異的結合物質に捕捉される。
従って、前記固定相に捕捉された標識複合体に基づく発
色の有無又は該発色の強さを測定することにより、被検
液中の被検物質を検出することができる。

【０００３】前記した免疫クロマトグラフ法は、検出可
能な被検物質の量の範囲（検出レベル）を、測定目的に
適した範囲となるように調整することを必要とする。例
えば、生化学検査における尿中のアルブミン量の測定の
場合、２０μｇ／ｍｌ付近以上の濃度のヒトアルブミン
を検出できるように調整される。

【０００４】従来の製法によれば、得られる試験片によ
る検出レベルの範囲は、数ｎｇ／ｍｌ〜数千ｎｇ／ｍｌ
程度になる場合が多い。したがって、例えば、前記尿中
アルブミンの場合等では、検出限界を調整する必要が生
じる場合がある。

【０００５】検出限界の調整は、例えば、試験片の固定
相に固定化する特異的結合物質量又は標識複合体量を下
げること等が行なわれる。しかしながら、この場合、検
出限界を変えることはできても、全般に発色が弱くな
り、被検物質が高濃度の場合に見られるプロゾーン現象
がより低い被検物質濃度で生じ、さらに、測定可能な被
検物質濃度の範囲がせまくなるという欠点がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、検出レベル
の調整手段を備え、被検物質を迅速、簡便に、かつ良好
に検出しうる、免疫クロマトグラフ法に基づく免疫測定
法用試験片を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、吸水性基材に、下記（ｉ）、（ii）及び(iii) ： （ｉ）被検液を滴下するための被検液受領部、（ii）標
識物質と、前記被検物質に特異的に結合しうる第１特異
的結合物質とを含有した標識複合体を、水との接触によ
って吸水性基材から脱離するように保持した標識相、(i
ii) 被検物質に特異的に結合しうる第２特異的結合物質
を固定化した固定相、が順に配置された試験片であっ
て、かつ被検液受領部上の領域又は該被検液受領部と該
標識相との間（ただし、標識相は含まない）の領域に、
（iv）被検物質に特異的に結合しうる第３特異的結合物
質を固定化した調整相、が配置され、かつ該（ｉ）〜
（iv）が、同一又は異なる吸水性基材上に設けられてな
るものである、免疫測定法用試験片に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の免疫測定法用試験片は、
固定相の上流に、検出レベルの調整手段（調整相とい
う）を有する試験片、具体的には、吸水性基材に、下記
（ｉ）、（ii）及び(iii) ： （ｉ）被検液受領部、（ii）標識相、(iii) 固定相、が
順に配置された試験片であって、かつ被検液受領部上の
領域又は該被検液受領部と該標識相との間の領域に、
（iv）調整相、が配置され、かつ該（ｉ）〜（iv）が、
同一又は異なる吸水性基材上に設けられてなるものであ
る、試験片である。本発明の試験片は、かかる調整相を
有するため、使用時に特別な操作（例えば、被検液の段
階的希釈液の作製など）をする必要がなく、固定相にお
いて捕捉される被検物質量を調製することができ、検出
の際、良好な発色を得ることができる。

【０００９】なお、調整相とは、後述のように、被検物
質に特異的に結合しうる第３特異的結合物質を固定化し
た領域をいう。

【００１０】なお、本明細書において、「上流」とは、
被検液受領部に近い一端側を意味する。

【００１１】なお、本明細書において、「検出限界」と
は、検出できる最小の被検物質量を意味する。

【００１２】本明細書において、被検液とは、被検試料
を含有した溶液をいう。前記被検試料としては、例え
ば、食品；個体（ヒトを含む動物など）から得られた固
体試料；血液、血清、血漿、尿、便溶液、唾液などの液
体試料などが挙げられる。前記被検液は、前記固体試料
を適切な溶媒（例えば、緩衝液、生理的食塩水等）に溶
解又は希釈して得られた溶液であってもよく、前記液体
試料を前記溶媒（例えば、緩衝液、生理的食塩水等）に
より希釈して得られた溶液であってもよい。緩衝液とし
ては、例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液等が挙げられる。かかる緩衝液のｐＨ及
び濃度は、被検試料及び被検物質の性質等に応じて適宜
選択されうる。

【００１３】本発明の試験片により検出されうる被検物
質は、通常の免疫反応により検出可能な物質であればよ
く、例えば、タンパク質、ウイルス抗原、細菌、環境ホ
ルモン等の抗原；抗体等が挙げられる。タンパク質とし
ては、例えば、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリ
ン、ヒトヘモグロビン、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク
質）、ＦＤＰ、Ｄダイマー等が挙げられる。ウイルス抗
原としては、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原、
ロタウイルス抗原、アデノウイルス抗原等が挙げられ
る。細菌としては、例えば、大腸菌Ｏ１５７、サルモネ
ラ菌、黄色ブドウ球菌等が挙げられる。環境ホルモンと
しては、ダイオキシン、ＤＤＴ、ヘキサクロロベンゼ
ン、ビスフェノールＡ等が挙げられる。抗体としては、
抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢｅ抗
体等が挙げられる。

【００１４】前記第１特異的結合物質、第２特異的結合
物質及び第３特異的結合物質は、被検物質に特異的に結
合しうる物質であればよい。なお、第１特異的結合物質
とは、標識複合体に保持された特異的結合物質をいい、
第２特異的結合物質とは、固定相に固定化された特異的
結合物質をいい、第３特異的結合物質とは、調整相に固
定化された特異的結合物質をいう。

【００１５】被検物質が抗原である場合、特異的結合物
質として、被検物質に特異的に結合しうる抗体を用いる
ことができる。かかる抗体としては、通常の免疫測定法
に用いられる公知の抗体を適宜選択する。特異的結合物
質が抗体である場合、第１特異的結合物質、第２特異的
結合物質及び第３特異的結合物質として、同一の抗体を
用いてもよく、被検物質に存在するそれぞれ異なる抗原
決定基を認識する２種以上の抗体を用いてもよい。前記
抗体としては、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等由来のポリクロ
ーナル抗体、マウス、ラット由来のモノクローナル抗体
を使用することができる。また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、
Ｆ（ａｂ’）₂ 等の断片化された抗体であってもよい。

【００１６】また、被検物質が抗体である場合、特異的
結合物質として、被検物質に特異的に結合する抗原を用
いてもよく、被検物質に特異的に結合する抗原決定基を
有する物質を用いてもよい。

【００１７】前記調整相は、被検液受領部上の領域又は
該被検液受領部と該標識相との間の領域に配置される。
本発明においては、第３特異的結合物質を吸水性基材上
に固定化する方法（調整相の作製方法）としては、公知
の物理的吸着法及び共有結合法が挙げられる。例えば、
吸水性基材がニトロセルロースフィルターである場合、
第２特異的結合物質の水溶液を塗布して乾燥するだけで
固定化することができる。吸水性基材がガラス繊維濾紙
の場合は、特異的結合物質とポリビニルアルコールの混
合溶液を塗布した後、アルコールに浸漬して乾燥するこ
とにより強固に固定化することができる。

【００１８】調整相の大きさは、被検液受領部から標識
相までの領域内であれば特に制限はない。

【００１９】本発明に用いられる吸水性基材としては、
被検液を吸収及び展開できるものであればよい。本発明
においては、前記吸水性基材は、迅速な測定が行なえ、
かつ固定相での捕捉を十分に行なうことができる程度の
吸水性を呈する吸水性基材であればよく、吸水性基材の
吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断した吸水性基
材の片端部に水を浸漬し、１分間経過後の吸水距離が
０．５〜５ｃｍ程度のものが望ましい。

【００２０】好ましい具体例としては、適度な吸水速度
を有する観点から、例えば、ニトロセルロース多孔質
膜、ナイロン多孔質膜、ガラス繊維濾紙、不織布、濾紙
等が挙げられる。さらに本発明においては、吸水性基材
として、同一材料からなる基材を用いてもよいし、ある
いは異種の材料からなる基材を任意の接着手段によって
連結して得られた連続した基材を用いることもできる。
具体的には、後述の調整相、被検液受領部、標識相及び
固定相をそれぞれ同一基材上に配置させてもよく、異な
る基材に設け、連結してもよい。

【００２１】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、吸水性基材の表面に親水性重合体、タンパク質
（例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン等）、スキム
ミルク、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０等）を
被覆することもでき、基材に親水性重合体（例えば、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロ
ース等）、タンパク質、界面活性剤を含浸させることも
できる。

【００２２】吸水性基材の形状は、前記被検液等の液体
を展開できる形状であればよく、例えば、矩形のシート
状やロッド状等が好ましい。

【００２３】被検液受領部は、被検液を滴下するための
部位である。かかる被検液受領部は、試験片の上流側末
端に配置されることが好ましい。

【００２４】標識相は、吸水性基材の一端の被検液受領
部と固定相との間に設けられた、標識複合体を、水との
接触によって吸水性基材から脱離するように保持した部
位である。

【００２５】標識相の作製方法としては、例えば、水溶
性重合体および／または糖類溶液中に標識複合体を分散
させ、該分散液を吸水性基材上に塗布して乾操させる方
法が挙げられる。前記水溶性重合体としては、例えば、
ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロ
ースエステル等が好適である。また、糖類としては、例
えば、サッカロース、ラフィノース、トレハロース等が
好適である。また、必要に応じて上記にさらに界面活性
剤を添加、混合してから塗布、乾燥してもよい。

【００２６】標識相は、前記調整相、前記被検液受領部
及び後述の固定相と同一基材上に配置させてもよく、異
なる基材に設け、連結してもよい。標識相に用いる基材
としては、前記吸水性基材が挙げられる。

【００２７】前記標識複合体としては、標識物質と、前
記被検物質に特異的に結合しうる第１特異的結合物質と
を含有した複合体が挙げられる。

【００２８】前記標識物質としては、免疫測定分野で用
いられる公知の物質、例えば、着色粒子、酵素、蛍光物
質等が挙げられるが、測定操作、検出の簡便性から着色
粒子が特に好ましい。

【００２９】着色粒子としては、肉眼で色が検出可能な
ものであればよく、例えば、金コロイド粒子等の金属コ
ロイド粒子；スダンブルー、スダンレッドIV、スダンII
I 、オイルオレンジ、キニザリングリーン等に代表され
る染料、顔料等でラテックス粒子を着色した着色ラテッ
クス粒子等が挙げられる。前記着色粒子の平均粒子径
は、発色の良好性の観点から、約０．０１μｍ以上、好
ましくは０．０５μｍ以上であり、着色粒子の僅かな凝
集に起因する吸水性基材の目詰まりを防ぐ観点から、約
３μｍ以下、好ましくは、約０．５μｍ以下であること
が望ましい。具体的には、約０．０１〜３μｍ、好まし
くは、約０．０５〜０．５μｍの範囲であることが望ま
しい。

【００３０】酵素としては、例えば、ペルオキシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステ
ラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられる。よ
り高感度で安定な検出を達成することが可能なペルオキ
シダーゼ又はアルカリホスファターゼが好ましい。

【００３１】また、蛍光物質としては、例えば、フルオ
レセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン
イソチオシアネート、フルオレセイン、ローダミン等が
挙げられる。

【００３２】さらに、本発明においては、前記標識複合
体は、水分散型高分子粒子等を担体とし、該担体に、標
識物質（前記酵素又は蛍光物質）と第１特異的結合物質
とが固定化された複合体であってもよい。

【００３３】前記水分散型高分子粒子としては、例え
ば、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アクリ
ロニトリル−ブタジエン共重合体等の種々のスチレン共
重合体からなるエマルジョン等のスチレン又はその誘導
体を単量体成分とする単独重合体や共重合体のエマルジ
ョン；（メタ）アクリル酸の長鎖アルキルエステル又は
その誘導体を単量体成分とする単独重合体、該単量体成
分と（メタ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エ
チル、グリシジル（メタ）アクリレート等との共重合
体；前記したスチレン又はその誘導体と、（メタ）アク
リレートエステルやその誘導体との共重合体；ゴム、ナ
イロン、ポリウレタン、微結晶質セルロース等が挙げら
れる。

【００３４】前記標識複合体は、慣用方法により、第１
特異的結合物質と標識物質とを結合させること、又は第
１特異的結合物質及び標識物質と担体とを結合させるこ
とにより作製されうる。

【００３５】前記標識複合体における第１特異的結合物
質量は、乾燥重量として、検出感度の観点から、担体の
乾燥重量１ｇ当たり０．１ｍｇ以上、好ましくは０．５
ｍｇ以上であり、担体表面積や経済性の観点から、２０
０ｍｇ以下、好ましくは１００ｍｇ以下であることが望
ましい。

【００３６】また、着色粒子のかわりに前記担体と標識
物質とを用いる場合、前記標識複合体における標識物質
量は、具体的には、例えば、標識物質に酵素を用いる場
合には、乾燥重量として、検出の迅速性や感度、再現性
の観点から、１ｍｇ以上、好ましくは１０ｍｇ以上であ
り、担体の表面積およびバックグラウンド発色の観点か
ら、１００ｍｇ以下、好ましくは５０ｍｇ以下であるこ
とが望ましい。例えば、標識物質に蛍光物質を用いる場
合には、担体１個（１分子）当たり、蛍光物質の分子を
５，０００〜１，０００，０００、好ましくは５０，０
００〜５００，０００の分子（数）を固定することが望
ましい。

【００３７】また、標識相の大きさは、調整相と固定相
の間の範囲内であればよい。

【００３８】固定相は、被検物質に特異的に結合しうる
第２特異的結合物質を固定化した領域である。

【００３９】本発明において、第２特異的結合物質を吸
水性基材上に固定化する方法（固定相の作製方法）とし
ては、前記（調整相）の作製方法と同様の公知の物理的
吸着法及び共有結合法が挙げられる。

【００４０】固定相における第２特異的結合物質の固定
化量は、第２特異的結合物質の検出感度の観点から、
０．００５ｍｇ／ｃｍ² 以上、好ましくは０．０１ｍｇ
／ｃｍ ² 以上であり、経済性の観点から、１０ｍｇ／ｃ
ｍ² 以下、好ましくは５ｍｇ／ｃｍ² 以下であることが
望ましい。

【００４１】固定相の大きさは、〔被検物質−第１特異
的結合物質（標識複合体）〕を捕捉できるものであれば
よく、０．２〜１０ｍｍ、好ましくは０．５〜２ｍｍの
幅であることが望ましい。

【００４２】本発明の試験片の具体例としては、例え
ば、図１および図３に記載の試験片が挙げられる。図１
の試験片は、被検液受領部１と調整相３とを配置した吸
水性基材と、標識相２を配置した吸水性基材と、固定相
４を配置した吸水性基材と、吸水性パッド５とが、順
に、それぞれの端部が１ｍｍずつ重なるように連結され
た試験片である。また、図３の試験片は、被検液受領部
１を配置した吸水性基材と、調整相３と標識相２と固定
相４とを配置した吸水性基材と、吸水性パッド５とが、
順に、それぞれの端部が１ｍｍずつ重なるように連結さ
れた試験片である。さらに、本発明の試験片には、同一
の吸水性基材上に、被検液受領部１と調整相３と標識相
２と固定相４とが順に配置された試験片も含まれる。

【００４３】本発明の試験片を用いた免疫測定法の一例
を図１を参照して説明する。まず、試験片の一端の被検
液受領部１に、被検液を滴下する。ついで、被検液は、
吸水性基材中を展開移動して、調整相３に到達する。被
検液中に被検物質が存在する場合、調整相３において、
一定量（設定した検出限界に基づく量）の被検物質が第
３特異的結合物質に捕捉される。第３特異的結合物質に
捕捉されなかった被検物質（検出限界以上の量の被検物
質）は、標識相２に移動する。標識相２においては、被
検液が標識複合体を吸水性基材から脱離させる。ここ
で、標識複合体は被検物質に特異的に結合し、〔標識複
合体−被検物質〕からなる複合体を形成する。ついで、
吸水性基材中の被検液の移動と共に、前記複合体は、固
定相４に到達し、固定相４に固定化された第２特異的結
合物質に捕捉される。この後、標識物質として酵素を用
いている場合は、基質又は基質と発色剤の溶液を試験片
に滴下し、展開させる。これにより、固定相上に捕捉さ
れた着色粒子の色、酵素反応により生じる発色又は蛍光
の有無又は強度を、肉眼観察又は光学的に測定すること
により被検液中の被検物質の有無又は量を知ることがで
きる。

【００４４】本発明の免疫測定法によれば、調整相３に
おける第３特異的結合物質と、固定相４における第２特
異的結合物質との存在量比を変えることによって、検出
レベルを適宜設定することができ、被検物質を良好に検
出することが可能となる。

【００４５】

【実施例】実施例１ （１）標識複合体の作製 スチレン／アクリル酸共重合体ラテックス粒子にスダン
ブルーで着色した着色粒子（平均粒径約０．２μｍ、粒
子表面カルボキシル基量５μｍｏｌ／ｍ² ）を、１０ｍ
Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）に固形分濃度５重量％
となるように分散し、ラテックス粒子分散液を得た。前
記分散液３ｍｌに、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２ｍｇ／
ｍｌ）１ｍｌと、抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗
体（日本バイオテスト研究所製）の１０ｍＭ−ホウ酸緩
衝液（ｐＨ７．５）溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌとを添
加し、１０℃で５時間反応させた。得られた反応物を、
１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて遠心洗
浄し、固形分濃度５重量％になるように再分散させ、抗
ヒトヘモグロビン抗体を固定化した着色粒子含有液（標
識複合体含有液）を得た。

【００４６】（２）標識相の作製 前記（１）で得られた標識複合体含有液（固形分濃度５
重量％）０．５μ１とサッカロース水溶液（１０重量
％）１５μ１とを混合して、得られた混合物をレーヨン
不織布（５×１０ｍｍ）に塗布した。ついで、３７℃に
て１２時間乾燥させ、標識相を配置した吸水性基材を得
た。

【００４７】（３）固定相の作製 抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体（日本バイオテ
スト研究所製）の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を、ニトロセルロース膜（ワ
ットマン製、孔径３μｍ、支持体付き、５×２０ｍｍ）
の一端から１０ｍｍの部位にライン状に１μｌ塗布し
た。塗布後の膜を３７℃で３時間乾燥した後、得られた
膜を１重量％ウシ血清アルブミンと０．１重量％ツイー
ン２０とを含有した水溶液に１０分間浸漬した。つい
で、浸漬後の膜を、３７℃で３時間乾燥させて、固定相
を配置した吸水性基材を得た。

【００４８】（４）調整相及び被検液受領部の作製 抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体（日本バイオテ
スト研究所製）の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ又は６ｍｇ／ｍｌ）又は１０
ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）単独と、ポリビニル
アルコール（重合度１５００）の水溶液（５重量％）と
を当量混合し、得られた混合液をガラス繊維濾紙（ワッ
トマン製、ＧＦ／Ｃ、５×２０ｍｍ）の一端から３ｍｍ
の部位にライン状に３μｌ塗布した。このガラス繊維濾
紙を、０．１重量％ツイーン２０を含有したメタノール
に３０分間浸漬した。ついで、３７℃で３時間乾燥させ
て、調整相を配置した吸水性基材を得た。

【００４９】（５）試験片の作製 （４）で得られた吸水性基材（調整相を配置したガラス
繊維濾紙）と、（２）で得られた吸水性基材（標識相を
配置した不織布）と、（３）で得られた吸水性基材（固
定相を配置したニトロセルロース膜）と、吸水パッドと
してのガラス繊維濾紙（ワットマン製、ＧＦ／Ｂ、５×
２０ｍｍ）とを、順に、それぞれの端部が１ｍｍづつ重
なるように連結してヒトヘモグロビン検出用試験片を得
た。得られた試験片を図１に示す。

【００５０】比較例１ （１）固定相の作製 抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体（日本バイオテ
スト研究所製）の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／
ｍｌ）を、ニトロセルロース膜（ワットマン製、孔径３
μｍ、支持体付き、５×２０ｍｍ）の一端から１０ｍｍ
の部位にライン状に１μｌ塗布した。塗布後の膜を３７
℃で３時間乾燥した後、得られた膜を１重量％ウシ血清
アルブミン及び０．１重量％ツイーン２０の水溶液に１
０分間浸漬した。ついで、浸漬後の膜を、３７℃で３時
間乾燥させて、固定相を配置した吸水性基材を得た。

【００５１】（２）試験片の作製 被検液受領部としてのガラス繊維濾紙（ワットマン製、
ＧＦ／Ｂ、５×２０ｍｍ）と、実施例１の（２）と同様
にして得られた標識相を配置した吸水性基材と、前記比
較例１の（１）で得られた固定相を配置した吸水性基材
と、吸水パッドとしてのガラス繊維濾紙（ワットマン
製、ＧＦ／Ｂ、５×２０ｍｍ）とを順に、それぞれの端
部が１ｍｍづつ重なるように連結してヒトヘモグロビン
検出用試験片を得た。得られた試験片を図２に示す。

【００５２】試験例１ ヒトヘモグロビンの検出 表１に示す各濃度となるように、ヒトヘモグロビンを生
理食塩水に溶解させ、被検液１００μｌを得た。得られ
た被検液を、実施例１の試験片及び比較例１の試験片そ
れぞれの被検液受領部に滴下して展開した。１０分後、
固定相における発色を目視で観察した。結果をそれぞれ
表１及び２に示す。なお、表１及び２における判断基準
は、以下の通りである。 ＋ ：強い発色が見られる ＋ｗ：弱い発色が見られる − ：発色が見られない

【００５３】

【表１】

【００５４】

【表２】

【００５５】表２に示すように、調整相を持たない比較
例１の試験片を用いた場合、検出限界を設定できるが、
固定相における抗ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体
濃度が低くなる程、全般に発色が弱くなり、検出できる
最大ヒトヘモグロビン濃度が低くなることがわかる。

【００５６】一方、表１に示すように、調整相を有する
実施例１の試験片を用いた場合、調整相に保持させる抗
ヒトヘモグロビン・ヒツジＩｇＧ抗体（第３特異的結合
物質）量を高くすることにより、ヒトヘモグロビンの検
出レベルの範囲を簡便に設定することができ、かつ良好
に検出できることがわかる。

【００５７】実施例２ （１）固定相及び調整相の作製 抗ヒトトランスフェリン・ウサギＩｇＧ抗体（ダコ製）
の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液（２ｍｇ
／ｍｌ）を、ニトロセルロース膜（ワットマン製、孔径
３μｍ、支持体付き、５×３５ｍｍ）の一端から１０ｍ
ｍの部位にライン状に１μｌ塗布した（固定相）。さら
に、この膜の前記固定相と同じ側の一端から３０ｍｍの
部位に、抗ヒトトランスフェリン・ウサギＩｇＧ抗体
（ダコ製）の１０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶
液（６ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ）又は１０ｍＭ−リン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）単独をライン状に１μｌ塗布し
た（調整相）。この膜を３７℃で３時間乾燥した後、
０．５重量％スキムミルクと０．１重量％ツイーン２０
とを含有した水溶液に１０分間浸漬し、３７℃で３時間
乾燥させ、調整相と固定相とを配置した吸水性基材を得
た。

【００５８】（２）標識複合体の作製 実施例１の（１）に記載のラテックス粒子分散液３ｍｌ
に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩水溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌと
抗ヒトトランスフェリン・ウサギＩｇＧ抗体（ダコ製）
の１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．５）溶液（４ｍｇ
／ｍｌ）２ｍｌとを添加し、１０℃で５時間反応させ
た。得られた反応物を、１０ｍＭ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ
７．５）溶液により遠心洗浄し、固形分濃度５重量％に
なるように再分散させ、抗ヒトトランスフェリン抗体を
固定化した標識複合体含有液を得た。

【００５９】（３）標識相の作製 前記（２）で得られた標識複合体含有液（５重量％）
０．５μ１とサッカロース水溶液（１０重量％）５μ１
とを混合して得られた混合物を、前記（１）で得られた
調整相と固定相とを配置した吸水性基材の固定相に近い
側の端部から２５ｍｍの部位に塗布した。得られた膜を
３７℃で１２時間乾燥させ、調整相と標識相と固定相と
を配置した吸水性基材を得た。

【００６０】（４）試験片の作製 被検液受領部としてのガラス繊維濾紙（ワットマン製、
ＧＦ／Ｂ、５×２０ｍｍ）と、前記（３）で得られた調
整相と標識相と固定相とを配置した吸水性基材と、吸水
パッドとしてのガラス繊維濾紙（ワットマン製、ＧＦ／
Ｂ、５×２０ｍｍ）とを、順に、それぞれの端部が１ｍ
ｍづつ重なるように連結してヒトトランスフェリン検出
用試験片を得た。得られた試験片を図３に示す。

【００６１】試験例２ ヒトトランスフェリンの検出 表３に示す各濃度となるように、ヒトトランスフェリン
を生理食塩水に溶解させ、被検液８０μｌを得た。得ら
れた被検液を前記（４）で得られた試験片の被検液受領
部に滴下して展開した。１０分後、固定相における発色
を目視で観察した。結果を表３に示す。なお、表３にお
ける判断基準は、前記表１及び表２と同様である。

【００６２】

【表３】

【００６３】表３に示すように、調整相に保持させる抗
ヒトトランスフェリン・ウサギＩｇＧ抗体（第３特異的
結合物質）量を高くすることにより、ヒトトランスフェ
リンの検出のレベル範囲を所望の範囲に設定することが
でき、かつ良好に検出することができることがわかる。

【００６４】

【発明の効果】本発明の試験片によれば、調整相を有す
るため、使用時に特別な操作（例えば、被検液の段階的
希釈液の作製など）をすることなく、検出限界及び検出
レベルの範囲を簡便に設定することができ、検出の際、
良好な発色を得ることができるという優れた効果を奏す
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、調整相を有する試験片の概略図であ
る。

【図２】図２は、調整相を持たない試験片の概略図であ
る。

【図３】図３は、調整相を有する試験片の概略図であ
る。

【符号の説明】

１ 被検液受領部 ２ 標識相 ３ 調整相 ４ 固定相 ５ 吸水パッド

フロントページの続き (72)発明者 松縄 彩子 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 吸水性基材に、下記（ｉ）、（ii）及び
   (iii) ： （ｉ）被検液を滴下するための被検液受領部、（ii）標
   識物質と、前記被検物質に特異的に結合しうる第１特異
   的結合物質とを含有した標識複合体を、水との接触によ
   って吸水性基材から脱離するように保持した標識相、(i
   ii) 被検物質に特異的に結合しうる第２特異的結合物質
   を固定化した固定相、が順に配置された試験片であっ
   て、かつ被検液受領部上の領域又は該被検液受領部と該
   標識相との間（ただし、標識相は含まない）の領域に、
   （iv）被検物質に特異的に結合しうる第３特異的結合物
   質を固定化した調整相、が配置され、かつ該（ｉ）〜
   （iv）が、同一又は異なる吸水性基材上に設けられてな
   るものである、免疫測定法用試験片。
2. 【請求項２】 標識物質が着色粒子である、請求項１記
   載の免疫測定法用試験片。