DE69912904T2 - Markiertes Kojugat und Nachweismethode unter Verwendung desselben - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein markiertes Konjugat, das eine markierte immunchemische Komponente umfasst, die für Immuntests geeignet ist, mehr spezifisch ein Enzym-markiertes spezifisches Konjugat, wobei ein spezifischer bindender Stoff und ein Enzym an einem Träger immobilisiert sind, ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, wobei das Enzym-markierte spezifische Konjugat verwendet wird, und einen Test-Streifen, wie in den anhängenden Ansprüchen 1–26 definiert.
  • Als eines der Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung eines Antigens oder eines Antikörpers, unter Verwendung der hohen Spezifität und Nachweis-Sensitivität einer Antigen-Antikörper-Reaktion, kennt man einen markierten Immuntest, in dem ein Antigen oder ein Antikörper verwendet wird, der mit einer Substanz markiert ist, die leicht abgespalten und nachgewiesen werden kann. Ein markiertes Antigen oder ein markierter Antikörper, wie er in diesem Verfahren verwendet wird, wird im Allgemeinen durch Bindung einer Markierung an ein Antigen oder einen Antikörper erhalten (hierin nachfolgend als "markiertes Antigen" bzw. "markierter Antikörper" bezeichnet). Eine solche Bindung wurde herkömmlicherweise mit Hilfe einer Quervernetzung durchgeführt. Ein herkömmliches Verfahren beinhaltet jedoch die Quervernetzung von Antigenen oder Antikörpern miteinander oder die Quervernetzung von Markierungen miteinander, derart dass ein Anteil zunimmt, der nicht zu der Herstellung eines markierten Antigens oder eines markierten Antikörpers beiträgt. Demgemäß ist der Produktionsertrag niedrig und die Bindungsdichte der Markierung an das Antigen oder den Antikörper wird ebenfalls ausgesprochen gering, so dass dessen Funktion als eine Markierung erniedrigt wird. Zusätzlich hängt die Menge der Markierung, die in der Lage ist, an ein Antigen oder einen Antikörper zu binden, von der molekularen Größe der Markierung ab. In einem herkömmlichen Verfahren, das eine direkte Verknüpfung einer Markierung mit einem Antigen oder einem Antikörper verwendet, gibt es einen Nachteil dahingehend, dass die Aktivität, Funktionalität und Spezifität des Antigens oder des Antikörpers wahrscheinlich verloren gehen.
  • Da es unmöglich ist, eine Vielzahl von Positionen gleichzeitig zu bestimmen, ist es darüber hinaus erforderlich, die Bestimmung mit einer Vielzahl von Kits durchzuführen, die parallel angeordnet sind.
  • Andererseits kann der Nachweis eines pathogenen Mikroorganismus wie E. coli 0157, der kürzlich große Besorgnis erregte, in einem Lebensmittel oder in einem Individuum zeitaufwändig sein und komplizierte Verfahren erfordern. Zusätzlich kann bei einigen Erkrankungen eine schnellere Diagnose erforderlich sein. Für eine solche Diagnose werden verschiedene Immuntests wie ein markierter Immuntest wie vorstehend beschrieben, in geeigneter Weise verwendet. Kürzlich fiel eine Immunchromatographie auf, da diese ein schnelles und einfaches Immuntest-Verfahren bereitstellt. Dieses Verfahren beinhaltet zum Beispiel einen nachfolgend beschriebenen Prozess. Ein Antigen wie eine Bakterienzelle wird zu einem Wasserabsorbierenden Substrat gegeben, auf das ein Antikörper (erster Antikörper) aufgetragen ist und dann einige gesaugt wird, wobei dem ersten Antikörper erlaubt wird, das Antigen abzufangen bzw. zu binden. Nachfolgend wird ein markierter Antikörper (zweiter Antikörper), der spezifisch an das Antigen bindet, zu dem Wasserabsorbierenden Substrat zugegeben und dann eingesaugt, wobei das Antigen gebunden wird, das bereits von dem Antikörper gefangen worden war. Schließlich wird ein immunologischer Komplex (erster Antikörper-Antigen-zweiter Antikörper-Markierung), der sich an der Antikörper-Bindungsstelle auf dem Wasserabsorbierenden Substrat gebildet hat, optisch bestätigt. Neben dem Vorstehenden wird ein EIA (Enzym-Immuntest) oder ein Verfahren, das eine Sonde verwendet, ebenfalls benutzt; bis jetzt wurde jedoch noch kein Verfahren etabliert, das befriedigend einfach, schnell und/oder sensitiv ist. JP-A-32 69 362 offenbart ein Immuntest-Reagens, das aus Wasser-dispergierenden Latex-Partikeln besteht, die einen Antikörper und ein Enzym auf ihrer Oberfläche immobilisiert haben, wobei das Enzym ein hydrolytisches Enzym ist, dessen Funktion es ist, die Zellen für die Freisetzung von intrazellulärem Material zu lysieren. WO-A-93/15230 offenbart ein Nachweisverfahren, das auf der Verwendung eines Teststreifens beruht und das in der Abfangregion die Bindung eines löslichen Komplexes aus einem Konjugat, das aus einem Latex-Partikel besteht, das ein Enzymmarkiertes spezifisches Mitglied daran angeheftet hat, und aber dem Analyt an einen unmarkierten spezifischen Bindungspartner, der an den porösen Streifen angeheftet ist, umfasst.
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein markiertes Konjugat bereitzustellen, das eine markierte immunchemische Komponente besitzt, die für einfache, schnelle und hochgradig sensitive Immuntests geeignet ist.
  • Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten bereitzustellen, wobei ein Enzym-markiertes spezifisches Konjugat wie ein markiertes Konjugat und ein Teststreifen verwendet werden.
  • Diese und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung offensichtlich sein.
  • Als ein Ergebnis intensiver Untersuchungen im Hinblick auf die vorstehenden Probleme gelang es den Erfindern der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zum Nachweis eines Analyten, das hinsichtlich der Einfachheit, der Sensitivität und der Schnelligkeit außerordentlich ist, indem es ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat verwendet, bei dem es sich um ein markiertes Konjugat, in dem ein Enzym als Markierung über einen Träger mit einer spezifischen bindenden Substanz verknüpft ist handelt und einen Teststreifen, der dafür eingesetzt wurde, zu finden.
  • Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung:
    • [1] ein markiertes Konjugat, umfassend in Wasser-dispergierbare Polymerpartikel als Träger, mindestens eine immunchemische Komponente, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen, Haptenen, Antikörpern und Oligonucleotiden, und ein Enzym, wobei die immunchemische Komponente und das Enzym auf einer Oberfläche des Trägers immobilisiert sind und wobei die Gesamtmenge der immobilisierten immunchemischen Komponente und des immobilisierten Enzyms zwischen 5 und 200 mg pro 1 g der in Wasser dispergierbaren Polymerpartikel bezogen auf die Trockenmasse liegt;
    • [2] ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, das die folgenden Schritte umfasst:
    • (1) Bildung eines Komplexes aus
    • (a) einem Enzymmarkierten sepzifischen Konjugat, erhalten durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, mittels eines Trägers; und
    • (b) dem Analyten, wobei der resultierende Komplex auf einem Wasser-absorbierenden Substrat eingesaugt wird;
    • (2) Abfangen bzw. Binden des Komplexes an einer Bindungsregion, die mit einem zweiten spezifischen bindenden Stoff, der in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, auf dem Wasser absorbierenden Substrat immobilisiert ist; und
    • (3) Nachweis des gebundenen Komplexes;
    • [3] Ein Verfahren zum Nachweis einer Vielzahl von Analyten, das die folgenden Schritte umfasst:
    • (1) Bildung eines Komplexes oder von Komplexen aus:
    • (a) einem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat, erhalten durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, direkt oder mittels eines Trägers; und
    • (b) einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten, wobei der resultierende Komplex oder die resultierenden Komplexe auf einem Wasserabsorbierenden Substrat eingesaugt wird/werden;
    • (2) Binden des Komplexes oder der Komplexe an die Vielzahl der Bindungsregionen auf dem Wasser-absorbierenden Substrat, von denen jede mit einem zweiten spezifischen bindenden Stoff immobilisiert ist, der in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl der unterschiedlichen Analyten zu binden; und
    • (3) Nachweis des oder der gebundenen Komplexe(s).
    • [4] Ein Teststreifen, umfassend:
    • (a) eine Bindungsregion, angeordnet auf einem Wasser-absorbierenden Substrat, die einen zweiten spezifischen bindenden Stoff umfasst, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, wobei der zweite spezifische bindende Stoff darauf immobilisiert ist;
    • (b) eine getrocknete Reagens-Region, umfassend ein Enzym-markiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, wobei die getrocknete Reagens-Region so auf dem Wasserabsorbierenden Substrat angeordnet ist, dass das Enzymmarkierte spezifische Konjugat bei Kontakt mit Wasser den Bereich verlässt und aufgesaugt wird; und
    • (c) einen Probenempfänger, der an einer stromaufwärts zur getrockneten Reagens-Region gelegenen Position oder an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region angeordnet ist.
    • [5] Einen Teststreifen, umfassend:
    • (a) eine Vielzahl von Bindungs-Regionen, angeordnet auf einem Wasser-absorbierenden Substrat, wobei jede einen zweiten spezifischen bindenden Stoff umfasst, der in der Lage ist, spezifisch an eine Vielzahl unterschiedlicher Analyten zu binden, wobei jeder der zweiten spezifischen bindenden Stoffe darauf immobilisiert ist;
    • (b) eine getrocknete Reagens-Region, die ein Enzym-markiertes spezifisches Konjugat umfasst, das durch Verbinden eines Enzyms und erster spezifischer bindender Stoffe mittels eines Trägers erhalten wird, wobei von den Stoffen jeder in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl der Analyten zu binden, um einen Komplex zu bilden, wobei die getrocknete Reagens-Region so auf dem Wasserabsorbierenden Substrat angeordnet ist, dass das Enzymmarkierte spezifische Konjugat bei Kontakt mit Wasser den Bereich verlässt und aufgesaugt wird; und
    • (c) einen Probenempfänger, der an einer stromaufwärts zur getrockneten Reagens-Region gelegenen Position oder an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region angeordnet ist;
    • [6] einen Kit zum Testen auf einen Analyten, umfassend:
    • (1) einen Teststreifen, umfassend eine Bindungs-Region, angeordnet auf einem Wasserabsorbierenden Substrat, umfassend einen zweiten spezifischen bindenden Stoff, der in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden und einen Probenempfänger, der an einer stromaufwärts zur Bindungsregion gelegenen Position angeordnet ist; und
    • (2) ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Träger erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden; und
    • [7] einen Kit zum Testen auf einen Analyten, umfassend:
    • (1) einen Teststreifen, der eine Vielzahl von Bindungsregion umfasst, die auf einem Wasserabsorbierenden Substrat angeordnet sind, wobei jede einen zweiten spezifischen bindenden Stoff umfasst, der in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl der Analyten zu binden, und einen Probenempfänger, der an einer stromaufwärts zur Bindungsregion gelegenen Position angeordnet ist; und
    • (2) ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden.
  • Gemäß dem Verfahren zum Nachweis oder gemäß einem Teststreifen, wobei ein erfindungsgemäßes Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat verwendet wird, können Immuntests mit hoher Sensitivität und hoher Genauigkeit durchgeführt werden, da ein spezifischer bindender Stoff und ein Enzym mit einem aktiven Zustand in spezifischen Mengen auf der Oberfläche eines Trägers immobilisiert werden, so dass dort ein Analyt oder eine Vielzahl von unterschiedlichen Analyten nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus kann dieses Enzymmarkierte spezifische Konjugat leicht hergestellt und aufgereinigt werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der ausführlichen Beschreibung, die hierin nachfolgend bereitgestellt wird, und der begleitenden Zeichnungen vollständiger verstanden werden, wobei:
  • 1 ist eine schematische Darstellung, die eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
  • 2 ist eine schematische Darstellung, die eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
  • 3 ist eine schematische Darstellung, die noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
  • 4 ist eine schematische Darstellung, die noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt; und
  • 5 ist eine schematische Darstellung, die noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • Die Bezugnummern in jeder der 1 bis 5 sind wie folgt:
    1 ist ein Wasserabsorbierendes Substrat, 2 eine Bindungsregion, 3 eine getrocknete Reagens-Region und 4 ein Probenempfänger.
  • Das Verfahren zum Nachweis gemäß der vorliegenden Erfindung ist durch die Verwendung eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats, das durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, mittels eines Trägers erhalten wird, charakterisiert.
  • Der Träger, der für das Enzymmarkierte spezifische Konjugat verwendet wird, ist nicht besonders eingeschränkt, solange er in der Lage ist, in der vorliegenden Erfindung einen spezifischen bindenden Stoff und ein Enzym auf seiner Oberfläche zu verbinden. Der Träger beinhaltet gewöhnlich Metallkolloide, Wasserdispergierbare polymere Partikel, Silikone, Kieselerde, Glas, Diatomeenerde und ähnliches. Von diesen werden die Metall-Kolloide und die Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel bevorzugt.
  • Die Metall-Kolloide beinhalten zum Beispiel ein Gold-Kolloid und ein Selen-Kolloid.
  • Die Wasserdispergierbaren polymeren Partikel werden durch Emulsions-Polymerisierung von einem oder mehreren Monomeren hergestellt, von welchem jedes eine ungesättigte Doppelbindung besitzt. Brauchbare Monomere beinhalten zum Beispiel Olefin-Monomere wie Ethylen und Propylen; Vinyl-Monomere wie Vinylacetat und Vinylchlorid; Styrolmonomere wie Styrol, Methylstyrol und Chlorstyrol; Methacrylsäureester-Monomere wie Methylacrylat; Dien-Monomere wie Butadien und ähnliche.
  • Die Wasserdispergierbaren polymeren Partikel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beinhalten zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Homopolymeren oder Copolymeren der Monomere solche, die mit einem Modifikator-Monomer co-polymerisiert wurden, um die resultierenden Partikel mit einer funktionellen Gruppe oder einer ionischen Gruppe zu versehen oder um die Dispersions-Stabilität der Partikel in einem wässrigen Medium zu erhöhen. Das Modifikator-Monomer beinhaltet Acrylsäure, Methacrylsäure, fluorierte Methacrylsäureester wie 2,2,2-Trifluorethylmethylmethacrylat, Acrylnitril, Methacrylnitril, Acrylamid, Natriumsalz von Styrolsulfonat, Natriumsalz von Sulfpropyl(meth)acrylat, N-Vinyl-2-pyrrolidon, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylat, Glycidylmethacrylat und ähnliche.
  • Zusätzlich können in der vorliegenden Erfindung verschiedene, kommerziell erhältliche Wasserdispergierbare polymere Partikel ebenfalls vorteilhaft verwendet werden. Die kommerziell erhältlichen Wasserdispergierbaren polymeren Partikel beinhalten zum Beispiel Emulsionen, die Homopolymere und Co-Polymere von Styrol und dessen Derivaten umfassen, zum Beispiel p-Chlorstyrol, sowie verschiedene Styrol-Copolymere wie Styrolbutadien-Copolymere und Styrol-acrylnitril-butadien-Copolymere und ähnliche. In der vorliegenden Erfindung können auch Homopolymere von langkettigen Alkylestern von (Meth)acrylsäure oder Derivaten davon sowie Co-Polymere davon mit Methyl(meth)acrylat, Ethyl(meth)acrylat, Glycidyl(meth)acrylat oder ähnliche verwendet werden. Co-Polymere von Styrol oder dessen Derivaten wie vorstehend erwähnt mit einem (Meth)acrylsäureester oder dessen Derivate, können ebenfalls verwendet werden. Ebenfalls beispielhaft erläutert sind Gummis, Nylonarten, Polyurethane, mikrokristalline cellulosen und ähnliche.
  • Von den vorstehend erwähnten Wasserdispergierbaren polymeren Partikel wird ein Polymer, dessen hauptsächlicher Bestandteil ein Styrol-Monomer ist, hinsichtlich seiner Partikel-Stabilität bevorzugt, und es wird bevorzugt, polymere Partikel zu verwenden, die mit einem Monomer co-polymerisiert sind, das eine Carboxylgruppe besitzt, wie Acrylsäure oder Methacrylsäure, um einen spezifischen bindenden Stoff und ein Enzym zu immobilisieren.
  • Die genauen Arten der einzelnen Monomere werden so ausgewählt, dass die resultierenden Wasserdispergierbaren polymeren Partikel eine vorgegebene Übergangs-Temperatur für Glas besitzen, derart dass sie während der Verwendung oder der Aufbewahrung keine Fusionierung oder Aggregation verursachen, wenn die Wasserdispergierbaren polymeren Partikel verwendet werden, die mit einem ersten spezifischen bindenden Stoff und einem Enzym immobilisiert sind. Die Übergangs-Temperatur der Wasserdispergierbaren polymeren Partikel in Glas beträgt vorzugsweise 10°C oder mehr, insbesondere Raumtemperatur oder mehr.
  • Der Träger, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann gefärbt sein. In dem Fall, in dem ein gefärbter Träger verwendet wird, kann, falls die Konzentration eines Analyten hoch ist, eine Bestimmung auf der Grundlage der Intensität der Färbung durchgeführt werden, sogar bevor eine enzymatische Reaktion durchgeführt wird. Der gefärbte Träger, wie hierin verwendet, ist nicht besonders eingeschränkt, solange die Färbung optisch nachgewiesen werden kann. Der gefärbte Träger beinhaltet zum Beispiel Kolloid-Partikel, die aus Metallen wie Gold, Silber und Kupfer hergestellt sind; Wasser-dispergierbare polymere Partikel die mit Pigmenten und Farbstoffen wie Sudanblau, Sudanrot IV, Sudan III, Ölorange und Quinizaringrün und ähnlichem gefärbt sind. Hinsichtlich der optischen Bestätigung ist es bevorzugt, ein Gold-Kolloid und Wasserdispergierbare polymere Partikel zu verwenden, die mit blauen, roten, grünen oder orangefarbigen Pigmenten und Fabstoffen gefärbt sind. Stärker bevorzugt wird hinsichtlich der Dispergierungs-Stabilität und der einfachen Anpassung der Nachweis-Sensitivität des Analyten ein blau- oder rot-gefärbtes Latex als Wasserdispergierbare polymere Partikel verwendet. Das Enzym-markierte, spezifische Konjugat, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch Immobilisieren eines ersten spezifischen bindenden Stoffes und eines Enzyms auf einem Träger wie Wasserdispergierbare polymere Partikel erhalten werden. Die Partikelgröße der polymeren Partikel beträgt unter dem Gesichtspunkt einer einheitlichen Dispersion der Partikel in einem wässrigen Medium, um die Sedimentbildung zu verhindern, und einer ausreichenden Immobilisation des ersten spezifischen bindenden Stoffes und des Enzyms vorzugsweise 3 μm oder weniger, mehr bevorzugt 2 μm oder weniger, und die Partikelgröße beträgt vorzugsweise 0,01 μm oder mehr, mehr bevorzugt 0,1 μm oder mehr unter dem Gesichtspunkt einer Erleichterung der Aufreinigung der Partikel, wenn sie immobilisiert sind.
  • Das Enzym, das in der vorliegenden Erfindung als eine Markierung verwendet wird, kann jedes beliebige von denjenigen sein, die herkömmlich bei einem Festphasen-Immuntest verwendet werden. Bei denjenigen, die konkret beispielhaft erläutert sind, handelt es sich um Peroxidasen, β-D-Galactosidase, alkalische Phosphatasen, Glucose-Oxidasen, Luciferase, Esterasen, β-D-Glucuronidase und ähnliche. Peroxidasen und alkalische Phosphatasen sind diejenigen, die bevorzugt werden, da sie in der Lage sind, einen stabilen Nachweis mit hoher Sensitivität zu erzielen.
  • Der erste spezifische bindende Stoff, der auf den Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel immobilisiert ist, ist nicht besonders eingeschränkt, solange er spezifisch an einen Analyten bindet. Beispiele dafür sind Antigene, Haptene, Antikörper, Oligonucleotide, Effektoren, Rezeptoren, Enzyme, Co-Enzyme, Enzym-Inhibitoren und ähnliche. Einer oder mehrere der ersten spezifischen bindenden Stoffe können in Abhängigkeit von einem zu testenden Analyten aus denjenigen, die bekanntermaßen in einem gewöhnlichen Nachweisverfahren wie einem Sandwich-Verfahren verwendet werden, sachgemäß ausgewählt werden.
  • In der vorliegenden Erfindung ist eine immunchemische Komponente wie ein Antigen, ein Hapten oder ein Antikörper besonders bevorzugt. In anderen Worten, es wird bevorzugt, ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat, ein markiertes Konjugat, das Wasserdispergierbare polymere Partikel als einen Träger umfaßt, und eine immunchemische Komponente, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen, Haptenen und Antikörpern, die auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert ist, und ein Enzym, das darauf immobilisiert ist, zu verwenden. Die gesamte immobilisierte Menge der immunchemischen Komponente und des Enzyms beträgt, wie nachfolgend beschrieben, vorzugsweise von 5–200 mg pro 1 g Wasser-dispergierbare polymere Partikel, bezogen auf die Trockenmasse. In der vorliegenden Erfindung kann das Enzymmarkierte spezifische Konjugat hierin einfach als „markiertes Konjugat" bezeichnet werden.
  • Falls der spezifische bindende Stoff ein Antigen oder ein Hapten ist, beinhaltet das Antigen oder Hapten verschiedene Mikroorganismen-Antigene wie Chlamydia trachomatis, hämolytischen Streptococcus, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, Leptospira, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, und Borrelia; und Mycoplasma-Lipid-Antigen, HA-Antigen, HBc-Antigen, HBe-Antigen, HBs-Antigen, HCV-Antigen und HIV-Antigen; Haptene, die von den vorstehend erwähnten Antigenen abstammen und ähnliches.
  • Falls der spezifische bindende Stoff ein Antikörper ist, kann der Antikörper ein monoclonaler Antikörper oder ein polyclonaler Antikörper sein. Konkrete Beispiele dafür beinhalten anti-E. coli-Antikörper, anti-E. coli 0157-Antikörper, anti-Salmonella-Antikörper, anti-Staphylococcus-Antikörper, anti-Campylobacter-Antikörper, anti-Clostridium perfringens-Antikörper, anti-Vibrio parahämolyticus-Antikörper, anti-Verotoxin-Antikörper, anti-menschliches Transferrin-Antikörper, anti-menschliches Albumin-Antikörper, anti-menschliches Immunglobulin-Antikörper, anti-Mikroglobulin-Antikörper, anti-CRP-Antikörper, anti-Troponin-Antikörper, anti-HCG-Antikörper, anti-Chlamydia trachomatis-Antikörper, anti-Streptolysin-O-Antikörper, anti-Helicobacter pylori-Antikörper, anti-β-Glucan-Antikörper, anti-HBe-Antikörper, anti-HBs-Antikörper, anti-Adenovirus-Antikörper, anti-HIV-Antikörper, anti-Rotavirus-Antikörper, anti-RF-Antikörper und ähnliche.
  • Wenn es sich bei dem spezifischen bindenden Stoff um ein Oligonucleotid handelt, beinhaltet das Oligonucleotid Oligonucleotide, die zu den Nucleinsäure-Komponenten komplementär sind, die von verschiedenen Mikroorganismen, Mycoplasmen und verschiedenen Viren abstammen, die vorstehend beispielhaft als Antigene erläutert sind.
  • Die Wasserdispergierbaren polymeren Partikel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können alle eine funktionelle Gruppe besitzen, zum Zweck der Immobilisation eines ersten spezifischen bindenden Stoffes und eines Enzyms auf dessen Oberfläche, zum Zweck der Einführung einse Spacers oder zum Zweck der Erhöhung der Stabilität in einem Stadium der Wasser-Dispersion. Beispiele für die funktionelle Gruppe sind eine Carboxylgruppe, Hydroxylgruppe, Glycidylgruppe, Aminogruppe, Formylgruppe, Carbamoylgruppe, Isothiocyanatgruppe, Azidocarbonylgruppe, Hydrazidgruppe, saure Anhydridgruppe und ähnliche, wobei der Fall bevorzugt wird, in dem eine Carboxylgruppe eingebracht wird. Um die Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel herzustellen, die jeweils die vorstehend erwähnte funktionelle Gruppe besitzen, wird ein Monomer, das eine Carboxylgruppe wie Acrylsäure oder Methacrylsäure besitzt; ein Monomer, das eine Hydroxylgruppe wie 2-Hydroxyethylacrylat oder 2-Hydroxyethylmethacrylat besitzt; oder ein Monomer, das eine Glycidylgruppe wie Glycidyl-methacrylat besitzt, als eine monomere Komponente verwendet und einer Emulsions-Co-polymerisation mit anderen co-polymerisierbaren Monomeren, falls erforderlich, unterzogen so dass Wasserdispergierbare polymere Partikel erhalten werden können die jeweils eine Carboxylgruppe, Hydroxylgruppe oder Glycidylgruppe besitzen. Alternativ dazu wird eine bestimmte Menge der monomeren Komponente polymerisiert, und danach kann die funktionelle Gruppe in die resultierenden Wasserdispergierbaren polymeren Partikel eingebracht werden.
  • Der erste spezifische bindende Stoff und/oder das Enzym werden mit Hilfe einer hydrophoben Bindung (physikalische Adsorption), einer ionischen Bindung, einer kovalenten Bindung und ähnlichen auf dem Träger immobilisiert, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Hinsichtlich der Stabilität wird es bevorzugt, mit Hilfe einer kovalenten Bindung fest zu immobilisieren.
  • In der vorliegenden Erfindung kann, falls notwendig, auch eine Spacer-Gruppe eingebracht werden, wenn die Wasserdispergierbaren polymeren Partikel mit dem ersten spezifischen bindenden Stoff und/oder mit dem Enzym über eine kovalente Bindung gekoppelt werden, um die Freiheit der ersten spezifischen bindenden Substanz und/oder des Enzyms auf den polymeren Partikeln zu erhöhen. Die Spacergruppe kann zuerst mit den Wasserdispergierbaren polymeren Partikeln gekoppelt werden und nachfolgend mit dem ersten spezifischen bindenden Stoff und/oder dem Enzym gekoppelt werden. Alternativ dazu kann die Spacergruppe zuerst an den ersten spezifischen bindenden Stoff und/oder das Enzym gekoppelt werden und nachfolgend mit den Wasserdispergierbaren polymeren Partikeln verknüpft werden. Darüber hinaus kann die Spacergruppe an jedes der Wasserdispergierbaren polymeren Partikel, den ersten spezifischen bindenden Stoff und das Enzym zuerst gekoppelt werden, und jede Spacergruppe gekoppelte Verbindung wird dann mit den verbleibenden Teilen gekoppelt.
  • Die Verbindung, die als eine Spacergruppe verwendet werden kann, ist eine organische Verbindung, die mindestens eine bifunktionelle Gruppe besitzt und besonders bevorzugt eine organische Verbindung mit einer Kohlenstoffkette von 1–12 Kohlenstoffatomen, die eine bifunktionelle Gruppe besitzt; ein Polymer, das eine multifunktionelle Gruppe besitzt, ist aber auf keinen Fall ausgeschlossen. Konkrete Beispiele für die Verbindung, die als eine Spacergruppe dient sind Diamine, wie Hexamethylendiamin, Dodecamethylendiamin und Xylylendiamin; Aminoalkylcarbonsäuren wie Glycin, β-Aminopropionsäure, γ-Aminobuttersäure, ε-Aminocapronsäure und ε-Aminocaprylsäure; Aminosäuren wie Lysin, Glutaminsäure, β-Alanin, Arginin und Glycylglycin und ähnliche, ohne auf diese beschränkt zu sein.
  • Das Verfahren für die kovalente Kopplung eines ersten spezifischen bindenden Stoffes und/oder eines Enzyms an Wasser-dispergierbare polymere Partikel, entweder direkt oder mit Hilfe einer Spacergruppe, ist nicht besonders eingeschränkt und kann jedes beliebige, an sich bekanntes Verfahren sein. Ein bevorzugtes Verfahren beinhaltet zum Beispiel ein Verfahren, das ein wasserlösliches Carbodiimid als ein BindungsReagens verwendet. In dem Fall, in dem zum Beispiel eine Aminoalkylcarbonsäure als eine Spacergruppe verwendet wird, wird die Aminoalkylcarbonsäure unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids an die Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel gekoppelt, und dann wird an die Aminoalkylcarbonsäure, die an die polymeren Partikel gekoppelt worden ist, ein erster spezifischer bindender Stoff und/oder ein Enzym kovalent gekoppelt, wobei das wasserlösliche Carbonyldiimid auf die gleiche Art und Weise wie vorstehend verwendet wird.
  • Das wasserlösliche Carbodiimid, das in dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet wird, beinhaltet 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonsäure und ähnliche. Um den ersten spezifischen bindenden Stoff und/oder das Enzym an die Wasserdispergierbaren polymeren Partikel kovalent zu koppeln, direkt ohne einen Abstandshalter oder über einen Abstandshalter, wobei ein vorstehend erwähntes wasserlösliches Carbodiimid verwendet wird, können herkömmliche bekannte Verfahren und Bedingungen angewandt werden. In der vorliegenden Erfindung werden der spezifische bindende Stoff und das Enzym an einen Träger gekoppelt, indem sie gleichzeitig oder separat immobilisiert werden.
  • Zusätzlich zu dem Fall, in dem ein einzelner erster spezifischer bindender Stoff immobilisiert wird, kann, falls notwendig, ein Gemisch von mehreren ersten bindenden Stoffen immobilisiert werden, wobei jeder davon spezifisch an einen von mehreren Analyten bindet.
  • Somit kann die vorliegende Erfindung auch auf das Verfahren zum Nachweis einer Vielzahl von unterschiedlichen Analyten gerichtet sein, zusätzlich zu dem Verfahren zum Nachweis eines einzelnen Analyten. In dem Fall gibt es zwei Ausführungsformen für das Enzymmarkierte spezifische Konjugat: 1) eine Ausführungsform, bei der das Enzymmarkierte spezifische Konjugat aus der Kopplung eines Enzyms und eines einzelnen ersten spezifischen bindenden Stoffes, der in der Lage ist, an einen einzelnen Analyten spezifisch zu binden, über einen Träger resultiert; und 2) eine Ausführungsform, bei der das Enzymmarkierte spezifische Konjugat aus der Kopplung eines Enzyms und einer Vielzahl von ersten spezifischen bindenden Stoffen über einen Träger resultiert, wovon jeder in der Lage ist, an einen von einer Vielzahl von Analyten spezifisch zu binden. Die Ausführungsform 1) verwendet eine Vielzahl unterschiedlicher Enzymmarkierter spezifischer Konjugate, wovon jedes in der Lage ist, an einen aus der Vielzahl von unterschiedlichen Analyten spezifisch zu binden, und in Schritt (1) des erfindungsgemäßen Nachweis-Verfahrens wird eine Vielzahl von Komplexen gebildet. Andererseits kann im Fall der Ausführungsform 2) ein Komplex aus einem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat und der Vielzahl unterschiedlicher Analyte gebildet werden.
  • Die gesamte immobilisierte Menge des ersten spezifischen bindenden Stoffes und des Enzyms, die in dem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat enthalten ist, das, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde, beträgt vorzugsweise 5 bis 200 mg pro 1 g des Trägers bezogen auf die Trockenmasse, und die Menge kann in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der spezifischen bindenden Stoffe und Enzyme, die verwendet werden, sowie dem Ausmaß der Aktivität innerhalb des vorstehenden Bereiches entsprechend variieren. Wenn es sich zum Beispiel bei dem Träger um Wasserdispergierbare polymere Partikel handelt, beträgt die gesamte immobilisierte Menge vorzugsweise 200 mg oder weniger, mehr bevorzugt 150 mg oder weniger pro 1 g der Wasserdispergierbaren polymeren Partikel bezogen auf die Trockenmasse hinsichtlich des Oberflächenbereiches der Partikel, und die gesamte immobilisierte Menge beträgt vorzugsweise 5 mg oder mehr und mehr bevorzugt 10 mg oder mehr wenn der Nachweis schnell und die Sensitivität und Reproduzierbarkeit hoch sein soll.
  • Der Begriff "bezogen auf die Trockenmasse" der Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel bezieht sich hierin auf ein Gewicht einer vorgegebenen Menge der Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel, nachdem diese zwei Stunden bei 120°C getrocknet worden waren.
  • Wenn ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat verwendet wird, wobei man erwartet, einen weiteren schnellen und hochsensitiven Immuntest zu erhalten, kann ein Enzym, das an einen Träger immobilisiert werden soll, in Abhängigkeit von dessen Eigenschaften entsprechend variiert werden. Zum Zweck des schnellen Nachweises und der höheren Sensitivität und Reproduzierbarkeit ist es bevorzugt, dass die Menge des Enzyms, das immobilisiert werden soll, 1,0 mg oder mehr pro 1 g der Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel bezogen auf die Trockenmasse betragen. Aus den gleichen Gründen wie vorstehend wird es bevorzugt, dass die Menge des Enzyms, das immobilisiert werden soll, 100 mg der weniger pro 1 g der Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel bezogen auf die Trockenmasse beträgt.
  • Die immobilisierte Menge des Enzyms beträgt vorzugsweise 0,6 Mol oder mehr pro 1 Mol des ersten spezifischen bindenden Stoffes, und unter dem Gesichtspunkt des Oberflächenbereiches der Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel und um den Hintergrund-Spiegel zu reduzieren, beträgt sie vorzugsweise 60 Mol oder weniger pro 1 Mol des ersten spezifischen bindenden Stoffes.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Menge eines Enzyms, das immobilisiert werden soll, auch als dessen Aktivität ausgedrückt werden. Es ist selbstverständlich, dass die Enzym-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen wie die Art des Enzyms, das immobilisiert werden soll, dessen Substrat und der Temperatur variieren kann. Wenn das Enzym, das auf einen Träger immobilisiert werden soll, eine Peroxidase ist, wird die Aktivität mit Hilfe des folgenden Verfahrens bestimmt. In 3,3 ml 0,1 M Citratpuffer (pH 4,5), der 0,2 mg/ml Substrat TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) und 0,01% Wasserstoffperoxid enthält, werden 100 μl einer 0,0125%igen Suspension eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats zugemischt. Das resultierende Gemisch wird bei 25°C umgesetzt, wobei die Absorptionen bei 580 nm im Verlauf der Zeit bestimmt werden, wobei die enzymatische Aktivität, die die Absorption in einer Minute um 1 (OD) erhöht, als eine U (unit, Einheit) gezählt wird.
  • Im Fall einer Peroxidase ist es erwünscht, dass das Enzym derart immobilisiert wird, dass das Enzym-markierte spezifische Konjugat eine enzymatische Aktivität von 5.000 bis 300.000 U, vorzugsweise 10.000 bis 300.000 U, mehr bevorzugt 50.000 bis 300.000 U pro 1 g der Wasser-dispergierbaren polymeren Partikel bezogen auf die Trockenmasse besitzt.
  • Wenn die enzymatische Aktivität in den vorstehenden Bereichen liegt, würde das den schnellen Nachweis eines Analyten ermöglichen und den Hintergrund-Spiegel reduzieren, wobei eine hohe Spezifität erhalten wird.
  • Die immobilisierten Mengen des ersten spezifischen bindenden Stoffes und des Enzyms werden bestimmt, indem die Menge an Proteinen auf der Grundlage der Messung ausgerechnet werden, die das Lowry-Verfahren verwendet. Wenn der spezifische bindende Stoff ein Oligonucleotid ist, beruht die Berechnung auf dem freien Oligonucleotid nach Immobilisierung, was durch Messung der Absorption des Überstandes nach Immobilisation bei 260 nm bestimmt wird.
  • Nach der Kopplung des ersten spezifischen bindenden Stoffes und des Enzyms an die Wasserdispergierbaren polymeren Partikel, wie vorstehend beschrieben, d. h. nach Herstellung eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats, kann das erfindungsgemäße Enzymmarkierte spezifische Konjugat mit einem herkömmlichen gewöhnlichen Trennverfahren wie Membran-Separation, Filtration und Zentrifugation isoliert und gereinigt werden. Das so erhaltene erfindungsgemäße Enzymmarkierte spezifische Konjugat kann aufbewahrt werden, indem es in Wasser imprägniert wird oder indem man es lyophilisiert.
  • Als nächstes wird das erfindungsgemäße Nachweisverfahren erklärt, indem man jeden der Schritte verfolgt.
  • A. Ausführungsform zum Nachweis eines Analyten
  • (1) Schritt zur Bildung eines Komplexes aus einem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat und einem Analyten, der auf einem Wasserabsorbierenden Substrat eingesaugt wird
  • Der Komplex aus einem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat und einem Analyten kann bereits ausgebildet sein, bevor er auf einem Wasserabsorbierenden Substrat eingesaugt wird, oder es kann alternativ dazu, wie nachfolgend beschrieben, ein Komplex auf einem Wasserabsorbierenden Substrat gebildet werden, indem eine Testlösung, die einen Analyten enthält, mit einem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat in Verbindung gebracht wird, das im Verlauf des Einsaugens auf dem Wasserabsorbierenden Substrat in einer getrockneten Reagens-Region enthalten ist. Darüber hinaus kann alternativ dazu ein Analyt, der auf ein Wasserabsorbierendes Substrat aufgebracht wird, mit einer Dispersion eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats in Kontakt gebracht werden, wobei ein Komplex auf dem Wasserabsorbierenden Substrat gebildet wird.
  • Wenn ein Komplex zuvor ausgebildet wird, wird eine Dispersion eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats mit einer Testlösung vermischt, die einen Analyten enthält, oder ein Analyt wird mit einer Dispersion eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats vermischt oder ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat wird zugegeben und in einer Testlösung dispergiert, die einen Analyten enthält, und danach kann das resultierende Gemisch auf einem Wasserabsorbierenden Substrat eingesaugt werden.
  • Als ein Verfahren zum Einsaugen wird eine Lösung eines Komplexes, der, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde, auf ein Ende eines Wasserabsorbierenden Substrats aufgebracht, wobei diesem erlaubt ist, als ein Ergebnis eines Kapillar-Phänomens eingesaugt zu werden. Um das Aufbringen der Lösung auf ein Wasserabsorbierendes Substrat zu vereinfachen, kann an der Auftragsstelle ein Wasserabsorbierendes Kissen bereitgestellt werden. Das Wasserabsorbierende Kissen kann an dem gegenüberliegenden Ende der Auftragsstelle für die Lösung bereitgestellt werden, um die Flüssigkeit zu absorbieren, die durch das Wasserabsorbierende Substrat eingesaugt wird, wobei ein schnelles Fortschreiten des Einsaugens gewährt wird.
  • Das Wasserabsorbierende Substrat, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht besonders eingeschränkt, solange es eine Testlösung absorbieren kann, die einen Analyten enthält, wie Plasma, Blut, Urin, Fäkalien und Speichel, sowie verdünnte Lösungen davon, die hergestellt wurden, indem diese mit Puffer verdünnt wurden. In der vorliegenden Erfindung wird ein Wasserabsorbierendes Substrat verwendet, dem sicherheitshalber einen ausreichenden Zeitraum gewährt werden kann, um die Umsetzung eines Analyten in einer Testlösung mit einem ersten spezifischen bindenden Stoff oder mit einem zweiten spezifischen bindenden Stoff in einer Bindungsregion in Schritt (2) durchzuführen, der nachfolgend beschrieben ist. Wenn ein Wasserabsorbierendes Substrat eine gute Absorptionsfähigkeit besitzt, ist der Zeitraum für die Testlösung zum Erreichen der Bindungsregion ausreichend kurz genug, um eine schnelle Bestimmung durchzuführen, und lange genug, um eine genaue Bestimmung durchzuführen. Bevorzugte konkrete Beispiele sind Vliesfasern, Filterpapiere, Glasfieberfasern, Glasfilter, Nitrocellulosen, poröse Substrate und ähnliches. Jedes dieser Substrate hat eine angemessene Wasser-Absorptionsrate und ermöglicht eine ausgezeichnete optische Bewertbarkeit, die der Farbentwicklung nach Aggregation des Trägers zu verdanken ist, wenn ein gefärbter Träger verwendet wird.
  • In Anbetracht der vorstehend beschriebenen Gesichtspunkte ist der Grad an Wasser-Absorptionsfähigkeit des erfindungsgemäßen Wasserabsorbierenden Substrats vorzugsweise so, dass die Wasser-Absorptionsstrecke etwa 0,5 bis etwa 5 cm in einer Minute beträgt, wenn ein Ende des Wasserabsorbierenden Substrats in Form eines 5 mm breiten Streifens in Wasser eingetaucht wird.
  • Die Oberfläche des Substrats kann auch mit einem hydrophilen Polymer beschichtet oder imprägniert sein, um die Wasser-Absorptionsfähigkeit des Substrats anzupassen. Weiter kann auch ein kontinuierliches Substrat verwendet werden, das durch Verbinden der Ränder von Substraten miteinander erhalten wird, die aus dem gleichen Material oder aus verschiedenen Materialien für das Wasserabsorbierende Substrat hergestellt werden, unter Verwendung irgendeines geeigneten Bindungssmittels.
  • In der vorliegenden Erfindung ist die Gestalt des Wasserabsorbierenden Substrats nicht besonders eingeschränkt, solange das Wasserabsorbierende Substrat eine Gestalt hat, die in der Lage ist, die Testlösung einzusaugen. Die Gestalt ist zum Beispiel vorzugsweise ein(e) rechteckige(r) Folie (Streifen) oder hat die Form eines Stabes.
  • In der vorliegenden Erfindung kann weiter bevorzugt, als eine andere Ausführungsform, ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat in dem Wasserabsorbierenden Substrat enthalten sein, so dass das Enzymmarkierte spezifische Konjugat so angeordnet ist, dass das Enzymmarkierte spezifische Konjugat das Wasserabsorbierende Substrat verlassen und durch dieses eingesaugt werden kann, wenn es mit Wasser in Berührung gebracht wird. In dieser Ausführungsform bedarf es keiner nachfolgenden separaten Zugabe eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats. Das Verfahren, in dem das Enzym-markierte spezifische Konjugat erhalten wird, beinhaltet zum Beispiel ein Verfahren, das das Aufbringen einer Lösung eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats auf ein Wasserabsorbierendes Substrat und das nachfolgende Trocknen unter geeigneten Bedingungen umfasst. Als ein Beispiel für einen Trocknungsprozess wird das Substrat, nachdem die Lösung auf ein Wasserabsorbierendes Substrat aufgebracht wurde, durch Luftzufuhr bei 20° bis 60°C oder durch Lyophilisation luftgetrocknet. Als ein alternatives Verfahren wird ein Enzym-markiertes spezifisches Konjugat in einer Lösung aus einem wasserlöslichen Polymer oder Saccharose dispergiert, und die resultierende Dispersion wird auf ein Wasserabsorbierendes Substrat aufgebracht und dann getrocknet. Dieses Verfahren ist bei der Herstellung eines Teststreifens vorteilhaft, der ein erfindungsgemäßes Test-Reagens ist. Das wasserlösliche Polymer oder die Saccharose wird in Wasser leicht solubilisiert, wenn es/sie mit Wasser in Kontakt gebracht wird, so dass das Enzymmarkierte spezifische Konjugat das Substrat leicht verlässt und durch dieses eingesaugt wird und mit einem Analyten umgesetzt wird, wobei ein Komplex gebildet wird. Zusätzlich kann das Enzymmarkierte spezifische Konjugat nicht nur leicht in einer vorgegebenen Region des Wasserabsorbierenden Substrats erhalten werden, da eine Lösung, die eine geeignete Viskosität besitzt, durch Anpassen der Konzentration des wasserlöslichen Polymers oder der Sacharose erhalten werden kann, sondern es ist auch schwierig, dass dieses sich während des Trocknens einer Aggregation oder Denaturierung unterzieht. Weiter verlässt das Enzym-markierte spezifische Konjugat das Wasserabsorbierende Substrat nach dem Trocknen weniger leicht.
  • Indem das Wasserabsorbierende Substrat verwendet wird, das das Enzymmarkierte spezifische Konjugat, wie vorstehend beschrieben, enthält, kann ein Komplex gebildet werden, indem eine Testlösung, die einen Analyten enthält, im Verlauf des Einsaugens durch das Wasserabsorbierende Substrat mit dem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat in Kontakt gebracht wird. In der vorliegenden Erfindung wird die Region, in der ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat in dem Wasserabsorbierenden Substrat, wie vorstehend beschrieben, enthalten ist, als getrocknete Reagens-Region bezeichnet.
  • Bevorzugte Beispiele für das vorstehend beschriebene wasserlösliche Polymer sind Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylalkohole, Polyethylenglycole, Celluloseether (wie Methylcellulose, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose, Oxyethylcellulose und Cyanoethylcellulose), Gelatine und ähnliches.
  • Um das Enzymmarkierte spezifische Konjugat in dieser Ausführungsform durch das Substrat einzusaugen, wird ein Proben-Empfänger beladen, der stromabwärts der getrockneten Reagens-Region oder an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region positioniert ist. Wenn ein Analyt direkt auf den Probenempfänger gegeben wird, wird ein Lösungsmittel auf den Probenempfänger gegeben, das in der Lage ist, den Analyten zu solubilisieren. Die Lösung wird durch ein Wasserabsorbierendes Substrat eingesaugt, was einem Kapillar-Phänomen zu verdanken ist. In dieser Ausführungsform kann innerhalb des Probenempfängers ein Wasserabsorbierendes Kissen angebracht sein, oder es kann an dem stromabwärts liegenden Ende des Probenempfängers angeordnet sein.
  • (2) Schritt der Bindung des Komplexes aus Schritt (1) an eine Bindungsregion, die mit einem zweiten spezifischen bindenden Stoff, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, auf dem Wasserabsorbierenden Substrat immobilisiert ist
  • Schritt (2) erfordert eine Bindungs-Region, die mit einem zweiten spezifischen bindenden Stoff, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, auf dem Wasserabsorbierenden Substrat, das in Schritt (1) verwendet wurde, immobilisiert ist.
  • Der zweite spezifische bindende Stoff kann der gleiche sein, wie derjenige, der vorstehend für den ersten spezifischen bindenden Stoff beschrieben wurde, der in Abhängigkeit von dem ersten spezifischen bindenden Stoff angemessen ausgewählt werden kann.
  • Wenn der erste spezifische bindende Stoff ein Antikörper ist, kann der gleiche Antikörper als der zweite spezifische bindende Stoff verwendet werden, oder es kann auch ein Antikörper dafür verwendet werden, der ein anderes Epitop erkennt. Wenn der erste spezifische bindende Stoff ein Antigen oder ein Hapten ist, kann der zweite spezifische bindende Stoff das gleiche Antigen oder Hapten sein, oder er kann ein Antigen, ein Antikörper oder ein Hapten sein, der/das eine bindende Substanz darstellt, die sich von der ersten spezifischen bindenden Substanz unterscheidet und spezifisch an einen Analyten gebunden ist. Wenn der erste spezifische bindende Stoff ein Oligonucleotid ist, kann ein Oligonucleotid verwendet werden, das komplementär ist zu einer Nucleotid-Sequenz eines anderen Bereiches eines Analyten, die sich von der Sequenz unterscheidet, die zu dem Oligonucleotid des ersten spezifischen bindenden Stoffes komplementär ist.
  • Das Verfahren zur Immobilisation eines zweiten spezifischen bindenden Stoffes auf ein Wasserabsorbierendes Substrat ist nicht besonders eingeschränkt und es wird vorzugsweise mit Hilfe von herkömmlicher und bekannter physikalischer Adsorption oder kovalenter Bindung durchgeführt. Alternativ dazu wird eine Lösung auf ein Wasserabsorbierendes Substrat gegeben, die einen zweiten spezifischen bindenden Stoff und ein hydrophiles Polymer enthält, und das resultierende Substrat wird nachfolgend in ein Verfestigungs-Lösungsmittel eingetaucht, das in der Lage ist, das hydrophile Polymer zu verfestigen, wobei eine Bindungsregion gebildet wird. Das hydrophile Polymer beinhaltet Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylalkohole, Hydroxyethylcellulose und ähnliches. Das vorstehend beschriebene verfestigende Lösungsmittel beinhaltet Aceton, Ethanol, Methanol, Ether und ähnliches.
  • Das Wasserabsorbierende Substrat wird nach der Immobilisation vorzugsweise nach Behandlung mit einer Lösung verwendet, die Proteine, grenzflächenaktive Stoffe und Saccharide enthält. Beispiele für die Proteine, die hierin verwendet werden, sind Kälber-Serumalbumin, Casein, Gelatine, Magermilch und ähnliches. Beispiele für die grenzflächenaktiven Stoffe sind Polyoxyethylen(10)octylphenylether, Polyoxyethylensorbitanmonolaurate, Polyoxyethylenalkylalyletherphosphate, Polyoxyethylenalkyletherphosphate, Polyoxyethylenalkylphenylether und ähnliches. Beispiele für Saccharide sind Glucose, Trehalose, Saccharode und ähnliches. Die Behandlung kann einfach durchgeführt werden, indem jede vorstehend beschriebene Komponente in Wasser aufgelöst wird und ein Wasserabsorbierendes Substrat nach Immobilisation in die resultierende Lösung eingetaucht wird. Die vorstehend erwähnten Proteine dienen dazu, die Adsorption der unnötigen Proteine auf der Oberfläche des Wasserabsorbierenden Substrats zu verhindern, und die grenzflächenaktiven Stoffe dienen dazu, das Einsaugen zu erleichtern, und die Saccharide dienen dazu, die Stabilität des zweiten spezifischen bindenden Stoffes zu erhöhen, der auf die Oberfläche des Wasserabsorbierenden Substrates aufgebracht wird.
  • Der Proteingehalt in einer Behandlungslösung beträgt vorzugsweise 0,1 bis 10 Gewichts-%, wobei innerhalb dieses Bereiches eine hohe Umsatzrate an der Bindungsregion wirkungsvoll erhalten wird. Der Gehalt an grenzflächenaktiven Stoffen beträgt vorzugsweise 0,01 bis 1 Gewichts-%, wobei innerhalb dieses Bereiches das Einsaugen wirkungsvoll durchgeführt wird und an der Bindungsregion eine hohe Reaktivität erhalten wird. Der Saccharidgehalt beträgt vorzugsweise 0,1 bis 10 Gewichts-%, wobei innerhalb dieses Bereiches die Lösung dazu neigt, effizient und in wirksamer Weise durch das Wasser-absorbierende Substrat eingesaugt zu werden.
  • In der so ausgebildeten Bindungsregion bindet ein immobilisierter zweiter spezifischer bindender Stoff an eine Analyt-Einheit des Komplexes, der in Schritt (1) gebildet wurde, wobei der Komplex gebunden bzw. eingefangen wird.
  • (3) Schritt des Nachweises des gebundenen Komplexes
  • i) Verfahren zum Nachweis unter Verwendung einer enzymatischen Reaktion
  • Wenn das Enzymmarkierte spezifische Konjugat, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in verschiedenen Immuntests eingesetzt wird, werden herkömmliche Substrate zur Farbentwicklung und Nachweismethoden, die als solche bekannt sind, in Abhängigkeit von der Art eines immobilisierten Enzyms ausgewählt, und ein Analyt wird auf der Grundlage der Intensität der Farbentwicklung und der Veränderung der Aktivität nachgewiesen und quantifiziert. Das Substrat, das bei diesem Schritt für eine alkalische Phosphatase verwendet wird, beinhaltet bzw. kann sein zum Beispiel p-Nitrophenylphosphat, 5-Brom-4-chlor-3-phosphat/nitroblautetrazolium, first Rot/Naphthol, AS-TR-Phosphat und ähnliches. Für eine Peroxidase sind Kombinationen von Hydrogenperoxid mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure, o-Phenylendiamin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, 3,3'-Diaminobenzidin, 3-Amino-9-ethylcarbazol, 4-Chloro-1-naphthol und ähnliche, beispielhaft angegeben.
  • ii) Verfahren zum Nachweis unter Verwendung eines gefärbten Trägers
  • Wenn eine große Menge an Analyt getestet wird, kann ein Komplex, der einen gefärbten Träger gebunden an eine Bindungsregion enthält, optisch nachgewiesen werden.
  • B. Ausführungsform zum Nachweis einer Vielzahl unterschiedlicher Analyte
  • (1) Schritt der Bildung eines Komplexes aus einem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat und einer Vielzahl unterschiedlicher Analyte, wobei dessen Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat aus der Kopplung eines Enzyms und einer Vielzahl von ersten spezifischen bindenden Stoffen über einen Träger resultiert, wobei diese alle in der Lage sind, einen der Analyte für das Einsaugen durch ein Wasserabsorbierendes Substrat spezifisch zu binden
  • Der Komplex aus einem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat und einem Analyten kann zuvor ausgebildet sein, bevor er durch ein Wasserabsorbierendes Substrat eingesaugt wird, oder alternativ dazu, wie nachfolgend beschrieben, kann ein Komplex auf einem Wasserabsorbierenden Substrat gebildet werden, indem eine Testlösung, die eine Vielzahl unterschiedlicher Analyte enthält, mit einem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat in Kontakt gebracht wird, das in einer getrockneten Reagens-Region im Verlauf des Einsaugens durch das Wasserabsorbierende Substrat enthalten ist. Als weitere Alternative dazu kann eine Vielzahl unterschiedlicher Analyte, die auf ein Wasserabsorbierendes Substrat aufgebracht wurden, mit einer Dispersion eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats in Kontakt gebracht werden, wobei auf dem Wasserabsorbierenden Substrat ein Komplex gebildet wird. Wie vorstehend beschrieben, kann in der vorliegenden Erfindung ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat verwendet werden, das durch Verbinden eines Enzyms und eines einzelnen ersten spezifischen bindenden Stoffes über einen Träger resultiert, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an einen einzelnen Analyten zu binden, oder ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und einer Vielzahl von ersten spezifischen bindenden Stoffen über einen Träger resultiert, wovon jeder Stoff in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl der unterschiedlichen Analyte zu binden. Deshalb werden im ersten Fall in Abhängigkeit von der Anzahl der Analyte eine Vielzahl von Komplexen gebildet, und im letzteren Fall wird ein Komplex gebildet, der aus der Bindung einer Vielzahl von Analyten an ein einzelnes Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat resultiert.
  • In dieser Ausführungsform B kann das Gleiche gesagt werden, wie vorstehend in der Ausführungsform A beschrieben, es sei denn, es ist wäre andersartig spezifiziert. Zum Beispiel sind das Verfahren zur vorherigen Komplexbildung, das Verfahren des Einsaugens und das Wasserabsorbierende Substrat die gleichen, wie diejenigen, die in der vorstehend beschriebenen Ausführungsform A angegeben sind. Auch das Gleiche wie in Ausführungsform A kann gesagt werden hinsichtlich dessen, dass das Enzymmarkierte spezifische Konjugat zuvor in einem Wasserabsorbierenden Substrat enthalten sein kann, so dass das Enzymmarkierte spezifische Konjugat das Wasserabsorbierende Substrat verlassen und durch dieses eingesaugt werden kann, sobald es mit Wasser in Kontakt gebracht wird und die Region in dem Wasserabsorbierenden Substrat, in der ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat enthalten ist, wird als eine getrockneten Reagens-Region bezeichnet. Ebenfalls können in der vorliegenden Erfindung bei der Verwendung von zwei oder mehreren Enzymmarkiertes spezifischen Konjugaten diese vermischt werden und auf ein Wasserabsorbierendes Substrat aufgebracht werden, um eine einzelne getrocknete Reagens-Region zu bilden (vgl. 2), oder jedes der Enzymmarkierten spezifischen Konjugate wird einzeln verwendet, um eine Vielzahl von getrockneten Reagens-Regionen zu bilden (vgl. 3, 4 und 5). In dem letzteren Fall kann eine Vielzahl von getrockneten Reagens-Regionen individuell auf einem einzelnen Wasserabsorbierearen Substrat gebildet werden (vgl. 3), oder eine Vielzahl von getrockneten Reagens-Regionen kann individuell auf jedem aus der Vielzahl von Wasser-absorbierenden Substraten gebildet werden (vgl. 4 und 5). Das Verfahren zum Einsaugen, nachdem eine getrocknete Reagens-Region sich gebildet hat, ist ebenfalls das gleiche, wie dasjenige, das in Ausführungsform A beschrieben ist.
  • (2) Schritt der Bindung eines Komplexes an eine Vielzahl von Bindungs-Regionen auf dem Wasserabsorbierenden Substrat, von denen jede mit einem zweiten spezifischen bindenden Stoff immobilisiert ist, der in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl der unterschiedlichen Analyte zu binden
  • Schritt (2) erfordert eine Vielzahl von Bindungsregionen auf dem Wasserabsorbierenden Substrat, das in Schritt (1) verwendet wurde und auf das ein zweiter spezifischer bindender Stoff immobilisiert, der in der Lage ist, spezifisch an einen der Analyte zu binden. Der Begriff "eine Vielzahl von Bindungsregionen", wie er hierin in der vorliegenden Erfindung benutzt wird, bedeutet eine Region, in der eine Vielzahl von zweiten spezifischen bindenden Stoffen immobilisiert ist, die alle in der Lage sind, spezifisch an einen aus der Vielzahl der Analyte zu binden. Hier wird jede Region, in der jeder zweite spezifische bindende Stoff immobilisiert ist, separat auf einem einzelnen Wasser-absorbierenden Substrat gebildet, um eine Vielzahl von Bindungsregionen zu erzeugen (vgl. 2 und 3) oder alternativ dazu kann eine Vielzahl von zweiten spezifischen bindenden Stoffen individuell auf jedem aus einer Vielzahl von Wasserabsorbierenden Substraten immobilisiert sein, indem die Vielzahl von Wasserabsorbierenden Substraten verwendet wird und ein Probenempfänger von diesen gemeinsam verwendet wird (vgl. 4 und 5).
  • Auch die Beschreibung des zweiten spezifischen bindenden Stoffes, das Verfahren zur Immobilisierung eines zweiten spezifischen bindenden Stoffes auf ein Wasserabsorbierendes Substrat und die Behandlung des Wasserabsorbierenden Substrats nach der Immobilisierung sind in diesem Schritt die gleichen wie diejenigen, die vorstehend in Ausführungsform A dargestellt sind.
  • (3) Schritt des Nachweisens des gebundenen Komplexes
  • Dieser Schritt wird ebenfalls auf die gleiche Art und Weise wie in Ausführungsform A mit einem Verfahren zum Nachweis unter Verwendung einer enzymatischen Reaktion oder einem Verfahren zum Nachweis unter Verwendung eines gefärbten Trägers durchgeführt.
  • Als Nächstes wird nachfolgend ein Teststreifen beschrieben, der erfindungsgemäß als Test-Reagens verwendet wird.
  • A. Ausführungsform zum Nachweis eines Analyten
  • Der erfindungsgemäße Teststreifen wird in geeigneter Weise in einem erfindungsgemäßen Nachweis-Verfahren verwendet, wobei eines von dessen Merkmalen in der Verwendung eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats liegt, das aus dem Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden. Konkret umfasst der Teststreifen ein Wasserabsorbierendes Substrat 1, wie in 1 gezeigt; eine Bindungsregion 2, in der ein zweiter spezifischer bindender Stoff, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, auf dem Wasserabsorbierenden Substrat 1 immobilisiert ist; eine getrocknete Reagens-Region 3, die ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat umfasst, das aus dem Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den vorstehend beschriebenen Analyten derart zu binden, dass das Enzymmarkierte spezifische Konjugat das Substrat verlässt und durch dieses eingesaugt wird, wenn es mit Wasser in Kontakt gebracht wird; und einen Probenempfänger 4, der stromaufwärts der getrockneten Reagens-Region oder an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region positioniert ist (1 veranschaulicht eine Ausführungsform, bei der ein Probenempfänger stromabwärts von der getrockneten Reagens-Region angeordnet ist).
  • Das Wasserabsorbierende Substrat, die Bindungs-Region und die getrocknete Reagens-Region, wie hierin verwendet, sind im Hinblick auf das erfindungsgemäße Nachweis-Verfahren ähnlich zu denjenigen, die vorstehend beschrieben sind. In der Bindungsregion wird der zweite spezifische bindende Stoff vorzugsweise in einer Menge von 0,005 bis 5 mg/cm2 auf das Wasserabsorbierende Substrat aufgetragen, um einen Komplex zu binden, der als ein Ergebnis der Absorption der Testlösung einwandert und eingesaugt wird. Wenn die Menge des zweiten spezifischen bindenden Stoffes innerhalb des vorstehenden Bereiches liegt, kann die Komplex-Bindungseffizienz und die Nachweis-Sensitivität gut erhalten werden, wodurch ökonomische Vorteile bestehen. Die Menge des Enzymmarkierten spezifischen Konjugats, das in einer getrockneten Reagens-Region enthalten sein soll, beträgt auch zum Beispiel vorzugsweise 0,5 bis 50 μg für ein Wasserabsorbierendes Substrat in Form eines Streifens, dessen Dimensionen derart sind, dass eine Breite von 6 mm und eine Länge von 6 cm vorliegen.
  • Zusätzlich wird in der vorliegenden Erfindung die Bindungsregion stromabwärts von der getrockneten Reagens-Region angeordnet, und der Abstand zwischen der Bindungsregion und der getrockneten Reagens-Region beträgt 0,5 cm oder mehr, vorzugsweise 1 cm oder mehr, hinsichtlich einer besseren Gleichmäßigkeit und Sensitivität bei der Farbentwicklung in der Bindungsregion, und der Abstand beträgt 6 cm oder kürzer, vorzugsweise 4 cm oder kürzer, hinsichtlich einer zufriedenstellenden Fähigkeit der Testlösung, die Bindungsregion zu erreichen, der Sensitivität bei der Farbentwicklung und der Zeitspanne des Tests.
  • Der Probenempfänger ist nicht besonders eingeschränkt, solange er stromaufwärts der getrockneten Reagens-Region oder an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region positioniert ist, wie vorstehend beschrieben, auf die eine Probe aufgetragen werden kann. Der Probenempfänger kann selbst ein Wasserabsorbierendes Substrat sein oder ein Wasser-absorbierendes Kissen, das in der Lage ist, eine wässrige Lösung vorübergehend zu speichern. Das Wasserabsorbierende Kissen beinhaltet zum Beispiel Vliesfasern, die aus Polyestern gemacht sind, Kunstseiden, Polypropylene, Cellulosen, Zellstoffe und ähnliches. Wenn ein Probenempfänger an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region angeordnet ist, wird die getrocknete Reagens-Region hergestellt und danach ein Wasserabsorbierendes Kissen darauf lamelliert, das einen Probenempfänger darstellt, oder eine getrocknete Reagens-Region kann innerhalb des Probenempfängers angeordnet sein.
  • Die Dimensionen des Probenempfängers sind vorzugsweise so, dass sowohl die Länge als auch die Breite zwischen 3 und 10 mm betragen und seine Dicke zwischen 0,1 bis 5 mm beträgt.
  • Der vorstehend beschriebene Probenempfänger ist an einem Ende des Wasserabsorbierenden Substrats angeordnet, das die Bindungsregion und die getrocknete Reagens-Region besitzt, oder in dessen Nachbarschaft. Der Probenempfänger wird angeordnet, indem man ihn auf ein Wasserabsorbierendes Substrat platziert und dann mit einem Teststreifen-Gehäuse physikalisch andrückt, oder mit einem Klebstoff anklebt.
  • Um den Nachweis mit dem erfindungsgemäßen Teststreifen durchzuführen, wird einer zu analysierenden Testlösung erlaubt, von einem Probenempfänger absorbiert zu werden, der stromaufwärts der getrockneten Reagens-Region positioniert ist. Die Testlösung wird durch ein Wasserabsorbierendes Substrat eingesaugt und wandert in das Substrat ein und kommt in einer getrockneten Reagens-Region an, wo das Enzymmarkierte spezifische Konjugat das Substrat verlässt. Gleichzeitig wird der Analyt, der in der Testlösung enthalten ist, an das Enzymmarkierte spezifische Konjugat gebunden, wobei ein Komplex gebildet wird. Wenn der Probenempfänger an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region angeordnet ist, wird durch Zugabe und Absorption der Testlösung an dieser Position ein Komplex gebildet.
  • Nachfolgend wird ein so gebildeter Komplex durch das Wasserabsorbierende Substrat eingesaugt und wandert gemeinsam mit dem Einwandern der Testlösung in das Substrat ein und kommt an der Bindungsregion an. In der Bindungsregion wird der Komplex, der eingewandert ist, mit einem zweiten spezifischen Konjugat weiter verbunden, das an der Bindungsregion immobilisiert ist, wobei ein neuer Komplex eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats aus dem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat (Enzym-Träger-erster spezifischer bindender Stoff)-Analyt-zweiter spezifischer bindender Stoff gebildet wird, der in der Bindungsregion gebunden wird. Wenn die Konzentration eines Analyten hoch ist und der Träger gefärbt ist, kann der Komplex an einer Stelle konzentriert und aggregiert werden, indem der Komplex an der Bindungsregion gebunden und immobilisiert wird, wie vorstehend beschrieben, um eine klare Farbentwicklung zu erhalten, wodurch die Anwesenheit des Analyten optisch bestätigt werden kann.
  • Wenn die Konzentration eines Analyten niedrig ist, kann der Nachweis mit einer höheren Sensitivität erreicht werden, indem zu der Bindungsregion ein Substrat für ein immobilisiertes Enzym zugegeben wird. Das hierin verwendete Substrat kann jedes beliebige Substrat sein, das durch Umsetzung mit einem immobilisierten Enzym zur Farbentwicklung in der Lage ist. Im Falle einer alkalischen Phosphatase sind diejenigen, die beispielhaft erläutert sind, p-Nitrophenylphosphat, 5-Brom-4-chlor-3-phosphat/nitroblautetrazolium, First Red/Naphthol, AS-TR Phosphat und ähnliches. Im Fall einer Peroxidase sind diejenigen, die beispielhaft erläutert sind, Kombinationen aus Wasserstoffperoxid mit einer Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, enthaltend 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenthiazolin)-6-sulfonsäure, o-Phenylendiamin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, 3,3'-Diaminobenzidin, 3-Amino-9-ethylcarbazol, 4-Chlor-1-naphthol und ähnliches.
  • B. Ausführungsform zum Nachweis einer Vielzahl unterschiedlicher Analyte
  • Ein Merkmal dieser Ausführungsform betrifft die Verwendung eines Wasserabsorbierenden Substrats, das eine Vielzahl von Bindungsregionen, auf denen eine Vielzahl von zweiten spezifischen bindenden Stoffen immobilisiert ist, wovon jede in der Lage ist, an einen aus einer Vielzahl von verschiedenen Analyten spezifisch zu binden, und eine getrocknete Reagens-Region umfasst, die ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat umfasst, das aus dem Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden. Konkret umfasst der Teststreifen ein Wasserabsorbierendes Substrat 1, wie in den 2 bis 5 gezeigt; eine Bindungsregion 2, in der eine Vielzahl von zweiten spezifischen bindenden Stoffen auf dem Wasserabsorbierenden Substrat 1 immobilisiert ist, wovon jeder in der Lage ist, an einen aus der Vielzahl von unterschiedlichen Analyten spezifisch zu binden; eine getrocknete Reagens-Region 3, die ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat umfasst, das aus dem Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den vorstehend beschriebenen Analyten derart zu binden, dass ein Komplex oder Komplexe zwischen dem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat und der Vielzahl von unterschiedlichen Analyten gebildet wird und das Enzymmarkierte spezifische Konjugat von dem Substrat freigesetzt wird, wenn es mit Wasser in Kontakt gebracht wird; und einen Probenempfänger 4, der stromaufwärts der getrockneten Reagens-Region oder an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region positioniert ist (jede der 2 bis 5 veranschaulicht eine Ausführungsform, in der ein Probenempfänger stromaufwärts einer getrockneten Reagens-Region positioniert ist). Im Hinblick auf die getrocknete Reagens-Region 3 veranschaulicht jede der 2, 4 und 5 eine Ausführungsform, die eine einzelne getrocknete Reagens-Region besitzt, und 3 veranschaulicht eine Ausführungsform, die eine Vielzahl von getrockneten Reagens-Regionen besitzt. Im Hinblick auf den Probenempfänger 4, veranschaulicht jede der 4 und 5 eine Ausführungsform, die einen gemeinsam verwendeten Probenempfänger besitzt. Im Übrigen repräsentiert, wie in den Fällen, die durch die 2 und 3 veranschaulicht sind, jeder Teststreifen den erfindungsgemäßen Teststreifen, während, wie in den Fällen, die durch die 4 und 5 veranschaulicht sind, eine Anhäufung einer Vielzahl von Streifen als ein Ganzes den erfindungsgemäßen Teststreifen repräsentiert. Die Form des erfindungsgemäßen Teststreifens ist nicht besonders eingeschränkt und sie kann zum Beispiel in Form eines rechteckigen Streifens vorliegen, wie in den 2 bis 5 gezeigt.
  • Die Beschreibungen der Bindungsregion, der getrockneten Reagens-Region und des Probenempfängers, die in dieser Ausführungsform verwendet werden und das Verfahren zum Nachweis, das den vorstehend beschriebenen Teststreifen verwendet, sind die gleichen wie diejenigen, die in Ausführungsform A dargestellt sind.
  • In dieser Ausführungsform kann auch, anstatt ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat in einem Teststreifen als eine getrocknete Reagens-Region bereitzustellen, wie vorstehend beschrieben, zuvor ein Komplex aus einem Enzymmarkierten spezifischen Konjugat und einem Analyten ausgebildet werden und dann auf ein Wasserabsorbierendes Substrat aufgetragen werden, wobei das Enzymmarkierte spezifische Konjugat durch dieses hindurch eingesaugt wird, oder alternativ dazu werden ein Analyt und ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat sequenziell tropfenweise zu einem Probenempfänger zugegeben, und dann wird diesen erlaubt, innerhalb des Probenempfängers oder auf dem Wasserabsorbierenden Substrat einen Komplex auszubilden, wobei das Enzym-markierte spezifische Konjugat durch das Substrat hindurch eingesaugt wird. In diesem Fall besitzt der verwendete Teststreifen keine getrocknete Reagens-Region, umfasst aber eine einzelne Bindungsregion (Ausführungsform A) oder eine Vielzahl von Bindungsregionen (Ausführungsform B), wovon jede auf einem Wasserabsorbierenden Substrat immobilisiert ist, und einen Probenempfänger der stromaufwärts davon positioniert ist.
  • Deshalb kann erfindungsgemäß Folgendes bereitgestellt werden:
    • [1] ein Testkit eines Analyten, der Folgendes umfasst:
    • (1) einen Teststreifen, der eine Bindungsregion umfasst, die auf einem Wasserabsorbierenden Substrat angeordnet ist, umfassend einen zweiten spezifischen bindenden Stoff, der in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, und einen Probenempfänger, der in einer Position stromaufwärts der Bindungsregion angeordnet ist; und
    • (2) ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden; oder
    • [2] ein Testkit aus einer Vielzahl von Analyten, der Folgendes umfasst:
    • (1) einen Teststreifen, der eine Vielzahl von Bindungsregionen umfasst, die auf einem Wasserabsorbierenden Substrat angeordnet sind, wobei jede einen zweiten spezifischen bindenden Stoff umfasst, der in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl unterschiedlicher Analyte zu binden, und einen Probenempfänger, der in einer Position stromaufwärts von der Bindungsregion angeordnet ist; und
    • (2) ein Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden.
  • Die Teststreifen, die in den vorstehenden Kits verwendet werden, sind ähnlich den erfindungsgemäßen Teststreifen, mit der Ausnahme, dass sie keine getrocknete Reagens-Region bereitstellen.
  • Beispiel 1: Herstellung eines Enzymmarkierten spezifischen Konjugats (Enzym-Antikörper immobilisierter Träger)
  • 1) Herstellung einer Wasserdispergierbaren polymeren Partikel-Suspension
  • Ein flüssiges Gemisch, das 50 g Styrol, 0,5 g Acrylsäure, 0,2 g Triethylenglycolmethacrylat und 440 g destilliertes Wasser umfasst, wurde unter einer Stickstoffgas-Atmosphäre bei einer Temperatur von 75°C gehalten. Unter Rühren wurde zu dem resultierenden flüssigen Gemisch eine wässrige Lösung zugegeben, die durch Lösen von 0,25 g Kaliumpersulfat als ein Polymerisationsinitiator in 10 g destilliertem Wasser gelöst wurden, und die Komponenten wurden 10 Stunden lang polymerisiert. Als ein Ergebnis wurden carboxylierte Polystyrol-Latex-Partikel (durchschnittliche Partikelgröße: 0,2 μm) als carboxylierte Wasser-dispergierbare polymere Partikel erhalten. Die resultierenden carboxylierten Polystyrol-Latex-Partikel wurden bei pH 8,2 in 0,01 M Borat-Puffer dispergiert, sodass eine Konzentration an festen Bestandteilen von 5 Gewichts-% erhalten wurde.
  • 2) Immobilisierung
  • i) Immobilisierung eines spezifischen bindenden Stoffes
  • In diesem Beispiel wurde als ein spezifischer bindender Stoff ein Antikörper auf die folgende Art und Weise auf den unter Punkt 1) hergestellten Latex-Partikeln immobilisiert.
  • Zu 3 ml einer Dispersion der Latex-Partikel wurden 0,5 ml eines wasserlöslichen Carbodiimids [hergestellt von DOJINDO LABORATORIES; 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid in einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8,2] und 2 ml eines polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörpers (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8,2) zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde drei Stunden bei 10°C umgesetzt. Danach wurde Waschen durch Zentrifugation durchgeführt, wobei 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8,2 als Waschflüssigkeit verwendet wurde, und die Konzentration der festen Bestandteile wurde mit dem gleichen Puffer auf 5 Gewichts-% eingestellt.
  • ii) Immobilisierung von Enzym
  • Als nächstes wurde zu 3 ml der Suspension der zuvor hergestellten Antikörper-immobilisierten Latex-Partikel 1 ml eines wasserlöslichen Carbodiimids [hergestellt von DOJINDO LABORATORIES; 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid in einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8,2] und 2 ml einer von Meerrettich abstammenden Peroxidase (hierin nachfolgend einfach als "HRP" bezeichnet, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. in einer Konzentration von 1,2 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8,2), zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde 3 Stunden bei 10°C umgesetzt. Danach wurde ein Waschen durch Zentrifugation mit 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8,2 als Waschflüssigkeit durchgeführt, und die Konzentration der festen Bestandteile wurde mit dem gleichen Puffer auf 2 Gewichts-% eingestellt, um Latex-Partikel herzustellen, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und der HRP immobilisiert waren.
  • Beispiel 2
  • Vollkommen die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 wurden durchgeführt, mit Ausnahme, dass eine HRP verwendet wurde, die in einer Konzentration von 12 mg/ml hergestellt wurde, anstelle der HRP, die in einer Konzentration von 1,2 mg/ml hergestellt worden war, als das Enzym immobilisiert wurde, um Latex-Partikel herzustellen, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und HRP immobilisiert waren.
  • Beispiel 3
  • Vollkommen die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 wurden durchgeführt, mit Ausnahme, dass eine HRP verwendet wurde, die in einer Konzentration von 60 mg/ml hergestellt wurde, anstelle der HRP, die in einer Konzentration von 1,2 mg/ml hergestellt worden war, um Latex-Partikel herzustellen, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und der HRP immobilisiert waren.
  • Experimentelles Beispiel 1: Bestimmung der Menge an immobilisiertem Antikörper und Enzym
  • Im Hinblick auf jedes der Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und der HRP immobilisiert waren, die in den Beispielen 1 bis 3 hergestellt wurden, wurde der Überstand nach der Immobilisierung von jedem Antikörper und jedem Enzym einer Quantifizierung von Protein unterzogen, und es wurde jede immobilisierte Mengen pro 1 g der Latex-Partikel auf Trockenbasis berechnet. Die Quantifizierung von Protein wurde wie folgt durchgeführt.
  • Protein-Quantifizierung-Farbstoff-Bindungsverfahren (Bradford-Verfahren)
  • Als Quantifizierung für die Mengen an immobilisierten Antikörpern und Enzymen wurde ein Farbstoff-Bindungsverfahren mit Coomassie Brilliant Blue G-250 verwendet. Die tatsächliche Messung wurde mit einem kommerziell erhältlichen Kit "Coomassie Protein Assay Reagent" (hergestellt von PIERCE) durchgeführt. Das Messverfahren wurde entsprechend den beigefügten Protokollen durchgeführt.
  • Die Kalibrationskurve wurde hergestellt, indem die Absorption bei 595 nm nach Farbentwicklung einer bekannten Konzentration der Antikörper-Lösung oder Enzym-Lösung mit dem vorstehenden Reagens gemessen wurde. Der Überstand, der nach Immobilisierung von allen Antikörpern und Enzymen erhalten wurde und entsprechend verdünnt worden war, wurde mit dem vorstehenden Reagens farbig entwickelt, und die Absorption bei 595 nm wurde dann gemessen, um die Konzentrationen des Antikörpers und des Enzyms anhand der Kalibrierungskurve zu berechnen.
  • Die Messungen wurden bei Raumtemperatur (25°C) durchgeführt. Die Reaktionszeit ist nicht besonders eingeschränkt, und die Absorptionsmessung wurde innerhalb von 90 Minuten nach der Farbentwicklung durchgeführt.
  • Als ein Ergebnis betrug die Menge des immobilisierten Antikörpers (Molekulargewicht: etwa 160.000) für jedes der Beispiele 11,1 mg und die Menge des immobilisierten Enzyms (Molekulargewicht: etwa 40.000) für Beispiel 1 betrug 1,8 mg, die für Beispiel 2 betrug 17,3 mg und die für Beispiel 3 betrug 35,1 mg.
  • Zusätzlich wurde aus den vorstehenden Ergebnissen die Anzahl von Enzymen pro einem Antikörper-Molekül berechnet, und diese betrug 0,6 Moleküle in Beispiel 1, 6,2 Moleküle in Beispiel 2 und 12,6 Molekül in Beispiel 3.
  • Experimentelles Beispiel 2: Bestimmung von Enzym-Aktivität der mit Antikörper und Enzym immobilisierten Latex-Partikel
  • Im Hinblick auf jedes der Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper immobilisiert sind, und die HRP, die in den Beispielen 1 bis 3 hergestellt wurde, wurde davon die Enzym-Aktivität bestimmt. In diesem Experiment wurde TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)-Membran-Peroxidase-Substrat-System (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., pH 4,5) aus einer Substrat-Lösung verwendet. In einer Cuvette wurden 0,1 ml von der Dispersion der Enzym-Antikörper immobilisierten Latex-Partikel, die auf 0,0125 Gewichts-% verdünnt worden waren, und 3,3 ml der vorstehenden Substrat-Lösung vermischt, und das Gemisch wurde bei 25°C umgesetzt. Danach wurde mit einem Spektralphotometer der Anstieg der Absorption nach einer Minute bei 580 nm gemessen. Die Aktivität, bei der die Absorption in einer Minute um 1 erhöht werden kann, wird als 1 U (unit; Einheit) definiert und wird als Aktivität pro 1 g Latex-Partikel auf Trockenbasis ausgedrückt. Als ein Ergebnis betrug die Aktivität pro 1 g Latex-Partikel auf Trockenbasis 10.160 U in Beispiel 1, 85.230 U in Beispiel 2 und 267.180 U in Beispiel 3.
  • Vergleichendes Beispiel 1: Nicht mit Enzym immobilisierter Träger
  • Zu einer Dispersion von blau-gefärbten carboxylierten Polystyrol-Latex-Partikel (Konzentration der festen Bestandteile: 5 Gewichts-%; durchschnittliche Partikelgröße: 0,1 μm; 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8) wurden 0,5 ml wasserlösliches Carbodiimid [hergestellt von DOJINDO LABORATORIES; 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid in einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8] und 2 ml eines polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörpers (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8) zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde drei Stunden bei 10°C umgesetzt. Danach wurde Waschen durch Zentrifugation mit 0,01 M Borat-Puffer bei pH 8 als Waschflüssigkeit durchgeführt, wobei blau-gefärbte Latex- Partikel hergestellt wurden, die mit anti-E. coli 0157:H7-Antikörper markiert waren (Konzentration der festen Bestandteile: 2 Gewichts-%).
  • Beispiel 4: Verwendung von Teststreifen für Immunchromatographie
  • 1) Herstellung von Teststreifen
  • An einer Position, die 30 mm von einem Ende der Nitrocellulosemembran (Porengröße: 8 μm, Dimensionen: 6 mm × 60 mm) entfernt ist, wurden mit einem Dispenser in einer Reihe (Bindungsregion) 1,5 μl eines polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörpers (in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Phosphat-Puffer bei pH 7,4) aufgetragen.
  • Die resultierende Membran wurde 10 Minuten in eine wässrige Lösung eingetaucht, die Rinder-Serumalbumin (hergestellt von Oriental Yeast Co., 1 Gewichts-%) und Polyoxyethylen(10)-octylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 0,1 Gewichts-%) und Saccharose (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 1 Gewichts-%) umfaßte, und dann zwei Stunden bei 40°C getrocknet. Nachfolgend wurde eine Rückseite der Membran, die Seite gegenüber der Antikörperbeschichteten Oberfläche, mit einem Polyesterfilm (100 μm Dicke) zusammengeklebt, wobei ein Sprühkleber verwendet wurde.
  • An einer Position 0 bis 8 mm von dem stromaufwärts gelegen Ende der Antikörper-Beschichtungs-Position entfernt wurde ein Polyester-Vliesstoff-Gewebe (Dimensionen: 6 mm × 8 mm, Dicke: 2,5 mm) zusammengeklebt.
  • Weiter wurde an einer Position 0 bis 10 mm von dem stromabwärts liegenden Ende bezüglich der Position, an die das vorstehende Polyester-Vliesstoff-Gewebe geklebt worden war, ein Zellstoff-Vliesstoff-Gewebe (Dimensionen: 10 mm × 10 mm, Dicke: 5 mm) als ein Wasser-absorbierendes Kissen zusammengeklebt, um einen Teststreifen herzustellen. Sechs Teststreifen wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und für die nachfolgenden Messungen verwendet.
  • 2) Messung
  • Jeder der Teststreifen, in denen E. coli 0157:H7 (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) in einem 0,1 M Phosphat-Puffer (NaCl in einer Konzentration von 0,9 Gewichts-% pH 7,4 enthaltend,) dispergiert war, wurde in einer Konzentration hergestellt, die in Tabelle 1 gezeigt ist. Jedes der Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und der HRP immobilisiert und die in den Beispielen 1 bis 3 hergestellt worden waren, und die blau-gefärbten Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen anti-E. coli 0157:H7-Antikörper immobilisiert worden waren (ohne Immobilisierung des Enzyms), wurden separat mit der resultierenden Testprobe vermischt, so dass jeweils Konzentrationen an festen Bestandteilen von 0,02 Gewichts-% vorlagen. Danach wurden 60 μl von jedem flüssigen Gemisch separat tropfenweise zu dem Polyester-Vliesstoff-Gewebe-Anteil von jedem Teststreifen zugegeben, der vorstehend unter Punkt 1) hergestellt worden war.
  • Jeder der Teststreifen, die mit den Latex-Partikeln verwendet wurden, die in den Beispielen 1 bis 3 hergestellt worden waren, in denen sowohl der Antikörper als auch das Enzym immobilisiert waren, wurde nach fünf Minuten gewaschen, indem tropfenweise 60 μl 0,1 M Phosphat-Puffer zu dem gleichen Vliesstoff-Gewebe-Anteil zugegeben wurden. Nach weiteren fünf Minuten wurden 60 μl TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)-Membran-Peroxidase-Substrat-System (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., pH 4,5) tropfenweise zu dem gleichen Vliesstoff-Gewebe-Anteil zugegeben. Das Auftreten oder Ausbleiben der Farbentwicklung wurde nach 10 Minuten optisch beobachtet.
  • Andererseits wurde zu dem Teststreifen, der mit den blau-gefärbten Latex-Partikeln verwendet wurde, die mit anti-E. coli 0157:H7-Antikörper markiert waren und in dem vergleichenden Beispiel 1 hergestellt worden waren, in denen das Enzym nicht immobilisiert war, ein flüssiges Gemisch der Testprobe und des gefärbten Latex zugegeben. Das Auftreten oder Ausbleiben der Färbung wurde nach 20 Minuten bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Kriterien in Tabelle 1 sind wie folgt.
    • +
    In der Bindungsregion wird eine lineare Färbung beobachtet.
    –
    In der Bindungsregion wird keine lineare Färbung beobachtet.
  • Tabelle 1
    Figure 00470001
  • Obwohl die Anzahl an Zellen im Bereich von 1 × 105 Zellen pro ml für den Test erforderlich war, der ohne Enzym-Mobilisation durchgeführt wurde, d. h. die Markierung erfolgte mit dem gefärbten Latex, konnte E. coli 0157:H7 in der Immunchromatographie, die die erfindungsgemäßen Wasserdispergierbaren polymeren Partikel (Enzymmarkiertes spezifisches Konjugat) verwendet, in denen sowohl das Enzym als auch der Antikörper immobilisiert waren, in einer Konzentration im Bereich von 1 × 103 Zellen pro ml nachgewiesen werden.
  • Zusätzlich ist in "Studies on Food Hygiene", Study Group Report of 0157, the Ministry of Health and Welfare, 48, 35 (1998), berichtet worden, dass die Nachweis-Sensitivität von 0157 bei der Verwendung von herkömmlichen immunchromatographischen Verfahren (Markierung mit gefärbtem Latex) oder bei der Verwendung von enzymatischen immunchromatographischen Verfahren, in denen ein Enzym, das als eine Markierungssubstanz verwendet wird, direkt an einen Antikörper gebunden ist, im Bereich von 105 bis 106 Zellen pro ml liegt.
  • Bei den immunchromatographischen Verfahren, die das erfindungsgemäße Enzymmarkierte spezifische Konjugat verwenden, kann eine hohe Sensitivität erreicht werden, die etwa 100 bis etwa 1.000 mal höher ist, verglichen mit derjenigen dieser herkömmlichen Verfahren, und der benötigte Zeitrahmen kann verkürzt werden.
  • Beispiel 5: Verwendung von Teststreifen für Immunchromatographie
  • 1) Herstellung von Teststreifen, die eine getrocknete Reagens-Region besitzen
  • 1 ml einer Dispersion (2 Gewichts-%) der Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und der HRP immobilisiert worden waren und die in Beispiel 1 hergestellt worden waren, und 6 ml einer wässrigen Saccharoselösung (10 Gewichts-%) wurden miteinander vermischt. Mit 10 μl des resultierenden wässrigen Gemischs wurde Kunstseide-Vliesstoff-Gewebe (Dimensionen: 6 mm × 8 mm) imprägniert, und das Vliesstoff-Gewebe wurde zwei Stunden bei 30°C getrocknet. Dieses Vliesstoff-Gewebe wurde mit einem Bereich, der 12 bis 20 mm von dem gegenüberliegenden Ende der Antikörperbeschichteten Position entfernt war, auf der Seite der Oberfläche des Teststreifens, der die Bindungsregion enthält, die auf die gleiche Art und Weise wie in Punkt 1) von Beispiel 4 hergestellt worden war, zusammengeklebt, um einen Teststreifen herzustellen, der die Bindungsregion und die getrocknete Reagens-Region enthält. Sechs Teststreifen wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und für die nachfolgende Messung verwendet.
  • 2) Messung
  • Zu einem Polyester-Vliesstoff-Gewebe-Anteil des Teststreifens, der unter Punkt 1) vorstehend erhalten wurde, wurden tropfenweise 60 μl der Testprobe zugegeben, die unter Punkt 2) von Beispiel 4 verwendet worden war, und fünf Minuten danach wurde das Waschen durchgeführt, indem tropfenweise 60 μl 0,1 M Phosphatpuffer zu dem gleichen Vliesstoff-Gewebe-Anteil zugegeben wurden. Nach weiteren fünf Minuten wurden 60 μl TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)-Membran-Peroxidase-Substrat-System (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., pH 4,5) tropfenweise zu dem gleichen Vliesstoff-Gewebe-Anteil zugegeben. Das Auftreten oder Ausbleiben einer Farbentwicklung wurde nach 10 Minuten optisch beobachtet. Als ein Ergebnis konnte auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 der E. coli 0157:H7-Stamm in einer Konzentration im Bereich von 1 × 103 Zellen pro ml nachgewiesen werden.
  • Beispiel 6: Herstellung von Enzymmarkiertem spezifischem Konjugat (Enzym-Antikörper immobilisierter Träger)
  • Gänzlich das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein polyclonaler Ziege-anti-Salmonella Antikörper (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 8,2) verwendet wurde, um den spezifischen bindenden Stoff zu immobilisieren, wobei Latex-Partikel hergestellt wurden, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-Salmonella Antikörper und der HRP immobilisiert waren. Die Menge des immobilisierten Antikörpers betrug 12,3 mg pro 1 g Latex-Partikel auf Trockenbasis, und die Menge an immobilisiertem Enzym betrug 2,3 mg pro 1 g Latex-Partikel auf Trockenbasis.
  • Beispiel 7: Herstellung von Enzymmarkiertem spezifischem Konjugat (Enzym-Antikörper immobilisierter Träger)
  • Gänzlich das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein monoclonaler anti-Verotoxin Typ 1-A-Untereinheit-Antikörper (hergestellt von ViroStat in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 8,2) verwendet wurde, um den spezifischen bindenden Stoff zu immobilisieren, wobei Latex-Partikel hergestellt wurden, die mit dem monoclonalen anti-Verotoxin Typ 1-A-Untereinheit-Antikörper und der HRP immobilisiert waren. Die Menge des immobilisierten Antikörpers betrug 70 mg pro 1 g Latex-Partikel auf Trockenbasis, und die Menge an immobilisiertem Enzym betrug 2 mg pro 1 g Latex-Partikel auf Trockenbasis.
  • Beispiel 8: Herstellung von Enzymmarkiertem spezifischem Konjugat (Enzym-Antikörper immobilisierter Träger)
  • Gänzlich das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein monoclonaler anti-Verotoxin Typ 2-A-Untereinheit-Antikörper (hergestellt von ViroStat in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 8,2) verwendet wurde, um den spezifischen bindenden Stoff zu immobilisieren, wobei Latex-Partikel erhalten wurden, die mit dem monoclonalen anti-Verotoxin Typ 2-A-Untereinheit-Antikörper und der HRP immobilisiert waren. Die Menge an immobilisiertem Antikörper betrug 68 mg pro 1 g Latex-Partikel auf Trockenbasis, und die Menge an immobilisiertem Enzym betrug 1,8 mg pro 1 g Latex-Partikel auf Trockenbasis.
  • Beispiel 9: Nachweis von E. coli 0157:H7 und Salmonella
  • 1) Herstellung von Teststreifen
  • An einer Stelle, die 30 mm von einem Ende der Nitrocellulose-Membran (Porengröße: 8 μm, Dimensionen: 6 mm × 60 mm) entfernt war, wurden mit einem Dispenser in zwei Reihen (Bindungsregion) jeweils 1,5 μl polyclonaler Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper (in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,5) und ein polyclonaler Ziege-anti-Salmonella-Antikörper (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4) aufgetragen.
  • Die resultierende Membran wurde 10 Minuten lang in eine wässrige Lösung eingetaucht, die Rinder-Serumalbumin (hergestellt von Oriental Yeast Co., 1 Gewichts-%) und Polyoxythylen(10)octylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd., 0,1 Gewichts-%) und Saccharose (hergestellt von Wako Pure Chemical Industires, Ltd., 1 Gewichts-%) umfasste und dann zwei Stunden bei 40°C getrocknet. Nachfolgend wurde eine Rückseite der Membran, die Seite gegenüber der Antikörperbeschichteten Oberfläche, mit einem Polyesterfilm (100 μm Dicke) zusammengeklebt, wobei ein Sprühkleber verwendet wurde. Eine Position, die 0 bis 8 mm von dem stromaufwärts liegenden Ende der Antikörperbeschichteten Position gelegen war, wurde mit einem Polyester-Vliesstoff-Gewebe (Dimensionen: 6 mm × 8 mm, Dicke: 2,5 mm) zusammengeklebt. Weiter wurde eine Position, die 0 bis 10 mm von dem stromabwärts gelegenen Ende in Bezug auf die Position entfernt war, an der das vorstehende Polyester-Vliesstoff- Gewebe aufgeklebt war, mit einem Zellstoff-Vliesstoff-Gewebe (Dimensionen: 10 mm × 10 mm, Dicke: 5 mm) als ein Wasserabsorbierendes Kissen zusammengeklebt, wobei ein Teststreifen hergestellt wurde. Vier Teststreifen wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und für die nachfolgende Messung verwendet.
  • 2) Messung
  • Jede der Testproben wurde hergestellt, indem E. coli 0157:H7 (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) oder S. typhimurium (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) in 0,1 M Phosphatpuffer (NaCl enthalten zu 0,9 Gewichts-%, pH 7,4) in einer Konzentration die in Tabelle 2 gezeigt ist, dispergiert wurde.
  • Mit der resultierenden Testprobe wurden die in Beispiel 1 hergestellten Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und der HRP immobilisiert waren, und die in Beispiel 6 hergestellten Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-Salmonella-Antikörper und der HRP immobilisiert waren, separat vermischt, so dass jeder der festen Bestandteile in Konzentrationen von 0,02 Gewichts-% vorlag. Danach wurden 60 μl von jedem flüssigen Gemisch separat tropfenweise zu dem Polyester-Vliesstoff-Gewebe-Anteil von jedem Teststreifen zugegeben, die unter Punkt 1) vorstehend hergestellt worden waren.
  • Jeder der Teststreifen, die mit den Latex-Partikeln verwendet wurden, die in den Beispielen 1 und 6 hergestellt worden waren, in denen sowohl der Antikörper als auch das Enzym immobilisiert waren, wurde nach fünf Minuten gewaschen, indem tropfenweise 60 μl 0,1 M Phosphatpuffer zu dem gleichen Vliesstoff-Gewebe-Anteil zugegeben wurden. Nach weiteren fünf Minuten wurden 60 μl TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)-Membran-Peroxidase-Substrat-System (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., pH 4,5) tropfenweise zu dem gleichen Vliesstoff-Gewebe-Anteil zugegeben. Das Auftreten oder Ausbleiben einer Farbentwicklung wurde nach 10 Minuten optisch beobachtet.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Kriterien in Tabelle 2 sind wie folgt.
    • +
    In der Bindungsregion wird eine lineare Färbung beobachtet.
    –
    In der Bindungsregion wird keine lineare Färbung beobachtet.
  • Tabelle 2
    Figure 00530001
  • Beispiel 10: Nachweis von E. coli 0157:H7 und Vero-Toxin
  • 1) Herstellung von Teststreifen
  • An einer Position, die 30 mm von einem Ende der Nitrocellulose-Membran (Porengröße: 8 μm, Dimensionen: 6 mm × 60 mm) entfernt war, wurden mit einem Dispenser in drei Reihen (Bindungsregion) jeweils 1,5 μl von einem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,4), einem monoclonalen anti-Vero-Toxin Typ 1-B-Untereinheit-Antikörper (hergestellt von ViroStat in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4) und einem monoclonalen anti-Vero-Toxin Typ 2-B-Untereinheit-Antikörper (hergestellt von ViroStat in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4) aufgetragen.
  • Die resultierende Membran wurde 10 Minuten in eine wässrige Lösung eingetaucht, die Rinder-Serumalbumin (hergestellt von Oriental Yeast Co., 1 Gewichts-%) und Polyoxyethylen(10)octylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 0,1 Gewichts-%) und Saccharose (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 1 Gewichts-%) umfaßte, und dann bei 40°C zwei Stunden getrocknet. Nachfolgend wurde eine Rückseite der Membran, die Seite gegenüber der Antikörperbeschichteten Oberfläche, mit einem Polyester-Film (100 μm Dicke) zusammengeklebt, wobei Sprühkleber verwendet wurde. Eine Position, die 0 bis 8 mm von dem stromabwärts liegenden Ende der Antikörperbeschichteten Position lokalisiert war, wurde mit einem Polyester-Vliesstoff-Gewebe (Dimensionen: 6 mm × 8 mm, Dicke: 2,5 mm) zusammengeklebt. Weiter wurde eine Position, die 0 bis 10 mm war vom stromabwärts gelegenen Ende in Bezug auf die Position entfernt, an der das vorstehende Polyester-Vliesstoff-Gewebe aufgeklebt war, mit einem Zellstoff-Vliesstoff-Gewebe (Dimensionen: 10 mm × 10 mm, Dicke: 5 mm) als ein Wasserabsorbierendes Kissen zusammengeklebt, um einen Teststreifen herzustellen. Acht Teststreifen wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und für die nachfolgende Messung verwendet.
  • 2) Messung
  • Jeder der Teststreifen wurde hergestellt, indem in denen E. coli 0157:H7 (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.), Vero-Toxin-Typ 1 und Vero-Toxin-Typ 2 (jedes davon hergestellt von DENKA SEIKEN Co.) in 0,1 M Phosphat-Puffer (wobei NaCl in einer Konzentration von 0,9 Gewichts-%, pH 7,4 enthalten ist), in einer Konzentration, die in Tabelle 3 gezeigt ist, dispergiert wurde.
  • Mit der resultierenden Testprobe wurden separat die in Beispiel 1 hergestellten Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und der HRP immobilisiert waren, die in Beispiel 7 hergestellten Latex-Partikel, die mit dem monoclonalen anti-Vero-Toxin Typ 1-A-Untereinheit-Antikörper und der HRP immobilisiert waren, und die in Beispiel 8 hergestellten Latex-Partikel, die mit dem monoclonalen anti-Vero-Toxin Typ 2-A-Untereinheit-Antikörper und der HRP immobilisiert waren, vermischt so dass jeder der festen Bestandteile in einer Konzentration von 0,02 Gewichts-% vorlag. Danach wurden 60 μl von jedem flüssigen Gemisch separat tropfenweise zu dem Polyester-Vliesstoff-Gewebe-Anteil von jedem Teststreifen zugegeben, die in vorstehendem Punkt 1) hergestellt worden waren.
  • Jeder der Teststreifen, die mit den Latex-Partikeln verwendet wurden, die in den Beispielen 1, 7 und 8 hergestellt worden waren, in denen sowohl der Antikörper als auch das Enzym immobilisiert waren, wurde nach fünf Minuten durch tropfenweise Zugabe von 60 μl 0,1 M Phosphatpuffer zu dem gleichen Vliesstoff-Gewebe-Anteil gewaschen. Nach weiteren fünf Minuten wurden 60 μl TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)-Membran-Peroxidase-Substrat-System (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., pH 4,5)) tropfenweise zu dem gleichen Vliesstoff-Gewebe-Anteil zugegeben. Das Auftreten oder Ausbleiben einer Farbentwicklung wurde nach 10 Minuten optisch beobachtet.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Kriterien in Tabelle 3 sind wie folgt.
    • +
    In der Bindungsregion wird eine lineare Färbung beobachtet.
    –
    In der Bindungsregion wird keine lineare Färbung beobachtet.
  • Tabelle 3
    Figure 00560001
  • Beispiel 11: Nachweis von E. coli 0157:H7 und Salmonella
  • Gänzlich das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt mit der Ausnahme, dass jeweils 2 ml eines polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörpers (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 8,2) und eines polyclonalen Ziege-anti-Salmonella-Antikörpers (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 8,2) verwendet wurden, um Latex-Partikel herzustellen, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper, dem polyclonalen Ziege-anti-Salmonella Antikörper und der HRP immobilisiert waren.
  • Gänzlich das gleiche Experiment wie in Beispiel 9 wurde durchgeführt mit der Ausnahme, dass die vorstehend hergestellten resultierenden Latex-Partikel verwendet wurden, und es zeigte sich, dass E. coli 0157:H7 und Salmonella nachgewiesen werden konnten.
  • Beispiel 12: Herstellung von Teststreifen für Immunchromatographie und deren Verwendung
  • 1) Herstellung von Teststreifen, die eine getrocknete Reagens-Region besitzen
  • Es wurden 1 ml einer Dispersion (2 Gewichts-%) der in Beispiel 1 hergestellten Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und der HRP immobilisiert waren, 1 ml einer Dispersion (2 Gewichts-%) der in Beispiel 6 hergestellten Latex-Partikel, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-Salmonella-Antikörper und der HRP immobilisiert waren, und 6 ml einer wässrigen Saccharose-Lösung (10 Gewichts-%) miteinander vermischt. Mit 10 μl des resultierenden flüssigen Gemisches wurde ein Kunstseide-Vliesstoff-Gewebe (Dimensionen: 6 mm × 8 mm) imprägniert, und das Vliesstoff-Gewebe wurde zwei Stunden bei 30°C getrocknet. Dieses Vliesstoff-Gewebe wurde mit einer Position, die 12 bis 20 mm von dem gegenüberliegenden Ende der Antikörperbeschichteten Position entfernt war, auf der Seite der Oberfläche des Teststreifens zusammengeklebt, die die Bindungsregion enthält, die auf die gleiche Weise wie in Punkt 1) von Beispiel 9 hergestellt worden war, wobei ein Teststreifen hergestellt wurde, der die Bindungsregion und die getrocknete Reagens-Region enthält. Vier Teststreifen wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt und für die nachfolgende Messung verwendet.
  • 2) Messung
  • Zu dem Polyester-Vliesstoff-Gewebe-Anteil von jedem der Teststreifen, die in vorstehendem Punkt 1) hergestellt worden waren, wurden tropfenweise 60 μl der Testprobe zugegeben, die in Punkt 2) von Beispiel 9 verwendet worden war, und durch tropfenweise Zugabe von 60 μl 0,1 M Phosphatpuffer wurde der gleiche Vliesstoff-Gewebe-Anteil gewaschen. Nach weiteren fünf Minuten wurden 60 μl TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)-Membran-Peroxidase-Substrat-System (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., pH 4,5) zu dem gleichen Vliesstoff-Gewebe-Anteil zugegeben. Das Auftreten oder Ausbleiben einer Farbentwicklung wurde nach 10 Minuten optisch beobachtet. Als ein Ergebnis konnten E. coli 0157:H7 und Salmonella gleichzeitig nachgewiesen werden.
  • Beispiel 13: Herstellung von Teststreifen für die Immunchromatographie und deren Verwendung
  • Gänzlich das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt, mit der Ausnahme dass jeweils 2 ml eines polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörpers (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 8,2) und eines polyclonalen Ziege-anti-Salmonella-Antikörpers (hergestellt von Kirkegaard & Perry Laboratories Inc. in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,01 M Borat-Puffer bei einem pH-Wert von 8,2) verwendet wurden, um Latex-Partikel herzustellen, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper, dem polyclonalen Ziege-anti-Salmonella-Antikörper und der HRP immobilisiert waren. Gänzlich das gleiche Verfahren wie in Beispiel 12 wurde durchgeführt, mit der Ausnahme dass die vorstehend hergestellten resultierenden Latex-Partikel verwendet wurden, um einen Teststreifen herzustellen, der die Bindungsregion und die getrocknete Reagens-Region enthielt.
  • Gänzlich das gleiche Experiment wie in Beispiel 12 wurde durchgeführt, mit der Ausnahme dass der resultierende Teststreifen verwendet wurde, und es wurde gefunden, dass E. coli 0157:H7 und Salmonella nachgewiesen werden konnten.
  • Vergleichendes Beispiel
  • Beispiel 14: Nachweis von E. coli 0157:H7 und Salmonella durch direkt markierten Antikörper mit Enzym
  • Gänzlich das gleiche Experiment wie in Beispiel 9 wurde durchgeführt, mit der Ausnahme dass ein polyclonaler HRP markierter Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper anstelle der in Beispiel 1 hergestellten Latex-Partikel polyclonalen verwendet wurde, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-E. coli 0157:H7-Antikörper und der HRP immobilisiert waren, und dass ein polyclonaler HRP markierter Ziege-anti-Salmonella-Antikörper anstelle der in Beispiel 6 hergestellten Latex-Partikel verwendet wurde, die mit dem polyclonalen Ziege-anti-Salmonella-Antikörper und der HRP immobilisiert waren verwendet wurde und dass die Komponenten so vermischt wurden, dass die festen Bestandteile jeweils in einer Konzentration von 0,001 Gewichts-% vorlagen. Als ein Ergebnis konnten E. coli 0157:H7 und Salmonella auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 9 nachgewiesen werden.

Claims (26)

  1. Markiertes Konjugat, umfassend in Wasser dispergierbare Polymerpartikel als Träger, mindestens eine immunchemische Komponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Haptenen, Antikörpern und Oligonucleotiden, und eine Markierung, wobei die Markierung ein für den Nachweis verwendbares Enzym ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peroxidasen, β-D-Galactosidase, alkalischen Phosphatasen, Glucose-Oxidasen, Luciferase, Esterasen und β-D-Glucuronidase, wobei die immunchemische Komponente und das Enzym über den Träger miteinander verbunden sind und jedes auf einer Oberfläche des Trägers immobilisiert ist, und wobei die Gesamtmenge der immobilisierten immunchemischen Komponente und des immobilisierten Enzyms zwischen 5 und 200 mg pro 1 g der in Wasser dispergierbaren Polymerpartikel bezogen auf die Trockenmasse liegt.
  2. Markiertes Konjugat nach Anspruch 1, wobei die immunchemische Komponente und/oder das Enzym über eine kovalente Bindung auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert sind.
  3. Markiertes Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Menge des auf einer Oberfläche des Trägers immobilisierten Enzyms von 1,0 bis 100 mg pro 1 g der in Wasser dispergierbaren Polymerpartikel bezogen auf die Trockenmasse beträgt.
  4. Markiertes Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Enzym auf einer Oberfläche des Trägers in einem Verhältnis von 0,6 bis 60 Mol pro ein Mol der immunochemischen Komponente immobilisiert ist, die auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert ist.
  5. Markiertes Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Enzym mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peroxidasen und alkalischen Phosphatasen ist.
  6. Markiertes Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die enzymatische Aktivität bei 5.000 bis 300.000 U pro 1 g der in Wasser-dispergierbaren Polymerpartikel bezogen auf die Trockenmasse liegt, in einem Fall, in dem das auf dem Träger zu immobilisierende Enzym eine Peroxidase ist.
  7. Markiertes Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Partikelgröße der in Wasser dispergierbaren Polymerpartikel bei 0,01 bis 3 μm liegt.
  8. Markiertes Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei jedes der in Wasser dispergierbaren Polymerpartikel eine Carboxylgruppe hat.
  9. Verfahren zum Nachweis eines Analyten, umfassend die folgenden Schritte: (1) Bildung eines Komplexes aus: (a) einem Enzym-markierten spezifischen Konjugat, erhalten durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, mittels eines Trägers; und (b) dem Analyten, wobei der resultierende Komplex auf einem Wasser absorbierenden Substrat eingesaugt wird; (2) Binden des Komplexes an einer Bindungsregion, die mit einem zweiten spezifischen bindenden Stoff, der in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, auf dem Wasser absorbierenden Substrat immobilisiert ist; und (3) Nachweis des gebundenen Komplexes.
  10. Verfahren zum Nachweis einer Vielzahl von Analyten, umfassend die folgenden Schritte: (1) Bildung eines Komplexes oder von Komplexen aus: (a) einem Enzym-markierten spezifischen Konjugat erhalten durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, mittels eines Trägers; und (b) einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten, wobei der resultierende Komplex oder die Komplexe auf einem Wasser-absorbierenden Substrat eingesaugt wird/werden; (2) Binden des Komplexes oder der Komplexe an die Vielzahl der Bindungsregionen auf dem Wasser absorbierenden Substrat, von denen jede mit einem zweiten spezifischen bindenden Stoff immobilisiert ist, der in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl der unterschiedlichen Analyten zu binden; und (3) Nachweis des oder der gebundenen Komplexe(s).
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Enzym-markierte spezifische Konjugat durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an einen der Vielzahl unterschiedlicher Analyten zu binden, und eine Vielzahl von Komplexen durch die Verwendung einer Vielzahl verschiedener Enzym-markierter spezifischer Konjugate gebildet wird, von denen jedes in der Lage ist, einen aus der Vielzahl unterschiedlicher Analyten zu binden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Enzym-markierte spezifische Konjugat durch Verbinden eines Enzyms und einer Vielzahl erster spezifischer bindender Stoffe mittels eines Trägers erhalten wird, von denen jeder in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl der Analyten zu binden.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Enzym-markierte spezifische Konjugat der markierte Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 8 ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei der zweite spezifische bindende Stoff ein oder mehrere Stoffe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Haptenen und Oligonucleotiden.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei der zweite spezifische bindende Stoff auf dem Wasser absorbierenden Substrat immobilisiert ist, um die Bindungsregion zu bilden, und das resultierende Wasser absorbierende Substrat mit einer Lösung behandelt wird, die ein Protein, einen grenzflächenaktiven Stoff und einen Zucker enthält.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei der Träger gefärbt ist.
  17. Teststreifen, umfassend: (a) eine Bindungsregion, angeordnet auf einem Wasser absorbierenden Substrat, umfassend einen zweiten spezifischen bindenden Stoff, der in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, wobei der zweite spezifische bindende Stoff darauf immobilisiert ist; (b) eine getrocknete Reagens-Region, umfassend ein Enzym markiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, wobei die getrocknete Reagens-Region so auf dem Wasser-absorbierenden Substrat angeordnet ist, dass das Enzym-markierte spezifische Konjugat bei Kontakt mit Wasser den Bereich verlässt und aufgesaugt wird; und (c) einen Probenempfänger, der an einer stromaufwärts zur getrockneten Reagens-Region gelegenen Position oder an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region angeordnet ist.
  18. Teststreifen, umfassend: (a) eine Vielzahl von Bindungsregionen, angeordnet auf einem Wasser-absorbierenden Substrat, wobei jede einen zweiten spezifischen bindenden Stoff umfasst, der in der Lage ist, spezifisch an eine Vielzahl unterschiedlicher Analyten zu binden, wobei jeder der zweiten spezifischen bindenden Stoffe darauf immobilisiert ist; (b) eine getrocknete Reagens-Region, umfassend ein Enzym-markiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und erster spezifischer bindender Stoffe mittels eines Trägers erhalten wird, wobei von den Stoffen jeder in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl der Analyten zu binden, um einen Komplex zu bilden, wobei die getrocknete Reagens-Region so auf dem Wasser absorbierenden Substrat angeordnet ist, dass das Enzym-markierte spezifische Konjugat bei Kontakt mit Wasser den Bereich verlässt und aufgesaugt wird; und (c) einen Probenempfänger, der an einer stromaufwärts zur getrockneten Reagens-Region gelegenen Position oder an der gleichen Position wie die getrocknete Reagens-Region angeordnet ist.
  19. Teststreifen nach Anspruch 18, wobei das Enzym-markierte spezifische Konjugat durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an einen Analyten zu binden, und wobei die getrocknete Reagens-Region eine Vielzahl unterschiedlicher Enzym-markierter spezifischer Konjugate umfasst, von denen jedes in der Lage ist, spezifisch an einen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten zu binden.
  20. Teststreifen nach Anspruch 18, wobei das Enzym-markierte spezifische Konjugat durch Verbinden eines Enzyms und einer Vielzahl erster spezifischer bindender Stoffe mittels eines Trägers erhalten wird, wobei von den Stoffen jeder in der Lage ist, spezifisch an einen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten zu binden.
  21. Teststreifen nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei das Enzym-markierte spezifische Konjugat der markierte Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 8 ist.
  22. Teststreifen nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei der zweite spezifische bindende Stoff ein oder mehrere Stoffe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Haptenen und Oligonucleotiden.
  23. Teststreifen nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei der zweite spezifische bindende Stoff auf dem Wasser absorbierenden Substrat immobilisiert ist, um die Bindungsregion zu bilden, und das resultierende Wasser absorbierende Substrat mit einer Lösung, die ein Protein, einen grenzflächenaktiven Stoff und einen Zucker umfasst, behandelt wird.
  24. Teststreifen nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei der Träger gefärbt ist.
  25. Kit zum Testen auf einen Analyten, umfassend: (1) einen Teststreifen, umfassend eine Bindungsregion, angeordnet auf einem Wasser absorbierenden Substrat, umfassend einen zweiten spezifischen bindenden Stoff, der in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden, und einen Probenempfänger, der an einer stromaufwärts zur Bindungsregion gelegenen Position angeordnet ist; und (2) ein Enzym markiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden.
  26. Kit zum Testen auf eine Vielzahl von Analyten, umfassend: (1) einen Teststreifen, umfassend eine Vielzahl von Bindungsregionen, die auf einem Wasser absorbierenden Substrat angeordnet sind, wobei jede einen zweiten spezifischen bindenden Stoff umfasst, der in der Lage ist, spezifisch an einen aus der Vielzahl der Analyten zu binden, und einen Probenempfänger, der an einer stromaufwärts zur Bindungsregion gelegenen Position angeordnet ist; und (2) ein Enzym-markiertes spezifisches Konjugat, das durch Verbinden eines Enzyms und eines ersten spezifischen bindenden Stoffes mittels eines Trägers erhalten wird, wobei der Stoff in der Lage ist, spezifisch an den Analyten zu binden.
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