JP2000055919A

JP2000055919A - 被検物質の検査方法および検査試薬

Info

Publication number: JP2000055919A
Application number: JP10219250A
Authority: JP
Inventors: Shuji Senda; 修治千田; Takeshi Saiga; 健雑賀; Keisaku Okada; 圭策岡田
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1998-08-03
Filing date: 1998-08-03
Publication date: 2000-02-25

Abstract

(57)【要約】【課題】簡便で、且つ迅速高感度な検査方法および検査
試薬を提供すること。【解決手段】被検物質と特異的に結合しうる第一特異的
結合物質および酵素を担体に結合させた酵素標識特異的
結合体と前記被検物質との複合体を形成させ、吸水性基
材上を展開する工程；前記吸水性基材上に設けられた、
前記被検物質と特異的に結合しうる第二特異的結合物質
を固定した固定相にて前記複合体を捕捉する工程；なら
びに捕捉した複合体を検出する工程、を含む被検物質の
検査方法。吸水性基材上に、被検物質と特異的に結合し
うる第二特異的結合物質を固定した固定相、前記被検物
質と特異的に結合しうる第一特異的結合物質および酵素
を担体に結合させた酵素標識特異的結合体を水との接触
によって前記基材から離脱するように含有させた標識
相、ならびに前記標識相の上流または同じ箇所に位置す
る試料受領部を設けてなる検査試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、担体に特異的結合
物質と酵素をともに固定した酵素標識特異的結合体を用
いる被検物質の検査方法および検査試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応の高い特異性と検出感度を
利用して抗原または抗体を同定、定量する方法の一つ
に、分別検出の容易な物質で標識した抗原や抗体を用い
る標識化免疫測定法(labeled immunoassay) が知られて
いる。この方法において使用される標識化された抗原ま
たは抗体は、一般に、当該抗原または当該抗体に標識剤
を結合させることによって得られる( 以下、それぞれ標
識抗原または標識抗体という）。当該結合は、従来、架
橋法により行われてきた。しかしながら、従来の方法で
は、抗原または抗体が相互に、また標識剤が相互に架橋
されてしまい、標識抗原または標識抗体の生成に寄与し
ない割合が高くなる。従って、収率が低いほか、抗原ま
たは抗体上での標識剤の結合密度が著しく少ないために
標識剤としての機能も低下する。また、抗原または抗体
に結合しうる標識剤の量は、その分子の大きさにより自
ずから限られる。また、抗原や抗体に標識剤を直接結合
させるという従来の方法では、当該抗原や抗体の活性、
機能および特異性等が失われやすいという問題があっ
た。

【０００３】ところで、近年問題となっている大腸菌Ｏ
１５７をはじめとする病原性微生物等の食品中や患者か
らの検出は、多くの日数、煩雑な操作を要する場合があ
る。さらに、疾患によってはより迅速な診断が要求され
る場合も多い。これらの診断には、上述のような標識化
免疫測定法等の種々の免疫測定法（イムノアッセイ）が
好適に用いられている。近年になり迅速かつ簡便にイム
ノアッセイが行える方法として、免疫クロマトグラフ法
が注目されている。当該方法は、例えば以下のような工
程を経る。抗体（第１抗体）を塗布した吸水性基材に菌
体等の抗原を付与し、展開させて該第１抗体に抗原を捕
捉する。続いて該抗原に特異的に結合する標識化された
抗体（第２抗体）を付与し、展開させてすでに捕捉され
ている抗原に結合させる。最終的に吸水性基材上の抗体
塗布位置に形成される免疫複合体（第１抗体−抗原−第
２抗体−標識剤）を目視確認する。その他にＥＩＡ（酵
素免疫検定法）やプローブを用いた方法等も行われてい
るが、簡便性、迅速性および／または感度等の点におい
て十分なものが得られていないのが現状である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便で、且
つ迅速高感度な検査方法および検査試薬を提供すること
を目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、担体表面に特異的結合
物質と標識剤としての酵素とを共に結合させた担体を用
い、簡便性、感度および迅速性に優れた検査方法および
検査試薬を得ることに成功した。

【０００６】即ち、本発明の要旨は、〔１〕下記工程：（１）被検物質と特異的に結合しうる第一特異的結合物
質および酵素を担体に結合させた酵素標識特異的結合体
と前記被検物質との複合体を形成させ、吸水性基材上を
展開する工程；（２）前記吸水性基材上に設けられた、前記被検物質と
特異的に結合しうる第二特異的結合物質を固定した固定
相にて前記複合体を捕捉する工程；ならびに（３）捕捉した複合体を検出する工程、を含む被検物質
の検査方法、〔２〕吸水性基材上に、被検物質と特異的に結合しう
る第二特異的結合物質を固定した固定相、前記被検物質
と特異的に結合しうる第一特異的結合物質および酵素を
担体に結合させた酵素標識特異的結合体を水との接触に
よって前記基材から離脱するように含有させた標識相、
ならびに前記標識相の上流または同じ箇所に位置する試
料受領部を設けてなる検査試薬、に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の検査方法は、被検物質と
特異的に結合しうる第一特異的結合物質および酵素を担
体に結合させた酵素標識特異的結合体を用いることを１
つの特徴とする。まず、本発明において用いられる酵素
標識特異的結合体について説明する。

【０００８】酵素標識特異的結合体に用いられる担体
は、本発明における特異的結合物質および酵素をその表
面上に結合可能なものであれば特に限定されないが、通
常、金属コロイド、水分散型高分子粒子、シリコーン、
シリカ、ガラスケイソウ土等が挙げられる。中でも、金
属コロイドまたは水分散型高分子粒子が好ましい。

【０００９】金属コロイドとしては、金コロイドやセレ
ニウムコロイド等が例示される。

【００１０】水分散型高分子粒子は、不飽和二重結合を
有する単量体の一又は二以上の乳化重合によって調製さ
れる。かかる単量体としては、例えば、エチレン、プロ
ピレン等のオレフィン系単量体、酢酸ビニル、塩化ビニ
ル等のビニル系単量体、スチレン、メチルスチレン、ク
ロロスチレン等のスチレン系単量体、アクリル酸メチル
等のメタクリル酸エステル系単量体、ブタジエン等のジ
エン系単量体等が用いられる。

【００１１】本発明に用いる水分散型高分子粒子は、上
記単量体の単独重合体や共重合体のほか、得られる粒子
に官能基やイオン性基を付与し、または粒子の水性媒体
中での分散安定性を高めるなどの目的で、改質用単量体
を共重合することもできる。このような改質用単量体と
しては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，
２−トリフルオロエチルメチルメタクリレートなどのフ
ッ素化メタクリル酸エステル、アクリロニトリル、メタ
クリロニトリル、アクリルアミド、スチレンスルホン酸
ナトリウム、スルホプロピル（メタ）アクリレートナト
リウム塩、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−ヒドロキ
シエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリ
レート、グリシジルメタクリレートなどが用いられる。

【００１２】また本発明においては、市販されている種
々の水分散型高分子粒子も好適に使用することができ
る。市販されている水分散型高分子粒子としては、例え
ば、スチレンまたはその誘導体、例えば、ｐ−クロロス
チレンからなる単独重合体や共重合体、スチレン−ブタ
ジエン共重合体、スチレン−アクリロニトリル−ブタジ
エン共重合体等の種々のスチレン共重合体からなるエマ
ルジョンを挙げることができる。また、（メタ）アクリ
ル酸の長鎖アルキルエステルやその誘導体からなる単独
重合体や、これらと（メタ）アクリル酸メチルやエチ
ル、グリシジル（メタ）アクリレート等との共重合体も
本発明において用いられる。上述したスチレンやその誘
導体と、（メタ）アクリレートエステルやその誘導体と
の共重合体も用いられる。また、ゴム、ナイロン、ポリ
ウレタン、微結晶質セルロース等も挙げられる。

【００１３】上記水分散型高分子粒子のうち、粒子の安
定性の点から、スチレン系単量体を主成分とする重合体
が好ましく、また、特異的結合物質や酵素を固定化する
ために、アクリル酸やメタクリル酸などのカルボキシル
基を有する単量体を共重合した高分子粒子を用いること
が好ましい。

【００１４】個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子粒子を第一特異的結合物質とともに酵素
を固定して用いる場合に、その使用時や保存時に融着、
凝集を起こさないように、当該高分子粒子が所要のガラ
ス転移点を有するように選ばれる。水分散型高分子粒子
のガラス転移点は、好ましくは１０℃以上、特に室温以
上が好ましい。

【００１５】本発明において用いられる担体は、着色さ
れてもよい。着色担体を用いた場合、被検物質の濃度が
高いと酵素反応を行う前に着色の程度により判定が可能
となる。ここで用いる着色された担体としては、肉眼で
着色が検出可能なものであれば制限はなく、例えば金、
銀、銅等の金属からなるコロイド粒子、スダンブルーや
スダンレッドIV、スダン III、オイルオレンジ、キニザ
リングリーン等に代表される顔料や染料等で着色された
水分散型高分子粒子等を用いることができる。目視確認
性の点からは、金コロイドや青色、赤色、緑色、オレン
ジ色に着色した水分散型高分子粒子を用いることが好ま
しく、さらに好ましくは青色や赤色等で着色した水分散
型高分子粒子として着色ラテックスを用いることが分散
安定性や被検物質の検出感度の調整し易さ等の点から望
ましい。

【００１６】本発明において用いられる酵素標識特異的
結合体は、水分散型高分子粒子等の担体に第一特異的結
合物質および酵素を固定することにより得られる。当該
高分子粒子の粒子径は、水性媒体中で粒子が均等に分散
されて沈降しにくくなるように、ならびに第一特異的結
合物質および酵素が十分に固定されるようにする観点か
ら、好ましくは３μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以
下であり、固定後の当該粒子の精製が容易となるように
する観点から、好ましくは０．０１μｍ以上、さらに好
ましくは０．１μｍ以上である。

【００１７】本発明において標識剤として用いられる酵
素としては、従来より固相イムノアッセイ等に用いられ
る任意の酵素を用いることができる。具体的にはペルオ
キシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラー
ゼ、エステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げ
られる。好ましくはより高感度で安定な検出を達成する
ことが可能なペルオキシダーゼまたはアルカリホスファ
ターゼである。

【００１８】水分散型高分子粒子等に固定される第一特
異的結合物質は、被検物質と特異的に結合する物質であ
れば特に限定されず、抗原、ハプテン、抗体、オリゴヌ
クレオチド、エフェクター、レセプター、酵素、酵素補
助因子、酵素阻害剤等が例示される。第一特異的結合物
質は、検査すべき被検物質に応じて、サンドイッチ法等
の通常の検出方法で用いられる公知のものを適宜１種ま
たは２種以上選択すればよい。

【００１９】当該特異的結合物質が抗原またはハプテン
の場合、当該抗原およびハプテンとしてはクラミジア・
トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・
ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキ
ソプラズマ・ゴンディ、ボレリア等の各種微生物抗原、
マイコプラズマ脂質抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢ
ｅ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原および前
記抗原に由来するハプテン等が挙げられる。

【００２０】当該特異的結合物質が抗体の場合、当該抗
体としてはモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を
使用することができる。具体的には、抗大腸菌抗体、抗
大腸菌Ｏ１５７抗体、抗サルモネラ菌抗体、抗ブドウ球
菌抗体、抗カンピロバクター菌抗体、抗ウェルシュ菌抗
体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒ
トトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒ
ト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗
ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラ
ミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンＯ抗
体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗
体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗
体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗体、抗ＲＦ抗体等
が挙げられる。

【００２１】当該特異的結合物質がオリゴヌクレオチド
の場合、当該オリゴヌクレオチドとしては、前記抗原と
して例示された各種微生物、マイコプラズマ、各種ウイ
ルスに由来する核酸成分に相補的なオリゴヌクレオチド
等が挙げられる。

【００２２】本発明において用いられる水分散型高分子
粒子は、表面に第一特異的結合物質および酵素を固定す
るため、スペーサーを導入するため、あるいは水分散状
態での安定性を高めるために官能基を有していてもよ
い。このような官能基としては、例えばカルボキシル
基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、ホルミル基、カ
ルバモイル基、イソチオシアナート基、アジドカルボニ
ル基、ヒドラジド基、酸無水物基等を挙げることがで
き、好ましくはカルボキシル基が導入される。これらの
官能基を有する水分散型高分子粒子を調製するには、単
量体成分として、例えば、アクリル酸、メタクリル酸の
ようなカルボキシル基を有する単量体、例えばヒドロキ
シエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリ
レートのような水酸基を有する単量体、例えば、グリシ
ジルメタクリレートのようなグリシジル基を有する単量
体を、必要に応じて、他の共重合性単量体と乳化共重合
させることによって、それぞれカルボキシル基、水酸基
およびグリシジル基を有する水分散型高分子粒子を得る
ことができる。また、所要の単量体成分を重合させた
後、得られた水分散型高分子粒子に官能基を導入するこ
ともできる。

【００２３】本発明において用いられる担体に第一特異
的結合物質および／または酵素を固定する方法として
は、疎水結合（物理的吸着）、イオン結合、共有結合等
が利用できる。安定性の観点から、共有結合により強力
に固定することが好ましい。

【００２４】また、本発明においては、水分散型高分子
粒子に第一特異的結合物質および／または酵素を共有結
合によって結合する際に、必要に応じて、第一特異的結
合物質および／または酵素の当該高分子粒子上での自由
度を高めるために、スペーサー基を介在させることがで
きる。このスペーサー基は、予め水分散型高分子粒子に
結合させ、後に当該スペーサー基と第一特異的結合物質
および／または酵素を結合させてもよく、或いはスペー
サー基を予め第一特異的結合物質および／または酵素に
結合させ、これを当該高分子粒子に結合させてもよい。
更に、必要に応じて、水分散型高分子粒子、第一特異的
結合物質および酵素の全てに予めスペーサー基を結合さ
せ、これらを相互に結合させることもできる。

【００２５】スペーサー基として用い得る化合物は、少
なくとも二官能性の有機化合物であり、多官能性の重合
体を排除するものではないが、特に炭素数１〜１２の炭
素鎖基を有する二官能性の有機化合物が好ましい。この
ようなスペーサー基として機能する化合物の具体例とし
て、例えば、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレン
ジアミン、キシリレンジアミン等のジアミン類、グリシ
ン、β−アミノプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、ε−ア
ミノカプロン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアル
キルカルボン酸、リジン、グルタミン酸、β−アラニ
ン、アルギニン、グリシルグリシン等のアミノ酸類等が
好ましく用いられるが、これらに限定されるものではな
い。

【００２６】水分散型高分子粒子に直接またはスペーサ
ー基を介して第一特異的結合物質および／または酵素を
共有結合にて結合させるための方法は、特に限定され
ず、従来より知られている任意の方法によることができ
る。例えば、好ましい方法の一つとして、結合試薬とし
て水溶性カルボジイミドを用いる方法を挙げることがで
きる。例えば、アミノアルキルカルボン酸をスペーサー
基として用いる場合であれば、水溶性カルボジイミドを
用いて、アミノアルキルカルボン酸を水分散型高分子粒
子に結合させ、次いで、当該高分子粒子に結合したアミ
ノアルキルカルボン酸に水溶性カルボジイミドを用いて
同様にして、第一特異的結合物質および／または酵素を
共有結合にて結合させることができる。

【００２７】かかる方法において用いる水溶性カルボジ
イミドとしては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シク
ロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイ
ミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート等を挙げること
ができる。このような水溶性カルボジイミドを用いて、
スペーサー基を介してまたは介さずして直接に、共有結
合によって第一特異的結合物質および／または酵素を水
分散型高分子粒子に結合させるには、従来より知られて
いる通常の方法および条件によることができる。本発明
において、特異的結合物質および酵素の担体への結合
は、両者を同時に固定してもよいし、別々に固定しても
よい。

【００２８】１種類の第一特異的結合物質を固定する場
合に加え、必要に応じて、数種類の被検物質とそれぞれ
特異的に結合する数種類の第一特異的結合物質を混合し
て固定することも可能である。

【００２９】このようにして得られた酵素標識特異的結
合体中に含まれる第一特異的結合物質と酵素の総固定量
は、担体の乾燥重量１ｇあたり好ましくは５〜２００ｍ
ｇであり、その量は上記の範囲内で使用する特異的結合
物質や酵素の種類、活性の程度等によって適宜変更し得
る。例えば、担体が水分散型高分子粒子の場合、当該粒
子の表面積に鑑みると、前記総固定量は、水分散型高分
子粒子の乾燥重量１ｇあたり２００ｍｇ以下が好まし
く、さらに好ましくは１５０ｍｇ以下であり、被検物質
の検出の迅速性、感度、再現性の観点から、５ｍｇ以上
が好ましく、１０ｍｇ以上がさらに好ましい。

【００３０】ここで、水分散型高分子粒子の「乾燥重
量」とは、一定量の水分散型高分子粒子を１２０℃で２
時間乾燥した後の重量をいう。

【００３１】より迅速、且つ高感度なイムノアッセイを
期待して酵素標識特異的結合体を用いる場合には、当該
担体に固定される酵素は、その種類により適宜変更し得
る。被検物質の検出の迅速性、感度、再現性という観点
から、通常水分散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり
１．０ｍｇ以上が好ましく、同様に、１００ｍｇ以下で
あることが好ましい。

【００３２】また当該酵素の固定量は、第一特異的結合
物質１モルあたり０．６モル以上が好ましく、当該水分
散型高分子粒子の表面積との関係およびバックグランド
を低くするという観点から、６０モル以下が好ましい。

【００３３】第一特異的結合物質および酵素の固定量の
測定は、Ｌｏｗｒｙ法を用いて測定し、タンパク質の量
として算出する。特異的結合物質がオリゴヌクレオチド
の場合は、固定後の遊離のオリゴヌクレオチドを２６０
ｎｍの吸光度を測定することにより算出する。

【００３４】次に、本発明の検査方法について、各工程
に従って説明する。（１）酵素標識特異的結合体と被検物質との複合体を
形成させ、吸水性基材上を展開する工程酵素標識特異的結合体と被検物質との複合体は、吸水性
基材上を展開する前に予め形成させてもよいし、後述の
ように、吸水性基材上での展開中に被検物質を含有する
被検液と標識相に含有された酵素標識特異的結合体を接
触させることにより吸水性基材上で複合体を形成させて
もよい。また、吸水性基材上に添加された被検物質を酵
素標識特異的結合体の分散液と接触させることにより、
吸水性基材上で複合体を形成させてもよい。

【００３５】予め複合体を形成させる場合は、酵素標識
特異的結合体の分散液と被検物質含有液とを混合した
り、酵素標識特異的結合体の分散液に被検物質を添加混
合したり、酵素標識特異的結合体を被検物質含有液に添
加分散したりしたのち、これを吸水性基材上で展開させ
ればよい。

【００３６】展開方法としては、吸水性基材の一端側か
ら、上記の方法で調製した複合体の溶液を加え、毛細管
現象によって自然展開させる。吸水性基材上へ溶液等を
添加しやすいように、添加部位に吸水可能なパッドを設
けてもよい。また、上記溶液の添加部位の反対端に吸水
パッドを設けることによって吸水性基材中を展開する液
を吸収するので展開が容易に進行する。

【００３７】本発明において用いる吸水性基材は、被検
物質を含有する被検液、例えば、血清、血液、尿、便、
唾液等を吸収できるもの、またはこれらを緩衝液によっ
て希釈してなる希釈液を吸収するものであれば特に限定
されない。本発明においては、被検液中の被検物質が第
一特異的結合物質や後述の工程（２）の固定相の第二特
異的結合物質と充分な反応を行うための時間を確保でき
るような吸水性基材が用いられる。吸水性基材が吸水性
に劣る場合には、被検液が固定相に到達するのに長時間
を要し、その結果、迅速な測定を行うことができない。
一方、吸水性基材の吸水性があまりに高すぎる場合に
は、被検液中の被検物質が第一特異的結合物質や固定相
の第二特異的結合物質と充分な反応を行うための必要な
時間が不足するので、正確な測定を行うことが困難とな
る。好ましい具体例としは、例えば不織布、濾紙、ガラ
ス繊維布、ガラスフィルター、ニトロセルロース、多孔
質材料等が挙げられる。これらの基材は適度な吸水速度
を有するとともに、着色担体を用いた場合、担体が凝集
して発色した際の目視確認性に優れるものである。

【００３８】以上の点を考慮すると、本発明における吸
水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断し
た吸水性基材の片端部に水を浸漬し、１分間経過後の吸
水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが好ましい。

【００３９】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、基材の表面に親水性重合体を被覆し、または含浸
させることもできる。さらに、本発明においては吸水性
基材として同一材料からなる基材、あるいは異種の材料
からなるものの端面を任意の接着手段によって互いに接
合して得た連続した基材を用いることもできる。

【００４０】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検液を展開できる形状であれば特に限定されるものでは
なく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等が
好ましい。

【００４１】本発明においては、別の態様として酵素標
識特異的結合体が水との接触によって吸水性基材から脱
離しうるように、さらに酵素標識特異的結合体を吸水性
基材に予め含有させてもよい。この場合、酵素標識特異
的結合体をあとから別途加える必要がなくなる。含有さ
せる方法としては、例えば酵素標識特異的結合体の溶液
を吸水性基材に塗布したのち、適当な条件にて乾燥させ
る。乾燥の一態様として吸水性基材に塗布したのち、２
０〜６０℃の風によって風乾させたり、凍結乾燥させる
こともできる。その他の方法としては、水溶性重合体ま
たはサッカロースの溶液中に酵素標識特異的結合体を分
散させ、この分散液を吸水性基材に塗布したのち、乾燥
させる方法を挙げることができる。この方法は、本発明
の検査試薬を調製するのに有利な方法である。水と接触
したときに、水溶性重合体またはサッカロースが容易に
水溶化し、酵素標識特異的結合体が速やかに基材から脱
離して被検物質と反応して複合体を形成する。また、水
溶性重合体またはサッカロースの濃度を調整することに
よって、適当な粘度の溶液を得ることができるので、吸
水性基材の所定の領域に酵素標識特異的結合体を含有さ
せるのが容易であるのみならず、乾燥に際して酵素標識
特異的結合体の凝集や変性が生じにくく、さらに、乾燥
後に酵素標識特異的結合体が吸水性基材から脱離しにく
いからである。

【００４２】このような酵素標識特異的結合体を含有さ
せた吸水性基材を用いることにより、吸水性基材上での
展開中に被検物質を含有する被検液と酵素標識特異的結
合体を接触させることにより複合体を形成させることが
できる。本発明においては、このようにして吸水性基材
上に酵素標識特異的結合体を含有させた部分を標識相と
いう。

【００４３】上記水溶性重合体としては、例えばポリビ
ニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレン
グリコール、セルロースエーテル（例えば、メチルセル
ロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、カルボキシエチルセルロース、オキシエチルセルロ
ース、シアノエチルセルロース）、ゼラチン等が好まし
く用いられる。

【００４４】この態様において展開させるには、標識相
の上流または同じ箇所に位置する試料受領部へ被検物質
溶液を添加する。また、被検物質を試料受領部に直接塗
布する場合は、試料受領部へ被検物質を溶解しうる溶媒
を添加する。溶液は吸水性基材中を毛細管現象によって
展開してゆく。このとき、試料受領部に吸水パッドを置
いてもよいし、さらに試料受領部の下流端に吸水パッド
を置いてもよい。

【００４５】（２）被検物質と特異的に結合しうる第
二特異的結合物質を吸水性基材上に固定した固定相に
て、工程（１）の複合体を捕捉する工程工程（２）は、工程（１）で用いた吸水性基材上に、被
検物質と特異的に結合しうる第二特異的結合物質を固定
した固定相を要する。

【００４６】第二特異的結合物質とは、前記第一特異的
結合物質で記載されたものと同様のものが挙げられる
が、第一特異的結合物質に応じて適宜選択される。

【００４７】第一特異的結合物質が抗体ならば、同じ抗
体を使用してもよいし、別のエピトープを認識する抗体
を使用してもよい。第一特異的結合物質が抗原やハプテ
ンの場合、第二特異的結合物質は、同一の抗原、ハプテ
ンあるいは第一特異的結合物質とは異なる結合物質であ
って被検物質と特異的に結合する抗原、抗体、ハプテン
などが用いられる。第一特異的結合物質がオリゴヌクレ
オチドの場合は、第一特異的結合物質のオリゴヌクレオ
チドの相補的な配列とは異なる被検物質の他の部分のヌ
クレオチド配列と相補性を有するオリゴヌクレオチドが
利用できる。

【００４８】第二特異的結合物質の吸水性基材上への固
定方法は、特に限定されるものではないが、従来から知
られている物理吸着法や共有結合法によるのが好適であ
る。また、第二特異的結合物質および親水性重合体を含
む溶液を吸水性基材に塗布した後、上記親水性重合体を
凝固させる凝固溶剤に浸漬することで固定相を作製する
こともできる。上記親水性重合体としては、ヒドロキシ
プロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒ
ドロキシエチルセルロース等が用いられる。上記凝固溶
剤としては、アセトン、エタノール、メタノール、エー
テル等を用いることができる。

【００４９】固定後の吸水性基材は、タンパク質、界面
活性剤および糖を含有する溶液で処理して用いることが
好ましい。ここで、使用するタンパク質としては、ウシ
血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク等
が例示され、界面活性剤としては、ポリオキシエチレン
（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアル
キルアリルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレ
ンアルキルフェニルエーテル等が例示され、糖として
は、グルコース、トレハロース、サッカロース等が例示
される。前記成分を水に溶かして、これに固定後の吸水
性基材を浸漬するだけで処理できる。上記タンパク質は
不用なタンパク質が吸水性基材表面に吸着するのを防止
し、界面活性剤は展開を容易にし、糖は吸水性基材の表
面に塗布した第二特異的結合物質の安定性を向上する。

【００５０】処理液中のタンパク質の含有量は、好まし
くは０．１〜１０重量％であり、少なすぎると効果が出
にくく、多すぎると固定相での反応性が低下する傾向が
ある。界面活性剤の含有量は、好ましくは０．０１〜１
重量％であり、少なすぎると効果が出にくく、多すぎる
と展開が速すぎ、反応性が低下する傾向がある。糖の含
有量は、０．１〜１０重量％であり、少なすぎると効果
が出にくく、多すぎると展開しにくくなる。

【００５１】こうして得られた固定相において、固定さ
れた第二特異的結合物質によって工程（１）の複合体の
被検物質の部分と結合して複合体を捕捉する。

【００５２】（３）捕捉した複合体を検出する工程ｉ）酵素反応を用いる検出方法本発明で用いられる酵素標識特異的結合体を種々のイム
ノアッセイ等に使用する場合、固定した酵素の種類に応
じて従来公知の発色基質、検出方法が選択され、発色の
程度や活性の変化等により被検物質の検出、定量が行わ
れる。この時用いる基質としては、例えば、アルカリフ
ォスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト、５−ブロモ−４−クロロ−３−ホスフェート／ニト
ロブルーテトラゾリウム、ファーストレッド／ナフトー
ル、ＡＳ−ＴＲホスフェート等が挙げられる。また、ペ
ルオキシダーゼの場合、過酸化水素と、２，２’−アジ
ノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン
酸、ｏ−フェニレンジアミン、３，３’，５，５’−テ
トラメチルベンジジン、ｏ−ジアニシジン、５−アミノ
サリサイクリックアシッド、３，３’−ジアミノベンジ
シン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−クロ
ロ−１−ナフトール等の化合物との組合せが例示され
る。

【００５３】ii) 着色担体による検出方法被検物質の量が多い場合は、固定相に捕捉された着色担
体を含む複合体を目視により検出することができる。

【００５４】次に、本発明の検査試薬について説明す
る。本発明の検査試薬は、本発明の検査方法に好適に使
用されるものであり、被検物質と特異的に結合しうる第
一特異的結合物質および酵素を担体に結合させた酵素標
識特異的結合体を用いることを１つの特徴とする。すな
わち、当該検査試薬は、図１に示すように、吸水性基材
１上に、被検物質と特異的に結合しうる第二特異的結合
物質を固定した固定相２、前記被検物質と特異的に結合
しうる第一特異的結合物質および酵素を担体に結合させ
た酵素標識特異的結合体を水との接触によって前記基材
から離脱するように含有させた標識相３、ならびに前記
標識相の上流または同じ箇所に位置する試料受領部４を
設けてなるものである（図１は標識相の上流に試料受領
部を設けた態様を図示する）。

【００５５】ここで、吸水性基材、固定相および標識相
は、前記本発明の検査方法において記載されたものと同
様である。固定相は、被検液の吸液によって展開し移動
してきた複合体を捕捉するために、吸水性基材上に第二
特異的結合物質を好ましくは０．００５〜５ｍｇ／ｃｍ
²塗布する。塗布量が少なすぎると複合体の捕捉効率が
低下し、検出感度も低下する。また、塗布量が多すぎて
も、捕捉効率は向上せず、経済的に不利である。また、
標識相に含有させる酵素標識特異的結合体の量は、例え
ば、６ｍｍ幅×６ｃｍ長さの短冊状の吸水性基材で０．
５〜５０μｇである。

【００５６】また、本発明においては上記固定相は標識
相の下流側に設けられ、該固定相と標識相の間の距離
は、固定相での発色の均一性および発色感度という観点
から、０．５ｃｍ以上、好ましくは１ｃｍ以上であり、
固定相までの被検液の到達性、発色感度および測定時間
という観点から、６ｃｍ以下、好ましくは４ｃｍ以下程
度である。

【００５７】試料受領部とは、前記標識相の上流または
同じ箇所に位置して、試料を添加できるものであれば特
に限定されないが、吸水性基材そのものでも水溶液を一
時的に貯留できる吸水パッドを用いてもよい。吸水パッ
ドとしては、例えばポリエステル、レーヨン、ポリプロ
ピレン、セルロース、パルプなどからなる不織布等が例
示される。標識相と同じ箇所に試料受領部を設ける場
合、標識相を作製した後、その上に試料受領部を構成す
る吸水パッドを積層してもよいし、試料受領部内に標識
相を設けてもよい。

【００５８】試料受領部の大きさとしては、縦、横共、
３〜１０ｍｍ程度で、厚みは０．１〜５ｍｍ程度が好ま
しい。

【００５９】前記試料受領部は、固定相と標識相を有す
る吸水性基材上の一端またはその近傍に設置される。設
置方法としては、吸水性基材上に置いて、収納ケースに
より物理的に押さえてもよいし、糊剤などで接着しても
よい。

【００６０】本発明の検査試薬を用いて検査を行うに
は、まず標識相の上流に位置する試料受領部から検査対
象の被検液を吸収させる。被検液は吸水性基材中を展開
し移動して標識相に到達し、酵素標識特異的結合体を該
基材から脱離させる。このとき被検液中に含まれる被検
物質は酵素標識特異的結合体と結合し、複合体を形成す
る。標識相と同じ箇所に試料受領部を設けた場合は、被
検液を添加し吸収させることで、その位置で複合体が形
成される。

【００６１】次いで、形成された複合体は被検液の移動
と共に吸水性基材中を展開し移動して固定相に到達す
る。固定相では移動してきた複合体は固定相に固定され
た第二特異的結合体とさらに結合し、新たに酵素標識特
異的結合体（酵素−担体−第一特異的結合体）−被検物
質−第二特異的結合体からなる酵素標識特異的結合体の
複合体を形成して、固定相上に捕捉される。被検物質濃
度が高く、担体が着色されている場合は、このように固
定相に複合体を捕捉し固定化することによって、当該複
合体を一箇所に集合、凝集させ、明瞭に発色させること
になるので被検物質の存在を目視確認できる。

【００６２】また被検物質濃度が低い場合は、さらに、
固定相に固定化された酵素の基質を加えることにより高
感度に検出することができる。この時用いる基質として
は固定化された酵素と反応して、発色しうる基質であれ
ばよく、例えば、アルカリフォスファターゼの場合、ｐ
−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム、
ファーストレッド／ナフトール、ＡＳ−ＴＲホスフェー
ト等が挙げられる。また、ペルオキシダーゼの場合、過
酸化水素と、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベン
ズチアゾリン−６−スルホン酸、ｏ−フェニレンジアミ
ン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ｏ
−ジアニジジン、５−アミノサリサイクリックアシッ
ド、３，３’−ジアミノベンジシン、３−アミノ−９−
エチルカルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール等の
化合物との組合せが例示される。

【００６３】

【実施例】以下、実施例および実験例を挙げ、さらに具
体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定
されるものではない。

【００６４】実施例１：酵素標識特異的結合体の作製
（酵素−抗体固定化担体）１）水分散型高分子粒子懸濁液の作製スチレン５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエチレング
リコールメタクリレート０．２ｇ、蒸留水４４０ｇから
なる混合液を窒素ガス雰囲気下で７５℃に維持、攪拌し
ながら、重合開始剤としての過硫酸カリウム０．２５ｇ
を蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１０時間重合
を行った。その結果、カルボキシル化された水分散型高
分子粒子としてカルボキシル化ポリスチレンラテックス
粒子（平均粒子径は０．２μｍ）を得た。得られたカル
ボキシル化ポリスチレンラテックス粒子を０．０１Ｍ−
ホウ酸緩衝液ｐＨ８．２に固形分濃度が５重量％になる
ように分散した。

【００６５】２）固定化ｉ）特異的結合物質の固定本実施例では特異的結合物質として抗体を上記１）で作
製したラテックス粒子に以下のようにして固定した。

【００６６】上記ラテックス粒子の分散液３ｍｌに、水
溶性カルボジイミド（DOJIN 社製、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８．２）０．５ｍｌ、ヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：
Ｈ７ポリクロナール抗体(Kirkegaard & Perry Laborato
riesInc. 社製、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩
衝液ｐＨ８．２）２ｍｌを加えて１０℃で３時間反応さ
せた後、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ
８．２を用いて遠心分離洗浄を行い、同緩衝液で固形分
濃度５重量％に調製した。

【００６７】ii）酵素の固定次いで、上記で作製した抗体固定化ラテックス粒子懸濁
液３ｍｌに、水溶性カルボジイミド（DOJIN 社製、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩
衝液ｐＨ８．２）１ｍｌ、西洋ワサビ由来ペルオキシダ
ーゼ（以下ＨＲＰと略す：和光純薬社製、１．２ｍｇ／
ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．２）２ｍｌを
加えて１０℃で３時間反応させた後、洗浄液として０．
０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８．２を用いて遠心分離洗浄
を行った。同緩衝液で固形分濃度２重量％に調製し、ヤ
ギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ポリクロナール抗体
およびＨＲＰを固定化したラテックス粒子を作製した。

【００６８】実施例２酵素の固定の際、１．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＨ
ＲＰの代わりに、１２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＨＲ
Ｐを用いる以外は全て実施例１と同様にしてヤギ抗Ｅ．
ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ポリクロナール抗体およびＨ
ＲＰを固定化したラテックス粒子を作製した。

【００６９】実施例３酵素の固定の際、１．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＨ
ＲＰの代わりに、６０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したＨＲ
Ｐを用いる以外は全て実施例１と同様にしてヤギ抗Ｅ．
ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ポリクロナール抗体およびＨ
ＲＰを固定化したラテックス粒子を作製した。

【００７０】実験例１抗体および酵素の固定量の測定実施例１〜３で作製したヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５
７：Ｈ７ポリクロナール抗体およびＨＲＰを固定化した
ラテックス粒子について、抗体および酵素の各固定後の
上清をタンパク定量し、その値からラテックス粒子の乾
燥重量１ｇあたりの各固定量を算出した。

【００７１】当該タンパク定量は以下のようにして行っ
た。

【００７２】（タンパク定量−色素結合法(Bradford
法))固定化抗体、酵素量の定量にはCoomassie Brillian
t Blue G-250による色素結合法を用いた。実際の測定
は、市販キットである『Coomassie Protein Assay Reag
ent 』(PIERCE 社製) を使用した。測定法は附属の手順
書に従った。

【００７３】検量線は、濃度既知の該抗体、該酵素溶液
を用いて上記の試薬にて発色した後、５９５ｎｍの吸光
度を測定して作成した。適宜希釈した各固定化後の上清
を、上記の試薬にて発色させた後、５９５ｎｍの吸光度
を測定、検量線から当該抗体および当該酵素の濃度を算
出した。

【００７４】測定時は室温（２５℃）で行った。反応時
間は特に限定がないが、発色後９０分以内に吸光度測定
を実施した。

【００７５】その結果、抗体（分子量約１６万）の固定
量は各実施例とも１１．１ｍｇ、酵素（分子量約４万）
の固定量は実施例１では１．８ｍｇ、実施例２では１
７．３ｍｇ、実施例３では３５．１ｍｇであった。

【００７６】また、上記結果より抗体１分子あたりの酵
素数を算出すると、実施例１では０．６分子、実施例２
では６．２分子、実施例３では３５．１分子であった。

【００７７】実験例２抗体および酵素の固定されたラ
テックス粒子の酵素活性の測定実施例１〜３で作製したヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５
７：Ｈ７ポリクローナル抗体およびＨＲＰを固定化した
ラテックス粒子について、その酵素活性を測定した。Ｔ
ＭＢ（3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine) membran
e Peroxidase Substrate System (Kirkegaard & Perry
Laboratories Inc. 社製、ｐＨ４．５）を基質液として
使用した。キュベット内で、上記の基質液３．３ｍｌに
０．０１２５重量％に希釈した酵素−抗体固定化ラテッ
クス粒子分散液０．１ｍｌを混合し、２５℃で反応後、
分光光度計で５８０ｎｍにおける１分間の吸光度上昇を
測定した。吸光度を１分間に１上昇させる活性を１Ｕ
（ユニット）と定義し、ラテックス粒子の乾燥重量１ｇ
あたりの活性で表現した。

【００７８】その結果、ラテックス粒子の乾燥重量１ｇ
あたり実施例１では１０，１６０Ｕ、実施例２では８
５，２３０Ｕ、実施例３では２６７，１８０Ｕであっ
た。

【００７９】比較例１：酵素非固定担体青色着色カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子分
散液（固形分濃度５重量％、平均粒子径０．１μｍ、
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８）に水溶性カルボジイ
ミド（DOJIN 社製、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍ
ｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８）０．５ｍｌ、お
よびヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ポリクロナー
ル抗体(Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. 社製、
１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液ｐＨ８）２ｍ
ｌを加えて１０℃で３時間反応させた後、洗浄液として
ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて遠心分離洗浄を行い、
青色着色ラテックス粒子標識抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５
７：Ｈ７抗体を作製した（固形分濃度２重量％）。

【００８０】実施例４：免疫クロマトグラフ型試験片の
使用１）試験片の作製ニトロセルロースメンブレン（孔径８μｍ、６ｍｍ×６
０ｍｍ）の一端から３０ｍｍの箇所にヤギ抗Ｅ．ｃｏｌ
ｉＯ１５７：Ｈ７ポリクロナール抗体（１ｍｇ／ｍ
ｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４）を１．５μｌ、
ディスペンサーを用いてライン状に塗布した（固定
相）。

【００８１】このメンブレンをウシ血清アルブミン（オ
リエンタル酵母社製、１重量％）およびポリオキシエチ
レン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業
社製、０．１重量％）、サッカロース（和光純薬工業社
製、１重量％）からなる水溶液中に１０分間浸漬させて
のち、４０℃で２時間乾燥させた。次いで、このメンブ
レンの裏側（抗体塗布面の反対側）にポリエステルフィ
ルム（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて貼り合わせ
た。

【００８２】抗体塗布箇所の上流端から０〜８ｍｍの箇
所にポリエステル不織布（６ｍｍ×８ｍｍ、厚さ２．５
ｍｍ）を貼り合わせた。

【００８３】さらに、上記ポリエステル不織布を貼り合
わせた下流端０〜１０ｍｍの箇所に吸水用のパッドとし
てパルプ不織布（１０ｍｍ×１０ｍｍ、厚さ５ｍｍ）を
貼り合わせて試験片を作製した。当該試験片を４つ作製
して、以下の測定に用いた。

【００８４】２）測定０．１Ｍリン酸緩衝液（０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐ
Ｈ７．４）に、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７（Kirkeg
aard & Perry Laboratories Inc.社製）を表１に示した
濃度で分散させた被検試料を調製した。

【００８５】この被検試料に実施例１〜３で作製したヤ
ギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ポリクローナル抗体
およびＨＲＰを固定化したラテックス粒子ならびに比較
例１で作製した抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ポリク
ローナル抗体を固定化した青色着色ラテックス粒子（酵
素は固定されていない）を、それぞれ固形分濃度０．０
２重量％となるように別個に混合した後、各混合液６０
μｌを上記１）で作製した各試験片のポリエステル不織
布部に別々に滴下した。

【００８６】実施例１〜３で作製した、抗体および酵素
がともに固定されているラテックス粒子を用いた試験片
については５分後、０．１Ｍリン酸緩衝液６０μｌを同
不織布部に滴下して洗浄を行い、さらに５分後、ＴＭＢ
（3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine) membrane Pe
roxidase Substrate System (Kirkegaard & Perry Labo
ratories Inc. 社製、ｐＨ４．５）６０μｌを同不織布
部に滴下し、１０分後の発色の有無を目視観察した。

【００８７】一方、比較例１で作製した、酵素を固定し
ていない青色着色ラテックス標識抗体を用いた試験片に
ついては被検試料と当該着色ラテックスの混合液を添加
して２０分後に発色の有無を確認した。

【００８８】結果を表１に示す。なお、各表における判
定基準は以下の通りである。

【００８９】＋：固定相にライン状の発色が見られる。 −：固定相にライン状の発色が見られない。

【００９０】

【表１】

【００９１】酵素が固定されていない、すなわち、着色
ラテックスによる標識では、検査するのに１×１０⁵個
／ｍｌ程度の菌数が必要であったが、本発明の酵素と抗
体とがともに固定された水分散型高分子粒子（酵素標識
特異的結合体）を用いた免疫クロマトグラフ法では、１
×１０³個／ｍｌ程度の濃度でＥ．ｃｏｌｉＯ１５
７：Ｈ７を検出することができた。

【００９２】また、厚生省Ｏ１５７研究会報告、「食品
衛生研究」, 48, 35 (1998) には、従来の免疫クロマト
グラフ法（着色ラテックスによる標識）や標識剤として
の酵素が直接結合した抗体を用いる酵素免疫クロマトグ
ラフ法を用いたＯ１５７の検出感度が１０⁵〜１０⁶個
／ｍｌ程度であることを報告している。

【００９３】これら従来の方法に比べ、本発明の酵素標
識特異的結合体を用いた免疫クロマトグラフ法では１０
０〜１０００倍程度高い感度を達成することができ、ま
た所要時間の短縮化も可能であった。

【００９４】実施例５：免疫クロマトグラフ型試験片の
使用１）標識相を有する試験片の作製実施例１で作製したヤギ抗Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ
７ポリクローナル抗体およびＨＲＰを固定化したラテッ
クス粒子分散液（２重量％）１ｍｌとサッカロース水溶
液（1 ０重量％）６ｍｌを混合し、この混合液１０μｌ
をレーヨン不織布（６ｍｍ×８ｍｍ）に含浸させたの
ち、3 ０℃で２時間乾燥させた。この不織布を実施例４
の１）と同様の方法により作製した固定相を有する試験
片の表面側に、抗体塗布箇所の反対端から１２〜２０ｍ
ｍの箇所に貼り合わせることにより、固定相および標識
相を有する試験片を作製した。

【００９５】２）測定上記１）で得られた試験片のポリエステル不織布部に実
施例４の２）で用いた被検試料６０μｌを滴下し、５分
後、０．１Ｍリン酸緩衝液６０μｌを同不織布部に滴下
して洗浄を行い、さらに５分後、ＴＭＢ（3, 3’, 5,
5’-Tetramethylbenzidine) membrane Peroxidase Subs
trate System (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.
社製、ｐＨ４．５）６０μｌを同不織布部に滴下し、
１０分後の発色の有無を目視観察した。その結果、実施
例４と同様に、１×１０³個／ｍｌ程度の濃度でＥ．ｃ
ｏｌｉＯ１５７：Ｈ７を検出することができた。

【００９６】

【発明の効果】本発明の酵素標識特異的結合体を用いる
検査方法および検査試薬においては、担体表面に特異的
結合物質及び活性を維持した状態の酵素が特定量固定さ
れていることにより、高感度高精度なイムノアッセイを
行うことができる。しかも、当該酵素標識特異的結合体
は、その製造および精製が容易である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の検査試薬の１つの態様を示す
概略図である。

【符号の説明】

１吸水性基材２固定相３標識相４試料受領部

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記工程：（１）被検物質と特異的に結合しうる第一特異的結合物
質および酵素を担体に結合させた酵素標識特異的結合体
と前記被検物質との複合体を形成させ、吸水性基材上を
展開する工程；（２）前記吸水性基材上に設けられた、前記被検物質と
特異的に結合しうる第二特異的結合物質を固定した固定
相にて前記複合体を捕捉する工程；ならびに（３）捕捉した複合体を検出する工程、を含む被検物質
の検査方法。
【請求項２】担体が金属コロイドまたは水分散型高分
子粒子である請求項１記載の検査方法。
【請求項３】水分散型高分子粒子の粒径が０．０１〜
３μｍである請求項２記載の検査方法。
【請求項４】第一および第二特異的結合物質が抗体、
抗原、ハプテンおよびオリゴヌクレオチドからなる群よ
り選ばれる１つ以上のものである請求項１〜３いずれか
記載の検査方法。
【請求項５】水分散型高分子粒子がカルボキシル基を
有する請求項２又は３記載の検査方法。
【請求項６】第一特異的結合物質および酵素が水分散
型高分子粒子とそれぞれ共有結合により結合している請
求項２又は３記載の検査方法。
【請求項７】吸水性基材がニトロセルロースである請
求項１記載の検査方法。
【請求項８】吸水性基材に第二特異的結合物質を固定
後、該基材をタンパク質、界面活性剤および糖を含有す
る溶液で処理して用いる請求項１又は７記載の検査方
法。
【請求項９】水分散型高分子粒子に固定された第一特
異的結合物質と酵素の総固定量が該高分子粒子の乾燥重
量１ｇあたり５〜２００ｍｇである請求項２又は３記載
の検査方法。
【請求項１０】水分散型高分子粒子に固定された酵素
量が該高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり１．０〜１００
ｍｇである請求項２、３又は９記載の検査方法。
【請求項１１】水分散型高分子粒子に固定された第一
特異的結合物質１モルに対して、０．６〜６０モルの比
率で酵素が固定されている請求項２、３、９又は１０記
載の検査方法。
【請求項１２】酵素がペルオキシダーゼおよびアルカ
リフォスファターゼから選ばれる少なくとも１種である
請求項１〜１１いずれか記載の検査方法。
【請求項１３】担体が着色されている請求項１〜１２
いずれか記載の検査方法。
【請求項１４】吸水性基材上に、被検物質と特異的に
結合しうる第二特異的結合物質を固定した固定相、前記
被検物質と特異的に結合しうる第一特異的結合物質およ
び酵素を担体に結合させた酵素標識特異的結合体を水と
の接触によって前記基材から離脱するように含有させた
標識相、ならびに前記標識相の上流または同じ箇所に位
置する試料受領部を設けてなる検査試薬。
【請求項１５】担体が金属コロイドまたは水分散型高
分子粒子である請求項１４記載の検査試薬。
【請求項１６】水分散型高分子粒子の粒径が０．０１
〜３μｍである請求項１５記載の検査試薬。
【請求項１７】第一および第二特異的結合物質が抗
体、抗原、ハプテンおよびオリゴヌクレオチドからなる
群より選ばれる１つ以上のものである請求項１４〜１６
いずれか記載の検査試薬。
【請求項１８】水分散型高分子粒子がカルボキシル基
を有する請求項１５又は１６記載の検査試薬。
【請求項１９】第一特異的結合物質および酵素が水分
散型高分子粒子とそれぞれ共有結合により結合している
請求項１５又は１６記載の検査試薬。
【請求項２０】吸水性基材がニトロセルロースである
請求項１４記載の検査試薬。
【請求項２１】固定相が、吸水性基材に第二特異的結
合物質を固定した後、該基材をタンパク質、界面活性剤
および糖を含有する溶液で処理したものである請求項１
４又は２０記載の検査試薬。
【請求項２２】水分散型高分子粒子に固定された第一
特異的結合物質と酵素の総固定量が該高分子粒子の乾燥
重量１ｇあたり５〜２００ｍｇである請求項１５又は１
６記載の検査試薬。
【請求項２３】水分散型高分子粒子に固定された酵素
量が該高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり１．０〜１００
ｍｇである請求項１５、１６又は２２記載の検査試薬。
【請求項２４】水分散型高分子粒子に固定された第一
特異的結合物質１モルに対して、０．６〜６０モルの比
率で酵素が固定されている請求項１５、１６、２２又は
２３記載の検査試薬。
【請求項２５】酵素がペルオキシダーゼおよびアルカ
リフォスファターゼから選ばれる少なくとも１種である
請求項１４〜２４いずれか記載の検査試薬。
【請求項２６】担体が着色されている請求項１４〜２
５いずれか記載の検査試薬。