DE60318435T2 - Universeller biosensor und verfahren zur verwendung - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten unter Verwendung eines universellen Biosensors, bei denen markerbeladene Partikel und/oder Auffangmembranen an jedes/jeden gewünschte/n Erkennungselement und Analyten angepasst werden. Verfahren zur Verwendung der Einrichtung können markerbeladene Partikel, zum Beispiel Liposomen, und entweder den elektrochemischen oder den optischen Nachweis eines Zielanalyten in einer Testprobe verwenden.
  • AUSGANGSSITUATION DER ERFINDUNG
  • Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäuren sind zum Nachweisen und Messen des Vorhandenseins von Organismen, zum Beispiel Krankheitserreger, in Lebensmitteln und Wasservorräten potenziell zweckdienlich. Die herkömmlichen Verfahren zum Isolieren und Sichtbarmachen von spezifischen Nukleinsäuresequenzen sind das Southern Blotting, das Northern Blotting, das Dot Blotting, das Reverse Dot Blotting und die Elektrophorese. Jedes hat Vorteile und Nachteile. So ist zum Beispiel die Gelelektrophorese, die oft unter Einsatz einer Ethidiumbromid-Färbung durchgeführt wird, ein relativ einfaches Verfahren zum Gewinnen von Fragmentlängen-Informationen für DNA-Duplexe. Diese Technik stellt jedoch keine Informationen über die Nukleotidsequenz der Fragmente bereit, und Ethidiumbromid gilt als hochgiftig, auch wenn in letzter Zeit sicherere Farbstoffe entwickelt worden sind.
  • Wenn neben der Gewinnung von Längeninformationen auch die Bestimmung des Vorhandenseins von spezifischen Nukleotidsequenzen gewünscht wird, kann entweder das Southern Blotting (für DNA) oder das Northern Blotting (für RNA) gewählt werden. Diese Verfahren trennen zuerst die Nukleinsäuren auf einem Gel auf und übertragen sie anschließend auf einen Membranfilter, wo sie entweder durch Trocknen oder UV-Bestrahlung fixiert werden. Dieses Verfahren dauert oft mehrere Stunden. Die Membran wird typischerweise mit einer Vorhybridisierungslösung behandelt, um unspezifische Bindungen zu reduzieren, bevor die Übertragung in eine Lösung einer Reportersonde erfolgt. Die Hybridisierung erfolgt dann zwischen der Sonde und allen Sequenzen, zu denen sie komplementär ist. Die Anfangshybri disierung wird typischerweise unter Bedingungen einer relativ geringen Stringenz oder Selektivität durchgeführt, gefolgt von Waschungen zunehmender Stringenz, um die unspezifisch gebundene Sonde zu beseitigen und den Störabstand zu verbessern.
  • Ursprünglich wurden Sonden oft mit 32P markiert, das nachgewiesen wurde, indem die Membran auf einen photographischen Film belichtet wurde. Heutzutage verwenden viele Forscher jedoch nichtisotopische Reportersonden. Diese Blotting-Verfahren erfordern mehr Zeit und Mühe als eine einfache Gelelektrophorese, insbesondere dann, wenn geringe Nuldeinsäuremengen vorhanden sind. Insbesondere nimmt der gesamte Prozess des Nachweisens einer spezifischen Sequenz in einer Nukleinsäuremischung oft bis zu zwei Tage in Anspruch und ist sehr arbeitsintensiv und teuer.
  • In der Literatur gibt es eine breite Palette von DNA- und RNA-Nachweisanordnungen, von denen viele als handelsübliche Sätze erhältlich sind. Bei den Nukleinsäure-Nachweisanordnungen hat es die gleichen Trends hinsichtlich des Assay-Aufbaus gegeben wie bei den Immunoassays, wobei die Bemühungen auf einfachere, schnellere und automatisierbare Nachweisanordnungen gerichtet sind.
  • Liposomen sind aufgrund ihres Potenzials zur unmittelbaren Signalverstärkung als nachweisbare Marker in Hybridisierungsassays von Interesse. Liposomen sind kugelförmige Bläschen, in denen ein wässeriges Volumen von einer Doppelschichtmembran, die aus Lipiden und Phospholipiden zusammengesetzt ist, eingeschlossen ist (New, Liposomes: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1990)). Vorherige Studien (Plant et al., Anal. Biochem., 176: 420–426 (1989); Durst et al., In: GBF Monograph Series, Schmid, Ed., VCH, Weinheim, Bundesrepublik Deutschland, Band 14, Seiten 181–190 (1990)) haben die Vorteile von liposomgekapseltem Farbstoff gegenüber enzymatisch erzeugter Farbe bei der Signalverstärkung in Konkurrenz-Immunoassays demonstriert. Die bei diesen Versuchen verwendeten Kapillarmigrations- oder Lateralflussassays vermeiden Auftrenn- und Waschschritte und lange Inkubationszeiten und erreichen eine Empfindlichkeit und eine Spezifität, die mit denen von Nachweisassays, die mit Enzymen verknüpft sind, vergleichbar sind. Dennoch müssen für jeden krankheitserregenden Organismus neue Liposomen und Membranen entwickelt werden. Das ist ein mühsamer und zeitaufwendiger Prozess. Die EP-A-0 239318 , die WO 99/60399 , die US-A-5498551 , die US-A-5948624 , Igbal et al, Biosensors, Bioelectr 15: 549–78 (2000) und Rule et al, Anal. Biochem. 244: 260–9 (1997) offenbaren jeweils Verfahren nach dem Stand der Technik zum Nachweisen von Analyten in Testproben. Jedoch leiden alle nach dem Stand der Technik offenbarten Verfahren an dem Problem, dass sie die Verwendung von Markern einschließen, die durch direktes Koppeln eines analytenspezifischen Bindematerials an den Marker auf einen bestimmten Analyten festgelegt worden sind. Daher kann keines der bekannten Verfahren dazu verwendet werden, Analyten unter Verwendung eines Markers nachzuweisen, der mühelos an den bzw. die spezifischen Analyten von Interesse anpassbar sein kann. Daher besteht auf dem vorliegenden Fachgebiet ein starkes Bedürfnis nach universell anwendbaren Verfahren, die es einem Forscher ermöglichen, einen Testsatz schnell und mühelos anzupassen, um verschiedene unterschiedliche Analyten nachzuweisen.
  • Demgemäß besteht nach wie vor Bedarf an einem einfachen, zuverlässigen universellen Biosensor, der generische Bestandteile verwendet, die mit einem beliebigen Analyten, zum Beispiel umwelt- und lebensmittelverunreinigende Stoffe einschließlich krankheitserregender Organismen, kompatibel sind. Die vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet, diese und andere Unzulänglichkeiten auf dem vorliegenden Fachgebiet zu beseitigen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten in einer Testprobe. Dieses Verfahren schließt das Bereitstellen mindestens einer Testmischung ein, umfassend: eine Testprobe, wobei die Testprobe potenziell einen Analyten enthält, einen Markerkomplex, wobei der Markerkomplex ein Partikel, einen Marker und ein erstes Element einer ersten Kopplungsgruppe umfasst, ein erstes Bindematerial, wobei das erste Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, und wobei das erste Bindematerial ein zweites Element der ersten Kopplungsgruppe umfasst, und ein zweites Bindematerial, wobei das zweite Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, der ein anderer Teil als der Teil des Analyten ist, für den das erste Bindematerial ausgewählt wird, und wobei das zweite Bindematerial ein erstes Element einer zweiten Kopplungsgruppe umfasst. Die mindestens eine Testmischung wird durch eine Membran geleitet, in Bezug auf die ein zweites Element der zweiten Kopplungsgruppe immobilisiert ist. Es wird eine Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial, zwischen dem ersten und dem zweiten Element der ersten Kopplungsgruppe und zwischen dem ersten und dem zweiten Element der zweiten Kopplungsgruppe zugelassen. Das Vorhandensein oder die Menge des Markers auf der Membran wird unter Verwendung einer Nachweisbaugruppe nachgewiesen und mit dem Vorhandensein oder der Menge des Analyten in der Testprobe korreliert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten in einer Testprobe, das das Bereitstellen mindestens einer Testmischung einschließt, einschließend: eine Testprobe, wobei die Testprobe potenziell einen Analyten enthält, einen Markerkomplex, wobei der Markerkomplex ein Partikel, einen Marker und ein erstes Element einer Kopplungsgruppe umfasst, ein erstes Bindematerial, wobei das erste Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, und wobei das erste Bindematerial ein zweites Element der Kopplungsgruppe umfasst. Die mindestens eine Testmischung wird durch eine Membran geleitet, in Bezug auf die ein zweites Bindematerial immobilisiert ist, wobei das zweite Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, der ein anderer Teil als der Teil des Analyten ist, für den das erste Bindematerial ausgewählt wird. Es wird eine Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial und zwischen dem ersten und dem zweiten Element der Kopplungsgruppe zugelassen. Das Vorhandensein oder die Menge des Markers auf der Membran wird unter Verwendung einer Nachweisbaugruppe nachgewiesen und mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Testprobe korreliert.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten in einer Testprobe, einschließend das Bereitstellen mindestens einer Testmischung, einschließend eine Testprobe, wobei die Testprobe potenziell einen Analyten enthält, ein Markerkonjugat, wobei das Markerkonjugat ein Partikel, einen Marker und ein erstes Bindematerial umfasst, wobei das erste Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, und ein zweites Bindematerial, wobei das zweite Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, der ein anderer Teil als der Teil des Analyten ist, für den das erste Bindematerial ausgewählt wird, und wobei das zweite Bindematerial ein erstes Element einer Kopplungsgruppe umfasst. Die mindestens eine Testmischung wird durch eine Membran geleitet, in Bezug auf die ein zweites Element der Kopplungsgruppe immobilisiert ist. Es wird eine Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial und zwischen dem ersten und dem zweiten Element der Kopplungsgruppe zugelassen. Das Vorhandensein oder die Menge des Markers auf der Membran wird unter Verwendung einer Nachweisbaugruppe nachgewiesen und mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Testprobe korreliert.
  • Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten in einer Testprobe. In dieser Ausführungsform schließt das Verfahren das Bereitstellen einer Testmischung ein, umfassend: eine Testprobe, wobei die Testprobe potenziell einen Analyten enthält, einen ersten Markerkomplex, wobei der erste Markerkomplex ein erstes Partikel, einen ersten Marker und ein erstes Element einer ersten Kopplungsgruppe umfasst, ein erstes Bindematerial, wobei das erste Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, und wobei das erste Bindematerial ein zweites Element der ersten Kopplungsgruppe umfasst, einen zweiten Markerkomplex, wobei der zweite Markerkomplex ein zweites Partikel, einen zweiten Marker und ein erstes Element einer zweiten Kopplungsgruppe umfasst, und ein zweites Bindematerial, wobei das zweite Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, der ein anderer Teil als der Teil des Analyten ist, für den das erste Bindematerial ausgewählt wird, und wobei das zweite Bindematerial ein zweites Element der zweiten Kopplungsgruppe umfasst. Es wird eine Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial, zwischen dem ersten und dem zweiten Element der ersten Kopplungsgruppe und zwischen dem ersten und dem zweiten Element der zweiten Kopplungsgruppe zugelassen, um ein Aggregat zu bilden. Das Aggregat wird an einer Filtriereinrichtung gesammelt und das Vorhandensein oder die Menge des Markers an der Filtriereinrichtung unter Verwendung einer Nachweisbaugruppe nachgewiesen. Das Vorhandensein oder die Menge des Markers an der Filtriereinrichtung wird mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Testprobe korreliert.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten in einer Testprobe. Bei diesem Verfahren wird eine Membran, in Bezug auf die ein erstes Bindematerial immobilisiert ist, bereitgestellt, wobei das erste Bindematerial zu einer Bindung an einen Teil des Analyten fähig ist. Das Verfahren schließt auch das Bereitstellen mindestens einer Testmischung ein, umfassend: eine Testpro be, wobei die Testprobe potenziell einen Analyten enthält, einen Markerkomplex, wobei der Markerkomplex ein Partikel, einen Marker und ein erstes Element einer ersten Kopplungsgruppe umfasst, und ein Analyten-Analogon, wobei das Analyten-Analogon ein zweites Element der ersten Kopplungsgruppe umfasst. Es wird eine Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Element der ersten Kopplungsgruppe zugelassen. Die Testmischung wird unter Bedingungen durch die Membran geleitet, die so wirken, dass sie eine Konkurrenz zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem Analyten-Analogon um das erste Bindematerial zulassen. Das Vorhandensein oder die Menge des Markers auf der Membran wird unter Verwendung einer Nachweisbaugruppe nachgewiesen und mit dem Vorhandensein oder der Menge des Analyten in der Testprobe korreliert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein anderes Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten in einer Testprobe. Dieses Verfahren schließt das Bereitstellen mindestens einer Testmischung ein, umfassend: eine Testprobe, wobei die Testprobe potenziell einen Analyten enthält, einen Markerkomplex, wobei der Markerkomplex ein Partikel, einen Marker und ein erstes Element einer Kopplungsgruppe umfasst, ein Analyten-Analogon, wobei das Analyten-Analogon ein zweites Element der Kopplungsgruppe umfasst, und ein Bindematerial, das zu einer Bindung an einen Teil des Analyten fähig ist. Es wird eine Konkurrenz zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem Analyten-Analogon um das Bindematerial zugelassen. Außerdem wird eine Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Element der Kopplungsgruppe zugelassen. Die mindestens eine Testmischung wird durch eine Membran geleitet. Das Vorhandensein oder die Menge des Markers auf der Membran wird unter Verwendung einer Nachweisbaugruppe nachgewiesen und mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Testprobe korreliert.
  • Der universelle Biosensor gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt ein einfaches, schnelles und zuverlässiges Biosensorsystem bereit, das generische Bestandteile verwendet, die mit einem beliebigen Zielanalyten kompatibel sind. Die markerbeladene/n Partikel und Membran des erfindungsgemäßen Biosensors können schnell mit spezifischen Bindematerialien modifiziert werden. Somit kann der erfindungsgemäße Biosensor innerhalb kurzer Zeit auf einen gewünschten Zielanalyten zugeschnitten werden. Somit macht der erfindungsgemäße universelle Biosensor den Kauf von einzelnen Biosensoren oder Biosensorsätzen für jeden nachzuweisenden oder zu quantifizierenden Analyten überflüssig. Vielmehr kann ein einziger Biosensor oder Biosensorsatz gekauft werden und der Biosensor durch den Benutzer auf jeden gewünschten Analyten zugeschnitten werden. Der Satz kann einen universellen Markerkomplex oder mehrere universelle Markerkomplexe und/oder universelle Membranen einschließen und bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Außerdem kann in einem Satz mit dem anmeldungsgemäßen Biosensor eine Bibliothek von auf geeignete Weise modifizierten analytenspezifischen Bindematerialien bereitgestellt werden, so dass der universelle Biosensor schnell für einen spezifischen Analyten modifiziert werden kann.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A und 1B zeigen einen universellen Markerkomplex und eine universelle Membran gemäß der vorliegenden Erfindung. 1A ist eine schematische Darstellung eines universellen Markerkomplexes, an dessen Oberfläche ein Element einer Kopplungsgruppe gebunden ist. Ein Bindematerial für den Analyten, das so modifiziert wird, dass es das andere Element der Kopplungsgruppe einschließt, konjugiert mit der Oberfläche des Markerkomplexes, um den universellen Marker analytenspezifisch zu machen. 1B ist eine schematische Darstellung einer universellen Membran, an deren Oberfläche ein Element einer Kopplungsgruppe gebunden ist. Ein Bindematerial für den Analyten, das so modifiziert wird, dass es das andere Element der Kopplungsgruppe einschließt, konjugiert mit der Oberfläche der Membran, um die universelle Membran analytenspezifisch zu machen.
  • Die 2A und 2B zeigen einen Vergleich zwischen einem spezifischen Nukleinsäure-Biosensor nach dem Stand der Technik (2A) und einem erfindungsgemäßen universellen Nukleinsäure-Biosensor (2B). Der universelle Biosensor schließt einen universellen Markerkomplex ein, in Bezug auf den ein Element einer ersten Nukleinsäure-Kopplungsgruppe immobilisiert ist. Eine Reportersonde mit einem zweiten Element der ersten Nukleinsäure-Kopplungsgruppe bindet sich über die Kopplungsgruppe an den Markerkomplex. Das Ziel bindet sich dann an die Reportersonde und an eine zielspezifische Auffangsonde auf einer zielspezifischen Membran.
  • 3 ist eine graphische Darstellung, die die Optimierung der Länge einer generischen Oligonukleotid-Kopplungsgruppe zeigt. Generische Oligonukleotide (17 bis 30 Nukleotide lang) wurden auf einer Liposomenoberfläche immobilisiert. Escherichia-coli-spezifische Reportersonden wurden mit der komplementären Sequenz an ihrem 5'-Ende modifiziert, um eine Bindung an die generischen Oligonukleotide herzustellen. Modifizierte Liposomen und modifizierte E.-coli-spezifische Reportersonden wurden mit der Zielsequenz zehn Minuten lang bei 41°C inkubiert und anschließend in dem Biosensorassay verwendet.
  • 4 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse hinsichtlich des Verhältnisses der Signalstärke zu variierenden Konzentrationen einer E.-coli-Zielsequenz unter Verwendung von universellen Liposomen, die ein generisches Oligonukleotid tragen, das mit einer modifizierten E.-coli-spezifischen Reportersonde hybridisiert ist.
  • 5 zeigt die Ergebnisse hinsichtlich des Verhältnisses der Signalstärke zu variierenden Konzentrationen einer Cryptosporidium-parvum-Zielsequenz unter Verwendung von universellen Liposomen, die ein generisches Oligonukleotid tragen, das mit einer modifizierten C.-parvum-spezifischen Reportersonde hybridisiert ist.
  • 6 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von Assays, die Liposomen verwendeten, die 0,1, 0,2, 0,4 und 0,6 mol-% generische Oligonukleotid-Tags enthielten. Jeder Messpunkt stellt einen Durchschnitt von fünf identischen Proben dar. Bei jeder Probe wurden 500 fmol Zielsequenz verwendet.
  • 7 ist eine graphische Darstellung der Wirkung der Streptavidinmenge auf einer Polyethersulfon-Membran auf die Signalstärke. Es wurden Streptavidinmengen von 10, 15, 20, 25 und 30 pmol untersucht, wobei 500 finol Zielsequenz verwendet wurden.
  • 8 ist eine graphische Darstellung der Wirkung der Antifluoreszein-Antikörper-Konzentration, immobilisiert auf Polyethersulfon-Membranen. Die Probe enthielt 5 pmol fluoreszeinierte Auffangsonde, 2 μL mit Streptavidin markierte Liposomen, 2 pmol biotinylierte Reportersonden und 2 pmol Zielsequenz.
  • 9 ist eine graphische Darstellung der Optimierung der Reportersonden-Konzentration für den E.-coli-Nachweis unter Verwendung von Polyethersulfon- Membranen, die immobilisierten Antikörper einschließen, und Liposomen, die mit Streptavidin markiert sind.
  • 10 ist eine graphische Darstellung der Bestimmung der Nachweisgrenze und des Dynamikbereiches eines erfindungsgemäßen universellen Biosensors (unter Verwendung von Streptavidin, immobilisiert auf Membranen, und Liposomen, markiert mit einer generischen Oligonukleotidsonde) für den Nachweis von E. coli (synthetische Zielsequenz clpB).
  • 11 ist eine graphische Darstellung der Bestimmung der Nachweisgrenze und des Dynamikbereiches eines erfindungsgemäßen universellen Biosensors (unter Verwendung von Streptavidin, immobilisiert auf Membranen, und Liposomen, markiert mit einer generischen Oligonukleotidsonde) für den Nachweis von B. anthracis (synthetische Zielsequenz atxA).
  • 12 ist eine graphische Darstellung der Bestimmung der Nachweisgrenze und des Dynamikbereiches eines erfindungsgemäßen universellen Biosensors (unter Verwendung von Streptavidin, immobilisiert auf Membranen, und Liposomen, markiert mit einer generischen Oligonukleotidsonde) für den Nachweis von C. parvum (synthetische Zielsequenz hsp70).
  • 13 ist eine graphische Darstellung der Bestimmung der optimalen Formamidkonzentration in dem Mastermix für den erfindungsgemäßen universellen Biosensor (unter Verwendung von Antifluoreszein-Antikörper, immobilisiert auf Membranen, und Liposomen, markiert mit Streptavidin) für den Nachweis von E. coli (synthetische Zielsequenz clpB).
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet das erfindungsgemäße Verfahren einen ersten Markerkomplex, in Bezug auf den ein erstes Element einer ersten Kopplungsgruppe immobilisiert ist. Ein erstes Bindematerial für einen spezifischen Analyten von Interesse wird dann mit dem Markerkomplex konjugiert, um ein erstes Markerkomplex-Konjugat zu bilden. Das erste Bindematerial wird so modifiziert, dass es ein zweites Element der ersten Kopplungsgruppe einschließt. Somit wird das erste Bindematerial für einen spezifischen Analyten schnell und einfach über die erste Kopplungsgruppe mit dem universellen Markerkomplex konjugiert. Das Verfahren kann auch eine Membran verwenden, in Bezug auf die ein erstes Element einer zweiten Kopplungsgruppe immobilisiert ist. Ein zweites Bindematerial für einen spezifischen Analyten von Interesse wird mit einem Teil der Membran konjugiert. Das zweite Bindematerial wird so modifiziert, dass es ein zweites Element der zweiten Kopplungsgruppe einschließt. Somit wird das zweite Bindematerial für den spezifischen Analyten schnell und einfach über die zweite Kopplungsgruppe mit der universellen Membran konjugiert. Die beiden Bindematerialien binden sich an unterschiedliche Teile des Analyten. Sowohl das erste Markerkomplex-Konjugat als auch das immobilisierte Bindematerial werden im Überschuss verwendet. Somit geht der Markerkomplex in dem Maße, wie der Analyt in der Testprobe vorhanden ist, über den Analyten eine Bindung mit der Membran ein. Somit beruht das Verfahren einer ersten Ausführungsform der Erfindung auf dem „Sandwich", das durch das erste Bindematerial (mit dem Markerkomplex konjugiert), den Analyten und das zweite Bindematerial (auf der Membran immobilisiert) gebildet wird. Als Alternative dazu kann der universelle Markerkomplex mit einer analytenspezifischen Membran (bereitgestellt als spezifisch für einen einzigen Analyten vor der Bestimmung eines Analyten von Interesse) verwendet werden oder kann die universelle Membran mit analytenspezifischen Markern (bereitgestellt als spezifisch für einen einzigen Analyten vor der Bestimmung eines Analyten von Interesse) verwendet werden.
  • In einer zweiten Ausführungsform verwendet das erfindungsgemäße Verfahren einen ersten Markerkomplex, in Bezug auf den ein erstes Element einer ersten Kopplungsgruppe immobilisiert ist. Ein erstes Bindematerial für einen spezifischen Analyten von Interesse wird dann mit dem ersten Markerkomplex konjugiert, um ein erstes Markerkomplex-Konjugat zu bilden. Das erste Bindematerial wird so modifiziert, dass es ein zweites Element der ersten Kopplungsgruppe einschließt. Somit wird das erste Bindematerial für einen spezifischen Analyten schnell und einfach über die erste Kopplungsgruppe mit dem ersten universellen Markerkomplex konjugiert. Dieses erfindungsgemäße Verfahren verwendet auch einen zweiten Markerkomplex, in Bezug auf den ein erstes Element einer zweiten Kopplungsgruppe immobilisiert ist. Ein zweites Bindematerial für den spezifischen Analyten von Interesse wird dann mit dem zweiten Markerkomplex konjugiert, um ein zweites Markerkomplex-Konjugat zu bilden. Das zweite Bindematerial wird so modifiziert, dass es ein zweites Element der zweiten Kopplungsgruppe einschließt. Somit wird das zweite Bindematerial für den spezifischen Analyten schnell und einfach über die zweite Kopplungsgruppe mit dem zweiten universellen Markerkomplex konjugiert. Die beiden Bindematerialien binden sich an un terschiedliche Teile des Analyten. Beide Markerkonjugate werden im Überschuss verwendet. Somit gehen der erste und der zweite Markerkomplex in dem Maße, wie der Analyt in der Testprobe vorhanden ist, über das erste und das zweite Bindematerial und den Analyten eine Bindung miteinander ein. Somit beruht das Verfahren einer zweiten Ausführungsform der Erfindung auf dem „Sandwich", das durch das erste Bindematerial (auf dem ersten Markerkomplex immobilisiert), das zweite Bindematerial (auf dem zweiten Markerkomplex immobilisiert) und den Analyten gebildet wird. Dieses „Sandwich" bildet Aggregate von mehreren Markerkomplexen, die unter Verwendung einer Filtermembran aus der Lösung herausgefiltert werden können.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet das erfindungsgemäße Verfahren einen ersten Markerkomplex, in Bezug auf den ein erstes Element einer ersten Kopplungsgruppe immobilisiert ist. Ein Analyten-Analogon wird dann mit dem Markerkomplex konjugiert, um ein erstes Markerkomplex-Konjugat zu bilden. Das Analyten-Analogon wird so modifiziert, dass es ein zweites Element der ersten Kopplungsgruppe einschließt. Somit wird das Analyten-Analogon für einen spezifischen Analyten schnell und einfach über die erste Kopplungsgruppe mit dem universellen Markerkomplex konjugiert. Bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren werden der erste Markerkomplex und das Analyten-Analogon mit einem analytenspezifischen ersten Bindematerial und dem Analyten gemischt (entweder in einer Lösung oder auf einer Membran), so dass das Analyten-Analogon mit dem ersten Markerkomplex konjugiert wird und der Analyt und das Analyten-Analogon um eine Bindung an das erste Bindematerial konkurrieren. Das Verfahren kann auch eine Membran verwenden, in Bezug auf die ein Rezeptor für den ersten Markerkomplex immobilisiert ist. Sowohl das erste Markerkomplex-Konjugat als auch der immobilisierte Rezeptor werden im Überschuss verwendet.
  • Die Erfindung schließt sowohl direkte als auch indirekte Nachweis-/Messverfahren ein. Bei Ersteren wird das Vorhandensein oder die Menge des in einem Immobilisierungs- oder „Auffang"-Abschnitt der Testeinrichtung gebundenen Markers nachgewiesen. In dieser Ausführungsform ist die Menge des in dem Auffangabschnitt gebundenen Markers direkt proportional zu der Menge des Analyten in der Testprobe. Die Ausführungsform des indirekten Nachweises schließt den Nachweis oder das Messen des über den Auffangabschnitt hinaus migrierenden Markers ein, der indirekt proportional zu der Menge des Analyten in der Testprobe ist.
  • Unter „Analyt" wird die zu messende oder nachzuweisende Verbindung oder Zusammensetzung verstanden. Er besitzt die Fähigkeit, sich an das erste und das zweite Bindematerial zu binden. Geeignete Analyten schließen Antigene (zum Beispiel Protein-Antigene), Haptene, Zellen, und Zielnukleinsäuremoleküle ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Ein bevorzugter Analyt ist ein Zielnukleinsäuremolekül. Ein bevorzugterer Analyt ist ein Zielnukleinsäuremolekül, das in einem Organismus vorkommt, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Bakterien, Pilzen, Viren, Einzellern, Parasiten, Tieren (zum Beispiel Menschen) und Pflanzen besteht. Geeignete Organismen schließen Cryptosporidium parvum, Escherichia coli, Bacillus anthracis, das Dengue-Virus und das Menschliche Immunschwäche-Virus (HIV-1) ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
  • In einer Ausführungsform schließen die erfindungsgemäße/n Testeinrichtung und die Testverfahren das Immobilisieren eines analytenspezifischen zweiten Bindematerials auf der Membran ein. Das zweite Bindematerial besitzt die Fähigkeit, sich an einen Teil des Analyten zu binden, wenn die Testmischung durch Kapillarwirkung durch die Membran fließt oder durch die Membran hindurchgeht.
  • Unter „Bindematerial" wird ein Biorezeptormolekül, zum Beispiel ein Immunglobulin oder ein Derivat oder Fragment davon, verstanden, das einen Bereich auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum aufweist, der sich spezifisch an einen bestimmten räumlichen und polaren Aufbau eines anderen Moleküls (in diesem Fall der Analyt) bindet und dadurch als komplementär zu diesem Aufbau bestimmt ist. Geeignete Bindematerialien schließen Antikörper, Antigene, Nukleinsäuremoleküle, Aptamere, Zellrezeptoren, Biotin, Streptavidin und andere geeignete Liganden ein. Wenn der Analyt ein Zielnukleinsäuremolekül ist, kann das erste Bindematerial ein Nukleinsäuremolekül (zum Beispiel eine Reportersonde, die ausgewählt wird, um mit einem Teil des Zielnukleinsäuremoleküls zu hybridisieren) sein und kann das zweite Bindematerial ein Nukleinsäuremolekül (zum Beispiel eine Auffangsonde, die ausgewählt wird, um mit einem separaten Teil des Zielnukleinsäuremoleküls zu hybridisieren) oder ein anderer Anteil, zum Beispiel ein Antikörper oder ein anderes Mittel, der bzw. das zu einer Bindung an und einer Wechselwirkung mit dem Analyten fähig ist, sein.
  • Antikörper-Bindematerialien können monoklonal, polyklonal oder genetisch manipuliert (zum Beispiel einkettige Antikörper, katalytische Antikörper) sein und können mittels Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, zum Beispiel mittels Immunisierung eines Wirtes und Sammlung von Seren, Hybridzelllinien-Technologie oder Gentechnik. Das Bindematerial kann auch eine beliebige natürlich vorkommende oder synthetische Verbindung sein, die spezifisch den Analyten von Interesse bindet.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Analyten-Analogon verwendet. Diese Ausführungsform eignet sich besonders für einen Bindungskonkurrenz-Assay. Somit wird unter „Analyten-Analogon" ein Analogon verstanden, das das zweite Element einer Kopplungsgruppe einschließt, das mit dem Markerkomplex reagiert oder sich an diesen bindet. Wenn ein Analogon verwendet wird, ist es jedoch notwendig, dass die besonderen Merkmale des Analyten, die für die Erkennung durch das Bindematerial in der Konkurrenzreaktion notwendig sind, in dem mit dem Markerkomplex konjugierten Analyten-Analogon vorhanden sind.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet Markerkomplexe, die ein Partikel, einen Marker und ein Element einer Kopplungsgruppe einschließen. Geeignete Partikel schließen ein: Liposomen (der Marker kann in dem Liposom, in der Doppelschicht, eingekapselt oder auf der Liposomenmembran-Oberfläche befestigt sein), Latexkügelchen, Goldpartikel, Siliziumdioxidpartikel, Dendrimere, Quantenpunkte, magnetische Kügelchen (zum Beispiel antikörpermarkierte magnetische Kügelchen und mit Nukleinsäuresesonde markierte magnetische Kügelchen) oder ein beliebiges anderes Partikel, das für die Derivatisierung geeignet ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Partikel ein Liposom, das einen Marker einkapselt. Das erste Bindematerial und, falls gewünscht, das zweite Bindematerial können über eine erste bzw. eine zweite Kopplungsgruppe mit einer Liposomenoberfläche konjugiert werden. Das erste Bindematerial und, falls gewünscht, das zweite Bindematerial müssen an das Liposom oder ein anderes Partikel gebunden werden, um einen Teil des ersten Bindematerials (und des zweiten Bindematerials) darzubieten, der durch den Analyten erkannt werden kann.
  • Erfindungsgemäß können der erste und, falls gewünscht, der zweite Markerkomplex als universelle Markerkomplexe bereitgestellt werden (siehe 1A). Insbesondere schließen sie jeweils ein Element einer Kopplungsgruppe ein. Wie 1A zeigt, schließt ein Markerkomplex 10 ein Partikel 12 ein, das auf seiner Oberfläche ein Element 14 einer Kopplungsgruppe einschließt. Das Partikel 12 schließt einen Marker (nicht gezeigt) ein. Sobald ein gewünschter Analyt bestimmt worden ist, werden die universellen Markerkomplexe mit einem für den gewünschten Analyten spezifischen Bindematerial konjugiert, wodurch die Markerkomplexe für den konkreten Analyten spezifisch gemacht werden. Insbesondere wird, wie 1A zeigt, ein für den Analyten spezifisches Bindematerial 16 so modifiziert, dass es ein zweites Element 18 der Kopplungsgruppe einschließt. Das erste und das zweite Element 14, 18 der Kopplungsgruppe wirken aufeinander ein, um das Bindematerial 16 in Bezug auf den Markerkomplex 10 zu immobilisieren. Die analytenspezifischen Bindematerialien können gebildet werden, indem das Bindematerial erlangt oder erzeugt und das Bindematerial mit einem Element einer Kopplungsgruppe modifiziert wird. Als Alternative dazu können Bindematerialien, die ein Element einer Kopplungsgruppe einschließen, aus einer vorher hergestellten Bibliothek ausgewählt werden. Somit kann das erste Bindematerial über eine erste Kopplungsgruppe an den ersten Markerkomplex gebunden werden. Falls gewünscht, kann das zweite Bindematerial über eine zweite Kopplungsgruppe an den zweiten Markerkomplex gebunden werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäße Einrichtung können auch eine universelle Membran einschließen (siehe 1B). Insbesondere kann die universelle Membran mit einem in Bezug auf sie immobilisierten Element einer Kopplungsgruppe bereitgestellt werden. Wie 1B zeigt, schließt die universelle Membran 20 auf ihrer Oberfläche 24 ein Element 22 einer Kopplungsgruppe ein. Sobald ein gewünschter Analyt bestimmt worden ist, wird die universelle Membran mit einem für den gewünschten Analyten spezifischen Bindematerial konjugiert, wodurch die Membran für einen konkreten Analyten spezifisch gemacht wird. Insbesondere wird, wie 1B zeigt, ein für den Analyten spezifisches Bindematerial 26 so modifiziert, dass es ein zweites Element 28 der Kopplungsgruppe einschließt. Das erste und das zweite Element 22, 28 der Kopplungsgruppe wirken aufeinander ein, um das Bindematerial 26 in Bezug auf die Membran 20 zu immobilisieren. Wie oben beschrieben, kann das analytenspezifische Bindematerial gebildet werden, indem das Bindematerial erlangt oder erzeugt und das Bindematerial mit einem Element einer Kopplungs guppe modifiziert wird. Als Alternative dazu kann ein Bindematerial, das ein Element einer Kopplungsgruppe einschließt, aus einer vorher hergestellten Bibliothek ausgewählt werden. Das Bindematerial kann über eine zweite Kopplungsgruppe an die Membran gebunden werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Einrichtung schließen einen oder beide universelle/n Markerkomplex/e und die universelle Membran ein. Geeignete analytenspezifische Markerkonjugate und Membranen zur Verwendung mit entweder den universellen Membranen oder den universellen Markerkomplexen der vorliegenden Erfindung sowie Verfahren zu deren Herstellung werden zum Beispiel beschrieben in dem US-Patent Nr. 5.789.154 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.756.362 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.753.519 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.958.791 an Roberts et al., dem US-Patent Nr. 6.086.748 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 6.248.956 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 6.159.745 an Roberts et al., dem US-Patent Nr. 6.358.752 an Roberts et al., der gleichzeitig schwebenden US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 09/698.564, eingereicht am 27. Oktober 2000, und der gleichzeitig schwebenden US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 10/264.159, eingereicht am 2. Oktober 2002, die hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen sind.
  • Unter „Kopplungsgruppe" wird jede Gruppe von zwei oder mehr Elementen verstanden, von denen jedes zur Erkennung eines besonderen räumlichen und polaren Aufbaus eines Moleküls, zum Beispiel eine Epitopen- oder Determinantenstelle, fähig ist. Geeignete Kopplungsgruppen gemäß der Erfindung schließen Antikörper-Antigen, Rezeptor-Ligand, Biotin-Streptavidin, Zucker-Lectine und komplementäre Oligonukleotide, zum Beispiel komplementäre Oligonukleotide aus RNA, DNA oder PNA (Peptid-Nukleinsäure) ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Es kann zum Beispiel ein Antikörper, der sich in seiner Struktur in ausreichendem Maße von dem Analyten von Interesse unterscheidet, als ein Element einer Kopplungsgruppe für auf geeignete Weise derivatisiertes Bindematerial (d. h., derivatisiert mit dem spezifischen Antigen des Antikörpers) verwendet werden. Beispielhafte Elemente der Kopplungsgruppen schließen Avidin, Streptavidin, Biotin, Antibiotin, Antifluoreszein, Fluoreszein, Antidigoxin, Digoxin, Anti-Dinitrophenyl (DNP), DNP, generische Oligonukleotide (zum Beispiel im Wesentlichen dC- und dG-Oligonukleotide) und dergleichen ein. So fungiert zum Beispiel in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Biotin als ein Element einer Kopplungsgruppe für Liposomen oder eine Membran, derivatisiert mit Streptavidin oder Antibiotin-Antikörper.
  • Da die Bestandteile des universellen Biosensors (Markerkomplexe und/oder Membran) so bereitgestellt werden, dass ein Element einer Kopplungsgruppe bereits befestigt ist, werden sie schnell und einfach für einen konkreten Analyten modifiziert. Insbesondere kann das für den Analyten von Interesse spezifische Bindematerial, modifiziert mit dem anderen Element der Kopplungsgruppe, durch einfaches Mischen und Inkubieren in Bezug auf die Bestandteile des universellen Biosensors immobilisiert werden. Wenn die Kopplungsgruppe zum Beispiel Biotin-Streptavidin ist, führt das Mischen und Inkubieren von Bindematerial oder Bindematerialien mit dem/den Markerkomplex/en und/oder der Membran zu einer Konjugation durch spezifische Bindung. Als Alternative dazu führt, wenn die Kopplungsgruppe komplementäre Oligonukleotide (zum Beispiel ein Oligo-dC-generisches Oligonukleotid – Oligo-dG-generisches Oligonuldeotid) umfasst, das Mischen des Bindematerials oder der Bindematerialien mit dem/den Markerkomplex/en und/oder der Membran zu einer direkten Kopplung über DNA-Hybridisierung. Geeignete Bedingungen für das Konjugieren der Bestandteile des universellen Biosensors mit Bindematerialien für einen spezifischen Analyten werden durch die verwendete Kopplungsgruppe bestimmt und weiter unten beschrieben. Die Anwendung von Elementen von Kopplungsgruppen auf den/die Markerkomplex/e und/oder die Membran der vorliegenden Erfindung kann mittels wohl bekannter Techniken erfolgen, zum Beispiel mittels derjenigen, die in den Beispielen beschrieben werden (siehe unten).
  • Das erste und das zweite Bindematerial werden ausgewählt, um sich spezifisch an separate Teile des Analyten zu binden. Wenn der Analyt zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz ist, ist es notwendig, Sonden für separate Teile der Zielnukleinsäuresequenz auswählen. Techniken zum Gestalten solcher Sonden sind wohl bekannt. Sonden, die für das Praktizieren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, müssen zu der Zielanalytensequenz komplementär sein, d. h., zum Hybridisieren mit dem Ziel fähig sein, und sollten hochspezifisch für den Zielanalyten sein. Die Sonden sind vorzugsweise zwischen 17 und 25 Nukleotiden lang, um die erforderliche Spezifität bereitzustellen und gleichzeitig übermäßig lange Hybridisierungszeiten zu vermeiden und das Potenzial zur Ausbildung von Sekundärstrukturen unter den Assaybedingungen zu minimieren. Somit ist in dieser Ausführungsform das erste Bindematerial eine Reportersonde, die ausgewählt wird, um mit einem Teil der Zielnukleinsäuresequenz zu hybridisieren, und dies auch tut. Das zweite Bindematerial, das hierin als Auffangsonde für die Nukleinsäure-Nachweis-/Messausführungsform bezeichnet wird, wird ausgewählt, um mit einem Teil der Zielnukleinsäuresequenz zu hybridisieren, der ein anderer Teil als der Teil des Zieles ist, mit dem die Reportersonde hybridisiert, und tut dies auch. Die Auffangsonde kann in einem Auffangabschnitt der Membran immobilisiert werden. Außerdem sollten das erste und das zweite Bindematerial (Reportersonde und Auffangsonde) dazu fähig sein, gar nicht oder nur in beschränktem Maße aufeinander einzuwirken. Techniken zum Kennzeichnen von Sonden und Reaktionsbedingungen, die für das Praktizieren der Erfindung geeignet sind, werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen ist. Ein Anwendungsprogramm mit der Bezeichnung „Lasergene", erhältlich von DNASTAR, kann optional verwendet werden.
  • 2 ist eine schematische Darstellung eines Biosensors gemäß der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Nachweis-/Messausführungsform im Vergleich zum Stand der Technik. Insbesondere zeigt 2A einen zielnukleinsäure-spezifischen Biosensor nach dem Stand der Technik 100. Der Biosensor 100 schließt einen zielspezifischen Marker 102 ein, der sich an einen Teil einer Zielsequenz 104 bindet. Der zielspezifische Marker 102 schließt eine Reportersonde 106 ein, die sich an die Zielsequenz 104 bindet. Der Biosensor 100 schließt auch eine zielspezifische Auffangmembran 108 ein, die sich an einen separaten Teil der Zielsequenz 104 bindet. Die Auffangmembran 108 schließt eine Auffangsonde 110 ein, die sich an die Zielsequenz 104 bindet. Im Gegensatz dazu ist 2B eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen universellen Nukleinsäure-Biosensors. In 2B tragen die Elemente, die auch in 2A vorkommen, die Bezugszeichen von 2A, zu denen jeweils 100 addiert wurde und die also mit 2 beginnen. Somit schließt der erfindungsgemäße Biosensor 200 einen universellen Markerkomplex 202 ein. Der universelle Markerkomplex 202 schließt ein erstes Element 203a einer Kopplungsgruppe 203 ein, das sich an ein zweites Element 203b der Kopplungsgruppe 203 bindet, das an die Reportersonde 206 gebunden ist. Die Reportersonde 206 bindet sich an die Zielsequenz 204. Der Biosensor 200 schließt auch eine zielspezifische Auffangmembran 208 ein, die sich an einen separaten Teil der Zielsequenz 204 bindet. Die Auffangmembran 208 schließt eine Auffangsonde 210 ein, die sich an die Zielsequenz 204 bindet. Zwar ist in 2B die Membran 208 eine zielspezifische Membran, doch könnte auch eine erfindungsgemäße universelle Membran verwendet werden.
  • Im Allgemeinen wird zur Gestaltung eines Assays die Zielnukleinsäure aus einer Probe extrahiert und dann mittels einer von mehreren bekannten Verstärkungstechniken verstärkt. Solche Verstärkungstechniken schließen die Polymerase-Kettenreaktion, die Ligase-Kettenreaktion und die Verstärkung auf Nukleinsäuresequenz-Basis (Nucleic Acid Sequence Based Amplification – NASBA) ein, siehe Kievits et al., "NASBA Isothermal Enzymatic in vitro Nucleic Acid Amplification Optimized for the Diagnosis of HIV-1 Infection" J. of Virological Methods 35: 273–286 (1991), das hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen ist. NASBA, vermarktet durch Organon-Teknika, ist eine bevorzugte Verstärkungstechnik bei der Bestimmung von Informationen hinsichtlich des Vorhandenseins oder der Konzentration lebensfähiger Organismen in einer Probe. Jedoch muss die Zielnukleinsäure nicht erfindungsgemäß verstärkt werden.
  • Wie weiter unten noch erörtert werden wird, kann die Testprobe, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie den Analyten enthält, mit dem ersten Markerkomplex (und, falls gewünscht, mit dem zweiten Markerkomplex) und einem ersten und einem zweiten Bindematerial verbunden werden, um eine Mischung zu bilden, die eine Lösung, eine Suspension, eine Dispersion oder eine andere Mischung sein kann. Dann wird die Membran der Mischung ausgesetzt. Als Alternative dazu kann, wenn das zweite Bindematerial auf der Membran immobilisiert werden soll, die Membran – unabhängig von der Bildung der Mischung aus der Testprobe, dem/den universellen Markerkomplex/en und dem ersten Bindematerial – mit dem zweiten Bindematerial in Kontakt gebracht werden. In noch einer anderen Ausführungsform können die Testprobe, der/die universelle/n Markerkomplex/e und das/die Bindematerial/ien getrennt auf die Membran aufgebracht werden, indem sie beispielsweise jeweils an denselben oder an separaten Stellen auf das absorbierende Material aufgespritzt werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Membran ein „absorbierendes Material" sein. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eignet sich besonders für einen „Lateralfluss"-Assay. Unter „absorbierendem Material" wird ein poröses Material mit einer Porengröße von 0,05 μm bis 50 μm, vorzugsweise von 0,45 μm bis 5 μm, verstanden, das zulässt, dass es von einem wässerigen Medium als Reaktion auf eine Kapillarkraft durchquert wird. Solche Materialien können sein: natürliche polymere Materialien, insbesondere Zellulosematerialien, zum Beispiel Fasern enthaltende Papierarten, zum Beispiel Filterpapier, chromatographisches Papier, usw.; synthetische oder modifizierte, natürlich vorkommende Polymere, zum Beispiel Nitrozellulose, Zelluloseazetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Nylon, aktiviertes Nylon, Polysulfonbasis modifiziert, usw.; entweder allein verwendet oder zusammen mit einem Träger, wie weiter unten beschrieben. Polysulfone und Nitrozellulose sind bevorzugte absorbierende Materialien für das bzw. die absorbierende/n Pad/s, das bzw. die Kontakt- und Auffangabschnitte der Testeinrichtung umfasst bzw. umfassen (siehe Beschreibung weiter unten).
  • Die absorbierenden Materialien können Mehrzweckmaterialien sein oder die Fähigkeit besitzen, zu Mehrzweckmaterialien gemacht zu werden, um die Immobilisierung des zweiten Bindematerials durch die zweite Kopplungsgruppe sowie das Binden anderer Verbindungen, die einen Teil des Signalerzeugungssystems bilden, zu gestatten.
  • Die in der Testeinrichtung und dem Verfahren dieser Ausführungsform der Erfindung verwendeten absorbierenden Materialien können ein Zelluloseester mit Nitrozellulose sein, das zu außergewöhnlich guten Ergebnissen führt. Es versteht sich, dass sich der Begriff „Nitrozellulose" auf Salpetersäureester der Zellulose bezieht. Das kann Nitrozellulose allein sein oder ein Mischester der Salpetersäure und von anderen Säuren, insbesondere von aliphatischen Karbonsäuren, die ein bis sieben Kohlenstoffatome haben, wobei Essigsäure bevorzugt wird. Solche Materialien, die aus Zellulose, verestert mit Salpetersäure allein oder einer Mischung aus Salpetersäure und einer anderen Säure, zum Beispiel Essigsäure, gebildet werden, werden oft als Nitrozellulosepapier bezeichnet.
  • Zwar ist bei diesem/dieser erfindungsgemäßen Verfahren bzw. Testeinrichtung Nitrozellulose ein bevorzugtes Material, doch versteht es sich, dass auch andere Materialien mit einer Oberfläche, die dazu ausreicht, die auf ihr zu immobilisierenden Agenzien in einer weiter unten beschriebenen Konzentration zu tragen, und, falls gewünscht, mit einer Porengröße, die sich für das Ansammeln von Aggregaten, die aus dem Markerkomplex, einem analytenspezifischen Bindematerial und einem Analyten-Analogon gebildet werden, eignet, für die Herstellung solcher Testeinrichtungen verwendet werden können.
  • Außerdem schließt in der erfindungsgemäßen Lateralfluss-Ausführungsform das absorbierende Material vorzugsweise einen Kontaktabschnitt und einen Auffangabschnitt ein. Geeignete Membranen/Testeinrichtungen werden zum Beispiel beschrieben in dem US-Patent Nr. 5.789.154 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.756.362 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.753.519 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.958.791 an Roberts et al., dem US-Patent Nr. 6.086.748 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 6.248.956 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 6.159.745 an Roberts et al., dem US-Patent Nr. 6.358.752 an Roberts et al. und der gleichzeitig schwebenden US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 10/264.159, eingereicht am 2. Oktober 2002, die hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen sind. Insbesondere ist die Membran ein absorbierendes Material, das einen Kontaktabschnitt einschließt, wo die Testprobe, universelle Markerkomplexe und ein erstes (und ein zweites) Bindematerial, enthaltend eine oder mehrere Lösung/en oder eine oder mehrere Mischung/en, aufgebracht werden. Das absorbierende Material schließt ferner einen Auffangabschnitt ein, an den das zweite Bindematerial über die zweite Kopplungsgruppe ohne Diffusion gebunden wird.
  • In einer ersten Ausführungsform, wenn die Testprobenmischung von dem Kontaktabschnitt in den Auffangabschnitt migriert oder in einer Lösung vor dem Aufbringen auf die Membran, geht der erste Markerkomplex, an den ein erstes Element einer ersten Kopplungsgruppe gebunden ist, mit dem ersten Bindematerial, an das ein zweites Element der ersten Kopplungsgruppe gebunden ist, über die Kopplungsgruppe eine Bindung ein, und jeder in der Testprobe vorhandene Analyt geht eine Bindung mit dem ersten Bindematerial ein. Diese Durchquerung der Membran kann nach oben, nach unten, in horizontaler Richtung oder in Kombinationen dieser Richtungen erfolgen. Da das erste Bindematerial ausgewählt wird, um sich nur an einen Teil des Analyten zu binden, bleibt der Analyt auch für eine Bindung an das zweite Bindematerial verfügbar, wenn die Testbestandteile in den Auffangabschnitt migrieren. Das zweite Bindematerial kann in der Testprobenmischung vorhanden sein, so dass es mit jedem in der Testprobe vorhandenen Analyten eine Bindung eingeht und dann über die zweite Kopplungsgruppe eine Bindung mit der Membran in dem Auffangabschnitt eingeht. Als Alternative dazu kann die Membran getrennt mit dem zweiten Bindematerial in Kontakt gebracht werden, so dass das zweite Bindematerial über die zweite Kopplungsgruppe an die Membran gebunden wird und dann der Markerkomplex und das erste Bindematerial in den Auffangabschnitt migrieren und über jeden in der Testprobe vorhandenen Analyten eine Bindung mit dem zweiten Bindematerial eingehen.
  • Gemäß den oben beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine bestimmte Menge von markerbeladenen Partikeln, die zu der Konzentration des Analyten in der Testprobe proportional ist, in dem Auffangabschnitt der Testeinrichtung gebunden. Somit stellt das Signalerzeugungssystem ein nachweisbares Signal an dem Auffangabschnitt nur dann bereit, wenn der Zielanalyt an das zweite Bindematerial in dem Auffangabschnitt gebunden ist, so dass das Vorhandensein des Zielanalyten bestimmt werden kann, indem das Signal an dem Auffangabschnitt nachgewiesen wird.
  • Beim Konstruieren der Testeinrichtungen gemäß der Lateralfluss-Ausführungsform der Erfindung sollte die Position des Kontaktabschnittes und des Auffangabschnittes (oder von Abschnitten, wo die Bestimmung einer Mehrzahl von Analyten erfolgt) durch das in diesen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingeschlossene Grundprinzip bestimmt sein. So möchte man zum Beispiel, ob nun die Testprobe, der universelle Markerkomplex und das erste Bindematerial an denselben oder an separaten Stellen in dem Kontaktabschnitt der Testeinrichtung aufgebracht werden, ausreichend Gelegenheit dazu bieten, dass Bindungen zwischen dem ersten Bindematerial, dem Markerkomplex und jedem in der Testprobe vorhandenen Analyten zustande kommen, so dass die Konzentration des in dem Auffangabschnitt gebundenen Konjugates die Konzentration des Analyten in der Testprobe genau widerspiegelt. Im Allgemeinen sollte, wenn Nitrozellulose mit einer Porengröße von 8 μm für die erste oder die erste und die zweite Membran verwendet wird, der Abstand zwischen dem Kontaktabschnitt und dem Auffangabschnitt im Bereich von ca. 5 mm bis ca. 20 mm liegen. Wenn mehrere Auffangabschnitte für die Bestimmung von mehreren Analyten verwendet werden, können die Auffangabschnitte nahe beieinander oder in geringen Abständen zueinander angeordnet werden, doch dürfen sie nicht so nahe beieinander liegen, dass sie die Auflösung der Signale beeinträchtigen. Folglich sollte der Abstand zwischen solchen Auffangabschnitten für gewöhnlich nicht weniger als 0,5 mm, vorzugsweise mindestens 1 mm, betragen. Außerdem sollten der Auffangabschnitt und der Kontaktabschnitt einen Abstand zueinander aufweisen, der dazu ausreicht, eine vorzeitige oder unbeabsichtigte Verunreinigung des Auffangabschnittes durch menschliches Versagen bei der Handhabung der Einrichtung zu vermeiden. Wenn mehrere Auffangabschnitte auf dem absorbierenden Material positioniert sind (weiter unten beschrieben für Tests mit mehreren Analyten), können die einzelnen Auffangzonen nahe beieinander liegen und sich in bestimmten Fällen sogar überlappen.
  • Wie hierin beschrieben, kann ein absorbierendes Material oder können mehrere absorbierende Materialien verwendet werden. In einer Ausführungsform ist der Abschnitt des absorbierenden Materials oder der absorbierenden Materialien, der den Kontaktabschnitt und den Auffangabschnitt umfasst und zwischen diesen liegt, aus einem Material, das Liposomen nicht auflöst, gefertigt. Das Material, auf dem das zweite Bindematerial immobilisiert ist, muss dazu fähig sein, die Immobilisierung zu tragen, und gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung muss das Material bzw. müssen die Materialien die Migration von Flüssigkeiten (Lateralfluss) ermöglichen.
  • Absorbierende Materialien mit großen Oberflächen (zum Beispiel Nitrozellulose) werden bei einigen Anwendungen dahin gehend besonders bevorzugt, dass das zweite Bindematerial, falls gewünscht, in hohen Konzentrationen von solchen Materialien getragen werden kann. Es versteht sich jedoch, dass die Konzentration des tatsächlich verwendeten zweiten Bindematerials zum Teil von der Bindungsaffinität des zweiten Bindematerials abhängt. Demgemäß ist der Schutzbereich der Erfindung nicht auf eine besondere Konzentration des Bindematerials auf dem absorbierenden Material beschränkt.
  • Die Testeinrichtung und das Verfahren der Erfindung können nur ein Pad umfassen, wenn zum Beispiel das Probenvolumen gering ist. In einem solchen Fall ist es notwendig, dass das absorbierende Material jenseits des Auffangabschnittes eine ausreichend große Fläche aufweist, um ein ausreichendes Volumen von Testreagenzien zu absorbieren, um die Vollendung der Reaktionen oder Hybridisierungen, auf denen der Assay beruht, zu gestatten (weiter unten ausführlicher erörtert), und im Falle der hierin offenbarten Ausführungsform der indirekten Messung Platz für einen ausreichenden Abstand zwischen dem Auffangabschnitt und dem Abschnitt, wo der Marker gemessen oder nachgewiesen wird, bereitstellt.
  • Es können auch zwei oder drei aneinander gelegte absorbierende Pads verwendet werden. In der Ausführungsform mit zwei Pads schließt das erste Pad sowohl den Kontaktabschnitt als auch den Auffangabschnitt ein, der vorzugsweise ungefähr auf halber Länge des absorbierenden Materials oder jenseits dieses Punktes beginnt, um auf dem Pad vor der Auf fangzone ausreichend Platz für die Reaktion oder Hybridisierung des Analyten mit dem ersten Bindematerial und dem ersten Markerkomplex bereitzustellen. Ein zweites Pad kann als Dochtpad verwendet werden (weiter unten ausführlicher erörtert), um überschüssige Reagenzien aus dem ersten absorbierenden Pad herauszuziehen. Wenn drei Pads verwendet werden, befindet sich der Auffangabschnitt vorzugsweise auf dem mittleren Pad, am meisten bevorzugt in der oder nahe der Mitte des Pads. In dieser Ausführungsform ist das Dochtpad das dritte Pad, aber es könnte bzw. könnten auch ein oder mehrere zusätzliche/s Pad/s als Dochtpads jenseits eines dritten Pads verwendet werden.
  • Es kann ein separates absorbierendes Pad als Dochtpad verwendet werden, wobei es keine Rolle spielt, wie viele andere absorbierende Pads verwendet werden. Das Dochtpad dient dazu, die Flüssigkeitsprobe entlang des durch absorbierende Pads gebildeten Teststreifens zu ziehen. Das Dochtmaterial und die Padlänge werden vorzugsweise an die anderen Bestandteile der Einrichtung und die verwendeten einzelnen Testbestandteile angepasst, um einen ausreichenden Fluidflusskontakt entlang des Teststreifens bereitzustellen. Ein bevorzugtes Dochtmaterial ist Whatman-Filterpapier.
  • Wenn mehr als ein absorbierendes Pad verwendet wird, werden die Pads aneinander gelegt, und vorzugsweise überlappen sie sich geringfügig, um einen guten Fluidflusskontakt zu gewährleisten. Die Pads werden dort, wo sie sich berühren, vorzugsweise durch Laminieren, zum Beispiel mittels Kunststoff und Klebstoff, miteinander verbunden. Als Alternative dazu wird der Kontakt zwischen den sich überlappenden Abschnitten durch Druck aufrechterhalten, der durch eine Kassette, die den Teststreifen enthält, auf den Teststreifen ausgeübt wird. Geeignete Kassetten werden zum Beispiel in dem US-Patent Nr. 6.358.752 beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen ist.
  • Die Testeinrichtung kann so modifiziert werden, dass sie einen oder mehrere zusätzlichen Kanal/Kanäle einschließt, um eine lineare Interpolation und eine Verifizierung der Antwort bereitzustellen. So kann zum Beispiel eine Einrichtung mit drei Kanälen für die gleichzeitige Messung des Analyten in einer Testprobe und von Hoch- und Niederwert-Vergleichsverbindungen konstruiert werden. Es ist auch zu beachten, dass Einkanal-Einrichtungen im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegen.
  • Außerdem wird in der Lateralfluss-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Migration der Testprobe und des Markerkomplex/Bindematerial-Konjugates vorzugsweise dadurch unterstützt, dass ein Dochtreagens, vorzugsweise eine Pufferlösung, auf den Streifen aufgebracht wird, um die Testbestandteile entlang des Streifens zu bewegen. Als Alternative dazu ist es, wenn das Probenvolumen eine ausreichende Größe hat, nicht notwendig, eine separate Pufferlösung zu verwenden.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Membran eine Filtermembran. Diese Ausführungsform der Erfindung eignet sich besonders für einen „Durchfluss"-Assay. Unter „Filtermembran" wird ein poröses Material mit einer Porengröße von ca. 0,1 µm bis ca. 100 µm, vorzugsweise von ca. 2 µm bis ca. 30 µm, verstanden, das zulässt, dass es von einem wässerigen Medium durchflossen wird. Die Porengröße hat einen bedeutenden Einfluss auf die Leistungsfähigkeit der Einrichtung. Die Porengröße muss über dem mittleren Durchmesser von Markerkomplexen (d. h., verwendete Signalerzeugungselemente) liegen. Auch sollten die Poren nicht zu groß sein, so dass ein günstiges Volumen/Oberfläche-Verhältnis erreicht werden kann. Zusätzlich muss das Membranmaterial, falls gewünscht, das Zurückhalten des aus dem ersten Markerkomplexkonjugat, dem Analyten und dem zweiten Markerkomplexkonjugat bestehenden Aggregates (oder anderer Signalerzeugungselemente) und, falls gewünscht, den Durchfluss von Signalerzeugungselementen (zum Beispiel nicht an Analyten gebundener Markerkomplex) ermöglichen. Zu Herstellern von Membranen gehören Schleicher & Schuell, Pall/Gelman, Sartorius, Whatman und Millipore. Vorzugsweise ermöglicht die Filtermembran den Durchfluss von Bestandteilen der Testmischung, die nicht an das erste Bindematerial und das zweite Bindematerial, und somit an den ersten und an den zweiten Markerkomplex, gebunden sind.
  • Geeignete Filtermembranen für die erfindungsgemäße Einrichtung und für die erfindungsgemäßen Verfahren schließen Nitrozellulose-Membranen, Nitrozellulose-Mischester, Mylarmembranen, Membranen auf Polysulfonylbasis, einfaches Filterpapier, Glasfasermembranen und Membranen aus einem beliebigen Kunststoff mit einer festgelegten Porengröße, zum Beispiel Polycarbonatfilter, poröses Gold und porösen Magnetwerkstoff, ein. Die Filtermembranen können verschiedene Formen, einschließlich rechtwinklig, rund, oval, dreieckig oder dergleichen, aufweisen.
  • Gemäß der „Durchfluss"-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung fließt eine Testmischung, die die Testprobe, den Markerkomplex und das erste Bindematerial einschließt, durch eine Filtermembran und aus dieser heraus (und nicht im Lateralfluss durch ein absorbierendes Material). Wenn das zweite Bindematerial über die zweite Kopplungsgruppe an die Membran gebunden wird, geht es eine Bindung mit jedem in der Testmischung vorhandenen Analyten ein, der über das erste Bindematerial auch an den Markerkomplex gebunden ist. Die restlichen Bestandteile der Mischung, einschließlich jedes Markerkomplex/Bindematerial-Konjugates, das nicht an einen Analyten gebunden ist, bewegen sich durch die Filtermembran und aus dieser heraus. Als Alternative dazu fließt eine Testlösung, die die Testprobe, den ersten Markerkomplex, das erste Bindematerial, den zweiten Markerkomplex und das zweite Bindematerial einschließt, durch eine Filtermembran. Wenn ein Analyt vorhanden ist, geht er eine Bindung sowohl mit dem ersten Bindematerial (das auch eine Bindung mit dem ersten Markerkomplex eingeht) als auch mit dem zweiten Bindematerial (das auch eine Bindung mit dem zweiten Markerkomplex eingeht) ein, um Markerkomplexaggregate zu bilden. Die Aggregate, die zu groß sind, um durch die Filtermembran zu gehen, werden auf der Membran gesammelt, während sich die restlichen Bestandteile der Lösung, einschließlich jedes Markerkonjugates, das nicht an einen Analyten gebunden ist, durch die Filtriermembran und aus dieser heraus bewegen.
  • Gemäß dieser Ausführungsform kann die Membran in eine Filtrier-/Nachweiseinrichtung zum optischen oder elektrochemischen Nachweis integriert werden. Geeignete Filtrier-/Nachweiseinrichtungen, Verfahren zu deren Herstellung und Verfahren zur Verwendung werden in der gleichzeitig schwebenden US-Patentanmeldung Nr. 09/698.564, eingereicht am 27. Oktober 2000, beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen ist.
  • Die Anwendung von Elementen von Kopplungsgruppen und Elementen des Signalerzeugungssystems (zum Beispiel Agenzien, die Liposomen auflösen, und Agenzien, die Marker ansammeln) auf die erfindungsgemäße Membran (absorbierendes Material oder Filtermembran) kann mittels wohl bekannter Techniken erfolgen, zum Beispiel durch Aufsprühen oder Aufspritzen einer Lösung dieser Materialien auf die Membran.
  • Die Menge des Kopplungsgruppenelementes, das an die Membran gebunden ist, variiert in Abhängigkeit von der Menge, die erforderlich ist, um das zweite Bindematerial und anschließend das Markerkomplex/Analyt-Konjugat zu binden, um einen wirksamen Assay zu ermöglichen. Im Allgemeinen beträgt die Menge des auf der Membran immobilisierten Kopplungsgruppenelementes mindestens ca. 20 pmol/cm2. Jedoch ist die Erfindung, wie oben beschrieben, nicht auf eine besondere Konzentration des Kopplungsgruppenelementes auf dem absorbierenden Material beschränkt.
  • Das Kopplungsgruppenelement und Elemente des Signalerzeugungssystems (zum Beispiel Agenzien, die Liposomen auflösen, und Agenzien, die Marker ansammeln) können durch kovalentes Binden, Physisorption, Chemisorption oder mit beliebigen anderen Mitteln an die Membran gebunden werden. So kann zum Beispiel das zu bindende Material direkt auf die Membran aufgebracht und dann mittels Ultraviolettbestrahlung an diese gebunden werden. Als Alternative dazu können Materialien auf die Membran adsorbiert werden, solange das Binden des zweiten Bindematerials an die Membran ohne Diffusion erfolgt. Das schließt das Inkontaktbringen des absorbierenden Materials mit einer Lösung, die das an die Membran zu bindende Material enthält, und das Trocknenlassen der Membran ein. Im Allgemeinen ist dieses Verfahren nur dann zweckdienlich, wenn die Membran relativ hydrophob ist oder eine hohe Oberflächenladung aufweist, und es ist eine anschließende Behandlung mit Proteinen, Detergenzien, Polysacchariden oder anderen Materialien, die zum Blockieren von unspezifischen Bindungsstellen fähig sind, erforderlich.
  • Vor oder nach dem Aufbringen des Kopplungsgruppenelementes, des zweiten Bindematerials und/oder von Rezeptorsignal-Erzeugungsbestandteilen (zum Beispiel das Agens, das Liposomen auflöst, und das Agens, das Marker ansammelt) auf den/die geeigneten Abschnitte auf der Membran kann die restliche unspezifische Bindungsfähigkeit der Membranen mit Blockierungsagenzien gesättigt oder blockiert werden, die typischerweise eine Kombination von drei Verbindungen (Proteine, synthetische Polymere und Tenside) einschließen und die die in dem Assay zu verwendenden Materialien nicht spezifisch binden. Dieses Sättigen oder Blockieren erfolgt vorzugsweise auch. Das Blockieren erfolgt im Allgemeinen nach dem Aufbringen des Kopplungsgruppenelementes auf die Membran, aber es kann, in Abhängigkeit von dem Verfahren des Auftragens, dem konkreten Blockierungsagens und der verwendeten Membran, möglich sein, die Membran vor dem Aufbringen des Kopp lungsgruppenelementes zu blockieren. Somit kann zum Beispiel die Restbindungsfähigkeit der Membran blockiert werden, um unspezifische Bindungen zu verhindern, indem bovines Serumalbumin verwendet wird, beschrieben in Towbin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 76: 4350 (1979), das hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen ist. Die Techniken zum Verhindern von unspezifischen Bindungen sind dem Fachmann allgemein bekannt, und solche Techniken sind auch allgemein auf die Verhinderung von unspezifischen Bindungen in dem erfindungsgemäßen Assay anwendbar. Beispiele für besonders geeignete Techniken zum Blockieren mit Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol werden zum Beispiel in Bartles, et al. Anal. Biochem. 140: 784 (1984) bzw. in der Britischen Patentbeschreibung GB 2204398 A beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen sind. Als Alternative dazu können ein oder mehrere Blockierungsagenzien in die Pufferlösung integriert werden, die dazu verwendet wird, Testbestandteile zu waschen oder in die Membran/en hinein oder an ihr/ihnen entlang zu bewegen.
  • Die Blockierungsagenzien blockieren unspezifische Bindungsstellen auf der Membran. Die Blockierungsagenzien werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus eiweißartigen Blockierungsreagenzien, die dazu fähig sind, die Bindung von Molekülen mit einer Molmasse von mehr als ca. 1000 an besagte Membran zu hemmen, und Polymerblockierungsreagenzien, die dazu fähig sind, die Bindung von Molekülen mit einer Molmasse von weniger als ca. 1000 an besagte Membran zu hemmen, besteht. Das eiweißartige Blockierungsreagens kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Gelatine, fettarmer Trockenmilch, bovinem Serumalbumin, Keyhole Limpet Hemocyanin und Kasein besteht. Das Polymerblockierungsreagens kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol besteht, und das Tensid kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Polyoxyethylenethern, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Natriumdodecylsulfat, Octylglucopyranosid und Natriumdioxycholat besteht.
  • Zusammen mit einem Blockierungsreagens oder mit Blockierungsreagenzien kann ein Tensid auf die Membran aufgebracht werden, um die Migration von einem oder mehreren Liposomkonjugaten ohne Auflösung der Liposomen zu erleichtern. Geeignete Tenside schließen BrijTM (Polyoxyethylenether), Tween 20TM (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol), Natriumdodecylsulfat, n-Octyl-β-D-glucopyranosid, Span 20TM, Nonindet P-40, ChapsoTM, TurgitolTM und Natriumdioxycholat ein.
  • Die Konzentration des Tensids/der Tenside, das/die in einer Blockierungslösung verwendet wird/werden, hängt zum Teil von der Partikelzusammensetzung (zum Beispiel Liposom) ab. Im Allgemeinen können Tenside in einer Konzentration von ca. 0 bis ca. 0,01 Volumenanteilen der Blockierungslösung, bevorzugt von ca. 0,001 bis ca. 0,005 Volumenanteilen der Blockierungslösung, integriert werden. Es ist wichtig, dass die Konzentration des auf die Membran aufgebrachten Tensids gesteuert wird, da es zu einer vorzeitigen Auflösung der Liposomen kommen kann, wenn die Tensidkonzentration zu hoch ist. Bevorzugte Tenside schließen Polyoxyethylenether, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Natriumdodecylsulfat, Octylglucopyranosid und Natriumdioxycholat ein.
  • Blockierungsagenzien werden in einer Pufferlösung auf die Membran aufgebracht. Geeignete Pufferlösungen schließen Tris(hydroxymethyl)monomethylamin-HCl (Tris-HCl), Tris-Citrat, Tris-Maleat, Tris-Glycin, Phosphatpuffer, HEPES und andere biologische Puffer in dem richtigen pH-Bereich ein.
  • In einigen Fällen wird ein Vorwaschen der Membran empfohlen (zum Beispiel bei Sartorius-Membranen). Dieses Vorwaschen kann zum Beispiel in einem 0,02-M-Tris-HCl-Puffer, enthaltend 150 mM NaCl, pH 7,0, enthaltend 5% Methanol, erfolgen.
  • Die Membran/en kann/können eine Einzelstruktur sein, zum Beispiel eine dünne Schicht, die in Streifen geschnitten ist. Die Membran/en kann/können an einem Trägermaterial befestigt werden, wie weiter unten ausführlicher beschrieben wird. Andererseits kann/können die Membranen ihren eigenen Träger bereitstellen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Membran ein Streifen aus Feststoffen, gebunden an einen Träger oder eine feste Oberfläche, wie man das zum Beispiel in der Dünnschichtchromatographie findet. Die Membran kann eine dünne Schicht mit darauf befindlichen Bahnen sein, oder sie kann eine gleichförmige dünne Schicht sein, die in separate Bahnen unterteilt werden kann, indem die Membran physisch von dem Träger entfernt wird, um die Bildung von Bahnen zu induzieren, wobei in jeder Bahn ein separater Assay durchgeführt werden kann, gezeigt in dem US-Patent Nr. 5.958.791 , das hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen ist. Die Membran/en kann/können verschiedene Formen, einschließlich rechtwinklig, rund, oval, dreieckig oder dergleichen, aufweisen. In einer Ausführungsform gibt es mindestens eine Durchquerungsrichtung einer Testmischung durch Kapillarmigration. Es können andere Durchque rungsrichtungen vorkommen, zum Beispiel in einem ovalen oder runden Stück, das in seiner Mitte mit der Testmischung in Kontakt kommt. Hinsichtlich der Lateralflussausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das Hauptaugenmerk jedoch darauf, dass eine Fließrichtung von dem Kontaktabschnitt durch den Auffangabschnitt besteht. In dieser Erörterung werden Membranstreifen veranschaulichend und nicht einschränkend beschrieben.
  • Wenn ein Träger für die Membran gewünscht wird oder notwendig ist, dann ist dieser Träger normalerweise hydrophob, wasserunlöslich, porenfrei und steif und hat für gewöhnlich die gleiche Länge und Breite wie der absorbierende Streifen, kann aber auch größer oder kleiner sein. Es können viele verschiedene organische und anorganische Materialien, sowohl natürliche als auch synthetische, und Kombinationen davon verwendet werden, immer unter der Voraussetzung, dass der Träger die Erzeugung des von dem Marker ausgehenden Signals nicht beeinträchtigt. Beispielhafte Polymere schließen Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylchlorid) Poly(vinylbutyrat), Glas, keramische Werkstoffe, Metalle und dergleichen ein.
  • Die Größe des Membranstückes oder der Membranstücken hängt von mehreren Überlegungen ab. Die folgende Erörterung konzentriert sich, zum Zwecke der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung, in erster Linie auf Membranstreifen zur Verwendung in der Lateralfluss-Ausführungsform. Wie oben erwähnt, liegen andere Formen, zum Beispiel rund, oval, dreieckig und dergleichen, ebenso im Schutzbereich dieser Erfindung. Ihre Abmessungen und andere Parameter können durch Fachleute unter Bezugnahme auf die vorliegende Offenbarung bestimmt werden.
  • Wenn der Kapillarfluss vorwiegend nach oben verläuft, steuern die Länge und die Dicke des Streifens die Menge der Mischung, die durch den Messabschnitt fließen kann. Wenn ein großes Testmischungsvolumen bewegt werden soll, muss die Fluidkapazität des Streifens jenseits des Auffangabschnittes groß genug sein, um das gewünschte Volumen aufzunehmen. Als Alternative dazu kann ein zusätzliches/-er absorbierendes Material, absorbierendes Pad oder Schwamm, hierin als Dochtpad bezeichnet, verwendet werden, um das Ende des Streifens jenseits des Auffangabschnittes zu kontaktieren. Ein Dochtpad kann auf diese Weise in Situationen verwendet werden, in denen es erwünscht ist, ein größeres Volumen der Testmischung quer durch die Testeinrichtung zu ziehen.
  • Um die Erhaltung der Reagenzien zu gestatten und Proben von begrenzter Größe bereitzustellen, sind die Abmessungen der Membran vorzugsweise relativ gering. Im Allgemeinen beträgt die Breite des Streifens 1 mm bis 20 mm und die Länge des Streifens 1 mm bis 100 mm.
  • Wie weiter unten ausführlich beschrieben wird, kann die erfindungsgemäße Testeinrichtung für das gleichzeitige Nachweisen oder Bestimmung von mehreren Analyten modifiziert werden. Die Länge des Streifens hängt von der Konzentration des Analyten und von praktischen Überlegungen, zum Beispiel eine einfache Handhabung und die Anzahl der Auffangabschnitte auf dem Streifen, ab und beträgt ca. 4 cm bis 20 cm, für gewöhnlich ca. 5 cm bis 15 cm, vorzugsweise ca. 6 bis 13 cm, doch kann der Streifen jede praktische Länge aufweisen. Die Struktur auf dem Streifen kann sehr unterschiedlich gestaltet werden und schließt feine, mittelfeine, mittlere, mittelgrobe und grobe Strukturen ein. Die Wahl der Porosität des Materials kann auf der Grundlage der Bindungsrate der Bestandteile eines bestimmten Assays erfolgen.
  • Der/die Markerkomplex/e, das/die Bindematerial/ien und der Analyt können auf verschieden Wegen in die Einrichtung und das Verfahren eingeführt werden, einschließlich einer einzigen oder mehrerer Testmischung/en (hintereinander oder im Wesentlichen gleichzeitig eingeführt), wobei Reaktionen zwischen Bestandteilen in einer Lösung oder auf der Membran ablaufen. In einer Ausführungsform werden der erste Markerkomplex, das erste Bindematerial und das zweite Bindematerial vorzugsweise mit der Testprobe verbunden und können eine Zeit lang inkubiert werden, um eine Bindung des ersten Bindematerials über die erste Kopplungsgruppe an den ersten Markerkomplex sowie eine Reaktion oder Hybridisierung zwischen jedem in der Probe vorhandenen Analyten und dem ersten Bindematerial auf dem Konjugat zu ermöglichen. Als Alternative dazu werden der erste Markerkomplex, der zweite Markerkomplex, das erste Bindematerial und das zweite Bindematerial mit der Testprobe verbunden und können eine Zeit lang inkubiert werden, um eine Bindung des ersten Bindematerials über die erste Kopplungsgruppe an den ersten Markerkomplex, eine Bindung des zweiten Bindematerials über die zweite Kopplungsgruppe an den zweiten Markerkomplex sowie eine Reaktion oder Hybridisierung zwischen jedem in der Probe vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial auf den Konjugaten zu ermöglichen. Wenn der Analyt ein Nukleinsäuremolekül ist, wird die Mischung typischerweise ca. 3 bis 30 Minuten lang bei ca. 15°C bis ca. 50°C, vorzugsweise bei ca. 30°C bis 50°C, noch mehr bevorzugt bei ca. 40°C bis 44°C, inkubiert.
  • In einer anderen Ausführungsform werden der erste Markerkomplex, das erste Bindematerial (falls gewünscht, ein zweiter Markerkomplex, ein zweites Bindematerial) und die Testprobe an derselben Stelle oder an separaten Stellen auf das absorbierende Material in dem Kontaktabschnitt aufgebracht. Eine andere Alternative schließt das Einführen des zweiten Bindematerials kurz vor dem Aufbringen einer Mischung, die den ersten Markerkomplex, das erste Bindematerial und den Analyten einschließt, ein. Das zweite Bindematerial kann an dem Kontaktabschnitt oder direkt auf den Auffangabschnitt der Membran aufgebracht werden.
  • Die erfindungsgemäßen universellen Liposomen und Membranen können auch in einem Bindungskonkurrenz-Assayformat verwendet werden. Insbesondere können Membranen gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung einen Bereich zum Ansammeln von Aggregaten, die aus einem Markerkomplex, einem Analyten-Analogon und einem Bindematerial für den Analyten gebildet werden, umfassen, wie weiter unten ausführlicher beschrieben wird. Bei Testeinrichtungen, die einen elektrochemischen Messabschnitt umfassen, ist dieser Bereich zum Ansammeln von dem Agens, das Liposomen auflöst, weg und entweder zwischen dem Agens, das Liposomen auflöst, und dem Kontaktabschnitt oder in dem Kontaktabschnitt angeordnet. Bei den anderen erfindungsgemäßen Testeinrichtungen ist dieser Bereich zum Ansammeln von dem Auffangabschnitt weg und entweder zwischen dem Auffangabschnitt und dem Kontaktabschnitt oder in dem Kontaktabschnitt angeordnet.
  • Die Mischung, enthaltend den Markerkomplex, einschließend ein Element einer Kopplungsgruppe, ein Analyten-Analogon, modifiziert mit dem anderen Element der Kopplungsgruppe, ein Bindematerial und den Analyten (falls vorhanden), wird dann über einen Zeitraum inkubiert, der dazu ausreicht, zuzulassen, dass sich das Analyten-Analogon an den Markerkomplex bindet und dass das Analyten-Analogon und der Analyt um eine Bindung an das Bindematerial miteinander konkurrieren. Die Inkubationszeit variiert je nach Assay, jedoch reicht in den meisten Fällen eine Zeit von ca. weniger als einer Minute bis ca. 30 Minuten dazu aus, zu ermöglichen, dass die Konkurrenzreaktion abgeschlossen wird oder ihrem Abschluss nahe kommt. Inkubationszeiten von ca. einer Minute bis ca. 30 Minuten werden gemäß dem Verfahren der Erfindung ohne weiteres erreicht und auch bevorzugt, da einer der bedeutenden Vorteile der vorliegenden Erfindung die Geschwindigkeit ist, mit der die Untersuchung auf Analyten hin durchgeführt werden kann. Einem Fachmann wird einleuchten, dass es wichtig ist, der Konkurrenzreaktion zu gestatten, ihrem Abschluss nahe zu kommen, um ungenaue Ergebnisse zu vermeiden. In einigen Fällen kann es jedoch notwendig sein, die Reaktionszeit zu steuern, weil sich bei einer zu langen Inkubationszeit Ausflockungen, die Liposomen umschließen, bilden können.
  • Nach dem Inkubieren der Lösung wird die Membran mit der Testmischung in Kontakt gebracht. Das Fortschreiten des Benetzens der Membran durch die Kapillarwirkung wird zumindest so lange zugelassen, bis der Auffangabschnitt feucht ist, und vorzugsweise so lange, bis die Lösungsmittelfront das Ende der Membran erreicht hat. Die Testmischung setzt ihr Durchqueren der Membran fort und bewegt sich dabei in den und durch den Auffangabschnitt, wo das Konjugat, das aus dem Markerkomplex, dem Analyten-Analogon und dem Bindematerial besteht, durch einen spezifischen Rezeptor für den daran gebundenen Markerkomplex aufgefangen und angesammelt wird. Unter „Rezeptor" wird jede Verbindung oder Zusammensetzung verstanden, die zur Erkennung eines besonderen räumlichen und polaren Aufbaus eines Moleküls, zum Beispiel eine Epitopen- oder Determinantenstelle, fähig ist. Geeignete Rezeptoren gemäß der Erfindung schließen jene Rezeptoren ein, die dazu fähig sind, sich direkt an die Oberfläche der Liposomen oder an ein Molekül, das an die Oberfläche der Liposomen gebunden ist oder an dieser haftet, zu binden. Es kann zum Beispiel ein für einen Liposomen-Tag spezifischer Antikörper, der sich in seiner Struktur in ausreichendem Maße von dem Analyten von Interesse unterscheidet, als Rezeptor für auf geeignete Weise derivatisierte Liposomen verwendet werden. Beispielhafte Rezeptoren schließen natürlich vorkommende Rezeptoren, zum Beispiel Eiweißavidin, Streptavidin, Thyroxin, Bindungsglobulin, Antikörper, Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren, Protein A, Protein G und dergleichen ein. Zum Beispiel kann Avidin, noch mehr bevorzugt Antibiotin-Antikörper, als Rezeptor für mit Biotin derivatisierte Liposomen fungieren. Als Alternative dazu kann Eiweißavidin als Rezeptor verwendet werden, da es sich direkt an die Liposomenoberfläche bindet.
  • In einer anderen Ausführungsform der Bindungskonkurrenz-Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das analytenspezifische Bindematerial auf der Membran immobilisiert und nicht in der Testmischung bereitgestellt werden. In dieser Ausführungsform tritt die Konkurrenz zwischen dem Analyten-Analogon und dem Analyten, falls vorhanden, auf der Membran auf. Als Alternative dazu können zwei oder mehr Mischungen, die den Markerkomplex, ein Analyten-Analogon und/oder ein Bindematerial einschließen, an denselben oder an unterschiedlichen Stellen auf die Membran aufgebracht werden, so dass die Reaktion zwischen den Elementen der Kopplungsgruppe, die in Bezug auf den Markerkomplex immobilisiert sind, und dem Analyten-Analogon sowie die Konkurrenz zwischen dem Analyten-Analogon und dem Analyten, falls vorhanden, auf der Membran abläuft bzw. auftritt.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Bindungskonkurrenz-Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ein Analyten-Analogon und ein Markerkomplex in einem wässerigen Medium mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält, und einem analytenspezifischen Bindematerial verbunden, um eine wässerige Testmischung bereitzustellen. In Bezug auf den Markerkomplex sind mehrere Elemente einer Kopplungsgruppe immobilisiert, so dass sich mehrere Analyten-Analogon-Moleküle daran binden. Daher hat das Konjugat aus Markerkomplex und Analyten-Analogon mehrere Bindungsstellen für das Bindematerial. Wenn kein Analyt vorhanden ist, reagiert das Bindematerial ausschließlich mit dem Konjugat, was zur Bildung von relativ großen Aggregaten führt, von denen jedes mehrere Markerkomplexe einschließen kann. Während der Migration der Testmischung quer durch die Testeinrichtung neigen die während der Inkubation gebildeten großen Aggregate dazu, in den Lücken der Nitrozellulosematrix zurückgehalten zu werden, und bilden eine „Aggregationszone" auf dem absorbierenden Material, für gewöhnlich an dem Meniskus der Testmischung oder in dessen Nähe, wenn die Einrichtung in die Testmischung eingeführt wird. Indem er Bindungsstellen auf dem Bindematerial besetzt, hemmt der Analyt die Konjugataggregation. Somit bilden sich umso weniger Aggregate, je höher die Konzentration des Analyten in der Testprobe ist, und jene, die sich doch bilden, sind von relativ beschränkter Größe. Kleinere Partikel, einschließlich unaggregiertem Konjugat aus Markerkomplex und Analyten-Analogon, werden nicht in der „Aggregationszone" zurückgehalten und setzen ihre Migration fort, bis sie in der Auffangzone gebunden werden. Die Konjugate, die nicht aggregieren, sind proportional zu der Analytenmenge in der Mischung und binden sich an den Auffangabschnitt. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine Immunoseparation aggregierten Konjugates von unaggregiertem Konjugat bereit. Das wird als Ergebnis der Unfähigkeit von aggregiertem Konjugat, sich über eine bestimmte Position auf dem absorbierenden Material hinauszubewegen, erreicht.
  • Die Testprobe kann aus einer großen Anzahl von verschiedenen Quellen gewonnen werden, zum Beispiel physiologische Flüssigkeiten, zum Beispiel Speichel, Schweiß, Serum, Plasma, Urin, Tränenflüssigkeit, Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit usw., chemische Verarbeitungsströme, Nahrung, Abwasser, natürliche Gewässer, Luft, Bodenextrakte usw. Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Probe, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält, mit den universellen Liposomen und dem ersten Bindematerial (und anderen gewünschten Bestandteilen) in einem elektrolytischen wässerigen Medium verbunden werden, um eine wässerige Testmischung oder -lösung zu bilden. Zur Anpassung der Eigenschaften der Testmischung oder einer Trägerlösung, die als Dochtreagens verwendet wird, können verschiedene Zusatzstoffe zugesetzt werden, und zwar in Abhängigkeit von den Eigenschaften der anderen Bestandteile der Einrichtung sowie von den Eigenschaften der Markerkomplexe, der Konjugate oder des Analyten selbst. Beispiele für Lösungszusatzstoffe, die in Test-, Kontroll- oder Trägerlösungen oder -mischungen gemäß der Erfindung integriert werden können, schließen ein: Puffer, zum Beispiel pH und Ionenstärke, Proben- oder Analyten-Lösungshilfsmittel, zum Beispiel unpolare Lösungsmittel und Polymere mit hoher Molmasse, zum Beispiel Ficoll®, ein nichtionisches synthetisches Polymer der Saccharose, erhältlich von Pharmacia, und Dextran.
  • Die Reihenfolge, in der die Testprobe (von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält), der/die Markerkomplex/e, das Analyten-Analogon, das Markerkonjugat, das erste Bindematerial und/oder das zweite Bindematerial einander zugesetzt werden, ist nicht kritisch. In der Bindungskonkurrenz-Ausführungsform wird es bevorzugt, das Bindematerial und die Testprobe kurz vor der Zusetzung des ersten Markerkomplexes und des Analyten-Analogons aufeinander wirken zu lassen, um den Konkurrenzvorteil zu kompensieren, den das Konjugat, das aus dem ersten Markerkomplex und dem Analyten-Analogon besteht, mit seinen mehreren Bindematerial-Bindungsstellen hat.
  • Das Verfahren des Zusetzens der Testprobe, des Markerkomplexes/der Markerkomplexe, des Analyten-Analogons, des Markerkonjugates, des ersten Bindematerials und/oder des zweiten Bindematerials (verbunden in einer Testmischung) zu der Membran ist ebenfalls nicht kritisch. So kann zum Beispiel in der Lateralfluss-Ausführungsform der Kontaktabschnitt der Membran mit der/den Testmischung/en in Kontakt gebracht werden, indem zum Beispiel der Kontaktabschnitt in die Testmischung/en eingetaucht wird. Als Alternative dazu kann/können die Testmischung/en mit dem absorbierenden Material in Kontakt gebracht werden, indem die Testmischung/en (vorzugsweise nach der Inkubation zum Zulassen einer Reaktion oder Hybridisierung) auf die Membran in dem Kontaktabschnitt aufgespritzt wird/werden. Als Alternative dazu können die Testprobe, der/die Markerkomplex/e, das Analyten-Analogon, das Markerkonjugat, das erste Bindematerial und/oder das zweite Bindematerial, vorzugsweise in einer Pufferlösung, entweder an derselben Stelle oder an separaten Stellen getrennt auf den Kontaktabschnitt aufgebracht werden, solange die Bestandteile miteinander in Kontakt kommen, wenn sie quer durch oder durch die Membran/en migrieren.
  • In der Lateralfluss-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Fortschreiten des Benetzens der ersten Membran und der zweiten Membran, falls vorhanden, durch die Kapillarwirkung so lange zugelassen, bis sich ein ausreichendes Volumen der Testmischung und/oder der Pufferlösung durch den Auffangabschnitt bewegt hat, um zu gewährleisten, dass jeder in dem Test vorhandene Analyt den Auffangabschnitt erreicht hat. Wenn allein der Nachweis gewünscht wird, muss weniger darauf geachtet werden, dass alle Analyten den Auffangabschnitt erreicht haben. Es ist möglich, Laufzeiten und Puffervolumen zu „eichen", indem Vorläufe (Pre-runs) unter Einsatz des/der elektrochemischen Nachweises und Messung, beschrieben in dem US-Patent Nr. 6.358.752 , oder des kolorimetrischen Nachweises, beschrieben zum Beispiel in Rule et al., Clin. Chem. 42: 1206–1209 (1996), die hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen sind, verwendet werden.
  • Größtenteils benötigt die Testmischung in der Lateralfluss-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung relativ wenig Zeit, um die Membran zu durchqueren. Für gewöhnlich benötigt die Testmischung für die Durchquerung des Streifens mindestens 30 Sekunden und höchstens 45 Minuten bis eine Stunde, noch üblicher ca. eine Minute bis ca. zehn Minuten. Gemäß dem Verfahren der Erfindung ist das Signal rasch oder sogar unverzüglich nachweisbar.
  • Wie oben beschrieben, ist in der Lateralfluss-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Bewegung der Testbestandteile entlang der Membran/en auf die Kapillarwirkung zurückzuführen. Diese Kapillarbewegung entlang der Membran bewirkt, dass die Testmischung zu dem und durch den Auffangabschnitt hindurch befördert wird, wo dann die Messung der markerbeladenen Liposomen erfolgt.
  • In der „Durchfluss"-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Testmischung aus der Testprobe und den Aggregaten (gebildet durch das erste und das zweite Bindematerial, an die jeweils ein Markerkomplex gebunden ist, der ein Partikel und einen Marker einschließt, und einen Analyten) unter Verwendung des ersten und des zweiten Markerkomplexes angesetzt. Die Lösung wird durch die Filtermembran geleitet, so dass Aggregate auf der Filtermembran gesammelt werden, und die Filtermembran wird gewaschen. Als Alternative dazu wird eine Testmischung aus der Testprobe, dem ersten Markerkomplex und dem ersten Bindematerial durch die Filtermembran geleitet, so dass Konjugate, die aus dem ersten Markerkomplex, dem ersten Bindematerial und dem Analyten bestehen, über das an die Filtermembran gebundene zweite Bindematerial auf der Filtermembran aufgefangen werden. Das zweite Bindematerial kann in der Testmischung bereitgestellt oder vorher an die Filtermembran gebunden werden. Wie weiter unten beschrieben, erfolgt dann der Nachweis von immobilisiertem Konjugat oder gesammeltem Aggregat.
  • Wie weiter oben angegeben, schließt das Signalerzeugungssystem einen Markerkomplex ein, der ein Partikel, einen Marker und ein Element einer Kopplungsgruppe einschließt, zum Beispiel ein Marker im Inneren der derivatisierten Liposomen. Geeignete Marker schließen fluoreszierende Farbstoffe, sichtbare Farbstoffe, bio- und chemilumineszente Materialien, Quantenpunkte, Enzyme, enzymatische Substrate, radioaktive Materialien und elektroaktive Marker ein. Wenn Liposomen als Partikel verwendet werden, können sichtbare Farbstoffe und radioaktive Materialien gemessen werden, ohne die Liposomen aufzulösen. Das Auflösen der Liposomen in der Einrichtung und den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann erreicht werden, indem ein Agens, das Liposomen auflöst, auf die Membran, zum Beispiel in der Auffangzone, aufgebracht wird. Geeignete Materialien, die Liposomen auflösen, schließen ein: Tenside, zum Beispiel Octylglucopyranosid, Natriumdioxycholat, Natriumdodecylsulfat, Saponin, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, vertrieben durch Sigma unter der Marke Tween-20, und ein nichtionisches Tensid, vertrieben durch Sigma unter der Marke Triton X- 100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol). Octylglucopyranosid ist bei vielen Assays ein bevorzugtes auflösendes Agens, da es Liposomen rasch auflöst und die Signalmessung anscheinend nicht beeinträchtigt. Als Alternative dazu kann das komplementäre Auflösen von Liposomen eingesetzt werden, oder die Liposomen können mit elektrischen, optischen, thermischen oder anderen physikalischen Mitteln aufgebrochen werden.
  • Wenn mehrere Markerkomplexe verwendet werden, kann der Marker in jedem Komplex der gleiche oder ein anderer sein.
  • Eine qualitative oder halbquantitative Messung des Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten von Interesse kann mit bloßem Auge erfolgen, wenn sichtbare Farbstoffe als Marker verwendet werden. Die Farbintensität kann für eine halbquantitative Messung visuell mit einer Reihe von Bezugsnormen, zum Beispiel in einer Farbenkarte, verglichen werden. Als Alternative dazu kann die Intensität des Markers, wenn eine höhere Genauigkeit erwünscht ist oder wenn der verwendete Marker eine instrumentelle Analyse erfordert, unter Verwendung eines quantitativen Instrumentes, zum Beispiel ein Reflektometer, ein Fluorimeter, ein Spektrophotometer, ein Elektroanalysator usw., direkt auf der Membran gemessen werden.
  • Als Alternative dazu können die erfindungsgemäßen Verfahren und Testeinrichtungen so modifiziert werden, dass sie einen elektrochemischen Marker verwenden. Gemäß dem elektrochemischen Nachweisverfahren der Erfindung wird eine elektroaktive Spezies, zum Beispiel Ferrocyanid, in den Marker, zum Beispiel Liposomen, eingekapselt. Elektroden werden auf die Membran aufgedruckt oder die Membran wird in Kontakt mit wieder verwendbaren Elektroden, zum Beispiel eine verzahnte Elektrodengruppierung, gebracht. Nach der Auflösung der Liposomen wird die Quantität der elektroaktiven Spezies bestimmt.
  • Geeignete elektrochemische Marker sowie Verfahren zu deren Auswahl und deren Verwendung sind zum Beispiel offenbart in dem US-Patent Nr. 5.789.154 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.756.362 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.753.519 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.958.791 an Roberts et al., dem US-Patent Nr. 6.086.748 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 6.248.956 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 6.159.745 an Roberts et al., dem US-Patent Nr. 6.358.752 an Roberts et al. und der gleichzeitig schwebenden US- Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 10/264.159, eingereicht am 2. Oktober 2002, die hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen sind. Die Testeinrichtung kann, kurz gesagt, für das amperometrische Nachweisen oder Quantifizieren eines elektroaktiven Markers konstruiert sein. In dieser Ausführungsform schließt die Testeinrichtung einen oder mehrere Arbeitselektrodenabschnitt/e, einen oder mehrere Bezugselektrodenabschnitt/e und einen oder mehrere Gegenelektrodenabschnitt/e auf der Membran der Testeinrichtung ein. Der eine oder die mehreren Arbeitselektrodenabschnitt/e, der eine oder die mehreren Bezugselektrodenabschnitt/e und der eine oder die mehreren Gegenelektrodenabschnitt/e sind jeweils so ausgelegt, dass sie über Anschlüsse an einen Potentiostat elektrisch aneinander angeschlossen werden können. Als Alternative dazu kann die Testeinrichtung für das potentiometrische Nachweisen oder Quantifizieren eines elektroaktiven Markers konstruiert sein. In dieser Ausführungsform schließt die Testeinrichtung einen oder mehrere Indikatorelektrodenabschnitt/e und einen oder mehrere Bezugselektrodenabschnitt/e auf der Membran der Testeinrichtung ein. Die Indikatorelektrodenabschnitte und die Bezugselektrodenabschnitte sind so ausgelegt, dass sie elektrisch an Potentiometer angeschlossen werden können. In einer anderen Ausführungsform kann die Testeinrichtung eine verzahnte Elektrodengruppierung einschließen, die positioniert ist, um Redoxzyklen eines elektroaktiven Markers zu induzieren, der nach der Auflösung der Liposomen aus den Liposomen freigesetzt wird.
  • Geeignete elektroaktive Marker sind jene, die elektrochemisch aktiv sind, aber die Partikel (zum Beispiel Liposomen) nicht zersetzen oder anderweitig aus den Partikeln aussickern. Sie schließen Metallionen, organische Verbindungen, zum Beispiel Chinone, Phenole und NADH, und Organometalle, zum Beispiel derivatisierte Ferrocene, ein. In einer Ausführungsform ist der elektrochemische Marker ein reversibles Redoxpaar. Ein reversibles Redoxpaar besteht aus chemischen Spezies, bei denen die Rate des heterogenen Elektronentransfers hoch ist und die Redoxreaktion eine minimale Konzentrationspolarisation aufweist. Geeignete Beispiele für ein reversibles Redoxpaar schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein: Ferrocenderivate, Ferrociniumderivate, Mischungen aus Ferrocenderivaten und Ferrociniumderivaten, Kupfer(II)-chlorid, Kupfer(I)-chlorid, Mischungen aus Kupfer(II)-chlorid und Kupfer(I)-chlorid, Ruthenium-tris-bipyridin, gelbes Blutlaugensalz, rotes Blutlaugensalz und Mischungen aus gelbem Blutlaugensalz und rotem Blutlaugensalz. Vorzugsweise ist der elektrochemische Marker in einem Liposom, in der Doppelschicht, eingekapselt oder an einer Liposomenmembran-Oberfläche befestigt.
  • Bei den Testeinrichtungen, die für die elektrochemische Messung gemäß der Erfindung ausgelegt sind, ist kein membranimmobilisiertes Bindematerial erforderlich.
  • Die Verwendung von Liposomen, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben, bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Signalerzeugungssystemen, die zum Beispiel Enzyme verwenden. Diese Vorteile schließen die erhöhte Signalstärke, die Lagerstabilität und die verzögerungsfreie Freisetzung von signalerzeugenden Markern ein, beschrieben in Siebert et al., Analytica Chimica Acta 282: 297–305 (1993); Yap et al., Analytical Chemistry 63: 2007 (1991); Plant et al., Analytical Biochemistry 176: 420–426 (1989); Locascio-Brown et al., Analytical Chemistry 62: 2587–2593 (1990) und Durst et al., Eds., Flow Injection Analysis Based an Enzymes or Antibodies, Band 14, VCH, Weinheim (1990), die alle hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen sind.
  • Liposomen können aus einer großen Anzahl von verschiedenen Lipiden gewonnen werden, einschließend Phospholipide, Glykolipide, Steroide, relativ langkettige Alkylester, zum Beispiel Alkylphosphate, Fettsäureester, zum Beispiel Lezithin, Fettamine und dergleichen. Es kann eine Mischung aus Fettmaterialien verwendet werden, zum Beispiel eine Verbindung aus neutralem Steroid, einem Ladlungsamphiphil und einem Phospholipid. Beispiele für Phospholipide schließen Lezithin, Sphingomyelin und Dipalmitoylphosphatidylcholin usw. ein. Typische Steroide schließen Cholesterin, Chlorestanol, Lanosterin und dergleichen ein. Typische ladungsamphiphile Verbindungen enthalten im Allgemeinen 12 bis 30 Kohlenstoffatome. Mono- oder Dialkylphosphatester oder Alkylamine, zum Beispiel Dicetylphosphat, Stearylamin, Hexadecylamin, Dilaurylphosphat und dergleichen sind typisch.
  • Die Liposomentaschen werden in einer wässerigen Lösung, die den Marker enthält, hergestellt, wobei die Taschen den Marker in ihrem Inneren einschließen. Die Liposomentaschen können unter starkem Schütteln in der Lösung mit anschließendem Entfernen des ungekapselten Markers hergestellt werden. Weitere Einzelheiten zur Herstellung von Liposomen sind in dem US-Patent Nr. 4.342.826 und der Internationalen PCT-Schrift Nr. WO 80/01515 dargelegt, die beide hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen sind.
  • Das Lösungsmittel für die Testmischung ist normalerweise ein wässeriges Medium, das bis zu ca. 40 Massenanteile anderer polarer Lösungsmittel sein kann, insbesondere Lösungsmittel mit 1 bis 6, noch üblicher 1 bis 4, Kohlenstoffatomen, einschließend Alkohole, Formamid, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, Dioxan und dergleichen. Für gewöhnlich sind die Cosolvents mit weniger als ca. 30 bis 40 Massenanteilen vorhanden. Unter gewissen Umständen, in Abhängigkeit von der Art der Probe, könnte ein Teil oder die Gesamtheit des wässerigen Mediums durch die Probe selbst bereitgestellt werden.
  • Der pH-Wert des Mediums liegt für gewöhnlich im Bereich von 4 bis 10, für gewöhnlich 5 bis 9, vorzugsweise im Bereich von ca. 6 bis 8. Der pH-Wert wird so gewählt, dass ein beträchtlicher Grad der Bindungsaffinität der Bindungselemente und die optimale Signalerzeugung durch das Signalerzeugungssystem aufrechterhalten werden. Es können verschiedene Puffer verwendet werden, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen und den pH-Wert während des Assays aufrechtzuerhalten. Beispiele für Puffer schließen Borat, Phosphat, Karbonat, Tris, Barbital und dergleichen ein. Der im konkreten Fall verwendete Puffer ist für gewöhnlich nicht kritisch, aber in einzelnen Assays kann ein Puffer einem anderen vorgezogen werden. Bei Nukleinsäureanalyten ist es notwendig, geeignete Puffer auszuwählen. Solche Puffer schließen SSC-Puffer (Natriumchlorid, Natriumcitrat) und SSPE (Natriumchlorid, Natriumphosphat, EDTA) ein.
  • Die Konzentration der Elektrolyten in dem Medium wird für gewöhnlich so eingestellt, dass der gleiche osmotische Druck oder die gleiche Osmolalität (oder bis zu ca. 50 bis ca. 100 mmol/kg hypertonisch) wie in der Lösung im Inneren der Liposomen erreicht wird, um deren Einkerben oder Anschwellen zu verhindern.
  • Mit einer etwas erhöhten Komplexität der durch den Elektroanalysator angewendeten Erregungswellenform kann die erfindungsgemäße elektrochemische Messung auch unter Verwendung der Stripping-Voltammetrie durchgeführt werden, wobei zum Beispiel liposomgekapselte Metallionen für den Nachweis und die Messung verwendet werden.
  • Der Assay wird normalerweise bei moderaten Temperaturen durchgeführt, wobei Temperaturen erwünscht sind, die im Wesentlichen konstant sind. Die Temperaturen für den Assay und die Erzeugung eines nachweisbaren Signals liegen im Allgemeinen im Bereich von ca. 4 bis 65°C, noch üblicher im Bereich von ca. 20 bis 38°C und häufig bei ca. 15 bis 45°C.
  • In der Flüssigkeitsprobe variiert die Konzentration des Analyten, der getestet werden kann, im Allgemeinen von ca. 10–3 bis ca. 10–20 M, noch üblicher von ca. 10–5 bis ca. 10–15 M. Überlegungen wie zum Beispiel die Konzentration des Analyten von Interesse und das Protokoll bestimmen normalerweise die Konzentration der anderen Reagenzien.
  • Mit der Testeinrichtung und dem Verfahren der Erfindung kann man eine Testprobe auch auf eine Mehrzahl von Analyten, zum Beispiel giftige Chemikalien oder Krankheitserreger, testen oder eine Mehrzahl von Analyten nach einem oder mehreren Analyten durchsuchen. In einer Ausführungsform schließt die Testeinrichtung mehrere Auffangabschnitte ein, von denen jeder so modifiziert ist, dass er ein besonderes zweites Bindematerial bindet, das für einen von mehreren Analyten spezifisch ist. Somit kann jeder Analyt dadurch bestimmt werden, dass jedes/jeder Konjugat/Analyt seinem eigenen Messabschnitt zur Konzentration und Messung zugewiesen wird. Als Alternative dazu kann das Konjugat jedes der in dieser Ausführungsform der Erfindung zu bestimmenden Analyten einen Marker einschließen, der so nachweisbar ist, dass er von den anderen Markern deutlich unterscheidbar ist. Mit unterschiedlichen eingekapselten Farbstoffen (zum Beispiel fluoreszierende Farbstoffe) oder Quantenpunkten können die Ergebnisse des Assays „farbcodiert" werden. Insbesondere kann ein Mehrwellenlängen-Detektor in einem Auffangabschnitt verwendet werden.
  • Aus praktischen Gründen kann die vorliegende Einrichtung in einem Satz, verpackt zusammen mit vorgegebenen Mengen von Reagenzien zur Verwendung beim Testen auf einen Analyten oder auf eine Mehrzahl von Analyten, bereitgestellt werden. Abgesehen von dem universellen Markerkomplex, in Bezug auf den ein Element einer ersten Kopplungsgruppe immobilisiert ist, dem universellen Markerkomplex, in Bezug auf den ein Element einer zweiten Kopplungsgruppe immobilisiert ist, und/oder der universellen Membran, bei der ein Element einer zweiten Kopplungsgruppe an einem Auffangabschnitt immobilisiert ist, können andere Zusatzstoffe, zum Beispiel ergänzende Reagenzien, eingeschlossen sein, zum Beispiel Stabilisatoren, Puffer und dergleichen. Außerdem kann der Satz eine Bibliothek von Bindematerialien, jeweils modifiziert mit einem Element einer Kopplungsgruppe, für die Auswahl und die Verwendung mit dem/den universellen Markerkomplex/en und der universellen Membran nach der Bestimmung des/der gewünschten Analyten einschließen. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien können stark variiert werden, um eine Konzentration in der Lösung der Reagenzien bereitzustellen, die die Empfindlichkeit des Assays substanziell optimiert. Die Reagenzien können als Trockenpulver, für gewöhnlich lyophilisiert und Vehikel einschließend, bereitgestellt werden, die nach ihrer Auflösung eine Reagenslösung mit den für die Durchführung des Assays geeigneten Konzentrationen bereitstellen. Der Satz oder die Packung kann auch andere Bestandteile einschließen, zum Beispiel Normen des/der Analyten (Analytenproben mit bekannten Konzentrationen des Analyten).
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren und Produkte zum Bestimmen einer breiten Palette von Analyten anwendbar. Als typische Beispiele für Analytentypen wären zu erwähnen: umwelt- und lebensmittelverunreinigende Stoffe, einschließend Pestizide und giftige Industriechemikalien; Drogen, einschließend therapeutische Drogen und missbrauchte Drogen; Hormone, Vitamine, Proteine, einschließend Enzyme, Rezeptoren und Antikörper aller Klassen, Prione; Peptide; Steroide; Bakterien; Pilze; Viren; Parasiten; Bestandteile oder Produkte von Bakterien, Pilzen, Viren oder Parasiten; Aptamere; Allergene aller Typen; Produkte oder Bestandteile von normalen oder malignen Zellen usw. Als besondere Beispiele wären zu erwähnen: T4; T3; Digoxin; hCG; Insulin; Theophyllin; Leutinizing-Hormone; Organismen, die verschiedene Krankheitszustände verursachen oder mit diesen verknüpft sind, zum Beispiel Streptococcus pyrogenes (Gruppe A), Herpes simplex I und II, Cytomegalovirus, Chlamydiae usw. Die Erfindung kann auch verwendet werden zum Bestimmen relativer Antikörperaffinitäten und für relative Nukleinsäure-Hybridisierungsexperimente, Restriktionsenzym-Assays mit Nukleinsäuren, das Binden von Proteinen oder anderen Materialien an Nukleinsäuren und den Nachweis jeder Nukleinsäuresequenz in jedem Organismus, d. h., Prokaryote und Eukaryote.
  • Wie oben beschrieben, kann eine erfindungsgemäße Einrichtung bei verschiedenen Assays, zum Beispiel Bindungskonkurrenz-Assays und Sandwich-Assays, verwendet werden, beschrieben in dem US-Patent Nr. 5.789.154 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.756.362 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.753.519 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 5.958.791 an Roberts et al., dem US-Patent Nr. 6.086.748 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 6.248.956 an Durst et al., dem US-Patent Nr. 6.159.745 an Roberts et al., dem US-Patent Nr. 6.358.752 an Roberts et al., der gleichzeitig schwebenden US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 09/698.564, eingereicht am 27. Oktober 2000, und der gleichzeitig schwebenden US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 10/264.159, eingereicht am 2. Oktober 2002, die hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich eingeschlossen sind.
  • Wie weiter oben angegeben, kann der Assay qualitativ (Vorhandensein oder Abwesenheit eines bestimmten Spiegels des Ziels) oder quantitativ oder halbquantitativ sein. Es wird davon ausgegangen, dass die Vorbereitung geeigneter Normen und/oder Normkurven (der Begriff „Normkurve" wird im allgemeinen Sinne unter Einschluss einer Farbenkarte gebraucht) im Bereich der Möglichkeiten von Fachleuten auf dem Gebiet der hierin dargelegten Lehre liegt.
  • Das Verfahren der Erfindung und die Herstellung und Verwendung der Testeinrichtung gemäß der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1 – Materialien und Verfahren
  • Nukleotidsequenzen, die in den folgenden Beispielen verwendet wurden (alle aufgeführt in der 5'-3'-Richtung)
    Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Liposomenherstellung
  • Liposomen wurden unter Einsatz des Verfahrens der Umkehrphasen-Verdampfung hergestellt. Die zur Herstellung der Liposomen verwendeten Lipide schlossen ein: 40,3 µmol Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), 21,0 µmol Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) und 51,7 µmol Cholesterin. 7,2 µmol (5 mg) Diphosphatidylpalmitoylethanolamin (DPPE) wurden zuerst in 1 ml 0,7% Triethylamin (v/v) in Chloroform durch Beschallen über einen Zeitraum von einer Minute in einem Rundkolben gelöst. Es wurde eine Reaktion von 14,3 µmol (3,5 mg) N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) mit DPPE zugelassen, um DPPEATA zu bilden, das in die Doppelschicht der Liposomen integriert wurde. Die Lipide wurden in 6,5 ml einer Mischung aus Chloroform, Isopropylether und Methanol (Verhältnis 6:6:1) verbunden. Es bildeten sich Liposomen, als das organische Lösungsmittel in einem Roto-Evaporator abgekocht wurde. 150 mM Sulforhodamin B wurden in Phosphatpuffer, pH 7,5, gelöst und in die Liposomen eingeschlossen. Anschließend wurden die Liposomen zum Zwecke des Sortierens nach Größe durch 0,4 µm- und dann 0,2 µm-Polycarbonatfilter extrudiert, wobei der Avanti-Miniextruder und Polycarbonatfilter (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AI) verwendet wurden. Die Liposomen wurden mittels Gelfiltration von freiem Farbstoff gereinigt, wobei Sephadex-G50-Säulen verwendet wurden, gefolgt von einer Dialyse gegen 0,1 M PBS-Puffer, pH 7,0, mit einer Osmolarität, die 75 mmol/kg über der Osmolarität der einkapselnden Lösung lag. Die Osmolarität wurde unter Verwendung von Saccharose eingestellt.
  • Beispiel 2 – Immobilisierung von Streptavidin auf einer Liposomenoberfläche
  • Um Streptavidin an die Liposomen zu koppeln, wurde ein aktiviertes Lipid (DPPEATA) in die Liposomen integriert. Streptavidin wurde zuerst in 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, enthaltend 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), bis zu einer Konzentration von 100 nmol/ml gelöst, um auf die Konjugation mit der Liposomenoberfläche vorzubereiten. Dann wurde N-(κ-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimidester (Sulfo-KMUS) in Dimethylsulfoxid (DMSO) bis zu einer Konzentration von 20,8 µmol/l gelöst. 4,3 µl dieses Vorrates wurden zu 100 µl der Streptavidinlösung gegeben, und es wurde eine Reaktion in einem Schüttler bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 bis 3 Stunden zugelassen.
  • Zweitens wurden die Thiolgruppen auf dem Streptavidin durch Desacetylierung der Acetylthioacetat-Gruppen entschützt. Das wurde erreicht durch Mischen des Streptavidins mit einer Hydroxylaminhydrochlorid-Lösung, pH 7,5, enthaltend 0,5 M Hydroxylaminhydrochlorid, 25 mM EDTA, und 0,4 M Phosphatpuffer. 28,73 µl der Lösung wurden zu der ATA-Streptavidin-Lösung gegeben, so dass die Endkonzentration von Hydroxylamin 0,05 M betrug. Diese Mischung wurde in einem Schüttler bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 Stunden inkubiert.
  • Schließlich wurde eine Reaktion des SH-Streptavidins mit den maleimidmarkierten Liposomen zugelassen. Die gewünschte Dichte des verwendeten Streptavidins betrug zum Beispiel 0,12 Mol-% des Gesamtlipides. Das SH-Streptavidin wurde bei Raumtemperatur mit den Liposomen über einen Zeitraum von 3 bis 4 Stunden und dann über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Liposomen wurden mit Cystein in PBS-Puffer bei dem Zehnfachen der Molarität von Maleimid in Reaktion gebracht, um alle unkonjugierten Maleimidgruppen abzudecken. Die Liposomen wurden von freiem Streptavidin auf einer Sepharose-CL-4B-Säule gereinigt und dann in 0,1 M PBS-Puffer, pH 7,0, plus Saccharose mit einer Osmolarität von 617 mmol/kg über Nacht im Dunklen dialysiert. Die Liposomen wurden im Dunklen bei 4°C gelagert.
  • Beispiel 3 – Immobilisierung eines generischen Oligonukleotides auf einer Liposomenoberfläche
  • Für die generische Sonde (SEQ ID NR: 1, siehe oben) (5'-Ende modifiziert mit einer Amingruppe) und spezifische Reportersonden (E. coli: SEQ ID NR: 3, siehe oben; C. par vum: 5' GTG CAA CTT TAG CTC CAG TT 3' (SEQ ID NR: 9); B. anthracis: 5' CAA GAT GTC CGC GTA TTT AT 3' (SEQ ID NR: 10)) (3'-Ende modifiziert mit einer Amingruppe), wurde nach dem gleichen Protokoll verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, wobei 100 nmol/ml Lösungen der Oligonukleotide verwendet wurden.
  • Beispiel 4 – Immobilisierung von Streptavidin auf Polyethersulfon-Membranen
  • Polyethersulfon-Membranen von Pall/Gelman Company wurden zur Verwendung mit dem originalen universellen Biosensor in Streifen von 4,5 × 55 mm geschnitten und mit Streptavidin beschichtet. 15 pmol Streptavidin in 0,4 M Na2CO3/NaHCO3-Puffer, pH 9,0, enthaltend 5% Methanol, wurde auf jede Membran pipettiert. Diese wurden über einen Zeitraum von 10 Minuten bei Raumtemperatur und dann in einem Vakuumtrockenofen (15 psi) bei 50 bis 55°C über einen Zeitraum von 1,5 Stunden getrocknet. Die Membranen wurden anschließend mit einem Blockierungsreagens aus 0,5% Polyvinylpyrrolidon, 0,015% Kasein in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,01% NaN3, pH 7–7,5) über einen Zeitraum von 30 Minuten blockiert. Die Membranen wurden auf Papier getrocknet, unter einer Abzugshaube über einen Zeitraum von 10 Minuten luftgetrocknet, und dann in dem Vakuumtrockenofen (15 psi) bei 25 bis 30°C über einen Zeitraum von 2 Stunden. Die Membranstreifen wurden bis zu ihrer Verwendung in vakuumversiegelten Beuteln bei 4°C gelagert.
  • Beispiel 5 – Immobilisierung von Antifluoreszein-Antikörper in Bezug auf Polyethersulfon-Membranen
  • Antifluoreszein-Antikörper-Membranen, die an Stelle von Streptavidin Antifluoreszein-Antikörper in der Auffangzone enthielten, wurden so hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben. In einer ersten Untersuchung wurden 15 pmol Antikörper in 0,4 M Na2CO3/NaHCO3-Puffer, pH 9,0, enthaltend 5% Methanol, auf jede Membran pipettiert. Alle anderen Verfahren folgten dem in Beispiel 4 beschriebenen Protokoll.
  • Beispiel 6 – Bioessay unter Verwendung von universellen Liposomen mit generischen Oligonukleotiden unterschiedlicher Länge
  • Liposomen wurden so modifiziert, dass sie generische Oligonukleotide einschlossen, die hauptsächlich dC unterschiedlicher Länge, d. h., 17 nt, 20 nt, 25 nt und 30 nt auf ihren Oberflächen enthielten (beschrieben in Beispiel 3). Die entsprechenden E.-coli-spezifischen Reportersonden wurden so modifiziert, dass sie ein 17 bis 30 nt langes Oligo-dG (mit einigen dA oder dT) an ihrem 3'-Ende trugen. Die Sequenzen der verwendeten generischen Sonden und Reportersonden waren wie folgt: Tabelle 1. Generische Sonden und modifizierte E.-coli-spezifische Reportersonden
    Figure 00470001
  • 2 µl Liposomen, 0,457 µl Reportersonden (2 pmol/µl, gelöst in NaHCO3/Na2CO3-Puffer, 0,4 M, pH 9,0), 1,0 µl Zielsequenz (1 pmol/µl) (SEQ ID NR: 5) und 8,54 μl Mastermix (20% Formamid, 5 × SSC, 0,2% Ficoll Typ 400, 0,2 M Saccharose) wurden über einen Zeitraum von 10 Minuten bei 41°C inkubiert. Die Membran wurde in die Mischung eingeführt, und dann wurden 50 µl Laufpuffer (20% Formamid, 5 × SSC, 0,2% Ficoll Typ 400, 0,2 M Saccharose) zugesetzt. Die Mischung wurde die gesamte Strecke bis zur Oberseite der Membran laufen gelassen, die Membran wurde aus der Mischung entnommen und trocknen gelassen. Dann wurde eine Reflektometerablesung unter Verwendung eines BR-10- Reflektometers (λ = 560 nm) (ESECO, Cushing, OK) vorgenommen. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Wie 3 zeigt, waren die generischen Sonden mit 20 nt optimal.
  • Beispiel 7 – Bestimmung der Nachweisgrenze unter Verwendung von generischen Oligonukleotiden mit 20 Nukleotiden und von spezifischen Escherichia-coli-/Cryptosporidiumparvum-Reportersonden
  • Universelle Liposomen, die so modifiziert wurden, dass sie generische Oligonukleotide einschlossen, wurden auch zur Untersuchung der Nachweisgrenze verwendet, wobei 20 nt lange generische Sonden (SEQ ID NR: 1) auf der Liposomenoberfläche und spezifische E.-coli-Reportersoriden (SEQ ID NR: 2) sowie spezifische C.-parvum-Reportersonden (SEQ ID NR: 4) verwendet wurden. Insbesondere wurden 2 µl Liposomen, 0,286 µl Reportersonden mit einem 20 nt langen generischen Teil (2 pmol/µl, gelöst in NaHCO3/Na2CO3-Puffer, 0,4 M, pH 9,0), 1,0 µl Zielsequenz (1 pmol/µl) (SEQ ID NR: 5 und 6) und 8,71 µl Mastermix (15% Formamid, 5 × SSC, 0,1% Ficoll Typ 400, 0,2 M Saccharose) über einen Zeitraum von 10 Minuten bei 41°C inkubiert. Die Membran wurde in die Mischung eingeführt, und dann wurden 50 µl Laufpuffer (20% Formamid, 8 × SSC, 0,2% Ficoll 400, 2 M Saccharose) zugesetzt. Die Mischung wurde die gesamte Strecke bis zur Oberseite der Membran laufen gelassen, die Membran wurde aus der Mischung entnommen und trocknen gelassen. Dann wurden Reflektometerablesungen vorgenommen (BR-10-Reflektometer (λ = 560 nm), ESECO, Cushing, OK). Es wurden unterschiedliche Konzentrationen der Zielsequenz (E. coli und C. parvum) untersucht, wobei 4 das E.-coli-Beispiel und 5 das C. parvum-Beispiel zeigt. Es wurden Nachweisgrenzen von lediglich 100 fmol für E. coli und von lediglich 50 finol für C. parvum (das Zehnfache über dem spezifischen Biosensorassay) festgestellt.
  • Beispiel 8 – Verbindung von universellen Liposomen von Beispiel 3 mit E.-coli-spezifischen Membranen – Optimierung von Sonden-Tag auf Liposomen
  • Eine Inkubationsmischung, einschließend 2,0 µl Liposomen, Oberflächen-Tag (SEQ ID NR: 1), variierte mit jedem Assay wie folgt: 0,1 Mol-%, 0,2 Mol-%, 0,4 Mol-% und 0,6 Mol-% Oberflächen-Tag, 1,0 μl Reportersonde (SEQ ID NR: 2) mit einer Konzentration von 2 pmol/µl, 1,0 µl synthetische Zielsequenz (SEQ ID NR: 5) mit einer Konzentration von 500 fmol/µl und 4,0 µl Mastermix (20% Formamid, 4 × SSC, 0,4% Ficoll, 0,4 M Saccharose) wurden in einem Kulturreagensglas angesetzt. Die Mischung wurde in dem Reagensglas über einen Zeitraum von 15 Minuten in einem Wasserbad bei 41°C inkubiert. Die Mischung wurde aus dem Bad entnommen und ein E.-coli-spezifischer Membranstreifen wurde in jede Mischung eingeführt.
  • Zur Herstellung des E.-coli-spezifischen Membranstreifens wurden Polyethersulfon-Membranen in Streifen von 4,5 × 80 mm geschnitten. Anschließend wurden die Membranen mit einer Mischung aus Streptavidin und biotinylierten Auffangsonden (SEQ ID NR: 7) beschichtet. Eine Mischung, enthaltend 15 pmol Streptavidin und 45 pmol Auffangsonde pro µl in einem Natriumkarbonat-Puffer (0,4 M NaHCO3/Na2CO3 mit 5% Methanol) wurde bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von mindestens 15 Minuten inkubiert. Die Mischung aus Streptavidin und Auffangsonde wurde auf den Membranstreifen immobilisiert, indem 1 µl der Mischung direkt auf die Membran, ca. 2,5 cm von der Unterseite entfernt, pipettiert wurde. Die Membranen wurden über einen Zeitraum von 5 Minuten bei Raumtemperatur und dann für weitere 1,5 Stunden in einem Vakuumtrockenofen (15 psi) bei 52 bis 55°C getrocknet. Die Membranen wurden anschließend in einer Blockierungslösung aus 0,5% Polyvinylpyrrolidon, 0,015% Kasein in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS: 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,01% NaN3, pH 7–7,5) über einen Zeitraum von 30 Minuten inkubiert. Die Membranen wurden auf Papier getrocknet und schließlich über einen Zeitraum von 2 Stunden in dem Vakuumtrockenofen (15 psi) bei 30°C getrocknet. Sie wurden bis zu ihrer Verwendung in vakuumversiegelten Beuteln bei 4°C gelagert.
  • Es wurde das Absorbieren der gesamten Inkubationsmischung durch die Membran zugelassen. Es wurden weitere 40 μl des angesetzten Laufpuffers (20% Formamid, 5 × SSC, 0,2% Ficoll, 0,2 M Saccharose) in das Kulturreagensglas gegeben und über die gesamte Länge der Membran laufen gelassen. Die Membranstreifen wurden trocknen gelassen, und das resultierende Signal an der Auffangzone wurde unter Verwendung eines Reflektometers (BR-10-Reflektometer (λ = 560 nm), ESECO, Cushing, OK) gemessen. Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass 0,2 Mol-% Tag der generischen Sonde auf dem Liposom unter den Assaybedingungen optimal waren.
  • Beispiel 9 – Verbindung von Membranen mit immobilisiertem Streptavidin und Liposomen, die mit einer generischen Sonde markiert sind – Optimierung der Streptavidinkonzentration auf der Polyethersulfon-Membran
  • Es wurde eine Inkubationsmischung angesetzt, einschließend 2 µl Liposomen (0,1 Mol-% Tag (SEQ ID NR: 1), Absorptionsvermögen 1:400, verdünnt bei 532 nm = 0,103), 1 µl Reportersonde (SEQ ID NR: 2) mit 2 pmol/µl, 1 μl Zielsequenz (SEQ ID NR: 5) mit 500 fmol/µl und 5 µl Mastermix (20% Formamid, 4 × SSC, 0,4% Ficoll 400, 0,4 M Saccharose). Die Mischung wurde in einem Reagensglas über einen Zeitraum von 20 Minuten bei 41°C inkubiert. Es wurde 1 μl Auffangsonde (SEQ ID NR: 7) mit 1 pmol/µl zugesetzt. Die Mischung wurde dann erneut über einen Zeitraum von 20 Minuten bei 41°C inkubiert. Es wurden Membranen in das Reagensglas eingeführt, wobei in Bezug auf jede Membran eine andere Streptavidinmenge immobilisiert war (10, 15, 20, 25 und 30 pmol). Es wurden drei wiederholte Gleichversuche für jeden Membrantyp durchgeführt. Anschließend wurden 38 µl Laufpuffer (20% Formamid, 5 × SSC, 0,2% Ficoll 400, 0,2 M Saccharose) zugesetzt. Für jeden Membrantyp wurden negative Kontrollen (mit Wasser an Stelle von Ziel) durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass 20 pmol auf der Membran immobilisiertes Streptavidin unter den gegebenen Assaybedingungen optimal waren (7).
  • Beispiel 10 – Verbindung von Antikörper, immobilisiert auf Membranen, und Liposomen mit Streptavidin – Optimierung der Antikörperkonzentration auf der Membran unter Verwendung von E.-coli-Sequenzen als Modellanalyten
  • Es wurden 5 µl Gesamtvolumen in einem Reagensglas gemischt, enthaltend 2 µl universelle Liposomen (mit immobilisiertem Streptavidin), 1 µl Zielsequenz (SEQ ID NR: 5), jeweils 0,5 µl Reportersonde (SEQ ID NR: 3) und Auffangsonde (SEQ ID NR: 7) und 1 µl Hybridisierungspuffer (45% Formamid, 9 × SSC, 0,6 M Saccharose und 0,6% Ficoll Typ 400). Durch Inkubieren der Mischung bei 41°C über einen Zeitraum von 10 Minuten ließ man die Bestandteile hybridisieren. Anschließend wurde die Membran mit variierenden Konzentrationen von immobilisiertem Antifluoreszein-Antikörper (20, 30, 40 und 50 pmol) in das Reagensglas eingeführt, und es wurde zugelassen, dass die Mischung die Membran hinauf migriert. Sobald die gesamte Mischung durch die Membran absorbiert war, wurden 40 μl Laufpuffer (30% Formamid, 6 × SSC, 0,2 M Saccharose, 0,4% Ficoll Typ 400) in das Rea gensglas gegeben. Sobald die Lösung das Ende der Membran erreicht hatte, wurden die Streifen aus dem Reagensglas entnommen und vor der Messung mit dem Reflektometer luftgetrocknet. Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt, wobei festgestellt wurde, dass 40 pmol Antifluoreszein-Antikörper unter den angewendeten Assaybedingungen die optimale Konzentration war.
  • Beispiel 11 – Verbindung von Antikörper, immobilisiert auf Membranen, und Liposomen, markiert mit Streptavidin – Optimierung der Reportersonden-Konzentration für den E.-coli-Nachweis
  • Es wurde eine Inkubationsmischung angesetzt, einschließend 1 µl Mastermix (45% Formamid, 10 × SSC, 0,6 M Saccharose, 0,6% Ficoll Typ 400), 2 µl Liposomen (0,2 Mol-% Tag von Streptavidin auf Liposomen), 0,5 μl Reportersonde (SEQ ID NR: 3) (variiert von 0 bis 10 pmol), 1 µl Ziel (SEQ ID NR: 5) (1 pmol) und 0,5 µl Auffangsonde (SEQ ID NR: 7) (4 pmol). Die Mischung wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 42°C inkubiert. Der Assay wurde mit 32 µl Laufpuffer (30% Formamid, 6 × SSC, 0,2 M Saccharose, 0,4% Ficoll Typ 400) durchgeführt. Die bei diesem Versuch verwendeten Membranen wiesen 30 pmol in der Auffangzone immobilisiertes Antifluoreszein auf und wurden mit 0,015% Kasein in 1XTBS und 0,5% PVP blockiert.
  • Es wurden elf Gesamtassays durchgeführt: einer mit 0 pmol Reportersonde, zwei mit 500 fmol Reportersonde, zwei mit 1 pmol Reportersonde, zwei mit 2 pmol Reportersonde, zwei mit 3 pmol Reportersonde und zwei mit 10 pmol Reportersonde (siehe 9). Es wurde festgestellt, dass 1 pmol die optimale Reportersonden-Konzentration für 0,2-Mol-%-markierte Liposomen war.
  • Beispiel 12 – Verbindung von Membranen mit immobilisiertem Streptavidin und Liposomen, die mit einem generischen Oligonukleotid markiert sind – Bestimmung der Nachweisgrenze und des Nachweisbereiches von E. coli (synthetische Zielsequenz clpB), B. anthracis (synthetische Zielsequenz atxA) und C. parvum (synthetische Zielsequenz hsp70)
  • Es wurde eine Inkubationsmischung angesetzt, einschließend 2 µl Liposomen (0,2 Mol-% Tag, 1 µl Reportersonde mit 2 pmol/µl, 1 µl synthetische Zielsequenz (synthetische Zielsequenz E. coli clpB, synthetische Zielsequenz B. anthracis atxA oder synthetische Zielsequenz C. parvum hsp70) in variierenden Konzentrationen (siehe 10 bis 12) und 5 µl Mastermix (20% Formamid, 4 × SSC, 0,4% Ficoll 400, 0,4 M Saccharose). Die Mischung wurde in einem Reagensglas über einen Zeitraum von 20 Minuten bei 41°C inkubiert. Es wurde 1 µl Auffangsonde mit 1 pmol/µl zugesetzt. Die Mischung wurde dann erneut über einen Zeitraum von 20 Minuten bei 41°C inkubiert. Es wurde eine Membran in das Reagensglas eingeführt, wobei in Bezug auf die Membran 20 pmol Streptavidin immobilisiert waren. Anschließend wurden 38 µl Laufpuffer (20% Formamid, 5 × SSC, 0,2% Ficoll 400, 0,2 M Saccharose) zugesetzt. Für jede Zielsequenz wurden negative Kontrollen (mit Wasser an Stelle von Ziel) durchgeführt.
  • Die folgenden Sequenzen wurden zur Bestimmung der Nachweisgrenze und des Dynamikbereiches des universellen Biosensors für den Nachweis von E. coli verwendet: synthetische Zielsequenz: SEQ ID NR: 5; generische 20-nt-Liposomensonde: SEQ ID NR: 1; Auffangsonde: SEQ ID NR: 7; Reportersonde: SEQ ID NR: 3. 10 zeigt die Ergebnisse für die synthetische Zielsequenz E. coli clpB. Es wurde festgestellt, dass die Nachweisgrenze bei 10 finol pro Assay lag und der Dynamikbereich sich von 10 fmol bis 750 fmol erstreckte.
  • Die folgenden Sequenzen wurden zur Bestimmung der Nachweisgrenze und des Dynamikbereiches des universellen Biosensors für den Nachweis von B. anthracis verwendet: Tabelle 2. Verwendete Sequenzen (geschrieben in 5'-3')
    Figure 00520001
  • 11 zeigt die Ergebnisse für die synthetische Zielsequenz B. anthracis atxA. Es wurde festgestellt, dass die Nachweisgrenze bei 10 fmol pro Assay lag und der Dynamikbereich sich von 10 fmol bis 750 fmol erstreckte.
  • Die folgenden Sequenzen wurden zur Bestimmung der Nachweisgrenze und des Dynamikbereiches des universellen Biosensors für den Nachweis von C. parvum verwendet: Tabelle 3. Verwendete Sequenzen (geschrieben in 5'-3')
    Figure 00530001
  • 12 zeigt die Ergebnisse für die synthetische Zielsequenz C. parvum hsp70. Es wurde festgestellt, dass die Nachweisgrenze bei 10 finol pro Assay lag und der Dynamikbereich sich von 10 fmol bis 1000 fmol erstreckte.
  • Beispiel 13 – Verbindung von Antikörper, immobilisiert auf Membranen, und Liposomen, markiert mit Streptavidin – Optimierung der Formamidkonzentration in dem Mastermix für den Nachweis von E.-coli-Zielsequenz (synthetische clpB)
  • Es wurde eine Inkubationsmischung angesetzt, einschließend 1 µl Mastermix (0 bis 55% Formamid, 10 × SSC, 0,6 M Saccharose, 0,6% Ficoll Typ 400), 2 µl Liposomen (0,2 Mol-% Tag von Streptavidin auf Liposomen), 0,5 µl Reportersonde (SEQ ID NR: 3) (1 pmol), 1 µl Ziel (SEQ ID NR: 5) (500 fmol) und 0,5 µl Auffangsonde (SEQ ID NR: 7) (4 pmol). Die Mischung wurde über einen Zeitraum von 20 Minuten bei 42°C inkubiert. Der Assay wurde mit 32 µl Laufpuffer (30% Formamid, 4 × SSC, 0,2 M Saccharose, 0,4% Ficoll Typ 400) durchgeführt. Die bei diesem Versuch verwendeten Membranen wiesen 30 pmol in der Auf fangzone immobilisiertes Antifluoreszein auf und wurden mit 0,015% Kasein in 1XTBS und 0,5% PVP blockiert.
  • Es wurden 18 Gesamtassays durchgeführt: drei mit 0% Formamid, drei mit 35% Formamid, drei mit 40% Formamid, drei mit 45% Formamid, drei mit 50% Formamid und drei mit 55% Formamid (siehe 13). Es wurde festgestellt, dass 45% Formamid die optimale Formamidkonzentration in dem Mastermix war. SEQUENZENLISTE
    Figure 00540001
    Figure 00550001
    Figure 00560001
    Figure 00570001
    Figure 00580001
    Figure 00590001
    Figure 00600001
    Figure 00610001
    Figure 00620001

Claims (39)

  1. Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten in einer Testprobe, umfassend: Bereitstellen mindestens einer Testmischung, umfassend: eine Testprobe, wobei die Testprobe potenziell einen Analyten enthält, einen Markerkomplex, wobei der Markerkomplex ein Partikel, einen Marker und ein erstes Element einer ersten Kopplungsgruppe umfasst, ein erstes Bindematerial, wobei das erste Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, und wobei das erste Bindematerial ein zweites Element der ersten Kopplungsgruppe umfasst, und ein zweites Bindematerial, wobei das zweite Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, der ein anderer Teil als der Teil des Analyten ist, für den das erste Bindematerial ausgewählt wird, und wobei das zweite Bindematerial ein erstes Element einer zweiten Kopplungsgruppe umfasst, Inkontaktbringen der mindestens einen Testmischung mit einer Oberfläche, in Bezug auf die ein zweites Element der zweiten Kopplungsgruppe immobilisiert ist, Zulassen einer Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial, zwischen dem ersten und dem zweiten Element der ersten Kopplungsgruppe und zwischen dem ersten und dem zweiten Element der zweiten Kopplungsgruppe, Nachweisen des Vorhandenseins oder der Menge des Markers auf der Oberfläche unter Verwendung einer Nachweisbaugruppe, und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge des Markers auf der Oberfläche mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Testprobe.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagtes Inkontaktbringen das Inkontaktbringen einer einzigen Mischung, die die Testprobe, den Markerkomplex, das erste Bindematerial und das zweite Bindematerial einschließt, umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagtes Inkontaktbringen das Inkontaktbringen von zwei oder mehr Mischungen, die jeweils die Testprobe und/oder den Markerkomplex und/oder das erste Bindematerial und/oder das zweite Bindematerial einschließen, umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei eine Testmischung, die das zweite Bindematerial umfasst, mit der Oberfläche unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die so wirken, dass sie eine Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Element der zweiten Kopplungsgruppe zulassen, und anschließend eine Testmischung, die die Testprobe, den Markerkomplex und das erste Bindematerial umfasst, mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial und die Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Element der ersten Kopplungsgruppe in der mindestens einen Testmischung ablaufen, bevor die mindestens eine Testmischung mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial und die Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Element der ersten Kopplungsgruppe auf der Oberfläche ablaufen.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oberfläche einen Kontaktabschnitt auf einem ersten absorbierenden Material und einen Auffangabschnitt entweder auf besagtem ersten absorbierenden Material oder auf einem zweiten absorbierenden Material, das über einen Fluidfluss mit besagtem ersten absorbierenden Material in Kontakt steht, umfasst und wobei das zweite Element der zweiten Kopplungsgruppe an den Auffangabschnitt gebunden wird.
  8. Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten in einer Testprobe, umfassend: Bereitstellen mindestens einer Testmischung, umfassend: eine Testprobe, wobei die Testprobe potenziell einen Analyten enthält, einen Markerkomplex, wobei der Markerkomplex ein Partikel, einen Marker und ein erstes Element einer Kopplungsgruppe umfasst, und ein erstes Bindematerial, wobei das erste Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, und wobei das erste Bindematerial ein zweites Element der Kopplungsgruppe umfasst, Inkontaktbringen der mindestens einen Testmischung mit einer Oberfläche, in Bezug auf die ein zweites Bindematerial immobilisiert ist, wobei das zweite Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, der ein anderer Teil als der Teil des Analyten ist, für den das erste Bindematerial ausgewählt wird, Zulassen einer Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial und zwischen dem ersten und dem zweiten Element der Kopplungsgruppe, Nachweisen des Vorhandenseins oder der Menge des Markers auf der Oberfläche unter Verwendung einer Nachweisbaugruppe, und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge des Markers auf der Oberfläche mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Testprobe.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei besagtes Inkontaktbringen das Inkontaktbringen einer einzigen Mischung, die die Testprobe, den Markerkomplex und das erste Bindematerial einschließt, umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei besagtes Inkontaktbringen das Inkontaktbringen von zwei oder mehr Mischungen, die jeweils die Testprobe und/oder den Markerkomplex und/oder das erste Bindematerial einschließen, umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten Bindematerial und die Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Element der Kopplungsgruppe in der mindestens einen Testmischung ablaufen, bevor die mindestens eine Testmischung mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten Bindematerial und die Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Element der Kopplungsgruppe auf der Oberfläche ablaufen.
  13. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Oberfläche einen Kontaktabschnitt auf einem ersten absorbierenden Material und einen Auffangabschnitt entweder auf besagtem ersten absorbierenden Material oder auf einem zweiten absorbierenden Material, das über einen Fluidfluss mit besagtem ersten absorbierenden Material in Kontakt steht, umfasst und wobei das zweite Bindematerial an den Auffangabschnitt gebunden wird.
  14. Verfahren zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Analyten in einer Testprobe, umfassend: Bereitstellen mindestens einer Testmischung, umfassend: eine Testprobe, wobei die Testprobe potenziell einen Analyten enthält, ein Markerkonjugat, wobei das Markerkonjugat ein Partikel, einen Marker und ein erstes Bindematerial umfasst, wobei das erste Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, und ein zweites Bindematerial, wobei das zweite Bindematerial ausgewählt wird, um sich an einen Teil des Analyten zu binden, der ein anderer Teil als der Teil des Analyten ist, für den das erste Bindematerial ausgewählt wird, und wobei das zweite Bindematerial ein erstes Element einer Kopplungsgruppe umfasst, Inkontaktbringen der mindestens einen Testmischung mit einer Oberfläche, in Bezug auf die ein zweites Element der Kopplungsgruppe immobilisiert ist, Zulassen einer Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial und zwischen dem ersten und dem zweiten Element der Kopplungsgruppe, Nachweisen des Vorhandenseins oder der Menge des Markers auf der Oberfläche unter Verwendung einer Nachweisbaugruppe, und Korrelieren des Vorhandenseins oder der Menge des Markers auf der Oberfläche mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Testprobe.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei besagtes Inkontaktbringen das Inkontaktbringen einer einzigen Mischung, die die Testprobe, das Markerkonjugat und das zweite Bindematerial einschließt, umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei besagtes Inkontaktbringen das Inkontaktbringen von zwei oder mehr Mischungen, die jeweils die Testprobe und/oder das Markerkonjugat und/oder das zweite Bindematerial einschließen, umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei eine Testmischung, die das zweite Bindematerial umfasst, mit der Oberfläche unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die so wirken, dass sie eine Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Element der Kopplungsgruppe zulassen, und anschließend eine Testmischung, die die Testprobe und das Markerkonjugat umfasst, mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial in der mindestens einen Testmischung abläuft, bevor die mindestens eine Testmischung mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Reaktion zwischen jedem vorhandenen Analyten und dem ersten und dem zweiten Bindematerial auf der Oberfläche abläuft.
  20. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Oberfläche einen Kontaktabschnitt auf einem ersten absorbierenden Material und einen Auffangabschnitt entweder auf besagtem ersten absorbierenden Material oder auf einem zweiten absorbierenden Material, das über einen Fluidfluss mit besagtem ersten absorbierenden Material in Kontakt steht, umfasst und wobei das zweite Element der Kopplungsgruppe an den Auffangabschnitt gebunden wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 7, 13 oder 20, wobei besagtes Inkontaktbringen das Zulassen des Migrierens der Testmischung von dem Kontaktabschnitt zu dem Auffangabschnitt umfasst.
  22. Verfahren nach Anspruch 1, 8 oder 14, wobei die Oberfläche eine Filtriermembran umfasst.
  23. Verfahren nach Anspruch 8 oder 14, wobei besagte Kopplungsgruppe aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Antikörper-Antigen, Rezeptor-Ligand, Biotin-Streptavidin, Zucker-Lectinen und komplementären Oligonukleotiden besteht.
  24. Verfahren nach Anspruch 1, 8 oder 14, wobei jedes der besagten ersten und zweiten Bindematerialien ein Antikörper, ein Antigen, eine Nukleinsäuresequenz, ein Aptamer oder ein Zellrezeptor ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagte erste und zweite Kopplungsgruppen aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Antikörper-Antigen, Rezeptor-Ligand, Biotin-Streptavidin, Zucker-Lectinen und komplementären Oligonukleotiden besteht.
  26. Verfahren nach Anspruch 1, 8 oder 14, wobei besagter Analyt ein Zielnukleinsäuremolekül ist, besagtes erstes Bindematerial eine erste Reportersonde ist, die ausgewählt wird, um mit einem Teil besagten Zielnukleinsäuremoleküls zu hybridisieren, und besagtes zweites Bindematerial eine zweite Reportersonde ist, die ausgewählt wird, um mit einem Teil besagten Zielnukleinsäuremoleküls zu hybridisieren, der ein anderer Teil als der Teil besagten Zielnukleinsäuremoleküls ist, für den besagte erste Reportersonde ausgewählt wird.
  27. Verfahren nach Anspruch 3, 10 oder 16, wobei die zwei oder mehr als zwei Mischungen hintereinander in Kontakt gebracht werden.
  28. Verfahren nach Anspruch 3, 10 oder 16, wobei die zwei oder mehr als zwei Mischungen im Wesentlichen gleichzeitig in Kontakt gebracht werden.
  29. Verfahren nach Anspruch 1, 8, 14 oder 26, wobei besagtes Zielnukleinsäuremolekül in einem Organismus vorkommt, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Bakterien, Pilzen, Viren, Einzellern, Parasiten, Tieren und Pflanzen besteht.
  30. Verfahren nach Anspruch 1, 8 oder 14, wobei besagtes Partikel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Liposomen, Latexkügelchen, Goldpartikeln, Siliziumdioxidpartikeln, Dendrimeren, Quantenpunkten und magnetischen Kügelchen besteht.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei besagtes Partikel ein Liposom ist, besagter Marker in besagtem Liposom eingekapselt ist und besagtes Verfahren ferner das Auflösen besagten Liposoms nach besagtem Inkontaktbringen und vor besagtem Nachweisen umfasst.
  32. Verfahren nach Anspruch 1, 8 oder 14, wobei besagter Marker einen elektroaktiven Marker umfasst.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei besagter elektroaktiver Marker ein reversibles Redoxpaar ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 1, 8, 14 oder 32, wobei besagte Nachweisbaugruppe eine elektrochemische Nachweisbaugruppe ist.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei besagte elektrochemische Nachweisbaugruppe eine Elektrodengruppierung umfasst, umfassend einen ersten Leiter, der eine Mehrzahl von Fingern aufweist, und einen zweiten Leiter, der eine Mehrzahl von Fingern aufweist, wobei besagte Finger besagten ersten Leiters mit besagten Fingern besagten zweiten Leiters verzahnt sind, besagte erste und zweite Leiter über eine Spannungsquelle und eine Anzeigeeinrichtung elektrisch aneinander angeschlossen sind und besagte Gruppierung positioniert ist, um Redoxzyklen des elektroaktiven Markers zu induzieren.
  36. Verfahren nach Anspruch 1, 8 oder 14, wobei besagter Marker einen optischen Marker umfasst.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei besagte Nachweisbaugruppe eine optische Nachweisbaugruppe ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 1, 8 oder 14, wobei die Oberfläche eine Membran umfasst.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei das Verfahren das Hindurchleiten der mindestens einen Testmischung durch die Membran umfasst.
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