JP2001021560A - 免疫クロマト測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】高感度であり、かつ非特異的反応を低減させう
る免疫クロマト測定法を提供すること。 【解決手段】固定相に固定された、被検物質に特異的に
結合しうる特異的結合物質と該被検物質との反応を電解
質の存在下に行うことを特徴とする免疫クロマト測定
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、非特異的反応を低
減させうる免疫クロマト測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素発色を利用した免疫測定法は、酵素
とその発色基質成分の反応によりシグナルを増幅させ、
高感度な測定を可能としている。酵素標識免疫成分とし
て酵素標識抗体が一般的に知られているが、さらに高感
度化を実現するために、水分散性粒子を酵素、抗体等の
担体として利用した免疫クロマト測定法が開発されてい
る。

【０００３】しかしながら、この方法では水分散性粒子
などを担体として有する酵素標識抗体に対する非特異的
な反応が起こる場合があり、特異的な測定が困難になる
場合があるという欠点を有する。

【０００４】かかる非特異的な反応を抑制するために、
標識免疫成分の濃度を調整した免疫測定が行われるが、
かかる免疫測定を行ったときにも、検出感度の低下を招
く場合があり、また非特異的反応の不十分な抑制によ
り、陰性を陽性と誤判定してしまうおそれがあり、特異
的な測定が困難になる場合がある。

【０００５】したがって、高感度であり、かつ非特異的
反応を低減させうる簡便な技術が求められている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、高感度であ
り、かつ非特異的反応を低減させうる免疫クロマト測定
法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、固定相
に固定された、被検物質に特異的に結合しうる特異的結
合物質と該被検物質との反応を電解質の存在下に行うこ
とを特徴とする免疫クロマト測定法に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の免疫クロマト測定法は、
固定相に固定された、被検物質に特異的に結合しうる特
異的結合物質と該被検物質との反応を電解質の存在下に
行うことを１つの特徴とする。電解質の存在により、固
定相の特異的結合物質と被検物質以外の物質との非特異
的な反応を抑制することができ、かつ高感度で、簡便な
検出を可能にする。

【０００９】本発明において、電解質とは、水、緩衝液
などの溶媒に溶解して溶液にイオン伝導性を発揮させう
る物質をいう。本発明の方法に用いられる電解質は、強
電解質が好ましい。なお、強電解質とは、溶液中でほと
んど完全に電離している電解質をいう。前記電解質のイ
オン強度は、非特異的反応の抑制の観点から、０．０５
以上であり、好ましくは、０．２以上である。具体的に
は、塩化コリン、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＫＣｌ、ＫＢ
ｒ、Ｎａ₂ ＳＯ₄ 、Ｋ₂ ＳＯ₄ 、ＭｇＣｌ₂ 、ＣａＣｌ
₂ などが挙げられる。

【００１０】固定相に固定された、被検物質に特異的に
結合しうる特異的結合物質と該被検物質との反応時にお
ける電解質の量は、非特異的反応の抑制の観点から、好
ましくは１重量％以上であり、検出感度の低下を防ぐと
いう観点から、２０重量％以下であることが望ましい。
なお、「被検物質に特異的に結合しうる特異的結合物
質」を、「被検物質に対する特異的結合物質」というこ
ともある。

【００１１】電解質は、被検物質を含む被検液に添加し
てもよく、該被検物質に対する特異的結合物質を含有し
た溶液に添加してもよい。

【００１２】また、電解質を含む溶液を吸水性基材上に
滴下することにより、被検物質に対する特異的結合物質
と該被検物質との固定相での反応の際に電解質を供給す
ることもできる。さらに、電解質は吸水性基材上の一部
や滴下パッド部に乾燥固定しておくこともでき、この場
合は被検物質の溶液や特異的結合物質の溶液を滴下する
ことで再溶解される。

【００１３】本発明の免疫クロマト測定法により検出さ
れうる被検物質としては、免疫化学的反応（すなわち抗
原抗体反応）によりサンドイッチ免疫複合体を形成し得
るものであれば特に制限されない。例えば、細菌（特に
大腸菌Ｏ１５７、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病
原性細菌）、放線菌、酵母、かび、ウイルス（特に、Ｈ
ＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等）などの微生物またはそれらに
対する抗体、細菌等が産生する毒素、あるいは腫瘍マー
カー抗原などの生体試料中の抗原性ペプチドなどが挙げ
られる。

【００１４】免疫クロマト測定法とは、例えば、以下の
ような工程を含む方法をいうが、その検出方法は特に限
定されない。すなわち、被検物質に対する特異的結合物
質が固定された固定相を有する吸水性基材からなる試験
片の一端より、該被検物質に対する標識特異的結合物質
（本発明における特異的結合体）と被検液とを別々にあ
るいはそれらの混合物を吸収させて展開すると、形成さ
れた被検物質−標識特異的結合物質複合体は、固定相に
固定化された特異的結合物質と結合して固定相上に捕捉
される。したがって、該固定相に結合した標識剤を測定
することにより被検液中の被検物質を測定することがで
きる。この場合、検出用の標識剤として酵素を用いた場
合、固定相で捕捉され形成される複合体が酵素標識複合
体となり、酵素反応により生じる産物を測定することに
より検出を行なうことができる。また、標識剤として蛍
光標識体を用いた場合、該蛍光標識体から生じる蛍光を
測定することにより行なうことができる。

【００１５】特異的結合物質としては、固定相に固定す
るもの、特異的結合体用として用いるもののいずれにお
いても被検物質に特異的に結合し得る物質であればよ
く、例えば、抗原、ハプテン、抗体、オリゴヌクレオチ
ド、エフェクター、レセプター、酵素、酵素補助因子、
酵素阻害剤などが挙げられる。前記特異的結合物質は、
検査すべき被検物質に応じて、サンドイッチ法等の通常
の検出方法で用いられる公知の物質を少なくとも１種選
択すればよい。なお、被検物質が核酸の場合、核酸を除
く特異的結合物質が用いられる。

【００１６】本発明においては、抗原、ハプテンまたは
抗体からなる群より選ばれた特異的結合物質を有し、か
つ標識剤による標識を有する担体からなる特異的結合体
を用いるのが好ましい。

【００１７】前記特異的結合物質が抗原またはハプテン
の場合、当該抗原およびハプテンとしてはクラミジア・
トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・
ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキ
ソプラズマ・ゴンディ、ボレリア等の各種微生物抗原、
マイコプラズマ脂質抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢ
ｅ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原および前
記抗原に由来するハプテン等が挙げられる。

【００１８】前記特異的結合物質が抗体の場合、当該抗
体としてはモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を
使用することができる。具体的には、抗大腸菌抗体、抗
大腸菌Ｏ１５７抗体、抗サルモネラ菌抗体、抗ブドウ球
菌抗体、抗カンピロバクター菌抗体、抗ウェルシュ菌抗
体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒ
トトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒ
ト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗
ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラ
ミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンＯ抗
体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗
体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗
体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗体、抗ＲＦ抗体等
が挙げられる。

【００１９】前記特異的結合物質が核酸の場合、該核酸
としては、前記抗原として例示された各種微生物、マイ
コプラズマ、各種ウイルスに由来する核酸成分に相補的
なオリゴヌクレオチド等が挙げられる。

【００２０】特異的結合体に用いられる担体としては、
その表面上に、特異的結合物質および標識剤を固定する
ことができる担体であればよく、金属コロイド、水分散
型高分子粒子、シリコーン、シリカ、ガラスケイソウ土
等が挙げられる。

【００２１】金属コロイドとしては、金コロイドやセレ
ニウムコロイド等が例示される。

【００２２】前記水分散型高分子粒子は、不飽和二重結
合を有する少なくとも１種の単量体の乳化重合によって
調製される。かかる単量体としては、例えば、エチレ
ン、プロピレンなどのオレフィン系単量体、酢酸ビニ
ル、塩化ビニルなどのビニル系単量体、スチレン、メチ
ルスチレン、クロロスチレンなどのスチレン系単量体、
アクリル酸メチルなどのメタクリル酸エステル系単量
体、ブタジエンなどのジエン系単量体などが用いられ
る。

【００２３】水分散型高分子粒子は、単量体の単独重合
体または共重合体に改質用単量体を共重合して得られた
重合体でもよい。このような改質用単量体としては、例
えば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフ
ルオロエチルメチルメタクリレートなどのフッ素化メタ
クリル酸エステル、アクリロニトリル、メタクリロニト
リル、アクリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウ
ム、スルホプロピル（メタ）アクリレートナトリウム
塩、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチ
ルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレー
ト、グリシジルメタクリレートなどが挙げられる。

【００２４】また本発明においては、市販されている水
分散型高分子粒子でもよい。市販されている水分散型高
分子粒子としては、例えば、スチレン−ブタジエン共重
合体、スチレン−アクリロニトリル−ブタジエン共重合
体などの種々のスチレン共重合体からなるエマルジョン
などのスチレンまたはその誘導体を単量体成分とする単
独重合体や共重合体のエマルジョン；（メタ）アクリル
酸の長鎖アルキルエステルまたはその誘導体を単量体成
分とする単独重合体、該単量体成分と（メタ）アクリル
酸メチルや（メタ）アクリル酸エチル、グリシジル（メ
タ）アクリレートなどとの共重合体；前記したスチレン
またはその誘導体と、（メタ）アクリレートエステルや
その誘導体との共重合体；ゴム；ナイロン；ポリウレタ
ン；微結晶質セルロースなどが挙げられる。

【００２５】個々の単量体の具体的な種類は、得られる
水分散型高分子粒子を担体として使用された特異的結合
体が、その使用時や保存時に融着、凝集を起こさないよ
うに、当該高分子粒子が所要のガラス転移点を有するよ
うに選ばれる。水分散型高分子粒子のガラス転移点は、
好ましくは１０℃以上、特に室温以上が好ましい。

【００２６】上記水分散型高分子粒子のうち、粒子の安
定性の点から、スチレン系単量体を主成分とする重合体
が好ましく、また、特異的結合物質および標識剤を固定
するために、アクリル酸やメタクリル酸などのカルボキ
シル基を有する単量体を共重合した高分子粒子が好まし
い。

【００２７】前記担体は、色を有する粒子であってもよ
い。色を有する担体を用いた場合、被検物質の濃度が高
いと酵素反応を行う前に着色の程度により判定が可能と
なる。ここで用いる色を有する担体としては、肉眼で色
を検出することが可能なできる担体であれば特に限定さ
れないが、例えば、スダンブルーやスダンレッドIV、ス
ダン III、オイルオレンジ、キニザリングリーンなどに
代表される顔料や染料などで着色された水分散型高分子
粒子などを用いることができる。目視確認性の点から
は、青色、赤色、緑色またはオレンジ色に呈色した水分
散型高分子粒子が好ましい。分散安定性や被検物質の検
出感度の調整し易さなどの点から青色または赤色などに
呈色したラテックスが望ましい。

【００２８】前記担体は、表面への特異的結合物質およ
び標識剤の固定、スペーサーの導入、あるいは水分散状
態での安定性の向上のために官能基を有していてもよ
い。このような官能基としては、例えばカルボキシル
基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、ホルミル基、カ
ルバモイル基、イソチオシアナート基、アジドカルボニ
ル基、ヒドラジド基、酸無水物基などを挙げることがで
き、好ましくはカルボキシル基が導入される。これらの
官能基を有する担体を調製するには、単量体成分とし
て、例えば、アクリル酸、メタクリル酸のようなカルボ
キシル基を有する単量体、例えばヒドロキシエチルアク
リレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレートのよう
な水酸基を有する単量体、例えば、グリシジルメタクリ
レートのようなグリシジル基を有する単量体を、必要に
応じて、他の共重合性単量体と乳化共重合させることに
よって、それぞれカルボキシル基、水酸基およびグリシ
ジル基を有する担体を得ることができる。また、所要の
単量体成分を重合させた後、得られた担体に官能基を導
入することもできる。

【００２９】担体の粒子径は、分散性、ならびに酵素、
特異的結合物質などの固定性の観点から、好ましくは３
μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以下であり、得られ
た特異的結合体の精製の容易性の観点から、好ましくは
０．０１μｍ以上、さらに好ましくは０．１μｍ以上で
ある。

【００３０】標識剤としては、酵素、蛍光標識体などが
挙げられ、酵素および蛍光標識体が好ましい。かかる標
識剤は、単独でまたは２種以上を混合して用いることが
できる。

【００３１】前記酵素としては、公知の標識に用いられ
る酵素を用いることができる。具体的にはペルオキシダ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エス
テラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼなどが挙げられ
る。より高感度で安定な検出を達成することが可能なペ
ルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼが好まし
い。

【００３２】前記蛍光標識としては、フルオレセインイ
ソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシ
アネートなどが挙げられる。

【００３３】担体に、特異的結合物質および標識剤を固
定させる方法としては、疎水結合（物理的吸着）、イオ
ン結合、共有結合などが利用できる。安定性の観点か
ら、共有結合により強力に固定することが好ましい。ま
た、本発明においては、共有結合を介して結合させる際
に、必要に応じて、特異的結合物質などの当該高分子粒
子上での自由度を高めるために、スペーサー基を介在さ
せることができる。スペーサー基は、予め水分散型高分
子粒子に結合させた後、特異的結合物質および標識剤と
結合させてもよく、予め特異的結合物質および標識剤に
結合させ、これを水分散型高分子粒子に結合させてもよ
い。更に、必要に応じて、水分散型高分子粒子、特異的
結合物質および標識剤の全てに予めスペーサー基を結合
させ、これらを相互に結合させることもできる。

【００３４】スペーサー基として用い得る化合物は、少
なくとも二官能性の有機化合物であり、特に炭素数１〜
１２の炭素鎖基を有する二官能性の有機化合物が好まし
い。このようなスペーサー基として機能する化合物とし
ては、特に限定されないが、例えば、ヘキサメチレンジ
アミン、ドデカメチレンジアミン、キシリレンジアミン
等のジアミン類、グリシン、β−アミノプロピオン酸、
γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、ε−アミノカ
プリル酸等のアミノアルキルカルボン酸、リジン、グル
タミン酸、β−アラニン、アルギニン、グリシルグリシ
ン等のアミノ酸類等が好ましい。

【００３５】水分散型高分子粒子に直接またはスペーサ
ー基を介して特異的結合物質および標識剤を共有結合に
て結合させるための方法は、特に限定されず、慣用の方
法が挙げられる。好ましい方法としては、例えば、結合
試薬として水溶性カルボジイミドを用いる方法が挙げら
れる。例えば、アミノアルキルカルボン酸をスペーサー
基として用いる場合であれば、水溶性カルボジイミドを
用いて、アミノアルキルカルボン酸を水分散型高分子粒
子に結合させ、次いで、当該水分散型高分子粒子に結合
したアミノアルキルカルボン酸に水溶性カルボジイミド
を用いて同様にして、特異的結合物質および標識剤を共
有結合にて結合させることができる。

【００３６】かかる方法において用いる水溶性カルボジ
イミドとしては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シク
ロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイ
ミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート等を挙げること
ができる。このような水溶性カルボジイミドを用いて、
スペーサー基を介するまたは直接的な、共有結合による
特異的結合物質およびペルオキシダーゼの水分散型高分
子粒子への結合は、慣用の方法および条件により行なう
ことができる。本発明において、特異的結合物質および
標識剤の担体への結合は、両者の結合を同時に行なって
もよく、別々に行なってもよい。

【００３７】このようにして得られた特異的結合体中に
含まれる特異的結合物質および標識剤の総固定量は、担
体の乾燥重量１ｇあたり好ましくは５〜２００ｍｇであ
り、その量は上記の範囲内で、使用する特異的結合物
質、標識剤の種類などによって適宜変更し得る。例え
ば、担体が水分散型高分子粒子の場合、当該粒子の表面
積に鑑みると、前記総固定量は、水分散型高分子粒子の
乾燥重量１ｇあたり２００ｍｇ以下が好ましく、さらに
好ましくは１５０ｍｇ以下であり、被検物質の検出の迅
速性、感度、再現性の観点から、５ｍｇ以上が好まし
く、１０ｍｇ以上がさらに好ましい。

【００３８】ここで、担体の「乾燥重量」とは、一定量
の担体を１２０℃で２時間乾燥した後の重量をいう。

【００３９】本発明において、標識剤として、酵素を用
いる場合、標識量はその活性としても表すことができ
る。勿論、用いる酵素の種類、その基質、温度など種々
の条件によって異なる。用いる酵素がペルオキシダーゼ
である場合には、活性は以下の方法で測定する：基質で
ある、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベン
ジジン）０．２ｍｇ／ｍｌと過酸化水素０．０１％とを
含む０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）３．３ｍ
ｌに、特異的結合体０．０１２５重量％懸濁液を１００
μｌ混合して、２５℃で反応、５８０ｎｍの波長での吸
光度を経時的に測定し、１分間に当該吸光度を１増加さ
せる酵素活性を１Ｕ（ユニット）として換算する。

【００４０】例えば、ペルオキシダーゼの場合、特異的
結合体が、水分散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり、
５，０００〜３００，０００Ｕ、好ましくは１０，００
０〜３００，０００Ｕ、より好ましくは５０，０００〜
３００，０００Ｕの酵素活性を有するように該ペルオキ
シダーゼが固定されている事が望ましい。

【００４１】特異的結合物質がペプチドを有する抗体、
抗原もしくはハプテンである場合、または標識剤が酵素
である場合、その固定量の測定は、色素結合法などの慣
用のタンパク質定量法により測定し、タンパク質の量と
して算出する。特異的結合物質がオリゴヌクレオチドの
場合は、固定後の遊離のオリゴヌクレオチドを２６０ｎ
ｍの吸光度を測定することにより算出する。

【００４２】このように担体に特異的結合物質および標
識剤を固定させた後、例えば膜分離法や濾過、遠心分離
法などの慣用の分離法によって、特異的結合体を分離精
製することができる。特異的結合体は、水中に浸漬して
保存してもよく、または凍結乾燥して保存してもよい。

【００４３】本発明の免疫クロマト測定法に用いる吸水
性基材は、被検液を吸収できる基材、またはこれらを緩
衝液によって希釈した希釈液を吸収する基材であれば特
に限定されない。本発明においては、被検液中の被検物
質と特異的結合体や固定相の特異的結合物質と充分な反
応を行うための時間を確保できるような吸水性基材が用
いられる。好ましい具体例としては、適度な吸水速度を
有する観点から、例えば、不織布、濾紙、ガラス繊維
布、ガラスフィルター、ニトロセルロース、多孔質材料
等が挙げられる。

【００４４】吸水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の
短冊状に裁断した吸水性基材の片端部に水を浸漬し、１
分間経過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが好
ましい。親水性重合体を使用して吸水性基材の吸水性を
調整することもできる。

【００４５】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検液を展開できる形状であれば特に限定されるものでは
なく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等が
好ましい。

【００４６】固定相に固定された、被検物質に特異的に
結合し得る特異的結合物質は、前記特異的結合体に用い
られる特異的結合物質と同様である。例えば、特異的結
合体に用いられる特異的結合物質が抗体の場合、固定相
には、同じ抗体または同一抗原の別のエピトープを認識
する抗体を使用することができる。特異的結合体に用い
られる特異的結合物質が抗原やハプテンの場合、固定相
には、同一の抗原、ハプテンあるいは特異的結合物質と
は異なるが被検物質と特異的に結合し得る抗原、抗体、
ハプテンなどが用いられる。特異的結合物質がオリゴヌ
クレオチドの場合は、固定相には、特異的結合物質であ
るオリゴヌクレオチドの配列とは異なるが、被検物質の
他の部分に対するオリゴヌクレオチドが利用できる。

【００４７】固定相は、公知の物理吸着法、共有結合法
などにより作製されうる。また、固定相に使用する特異
的結合物質と親水性重合体とを含む溶液を吸水性基材に
塗布した後、該親水性重合体を凝固させる凝固溶剤に浸
漬することで固定相を作製することもできる。親水性重
合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、
ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロースな
どが挙げられる。凝固溶剤としては、アセトン、エタノ
ール、メタノール、エーテルなどが挙げられる。

【００４８】固定相は、被検液の吸液によって展開し移
動してきた複合体を捕捉するために、吸水性基材上に特
異的結合物質を好ましくは０．００５〜５ｍｇ／ｃｍ²
塗布する。

【００４９】固定後の吸水性基材は、不用なタンパク質
の基材への非特異的吸着の防止、展開の容易性、特異的
結合物質の安定性の観点から、ブロッキング剤、界面活
性剤および糖を含有する溶液で処理されることが好まし
い。ここで、使用するブロッキング剤としては、ウシ血
清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク等が
挙げられる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン
（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアル
キルアリルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレ
ンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。糖として
は、グルコース、トレハロース、サッカロース等が挙げ
られる。処理液中のタンパク質の含有量は、好ましくは
０．１〜１０重量％である。界面活性剤の含有量は、好
ましくは０．０１〜１重量％である。糖の含有量は、
０．１〜１０重量％である。

【００５０】本発明に用いられる吸水性基材には、試料
受領部（試料を供するための部分）、発色基質溶液受領
部（発色基質溶液を供給するための部分）を設けてもよ
い。また、前記特異的結合体を展開できるように吸水性
基材に固定させてもよい。

【００５１】また、本発明に用いられる吸水性基材にお
いて、展開移動距離は、固定相での発色の均一性および
発色感度の観点から、０．５ｃｍ以上、好ましくは１ｃ
ｍ以上となり、固定相までの被検液の到達性、発色感度
および測定時間の観点から、６ｃｍ以下、好ましくは４
ｃｍ以下となるように設定されていることが好ましい。

【００５２】本発明においては、前記展開移動距離を得
るように、試料受領部、固定相などを配置した試験片を
用いることができる。

【００５３】展開方法としては、吸水性基材の一端側か
ら、上記の方法で調製した複合体の溶液を加え、毛細管
現象によって自然展開させる。また、試料受領部の反対
端に吸水パッドを設けることによって吸水性基材中を展
開する液体成分を吸収するので展開が容易に進行する。

【００５４】ついで、形成した被検物質−特異的結合物
質複合体を検出する。被検物質−特異的結合物質複合体
の検出は、標識剤で標識した特異的結合体を用いた場
合、標識剤を測定することにより検出することができ、
色を有する担体を有する特異的結合体を用いた場合、固
定相における呈色の有無により検出できる。

【００５５】

【実施例】調製例１ 特異的結合体溶液の調製 １）ラテックス粒子懸濁液の作製 スチレン５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエチレング
リコールメタクリレート０．２ｇ、蒸留水４４０ｇから
なる混合液を窒素ガス雰囲気下で７５℃に維持し、攪拌
しながら、重合開始剤としての過硫酸カリウム０．２５
ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１０時間重
合を行なった。その結果、カルボキシル化された水分散
性粒子としてカルボキシル化ポリスチレンラテックス粒
子（平均粒子径：約０．２μｍ）を得た。

【００５６】得られたカルボキシル化ポリスチレンラテ
ックス粒子を緩衝液〔０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ
８．２〕に固形分濃度が５重量％になるように分散し
た。

【００５７】２）固定化 本実施例では特異的結合物質として抗体（抗Ｏ１５７抗
体）及び酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を上記
１）で作製したラテックス粒子に以下のようにして固定
した。

【００５８】上記ラテックス粒子の分散液３ｍｌに、水
溶性カルボジイミド（DOJIN 社製、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ
８．２）０．５ｍｌ、抗Ｏ１５７抗体（Kirkegaard & P
erry Laboratories Inc.社製、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１
Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）２．１ｍｌを加えて１
０℃で３時間反応させた後、洗浄液として０．０１Ｍ−
ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２を用いて遠心分離洗浄を行
い、同緩衝液で固形分濃度５重量％に調製した。

【００５９】次いで、上記で作製した抗体固定化ラテッ
クス粒子懸濁液３ｍｌに、水溶性カルボジイミド（DOJI
N 社製、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍｌ、０．０１
Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）１ｍｌ、西洋ワサビ由
来ペルオキシダーゼ〔以下ＨＲＰと略す：和光純薬社
製、１２ｍｇ／ｍｌ（比活性２５０〜３５０Ｕ／ｍ
ｇ）、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２〕２ｍｌ
を加えて１０℃で３時間反応させた後、洗浄液として
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を用いて遠心
分離洗浄を行なった。同緩衝液で固形分濃度２．５重量
％に調製し、抗Ｏ１５７抗体およびＨＲＰを固定化した
ラテックス粒子を作製した。

【００６０】得られたラテックス粒子において、抗体
（分子量約１６万）の固定量は１１．１ｍｇ、酵素（分
子量約４万）の固定量は１７．３ｍｇであった。また、
酵素活性は、ラテックス粒子の乾燥重量１ｇあたり８５
２３０Ｕであった。

【００６１】３）特異的結合体溶液の調製 前記ラテックス粒子懸濁液と緩衝溶液〔ｐＨ８．０、組
成：０．２Ｍ−ＮＨ₄Ｃｌ、１重量％ サッカロース、
０．１５重量％ クロロブタノール、０．４５重量％
ｐ−オキシ安息香酸メチル、０．１重量％ ウシ血清ア
ルブミン〕を用いて、表１に示す特異的結合体溶液を調
製した。なお、比較例２および３の特異的結合体溶液
は、表１に示すラテックス量にした他は、比較例１の特
異的結合体溶液と同様の組成である。

【００６２】

【表１】

【００６３】調製例２ 免疫クロマトグラフ型試験片の
作製 ニトロセルロースメンブレン（孔径８μｍ、６ｍｍ×４
０ｍｍ）の一端から２０ｍｍの箇所に抗Ｏ１５７抗体
（１ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍ−リン酸緩衝液、ｐＨ７．
４）を１．５μｌ、ディスペンサーを用いてライン状
（幅１ｍｍ）に塗布した（固定相）。

【００６４】このメンブレンをウシ血清アルブミン（オ
リエンタル酵母社製、１重量％）およびポリオキシエチ
レン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業
社製、０．１重量％）、サッカロース（和光純薬工業社
製、１重量％）からなる水溶液中に１０分間浸漬させて
のち、４０℃で２時間乾燥させた。次いで、このメンブ
レンの裏側（抗体塗布面の反対側）にポリエステルフィ
ルム（１００μｍ厚）をスプレー糊を用いて貼り合わせ
た。

【００６５】抗体塗布箇所の端から４〜１０ｍｍの箇所
にポリエステル製不織布（６ｍｍ×６ｍｍ、厚さ１ｍ
ｍ）を貼り合わせ、試料受領部を作製した。また、試料
受領部を中心として、抗体塗布箇所の逆側の端から５〜
１７ｍｍの箇所にポリエステル製不織布（６ｍｍ×１２
ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合わせ、発色基質溶液受領部
を作製した。

【００６６】さらに、抗体塗布箇所側の端１０〜４０ｍ
ｍの箇所に吸水剤としてガラス繊維製不織布（ワットマ
ン社製）ＧＦ／Ｂ（１５ｍｍ×３０ｍｍ×厚さ１ｍｍ）
を貼り合わせた。前記のようにして得られた試験片は、
一例であり、かかる試験片にのみ限定されるものではな
い。

【００６７】試験例 市販のＯ１５７：Ｈ７陽性コントロール（KPL 社製）を
０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）中、０（対
照）、１０⁴ または１０⁵ 細胞／ｍｌの濃度になるよう
に添加し、被検液を調製した。

【００６８】前記被検液５０μｌを調製例２で作製した
５個の試験片の試料受領部にそれぞれ供し、直ちに被検
試料を展開させた前記５個の試験片のそれぞれの試験受
領部に実施例１、２、比較例１〜３の各特異的結合体２
５μｌを供し、直ちに特異的結合体を展開させた前記５
個の試験片のそれぞれの発色基質溶液受領部に発色基質
溶液〔組成：０．１Ｍ−ＮＨ₄ Ｃｌ（０．９重量％Ｎａ
Ｃｌ含有）（ｐＨ８．０）中０．２重量％ ３，３’，
５，５’−テトラメチルベンジジン、１重量％ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）、０．０１重量％ Ｈ
₂ Ｏ₂ 、０．１２重量％ 硫酸デキストラン〕１００μ
ｌを供し、展開させた。展開後、それぞれの試験片の固
定相における１５分後の発色の有無を目視観察した。結
果を表２に示す。なお、判定基準は、以下の通りであ
る。

【００６９】対照および被検試料を用いた測定 ＋：固定相に発色が見られる ±：固定相に弱い発色が見られる −：固定相に発色が見られない

【００７０】

【表２】

【００７１】電解質として、実施例１または２の特異的
結合体溶液を用いた場合、塩化コリン（実施例１）また
はＮａＣｌ（実施例２）の存在により、対照では、発色
が検出されなかったが、１０⁴ 、１０⁵ 細胞／ｍｌの濃
度の被検液では発色が検出され、非特異的発色が抑制さ
れ、かつ検出感度も良好であった。このことにより、電
解質（塩化コリンまたはＮａＣｌ）の存在により非特異
的な抗原抗体反応が抑制されることが示唆される。

【００７２】一方、電解質を含有しない比較例１の特異
的結合体溶液を用いた場合、対照で非特異的な発色が検
出された。また、比較例１の特異的結合体溶液の１／２
のラテックス量である比較例２の特異的結合体溶液を用
いた場合にも、対照で非特異的な発色が検出された。さ
らに、比較例１の特異的結合体溶液の１／１０のラテッ
クス量である比較例３の特異的結合体溶液を用いた場
合、対照における非特異的発色は検出されなかったが、
１０⁴ 細胞／ｍｌの被検液で発色が検出されず、検出感
度が低下した。

【００７３】

【発明の効果】本発明の免疫クロマト測定法によれば、
被検物質に特異的に結合する固定相と被検物質との非特
異的な反応を抑制することができ、かつ高感度で簡便な
検出を可能であるという優れた効果を奏する。したがっ
て、本発明の免疫クロマト測定法は、より高感度で特異
的な検出が望まれる分野で幅広く使用することができ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 辰已 元茂 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内 (72)発明者 田中 康進 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内 (72)発明者 岡田 圭策 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 固定相に固定された、被検物質に特異的
   に結合しうる特異的結合物質と該被検物質との反応を電
   解質の存在下に行うことを特徴とする免疫クロマト測定
   法。
2. 【請求項２】 電解質が強電解質である請求項１記載の
   免疫クロマト測定法。
3. 【請求項３】 強電解質のイオン強度が０．０５以上で
   ある請求項２記載の免疫クロマト測定法。
4. 【請求項４】 強電解質が塩化コリンまたはＮａＣｌで
   ある請求項２記載の免疫クロマト測定法。
5. 【請求項５】 被検物質を含む被検液および／または該
   被検物質に対する特異的結合物質を含有した溶液にさら
   に電解質を添加した溶液を、吸水性基材に展開させるこ
   とを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の免疫クロマ
   ト測定法。
6. 【請求項６】 電解質を含有した溶液を滴下する、請求
   項１〜４いずれか記載の免疫測定法。