JP2002350443A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】カゲ状発色を抑制し、試験開始からの時間にか
かわらず被検物質の有無を高い確実性で判定するための
免疫測定法を提供すること。 【解決手段】免疫クロマトグラフ法において、多価アル
コールの存在下に、 （ａ）吸水性基材上に、被検物質に特異的に結合しうる
第１の特異的結合物質が固定化された固定相を有する試
験片 上で、被検試料中における被検物質の有無を、下記
（ｂ）と（ｃ）： （ｂ）試験片の固定相における第１の特異的結合物質に
捕捉される被検物質、 （ｃ）担体に、被検物質に特異的に結合しうる第２の特
異的結合物質と標識物質とを固定化した標識複合体、と
の複合体 の有無により検出する免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カゲ状発色が抑制
されうる免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】感染性病原体等の検査、または感染症を
はじめとする種々の疾患の診断分野において、被検物質
を高感度かつ再現性よく測定するために、酵素免疫法
（ＥＩＡ法）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ法）等の
免疫測定法が汎用されている。しかしながら、かかる方
法は、特別な設備が必要である。さらに、免疫測定法
は、操作時間、反応時間または検出時間が長く、洗浄工
程も有するため、結果が出るまでに時間がかかるという
欠点を有する。

【０００３】近年、迅速かつ簡便に免疫化学的検査が行
なえる方法として、免疫クロマトグラフ法が注目されて
いる。当該方法は、例えば以下の工程を経る。被検試料
中に被検物質が存在する場合、試験片上に被検物質と結
合しうる特異的結合物質を固定化した固定相に、該被検
物質に特異的に結合しうる特異的結合物質と標識物質と
を含有した標識複合体と該被検物質との複合体を形成さ
せる。続いて固定相にて結合した標識物質を検出するこ
とにより、被検試料中に被検物質の存在を確認すること
ができる。被検試料中に被検物質が存在しない場合は、
固定相で複合体が形成されないため、標識複合体は検出
されず、被検試料中に被検物質が存在しないことを確認
することができる。この測定にかかる時間は１０〜２０
分であり、測定開始から１０〜２０分後に被検物質の有
無を判定するように規定されているものがほとんどであ
る。

【０００４】免疫クロマトグラフ測定法を構築するにあ
たりよく問題となるのは、被検試料中に被検物質が存在
しない場合に固定相と標識複合体とが非特異的に結合す
る現象である。この非特異的な結合は、標識複合体の量
を減らしたり、非特異抑制物質を添加することで改善可
能である。

【０００５】また、被検試料中に被検物質が存在しない
場合において、規定の判定時間を経過すると、固定相が
浮き上がって見える現象（以下、カゲ状発色という）が
生じ、判定の確実性が低下するといった問題も頻繁に見
受けられる。しかしながら、これは標識複合体量を減ら
したり、非特異抑制物質を添加することでは改善不可能
である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、カゲ
状発色を抑制し、試験開始からの時間にかかわらず被検
物質の有無を高い確実性で判定するための免疫測定法を
提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、免
疫クロマトグラフ法において、多価アルコールの存在下
に、 （ａ）吸水性基材上に、被検物質に特異的に結合しうる
第１の特異的結合物質が固定化された固定相を有する試
験片 上で、被検試料中における被検物質の有無を、下記
（ｂ）と（ｃ）： （ｂ）試験片の固定相における第１の特異的結合物質に
捕捉される被検物質、 （ｃ）担体に、被検物質に特異的に結合しうる第２の特
異的結合物質と標識物質とを固定化した標識複合体、と
の複合体 の有無により検出する免疫測定法に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明者らは検討の結果、カゲ状
発色は吸水性基材の乾燥に起因することを見い出した。
従って、本発明によれば、多価アルコールの存在下に被
検試料を展開することで多価アルコールの乾燥防止作用
により試験片の乾燥が防止される。これにより、免疫ク
ロマトグラフ法におけるカゲ状発色が抑制される。

【０００９】本発明の免疫測定法において、多価アルコ
ールとしては、乾燥防止作用を有し、免疫クロマトグラ
フ測定を阻害しないものであれば良く、中でも炭素数が
３〜１０で、価数が２〜５の多価アルコールが好適であ
る。例えば、ヘキサントリオール、グリセロール、プロ
パンジオール等が挙げられる。なかでも、免疫クロマト
グラフ測定を阻害せずカゲ状発色抑制効果が高いという
観点から、へキサントリオール、プロパンジオールが好
ましい。

【００１０】多価アルコールの存在下に免疫測定を行な
う方法は特に限定されない。具体的には、被検試料を滴
下するステップの後に、多価アルコールを含有した展開
組成液を滴下して展開するステップを含む免疫測定を行
なってもよい。また、展開組成液を滴下するための展開
組成液受領部及び／又は該展開組成液受領部と固定相と
の間に、展開組成液との接触により、多価アルコールを
脱離可能に保持した多価アルコール相を有する試験片を
用いて、免疫測定を行なってもよい。多価アルコール相
を有する試験片を用いる場合、展開組成液には多価アル
コールを含有させなくてもよいが、含有させていてもよ
い。また、展開組成液を滴下した後に、多価アルコール
を含む洗浄液を展開させてもよいし、多価アルコールを
含む液に試験片を浸漬してもよい。

【００１１】固定相を通過する多価アルコールの量は、
カゲ状発色を抑制し、かつ免疫測定を阻害しないという
観点から、固定相の面積１０ｍｍ² あたり２〜６０ｍｇ
が好ましく、４〜５０ｍｇがより好ましい。従って、こ
のような多価アルコール量になるように、展開組成液中
に多価アルコールを含有させる場合は、展開組成液１０
０重量部に対して好ましくは０．５〜１４０重量部、さ
らに好ましくは１〜５５重量部を混合し、また、多価ア
ルコール相を設ける場合は、展開組成液との接触により
脱離する量が前記の量になるように試験片に保持させ
る。多価アルコール相を設けると共に展開組成液中にも
多価アルコールを含有させる場合は、合計量が前記の量
となるように調整される。

【００１２】本発明によれば、被検試料中における被検
物質の有無を、下記（ｂ）と（ｃ）： （ｂ）試験片の固定相における第１の特異的結合物質に
捕捉される被検物質、 （ｃ）担体に、被検物質に特異的に結合しうる第２の特
異的結合物質と標識物質とを固定化した標識複合体、と
の複合体 の有無により検出することができる。

【００１３】本発明の免疫測定法により検出されうる被
検物質としては、免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反
応）によりサンドイッチ免疫複合体を形成し得るもので
あれば特に制限されない。例えば、細菌（特にＯ１５
７、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病原性大腸
菌）、放線菌、酵母、かび、ウィルス（特にＨＩＶ、Ｈ
ＢＶ、ＨＣＶ等）等の微生物またはそれらに対する抗
体、細菌等が産生する毒素等の細菌由来の物質、あるい
は腫瘍マーカー抗原等の生体試料中の抗原性ペプチド等
が挙げられる。

【００１４】本発明の免疫測定法において、被検試料と
しては、前記被検物質を含有する疑いがある試料が挙げ
られる。前記被検試料は、液体試料であってもよく、固
体試料であってもよい。固体試料の場合、該固体試料
を、例えば、 緩衝液、 生理食塩水、 培養液等の溶媒に溶
解または希釈して得られた溶液として用いてもよい。

【００１５】特異的結合物質としては、被検物質に特異
的に結合し得る物質であればよく、例えば、抗原、ハプ
テン、抗体、オリゴヌクレオチド、エフェクター、レセ
プター、酵素、酵素補助因子、 酵素阻害剤等が挙げられ
る。前記特異的結合物質は、被検物質に応じて、サンド
イッチ法等の通常の検出方法で用いられる公知の物質を
少なくとも１種選択すればよい。なお、被検物質が核酸
の場合、核酸を除く特異的結合物質が用いられる。

【００１６】前記特異的結合物質が抗原またはハプテン
の場合、当該抗原およびハプテンとしてはクラミジア・
トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・
ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキ
ソプラズマ・ゴンディ、ボレリア等の各種微生物抗原、
マイコプラズマ脂質抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢ
ｅ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原および前
記抗原に由来するハプテン等があげられる。

【００１７】前記特異的結合物質が抗体の場合、当該抗
体としてはモノクロナール抗体やポリクロナール抗体を
使用することができる。具体的には、抗大腸菌抗体、抗
リステリア菌抗体、抗サルモネラ菌抗体、抗カンピロバ
クター菌抗体、抗ウェルシュ菌抗体、抗腸炎ビブリオ菌
抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒトトランスフェリン抗
体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒト免疫グロブリン抗
体、抗マイクログロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗トロ
ポニン抗体、抗ＨＧＣ抗体、抗クラミジア・トラコマテ
ィス抗体、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ヘリコバクタ
ー・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗体、抗ＨＢｅ抗体、
抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＨＩＶ抗体、
抗ロタウイルス抗体、抗ＲＦ抗体等が挙げられる。

【００１８】前記特異的結合物質が核酸の場合、該核酸
としては前記抗原として例示された各種微生物、マイコ
プラズマ、各種ウイルスに由来する核酸成分に相補的な
オリゴヌクレオチド等が挙げられる。

【００１９】本発明においては、被検物質の検出に際し
て、抗原、ハプテンまたは抗体からなる群より選ばれた
特異的結合物質を有し、かつ標識物質による標識を有す
る担体からなる標識複合体を用いることが、高感度検出
という観点から好ましい。

【００２０】なお、本明細書において、「特異的結合物
質」には、標識複合体に用いられる特異的結合物質（第
２の特異的結合物質）、および展開した被検物質を試験
片上で捕捉するための固定相に用いられる特異的結合物
質（第１の特異的結合物質）のいずれもが包含される。
したがって、単に「特異的結合物質」と記載する場合、
第１または第２のいずれか、あるいは第１および第２の
特異的結合物質を総称することを意図する。

【００２１】標識複合体に用いられる担体としては、そ
の表面上に、特異的結合物質および標識物質を固定する
ことができる担体であればよく、金属コロイド粒子、水
分散型高分子粒子、シリコーン、ガラスケイソウ土粒子
等が挙げられる。

【００２２】金属コロイド粒子としては、金コロイド粒
子やセレニウムコロイド粒子等が例示される。

【００２３】水分散型高分子粒子としては、粒径コント
ロール、分散安定性、結合容易性の観点から、ラテック
ス粒子が好ましい。前記水分散型高分子粒子は、例え
ば、不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体の
乳化重合によって調製される。かかる単量体としては、
例えば、エチレン、プロピレン等のオレフィン系単量
体、酢酸ビニル、塩化ビニル等のビニル系単量体、スチ
レン、メチルスチレン、クロロスチレン等のスチレン系
単量体、メタアクリル酸メチル等のメタクリル酸エステ
ル系単量体、ブタジエン等のジエン系単量体等が挙げら
れる。

【００２４】前記担体は、色を有する粒子（着色粒子と
いう）であってもよい。前記着色粒子によれば、被検物
質の濃度が高い場合、酵素反応を行なう前に着色の程度
により判定が可能となる。ここで用いる着色粒子として
は、肉眼で色を検出することが可能な粒子であれば特に
限定されないが、例えば、スダンブルーやスダンレッド
IV、スダン III、オイルオレンジ、キニザリングリーン
等に代表される顔料や染料等で着色された水分散型高分
子粒子等が挙げられる。目視確認性の点からは、青色、
赤色、緑色またはオレンジ色に着色した水分散型高分子
粒子を用いることが望ましく、分散安定性や被検物質の
検出感度の調整し易さ等の観点から、青色または赤色等
に着色したラテックス粒子がより望ましい。

【００２５】担体の粒子径は、分散性、ならびに酵素、
特異的結合物質等の固定化量の調整を良好にする観点か
ら、好ましくは３μｍ以下、さらに好ましくは２μｍ以
下であり、得られた標識複合体の精製の容易性の観点か
ら、好ましくは０．０１μｍ以上、さらに好ましくは
０．１μｍ以上であることが望ましい。

【００２６】標識複合体に用いられる標識物質として
は、酵素、蛍光物質等が挙げられる。かかる標識物質
は、単独でまたは２種以上を混合して用いることができ
る。

【００２７】前記酵素としては、公知の標識に用いられ
る酵素を用いることができる。具体的にはペルオキシダ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エス
テラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられる。
より高感度で安定な検出を達成することが可能なペルオ
キシダーゼまたはアルカリホスファターゼが好ましい。

【００２８】前記蛍光物質としては、フルオレセインイ
ソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシ
アネート等が挙げられる。

【００２９】担体に、特異的結合物質および標識物質を
固定させる方法としては、疎水結合（物理的吸着）、イ
オン結合、共有結合等が利用できる。安定性の観点か
ら、共有結合を介して結合させる際に、必要に応じて、
特異的結合物質等の当該高分子粒子上での自由度を高め
るために、スペーサー基を介在させることができる。

【００３０】このようにして得られた標識複合体中に含
まれる特異的結合物質および標識物質の総固定量は、担
体の乾燥重量１ｇあたり好ましくは５〜２００ｍｇであ
り、その量は上記の範囲内で、使用する特異的結合物
質、標識物質の種類等によって適宜変更し得る。例え
ば、担体が水分散型高分子粒子の場合、当該粒子の表面
積に鑑みると、前記総固定量は、水分散型高分子粒子の
乾燥重量１ｇあたり、好ましくは２００ｍｇ以下であ
り、さらに好ましくは１５０ｍｇ以下であり、被検物質
の検出の迅速性、感度、再現性の観点から、好ましくは
５ｍｇ以上であり、さらに好ましくは１０ｍｇ以上であ
ることが望ましい。

【００３１】ここで、担体の「乾燥重量」とは、一定量
の担体を１２０℃で２時間乾燥した後の重量をいう。

【００３２】本発明において、標識物質として、酵素を
用いる場合は、標識量はその活性としても表わすことが
できる。勿論、用いる酵素の種類、その基質、温度等種
々の条件によって異なる。用いる酵素がペルオキシダー
ゼである場合には、活性は以下の方法で測定する：基質
である、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジン）０．２ｍｇ／ｍｌと過酸化水素０．０１重量
％とを含む０．１Ｍ−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）
３．３ｍｌに、標識複合体０．０１２５重量％懸濁液を
１００μｌ混合して、２５℃で反応、５８０ｎｍの波長
での吸光度を経時的に測定し、１分間に当該吸光度を１
増加させる酵素活性を１Ｕ（ユニット）として換算す
る。

【００３３】例えば、 ペルオキシダーゼの場合、 標識複
合体が、 水分散型高分子粒子の乾燥重量１ｇあたり、
５，０００〜３００，０００Ｕ、好ましくは１０，００
０〜３００，０００Ｕ、より好ましくは５０，０００〜
３００，０００Ｕの酵素活性を有するように該ペルオキ
シダーゼが固定されていることが望ましい。

【００３４】特異的結合物質がペプチドを有する物質、
例えば、抗体、抗原もしくはハプテンである場合、また
は標識物質が酵素である場合、その固定量の測定は、色
素結合法等の慣用のタンパク質定量法により測定し、タ
ンパク質の量として算出する。特異的結合物質がオリゴ
ヌクレオチドの場合は、固定後の遊離のオリゴヌクレオ
チドを２６０ｎｍの吸光度を測定することにより算出す
る。

【００３５】このように担体に特異的結合物質および標
識物質を固定させた後、例えば膜分離法や濾過、遠心分
離法等の慣用の分離法によって、標識複合体を分離精製
することができる。標識複合体は、水中に浸漬して保存
してもよく、または凍結乾燥して保存してもよい。

【００３６】本発明において試験片としては、吸水性基
材上に、被検物質に特異的に結合し得る第１の特異的結
合物質が固定化された固定相を有する試験片が挙げられ
る。試験片に用いられる吸水性基材は、被検試料を吸収
できる基材、またはこれらを緩衝液によって希釈した希
釈液を吸収する基材であればよい。本発明においては、
被検試料中の被検物質と標識複合体中の第２の特異的結
合物質や固定相の第１の特異的結合物質との充分な反応
を行なうための時間を確保できるような吸水性基材が用
いられる。好ましい具体例としては、適度な吸水速度を
有する観点から、例えば、不織布、濾紙、ガラス繊維
布、ガラスフィルター、ニトロセルロース、多孔質材料
等が挙げられる。

【００３７】吸水性基材の吸水性の程度は、５ｍｍ幅の
短冊状に裁断した吸水性基材の片端部に水を浸漬し、１
分間経過後の吸水距離が０．５〜５ｃｍ程度のものが好
ましい。親水性重合体を使用して吸水性基材の吸水性を
調整することもできる。

【００３８】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検試料を展開できる形状であれば特に限定されるもので
はなく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状等
が好ましい。

【００３９】前記試験片の固定相に用いられる第１の特
異的結合物質は、前記標識複合体に用いられる第２の特
異的結合物質と同様である。例えば、標識複合体に用い
られる第２の特異的結合物質が抗体の場合、固定相に
は、同じ抗体または同一抗原の別のエピトープを認識す
る抗体を使用することができる。標識複合体に用いられ
る第２の特異的結合物質が抗原やハプテンの場合、固定
相には、同一の抗原、ハプテンあるいは第２の特異的結
合物質とは異なるが被検物質と特異的に結合する抗原、
抗体、ハプテン等が用いられる。標識複合体に用いられ
る第２の特異的結合物質がオリゴヌクレオチドの場合、
固定相には、配列は異なるが被検物質の他の部分に対す
るオリゴヌクレオチドが用いられる。

【００４０】固定相は、公知の物理吸着法、共有結合法
等により作製されうる。また、固定相に使用する第１の
特異的結合物質と親水性重合体とを含む溶液を吸水性基
材に塗布した後、該親水性重合体を凝固させる凝固溶剤
に浸漬することで固定相を作製することもできる。親水
性重合体としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロー
ス等が挙げられる。凝固溶剤としては、アセトン、エタ
ノール、メタノール、エーテル等が挙げられる。

【００４１】固定相は、被検試料の吸液によって展開し
移動してきた複合体を捕捉するために、吸水性基材上に
特異的結合物質を好ましくは０．００５〜５ｍｇ／ｃｍ
² 塗布することが望ましい。

【００４２】固定後の吸水性基材は、被検対象でない不
用なタンパク質の基材への非特異的吸着の防止、展開の
容易性、固定した第１の特異的結合物質の保存安定性の
観点から、ブロッキング剤、界面活性剤および糖を含有
する溶液（処理液という）で処理されることが好まし
い。ここで、使用するブロッキング剤としては、ウシ血
清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク等が
挙げられる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン
（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアル
キルアリルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレ
ンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。前記処理
液中のブロッキング剤の含有量は、好ましくは０．１〜
１０重量％である。前記処理液中の界面活性剤の含有量
は、好ましくは０．０１〜１重量％である。前記処理液
中の糖の含有量は０．１〜１０重量％である。

【００４３】本発明に用いられる試験片には、 試料受領
部（被検試料および標識複合体を供するための部分)
と、展開組成液受領部（展開組成液を供給するための部
分）とを設けてもよい。また、展開組成液、被検試料等
に含まれる液体成分の接触により前記標識複合体を展開
できるように、該標識複合体を試験片に固定してもよ
い。

【００４４】また、本発明において、多価アルコール相
を設けるには、多価アルコールを蒸留水、各種溶剤、緩
衝液、生理食塩水等に溶解した溶液を、試験片に含浸さ
せ、次いで乾燥させることで調製することができる。こ
の場合の溶液中の多価アルコールの濃度は前記の各種の
溶液１００重量部に対して１〜２８０重量部が好まし
く、２〜１１０重量部がさらに好ましい。

【００４５】また本発明に用いられる試験片において、
展開移動距離は、固定相での発色の均一性および発色感
度の観点から、０．５ｃｍ以上となり、固定相までの被
検試料の到達性、発色感度および測定時間の観点から、
８ｃｍ以下となるように設定されていることが好まし
い。

【００４６】本発明においては、前記展開移動距離を得
るように、試料受領部、固定相等を配置した試験片を用
いることができる。

【００４７】被検試料、試薬等の展開方法としては、例
えば、試験片の一端側から、上記の方法で調製した標識
複合体の溶液および展開組成液を加え、毛細管現象によ
って自然展開させる。また、試料受領部の反対端に吸水
パッドを設けてもよく、これにより、試験片を展開する
液体成分を吸収するので展開が容易に進行する。

【００４８】ついで、固定相上で〔被検物質−標識複合
体〕の複合体の形成の有無を検出する。〔被検物質−標
識複合体〕の複合体の検出は、標識複合体中の標識物質
を測定することにより検出することができ、着色粒子を
有する標識複合体を用いた場合、固定相における呈色の
有無により検出できる。固定相上で前記複合体が検出さ
れた場合（例えば、固定相における呈色等）、被検試料
中に被検物質が存在することの指標となる。

【００４９】

【実施例】調製例１：標識複合体溶液の調製 １）ラテックス粒子懸濁液の作製 スチレン５０ｇと、アクリル酸０．５ｇと、トリエチレ
ングリコールメタクリレート０．２ｇと、蒸留水４４０
ｇとを含む混合液を窒素ガス雰囲気下で７５℃に維持
し、攪拌しながら、重合開始剤として過硫酸カリウム
０．２５ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１
０時間重合を行った。その結果、カルボキシル化された
水分散性粒子としてカルボキシル化ポリスチレンラテッ
クス粒子（平均粒子径：０．２μｍ）を得た。得られた
カルボキシル化ポリスチレンラテックス粒子を緩衝液
（０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）に固形分濃
度が５重量％になるよう分散して、ラテックス粒子懸濁
液を得た。

【００５０】２）固定化 本実施例では、特異的結合物質として抗体（抗ベロ毒素
１型抗体）を、さらに標識物質として酵素（西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ）を、上記１）で作製したラテックス
粒子に以下のようにして固定した。

【００５１】前記１）で得られたラテックス粒子懸濁液
３ｍｌに、水溶性カルボジイミド〔同仁化学研究所製、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍ１、０．０１Ｍ−ホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕０．６ｍｌと、西洋ワサビ由
来ペルオキシダーゼ〔以下ＨＲＰと略す；和光純薬社
製、５６ｍｇ／ｍｌ（比活性２５０〜３５０Ｕ／ｍ
ｇ）、０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕１．
８ｍｌと、抗ベロ毒素１型抗体〔以下、抗ＶＴ１抗体と
略す；トキシンテクノロジー社製、２ｍｇ／ｍ１、０．
０１Ｍ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕２．１ｍｌとを
加えて４℃で１６時間反応させた。次いで、得られた反
応物について、洗浄液として０．０１Ｍ−ホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．２）を用いて遠心分離洗浄を行い、前記０．
０１Ｍ−ホウ酸緩衝液で固形分濃度２．５重量％に調製
し、抗ＶＴ１抗体とＨＲＰとを固定化したラテックス粒
子の懸濁液（標識複合体懸濁液という）を作製した。

【００５２】得られた標識複合体において、標識複合体
乾燥重量１ｇあたりの抗体（分子量約１．６×１０⁵ ）
固定化量は２５．０ｍｇ、酵素（分子量約４×１０⁴ ）
の固定化量は２０．０ｍｇ、および酵素活性は４３３０
０Ｕであった。

【００５３】３）標識複合体溶液の調製 前記標識複合体懸濁液を緩衝溶液（組成：０．０１Ｍホ
ウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）で希釈して標識複合体溶液を
調製した。希釈比は、標識複合体懸濁液：緩衝液＝１：
１５０とした。

【００５４】調製例２：免疫クロマトグラフィー用試験
片の作製 抗ＶＴ１抗体（トキシンテクノロジー社製、１ｍｇ／ｍ
１、０．０１Ｍ−リン酸緩衝液、０．９重量％ＮａＣｌ
含有、ｐＨ７．２）をニトロセルロースメンブレン（ワ
ットマン社製、孔径１２μｍ、ＰＥＴ（ポリエチレンテ
レフタレート）サポート付、６ｍｍ×６０ｍｍ）の一端
から３０ｍｍの箇所に１．５μｍ、ディスペンサーを用
いてライン状（幅１ｍｍ）に塗布し、固定相（面積：６
ｍｍ² ）を配置したメンブレンを得た。得られたメンブ
レンを、ウシ血清アルブミン（オリエンタル酵母社製、
１重量％）と、プライサーフＡ２１２Ｅ（第一工業製薬
社製、０．１重量％）と、サッカロース（和光純薬工業
社製、１重量％）とを含む水溶液中に２０分浸漬させ
た。次いで、得られたメンブレンを、室温で１６時間乾
燥させた。

【００５５】次に、終濃度１重量％となるようにＴＭＢ
をトルエンで溶解して得られた発色基質溶液１．２μｌ
を、前記ニトロセルロースメンブレン上の固定相から上
流５ｍｍ離れた箇所に塗布した。その後、得られたメン
ブレンを乾燥させて発色基質相とした。

【００５６】固定相から発色基質相と同じ方向に１０〜
２２ｍｍの箇所にポリエステル製不織布（７×７ｍｍ、
厚さ１ｍｍ）を貼り合せ、試料受領部を作製した。ま
た、固定相から試料受領部と同じ方向に２７〜３９ｍｍ
の箇所にポリエステル製不織布（７×１２ｍｍ、厚さ１
ｍｍ）を貼り合せ、展開組成液受領部を作製した。

【００５７】さらに固定相から試料受領部と逆の方向に
２０〜５０ｍｍの箇所に吸水剤基剤としてガラス繊維製
不織布（ワットマン社製、ＧＦ／Ｂ、１５×３０ｍｍ、
厚さ１ｍｍ）を貼り合せた。

【００５８】調製例３：被検試料の調製 ベロ毒素１型（ナカライ社製）を緩衝溶液（ｐＨ８．
０：０．２Ｍ ＮＨ₄ Ｃｌ、０．９重量％ＮａＣｌ、
０．１重量％ＢＳＡ）で既知濃度（０ｍｇ／ｍｌおよび
４ｍｇ／ｍｌ）にして、被検試料を調製した。

【００５９】調製例４：展開組成液の調製 展開組成液〔組成：０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）、２０ｍＭ イミダゾール、０．０１重量％Ｈ
₂ Ｏ₂ 、０．１２重量％硫酸デキストランＮａ〕を調製
した。

【００６０】試験方法 調製例３で調製した被検試料７０μｌを各試験片の試料
受領部に供し、直ちに被検試料を展開させ、次いで、前
記試験片の前記試料受領部に調製例１で得られた標識複
合体溶液２５μｌを供した。次いで展開組成液受領部に
展開組成液１５０μｌを供し、展開させた。展開後、試
験片の固定相における１０〜６０分後の発色の有無を目
視観察した。

【００６１】なお、判定基準は以下の通りである。 ＋ ：固定相に発色が見られる ± ：固定相に弱い発色が見られる −⁺ ：固定相にカゲ状の発色が見られる − ：固定相に発色（カゲ状の発色）が見られない

【００６２】実施例１ 固定相を通過するヘキサントリオールの量が表１に示さ
れる量（１．２〜４８ｍｇ：固定相の面積１０ｍｍ² 当
たり２〜８０ｍｇ）となるように、調製例４で得られた
展開組成液にヘキサントリオールを添加したものを調製
した。得られたヘキサントリオール含有展開組成液およ
び調製例２で作製した試験片を用いて、上記の試験方法
にてベロ毒素検出試験を行った。展開組成液は１５０μ
ｌ滴下するので、展開組成液中のヘキサントリオール濃
度は０．８〜３２％（ｗ／ｖ）となる。

【００６３】比較例１ 調製例４で得られた展開組成液を使用して、上記の試験
方法にてベロ毒素検出試験を行った。

【００６４】実施例１および比較例１で得られた結果
を、表１に示す。

【００６５】

【表１】

【００６６】表１に示されるように、被検試料中に被検
物質であるベロ毒素ｌ型が存在しない場合、比較例１で
は試験開始から２０分後にカゲ状発色が生じ、測定に支
障をきたした。一方、実施例１においては、固定相を通
過するへキサントリオール量が１．２ｍｇでカゲ状発色
の発生を抑制（２０分後）し、１２〜４８ｍｇでは試験
開始から６０分経過してもカゲ状発色は認められないこ
とがわかる。

【００６７】被検試料中に被検物質であるベロ毒素ｌ型
が存在する場合、実施例１においては、へキサントリオ
ール量が１．２〜３６ｍｇであっても、比較例１と同等
の発色を示した。しかし、ヘキサントリオール量が４８
ｍｇになると比較例１と比較して発色がやや低下した。

【００６８】したがって、展開組成液にヘキサントリオ
ールを添加することによってカゲ状発色を抑制し、２０
分経過した後であっても被検物質の有無を高い確実性で
判定できることが分かった。

【００６９】実施例２ 固定相を通過するプロパンジオールの量が表２に示され
る量（１．２〜４８ｍｇ：固定相の面積１０ｍｍ² 当た
り２〜８０ｍｇ）となるように、調製例４で得られた展
開組成液にプロパンジオールを添加したものを調製し
た。得られたプロパンジオール含有展開組成液および調
製例２で作製した試験片を用いて、上記の試験方法にて
ベロ毒素検出試験を行った。展開組成液は１５０μｌ滴
下するので、展開組成液中のプロパンジオール濃度は
０．８〜３２％（ｗ／ｖ）となる。

【００７０】実施例２および比較例１で得られた結果
を、表２に示す。

【００７１】

【表２】

【００７２】表２に示されるように、被検試料中に被検
物質であるベロ毒素ｌ型が存在しない場合、比較例１で
は試験開始から２０分後にカゲ状発色が生じ、測定に支
障をきたした。一方、実施例２においては、固定相を通
過するプロパンジオール量が１．２〜１２ｍｇでカゲ状
発色の発生を抑制（２０分後）し、３６〜４８ｍｇでは
試験開始から６０分経過してもカゲ状発色は認められな
かった。

【００７３】被検試料中に被検物質であるベロ毒素ｌ型
が存在する場合、実施例２においては、プロパンジオー
ル量が１．２〜３６ｍｇであっても、比較例１と同等の
発色を示した。しかし、プロパンジオール量が４８ｍｇ
になると比較例１と比較して発色がやや低下した。

【００７４】したがって、展開組成液にプロパンジオー
ルを添加することによってカゲ状発色を抑制し、２０分
経過した後であっても被検物質の有無を高い確実性で判
定できることが分かった。

【００７５】実施例３ ヘキサントリオールを１．２〜４８％（ｗ／ｖ）となる
ように蒸留水に溶解して得られた溶液を、調製例２で作
製した試験片の展開組成液受領部に１００μｌ含浸さ
せ、次いで８０℃で２時間乾燥して、ヘキサントリオー
ル相を有する試験片を調製した。試験片に保持されたヘ
キサントリオールは、展開組成液受領部内で展開組成液
に溶解するため、表３に示される量（１．２〜４８ｍ
ｇ：固定相の面積１０ｍｍ² 当たり２〜８０ｍｇ）のヘ
キサントリオールが固定相を通過することになる。得ら
れた試験片および調製例４で得られた展開組成液を使用
して、上記の試験方法にてベロ毒素検出試験を行った。

【００７６】実施例３および比較例１で得られた結果
を、表３に示す。

【００７７】

【表３】

【００７８】表３に示されるように、被検試料中に被検
物質であるベロ毒素１型が存在しない場合、比較例１で
は試験開始から２０分後にカゲ状発色が生じ、測定に支
障をきたした。一方、実施例３においては、固定相を通
過するへキサントリオール量が１．２ｍｇでカゲ状発色
の発生を抑制（２０分後）し、１２〜４８ｍｇでは試験
開始から６０分経過してもカゲ状発色は認められなかっ
た。

【００７９】被検試料中に被検物質であるベロ毒素１型
が存在する場合、実施例３においては、ヘキサントリオ
ール量が１．２〜３６ｍｇであっても、比較例１と同等
の発色を示した。しかし、へキサントリオール量が４８
ｍｇになると比較例１と比較して発色がやや低下した。

【００８０】したがって、展開組成液受領部にへキサン
トリオールをあらかじめ固定することによってカゲ状発
色を抑制し、２０分経過した後であっても被検物質の有
無を高い確実性で測定できることが分かった。

【００８１】

【発明の効果】本発明の免疫測定法によれば、多価アル
コールの存在下に測定を行なうという簡便な方法でカゲ
状発色を抑制し、試験開始からの時間にかかわらず被検
物質の有無を高い確実性で判定できるという優れた効果
を奏する。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 免疫クロマトグラフ法において、多価ア
   ルコールの存在下に、 （ａ）吸水性基材上に、被検物質に特異的に結合しうる
   第１の特異的結合物質が固定化された固定相を有する試
   験片上で、被検試料中における被検物質の有無を、下記
   （ｂ）と（ｃ）： （ｂ）試験片の固定相における第１の特異的結合物質に
   捕捉される被検物質、 （ｃ）担体に、被検物質に特異的に結合しうる第２の特
   異的結合物質と標識物質とを固定化した標識複合体、と
   の複合体 の有無により検出する免疫測定法。
2. 【請求項２】 被検試料を滴下するステップの後に、多
   価アルコールを含有した展開組成液を滴下して展開する
   ステップを含む、請求項１記載の免疫測定法。
3. 【請求項３】 試験片が、展開組成液を滴下するための
   展開組成液受領部及び／又は該展開組成液受領部と固定
   相との間に、展開組成液との接触により、多価アルコー
   ルを脱離可能に保持した多価アルコール相を有するもの
   である、請求項１記載の免疫測定法。
4. 【請求項４】 固定相を通過する多価アルコールの量が
   固定相の面積１０ｍｍ² 当たり２〜６０ｍｇである請求
   項１〜３いずれかに記載の免疫測定法。
5. 【請求項５】 担体がラテックス粒子である請求項１〜
   ４いずれかに記載の免疫測定法。