JPH02308800A - 遺伝子診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 （Ｍ梁上の利用分野） 本発明は、特定の遺伝子断片が組み込まれた遺伝子を検
出する遺伝子診断方法に関する。

（従来の技術） 、遺伝子（ＤＮＡ）に刻み込まれた遺伝情報は、メツセ
ンジャーＲＮＡを介して蛋白質あるいは酵素として表現
される。この蛋白質や酵素の働きにより、様々な化合物
が生成され、それらの集合体として生物が存在している
わけである。ヒトの遺伝子の総数は５万〜ｌＯ万といわ
れているが、それらの遺伝子の中に何等かの異常や変化
［例えば。

欠損・重複など］が生じると、生成される蛋白質の特性
・種類・量などが変化し、結果として生体系のバランス
が崩れ疾病を引き起こすことになる。

したがって、逆に病因となっている遺伝子を検出するこ
とにより、疾患の同定や予防ができることになる。この
ような遺伝子診断が、近年の遺伝子工学の進歩に伴って
可能となってきた。

従来の診断方法と比較して遺伝子診断にはいくつかの特
色がある。まず遺伝子発現の機構を考えると、殆どの生
化学的なレベルでの変化に先行して遺伝子上での変化が
生じていることが推定される。したがって遺伝子診断で
は、病気という表現型での変化に先だって（すなわち、
発症前や病気の潜伏期あるいは極めて初期）、診断や予
測ができることが大きな特色である。また、遺伝性の疾
患に関しては、生体内の細胞では全く遺伝子は同一であ
るので、分析する臓器や組織には依存しないことも特色
の一つである。このことは、特に胎児での診断では重要
であり、妊婦から羊水を採取し羊水中に浮遊している胎
児の細胞を調べるだけで診断できる。

現在行なわれている一般的な遺伝子診断方法は１＋ クレヂオド配列を持つ遺伝子プローブを用意する。

オナ リヌクレｆＩド配列は各ヌクレオチドに含有される塩基
の配列によって決定される。塩基の種類としては、Ａ（
アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チ
ミン）またはＵ（ウラシル）の４種類があり、ＡとＴま
たはＵ、ＧとＣは対になって水素結合を作る。ポリヌク
レオチド配列が相補的であるとは、互いに対になる塩基
が対称的に配列されている２つのポリヌクレオチド配列
のことをいう。このような互いに相補的なポリヌクレオ
チド配列を持つ遺伝子同志は、二本鎖を形成してハイブ
リダイズすることが可能である。また糖の種類により遺
伝子がＤＮＡであるかＲＮＡであるかが決定される。

前述した遺伝子プローブには、あらかじめラベル剤とし
て３！Ｐ等の放射性同位元素を導入しておく１次に試料
から遺伝子を抽出し、熱処理、アルカリ処理等の処理に
より一本鎖の遺伝子を！１ＩＪｉ１！シた後、必要があ
れば適当な制限酵素で切断し、電気泳動後ニトロセルロ
ースのメンブレンフィルター上に固定する。次いで上記
した遺伝子プローブを、目的とするノ遺伝子断片が組み
込まれた遺伝子とメンブレンフィルター上でハイブリダ
イズさせ、ハイブリダイズしなかった遺伝子プローブを
分離した後、オートラジオグラフィーを行ない目的とす
る遺伝子断片の有無を確認する。

この方法はサザンプロット法と呼ばれるが、サザンプロ
ット法では検出感度が高く安定した診断結果が得られる
反面、放射性同位元素を使用することから診断場所が限
定され、試薬の取扱いにも十分注意しなければならない
という問題点があった。この点を改善するために、放射
性同位元素に代わる安全なラベル剤の開発が望まれてい
る。例えば特開昭６３−　ｚｊｓｓＧｓ号には、ラベル
剤として標識物質が封入されたリポソームを用いたもの
が示されている。しかしながらこの方法では、遺伝子プ
ローブをハイブリダイズさせるときの加熱の際に、リポ
ソームが熱に弱いため破壊される可能性が高く、信頼性
が乏しかった。

（発明が解決しようとする課り 上述したように、放射性同位元素を用いるサインプロッ
ト法では診断場所が限定され、試薬の取扱いにも注意し
なければならないという問題点かあフた。これに対し、
ラベル剤としてｉＲ識物質が封入されたリポソームを用
いる方法が提案されたが、遺伝子プローブをハイブリダ
イズさせるときの加熱によりリポソームが破壊されるお
それがあり、実用化に至らなかった。

本発明はこのような問題を解決するためになされたもの
であり、信頼性が高くかつ安全な遺伝子診断方法を提供
することを目的とする。

ド配列を持つ遺伝子プローブと、二本鎖の遺伝子との抗
原抗体反応性を有する生理活性物質が表面に固定化され
標識物質が封入されたリポソームからなる遺伝子診断用
試薬とを用いる遺伝子診断方法であって、試料中の遺伝
子を処理して二本鎖の遺伝子を一本鎖の遺伝子に変性せ
しめる第一の工程と、第一の工程の後、試料に前記遺伝
子プローブを加え被検物質である遺伝子断片が組み込ま
れた遺伝子とハイブリダイズさせる第二の工程と、前記
遺伝子プローブがハイブリダイズすることにより形成さ
れた二本鎖の遺伝子と前記遺伝子診断用試薬とを反応さ
せる第三の工程と、第三の工程の後、未反応の遺伝子診
断用試薬を試料より分離する第四の工程と、第四の工程
の後、試料中に残留した遺伝子診断用試薬に含有される
ｍ織物質を検出する第五の工程とからなる遺伝子診断方
法である。

さらには、被検物質の遺伝子断片が持つポリヌクレオチ
ド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を持ち抗原及び
ハプテンの少なくとも一種が導入された遺伝子プローブ
と、この遺伝子プローブとの抗原抗体反応性を有した生
理活性物質が表面に固定化されｐｐｍ物質が封入された
リポソームからなる遺伝子診断用試薬とを用いる遺伝子
診断方法であって、試料中の遺伝子を処理して二本鎖の
遺伝子を一本鎖の遺伝子に変性せしめる第一の工程と、
第一の工程の後、試料に前記遺伝子プローブを加え被検
物質である遺伝子断片が組み込まれた遺伝子とハイブリ
ダイズさせる第二の工程と、ハイブリダイズしなかった
遺伝子プローブを試料より分離する第三の工程と、第三
の工程の後、ハイブリダイズした遺伝子プローブと前記
遺伝子診断用試薬とを反応させる第四の工程と、第四の
工程の後、未反応の遺伝子診断用試料を試料より分離す
る第五の工程と、第五の工程の後、試料中に残留した遺
伝子診断用試薬に含有されるＩ５Ｉ識物質を検出する第
六の工程とからなる遺伝子診断方法である。すなわち本
発明の遺伝子診断方法においては、ラベル剤として標識
物質が封入されたリポソームが用いられているが、前記
リポソームは遺伝子プローブ中に導入されているのでは
なく、遺伝子診断試薬中に存在していることを特徴とし
ている。

本発明に係る遺伝子プローブは、目的とする遺伝子断片
が持つポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチ
ド配列を持つＤＮＡまたはＲＮＡである。遺伝子プロー
ブの長さは、短がすぎると精度の良い診断が困難となり
、長ずざると取扱いが困難となるので、適当な長さの遺
伝子プローブが、診断が行なわれる条件を考慮しつつ決
定されることがより望ましい６本発明では、このような
遺伝子プローブに抗原及びハプテンの少なくとも一種を
導入することもできる。ただしハプテンとは、抗原決定
基を有し、蛋白質のような高分子物質と結合したときに
抗原となる物質のことである。

この場合は遺伝子診断用試薬として、前記抗原及びハプ
テンの少なくとも一種を特異的に認識する生理活性物質
が固定化されたリポソームを利用できる。

本発明に係るリポソームにおいて、リポソームの主要構
成成分としては、リン脂質及び糖脂質のうち少なくとも
いずれが一方が用いられる１本発明ではリン脂質及び糖
脂質は特に限定されるものではなく、たとえばジパルミ
ト・品オスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミト
イルフオスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、
ジオレオイルフオスファチジルエタノールアミン（ＤＯ
ＰＥ）、ジミリストイルフオスファチジルエタノールア
ミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルフオスファチジルエ
タノールアミン（ＤＳＰＥ）などが挙げられる。リポソ
ームの安定化を考慮すると、これらリン脂質、糖脂質の
脂肪酸炭素鎖は炭素原子数が１２〜１８であることが好
ましく、さらに偶数であることがより好ましい、なお、
によってより安定なリポソーム試薬を調製することがで
きる。また複数種の脂質を混合して用いることもできる
。

本発明の遺伝子診断用試薬において、リポソーム内に封
入される標識物質としては、親水性でリポソーム外に流
出した際に定量可能な物質が選択される。このような物
質としては、例えば高濃度では自己消光により蛍光を示
さないが、低濃度（１０−３Ｍ以下）で非常に強い蛍光
を発するカルボキシフルオレセインのような蛍光性物質
；リポソーム外で酸化反応により発光するルミノールや
ルシフェリンのような発光性物質；可視域又は紫外域に
特異的な吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）
；酸化酵素の作用により分解され、酸素消費又は過酸化
水素生成をもたらすグルコース。

シュークロース等の糖類及びそれらの酸化酵素；テトラ
ペンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化
合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
）のような補酵素類；メチヅビオロゲンなどのラジカル
化合物等が挙げられる。これらの化合物は、検出方法、
感度及びリポソームの安定性等の因子を考慮したうえで
適宜選択される。

本発明の遺伝子診断用試薬において、リポソームの表面
に固定化される生理活性物質としては抗体を利用するこ
とができるが、該抗体としては、ＩｇＧ、　ＩｇＥ、　
ＩｇＤ、ＩｇＡ、　ＩｇＭなどのいかなる免疫グロブリ
ンクラスに属するタンパク質であっても良い。なお、感
度の向上という点からは、ポリクローナル抗体よりもモ
ノクローナル抗体を使用することが好ましい。また、抗
体のＦｃ部分を除去してλｂ′ 得られるＦ（≠）２等、抗体の一部でも良い。

本発明の遺伝子診断用試薬において、生理活性物質のリ
ポソームの表面への固定化の際は、リポソームを形成す
るリン脂質、糖脂質に生理活性物質を直接固定化するこ
とは困難である。このためリポソームと生理活性物質を
仲介する適当な固定剤を用いることが望ましい。このよ
うな固定剤とジ゛ しては、Ｎ−サクシンイミヅル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ｓｐｏｐ）、Ｎ−サクシンイミジ
ル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰ
Ｂ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｐ−マレイミドフェ
ニル）アセテート（ＳＭＰＡ）、　Ｎ−サクシンイミジ
ル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート（Ｓ
ＭＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サク
シンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロ
イルオキシ）サクシンイミド（ＥＭＣ３）等の架橋剤、
０−ブロモアセチル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（
ＯＢＮＩＩＳ）　。

ク シアノーゲンブロミド（ＣＮＢｒ）　、エビダロロヒド
リン（Ｅｌ＋）等の脂質活性剤等の中より、用いる脂質
及び生理活性物質の種類等を考慮して、適宜選択すれば
良い。また固定化される生理活性物質は未処理でも良い
が、　−５Ｈ基を導入する方がより好ましい。−３Ｈ基
を導入するには、ペプシン等の酵素による処理、還元処
理、５ＰＤＰ等の架橋剤による処理等が適用できる。さ
らにリポソームと生理活性物質との間には、上述したよ
うな固定剤とは別に直鎖状Ｖ炭素長鎖等によりなるスペ
ーサーを介しても良い。ただしスペーサーとは、リポソ
ームと生毛 理活性物質との間の距離を寿令くするためのものであり
、スペーサーを用いれば立体障害が少なくなるため、該
生理活性物質が関与する抗原抗体反応が起こり易くなり
、より精度のよい診断を行なうことが可能となる。

以下に１本発明の遺伝子診断方法を詳細に説明する。こ
こでは、遺伝子プローブに抗原及びハブテンの少なくと
も一種が導入されず、二本鎖の逍伝子との抗原抗体反応
性を有する生理活性物質が表面に固定化され標識物質が
封入されたリポソームからなる遺伝子診断用試薬を用い
る場合について示す。

まず試料となる遺伝子を適当な制限酵素で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動によりその長さにしたがって分画し
た後、ゲルをアルカリ溶液中に浸牲 して、二本鎖の遺伝子を変域′させ一本鎖の遺伝子を調
製する。次に、ドツトプロット装置を用いて試料の遺伝
子をニトロセルロースのメンブランフィルタ−上に移動
、固定化する０次に、本発明に係る遺伝子プローブをメ
ンブランフィルタ−上の遺伝子と反応させる。このとき
目的とする遺伝子断片が組み込まれた遺伝子が存在すれ
ば、前記遺伝子プローブが該遺伝子とハイブリダイズす
る。

なおこの反応は、試料の遺伝子及び用いる遺伝子プロー
ブにもよるが、通常６５℃程度に加熱して行なわれる。

さらに必要に応じて、メンブランフィルタ−を同程度の
温度の適当な緩衝液で洗浄し。

未反応の遺伝子プローブを分離する０次いで、本発明に
係る遺伝子診断用試薬を加えて恒温槽中で一定時間反応
させた後、適当な緩衝液で洗浄して未反応の遺伝子診断
用試薬を分離する。このときハイブリダイズした遺伝子
プローブがあれば、メンブランフィルタ−上に二本鎖の
遺伝子が存在するので、この二本鎖の遺伝子と、遺伝子
診断用試薬中の生理活性物質との間で、抗原抗体反応が
起こる。この後適当な試薬を加えて、試料中に残留する
遺伝子診断用試薬を構成するリポソームを破壊して、リ
ポソームに封入されていた標識物質の流出を適当な方法
で測定する。このようなリポソームの破壊は、水等の液
体を加えリポソーム内外の浸透圧の差を利用する方法、
トライトンＸ１００等の界面活性剤を用いてリポソーム
を溶解する方法、リポソームを含む試料を加熱する方法
等を用いれブ ば良い。またここでは、ドットプロット法によりブロッ
ティングする方法を示したが、本発明ではウェスタンプ
ロット法等他のプロット法を用いることもできる。

上述したような本発明の遺伝子診断方法は、ラベル剤が
導入された遺伝子プローブを用いる直接法ではなく、遺
伝子プローブがハイブリダイズした後に、さらにラベル
剤が導入された遺伝子診断用試薬を結合せしめる間接法
である。従って、リポソームを用いた従来の方法のよう
に未反応リポソームが、遺伝子プローブをハイブリダイ
ズせしめる際の加熱によって破壊されるおそれがなく、
目的とする遺伝子断片が組み込まれた遺伝子を信頼性高
く検出することができる。なお抗原及びハブテンの少な
くとも一種が導入された遺伝子プローブを用いる場合も
同様である。ただしこのときの抗原抗体反応は、抗原ま
たはハプテンが導入された遺伝子プローブと、遺伝子診
断用試薬中の生理活性物質との間で起こる。またこの場
合は、洗浄による未反応の遺伝子プローブの分離を必ず
行なう必要がある。この理由は、上述したように抗原抗
体反応が遺伝子プローブと遺伝子診断用試薬と上 の間で起こるので、このような洗浄が行なわなければ、
試料中に残留する未反応の遺伝子プローブと遺伝子診断
用試薬が反応してしまい、精度の良い診断結果が得られ
なくなるからである。

また本発明の遺伝子診断用試薬と被検遺伝子を含む試料
との、充分な反応に要する時間・温度・ｐｌ＋などの反
応条件は、被検遺伝子及び用いる遺伝子プローブの種類
（長さ・塩基配列など）、遺伝子診断用試薬の特性、さ
らには遺伝子診断用試薬を構成するリポソームに固定化
された生理活性物質の種類、量、純度などによって異な
る。このため、個々の場合に応じて、最適反応条件を設
定することが望ましい。

（実施例） 以下、本実施例を説明する。

本実施例において用いた試薬のうち、ジパルミリ トイルフオスファチジルｙン（ｏｐｐｃ）、ジパルミト
イルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、
コレステロールはシグマ社製のものを用いた。他の試薬
は市販品（特級）を精製せずに使用した。なお、水は全
てイオン交換水を用いた。

実施例−１ ■遺伝子診断用試薬の調製 ■リポソームの調製 以下に示す方法で、固定剤としてＢｒＡｃ　（ブロモア
セチル）基が導入され、標識物質としてカルボキシフル
オレセインが封入されたＤＰＰＨ及びＤＰＰ（１：から
なるリポソームを調製した。

（ａ）ＩｌｒＡｃ基の導入 ５−アミノ吉草酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）　１．１７ｇ
　［１０ミリモル］にトリエチルアミン（ＴＥＡ）　３
ｄ　［約２０ミリモル］及び水１０ｄを加えて溶解した
。これにアミノ基の保護基となるＢｏａ−ＯＮ　（ペプ
チド研究新製）２．７ｇ［１１ミリモル］をジオキサン
１０ａＱに溶解した溶液を添加し、室温で３時間撹拌し
た１反応後、反応液をロータリーエバポレータで濃縮し
、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、５％ク
エン酸水溶液の順で抽出・精製した。最後に、無水硫酸
ナトリウムで脱水し、低温で結晶化させてＢｏｃ−５−
アミノ吉草酸を得た。収率は７０％であった。

前記Ｂｏａ−５−アミノ吉草酸０．２３ｇ　［１ミリモ
ル］をクロロホルム２０ｍＡに溶解し、Ｎ−ヒドロキシ
サクシンイミド（ＨＳＩ：ペプチド研究所ｍり　０．１
３ｇ［１，１ミリモルコ及びジシクロへキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣＤ　；ペプチド研究新製）　０．２５ｇ
［１，２ミリモルコを添加した後、室温で３時間撹拌し
た１反応後、ベ ロータリーエバポレータで溶媒を除去し、生成物に酢酸
エチル３０ａｌｌを加えて溶解し、濾過して沈殿物を除
去した。再び溶媒を除去し、生成物をクロロホルム５ｄ
に溶解し、　Ｂｏｃ−５−アミノ吉草酸サクシンイミド
エステル溶液［約０．２ミリモル／ｍＩＱと仮定］とし
て以下の反応に使用した。

ＤＰＰ２７０■［１００マイクロモル］をクロロホルム
と ２０ｄに懸濁し、　ＴＥＡ　５ｏｔｔｘ及び前記Ｂｏａ
−５−アミノ吉草酸サ吉草酸サクシエイミドエステル溶
液［約２００マイクロモル］を加え、２０℃で一晩撹拌
・反応させた。

反応後、メタノール及び３％クエン酸水溶液を用法に、
生成物に１Ｍ塩酸／酢酸１．５ｄを加えて溶解し、３７
℃で１時間放置した。これをロータリーエバポレータで
濃縮した後、繰り返しメタノール及びクロロホルムで洗
浄し、塩酸及び酢酸を除去した。

次いで、シリカゲルの分取用薄層クロマトグラフィー　
（＄５７１７．　Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、クロロホル
ム／メタノールエフ／３混合溶媒を展開溶媒として、Ｎ
Ｈ□−Ｃ，−ＤＰＰＥを精製した。なお、　−ＮＨ，基
とＤＰＰＨの間に存在する炭素数５の炭素鎖は、スペー
サーとして機能している。収率は６０％であった。

さらにブロモ酢酸１４０ｍｇ［１ミリモル］をクロロホ
ルム３０ｍＱに溶解し、＋ｌＳＩ　１４０ｍｇ［１，２
ミリモル］及びＤＣＣＤ２５０■［１，２ミリモル］を
添加し、室温で３時間反応させた後、ロータリエバポレ
ータで溶媒を除去し、酢酸エチル３０−を加えた。生じ
た白色沈殿を濾別し、再び溶媒を除去した後、クロロホ
ルム１０ｍＱに再溶解させた。

次に、　　ＮＨ□−Ｃ，−ＤＰＰＥのクロロホルム溶液
約１０ｍＱと ［５０マイクロモル］に前記溶液１１ｄ及びＴＥＡ　５
ｏｄＱを加え、室温で１晩反応させた１反応後、溶媒を
濃縮し２分取用薄層クロマトグラフィーを用い、クロロ
ホルム／メタノール＝７７３混合溶媒を展開溶媒として
、生成物のＢｒＡｃ−ＮＨ−Ｃ，−ＤＰＰＥを精製した
。

収率は５０％であった。生成物はＩＩＩＭの濃度になる
ようにクロロホルムで希釈した。

（ｂ）カルボキシフルオレセインの封入ｏｐｐｃ及びコ
レステロールをクロロホルム／メタノール（２／ｌ）混
合溶媒に溶解して、　　５ｍＭのＤＰＰＣ溶液及び１０
＋ａＭのコレステロール溶液を調製した。

と び５ｍＭのステアリルアミンｚ５４ｔｔを、　１０ｍ１
ｌ容量のナシ型フラスコに入れ、更にクロロホルム２Ｉ
ＩＬＱを加えてよく混合した１次いで、約４０℃の水浴
中でロータリーエバポレータにより溶媒を除去した。再
びクロロホルム約２−を加えて十分に撹拌した後、再度
ロータリーエバポレータにより溶媒を除去した。この操
作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成さ
れた。続いて、フラスコをデシケータ中に移して真空ポ
ンプで約１時間吸引することにより溶媒を完全に除去し
た。

次いで、０．２Ｍのカルボキシフルオレセイン（イース
トマンヅダック社製、ｐＨ７，４：以下、　ＣＦとハ 記す）　１ｏ　ｏｉｔｔ、を添加し、フラスコ内部を窒
素で置換した後、密栓して約６０℃の水浴中に約１分間
ヶ潰した。続いて、Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、フラ
スコ壁面の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを激
しく振盪した。この操作により多重層リポソーム懸濁液
が調製された。更に、リポソーム懸濁液に０．０１Ｍの
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＯＪｔ％　ＮａＣ１含有、ｐＨ７，
４５：以下、ｌｌＢｓと記す）を少量添加した後、全て
遠心チューブに移し、４℃において１５０００ｒｐｍで
２０分間遠心する操作を数回繰り返した。最後に、　１
０ｍＭのホＬ つ酸緩新液（ＰＨ９，０，０，８５％Ｎａｕ含有：以下
、ＢＢＳと記す）でセラムチューブ（コーニング社製）
に得られたリポソームを移し、１度遠心分離して上澄を
除去した後、後述するモノクローナル抗−二ｂ′ 重鎖ＤＮＡ抗体（Ｆａｖ）の固定化反応に使用するまで
冷蔵庫に保存した。

■遺伝子診断用試薬の１ｉ１１１１１ 以下に示す方法により、二本鎖の遺伝子と抗原抗体反応
性を有する生理活性物質としてモノクローナル抗−二本
鎖ＤＮＡ抗体が表面に固定化され、標識物質としてＣＦ
が封入されたリポソームからなる遺伝子診断用試薬を調
製した。

（ａ）モノクローナル抗−二本鎖ＤＮＡ抗体の修飾 モノクローナル抗−二本鎖ＤＮＡ抗体（ケミコン社製）
１００昨を０．ＩＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）で透析
し、ペプシン（シグマ社ＩＩ）　１０ｆｊｇを添加し、
３７℃で１時間反応させた０次に、高速液体クロマ「 トゲラフイーによりＦ　（ａ　Ｖ）ｚ分画のみを分取し
た。

に のＦ（ａＮ）、分画［０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
（１）中］にメルカプトエチルアミン・塩酸塩ｌＯ■を
加え３７℃で９０分間反応させ、ゲル濾過（セファデッ
クスＧ−２５使用、ＢＢＳ）により遊離のＳＨ基を含有
したタンｂ′ バク分画（Ｆｅｂ’　）のみを分取した。このタンパク
分画の溶液の容量は０．５ｄ、濃度はＯＤ（吸光度）２
８０ｎｍ＝１であった・ ｂ′ （ｂ）モノクローナル抗−二本鎖ＤＮＡ抗体（Ｆａｎ）
のリポソームの表面への固定化 ｂ′ ■で調製したリポソームの懸濁液と前記Ｆａｎの溶液と
を混和し、２０℃で４４時間撹拌反応させた。

反応後、ゼラチン・ペロナール緩衝液（以下、　ＧＶＢ
−″と記す）で３回洗浄した。最後に、得られた遺伝子
診断用試薬をＧＶＢ−２−に懸濁させて使用するまで４
℃で保存した。

■遺伝子診断用試薬の評価 ！で調製した遺伝子診断用試薬を遺伝子検出ｌ使用する
に先立ち、リポソームの表面に確かに生理活性物質が固
定化されていることを確認するために免疫分析を行なっ
てみた。固定化した生理活性物質はマウス由来であり、
免疫グロブリンクラスＩｇＧに属するタンパク質である
ので、免疫分析はウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体を用いて
以下に示す方法で行なった。

Ｌ 予め、　ＧＶＢ”　（ＧＶＢ−ニ０．５＋ａＭ　Ｍｇｅ
４．及び０．１５ｄＣａＣＱ、を添加したもの）でウサ
ギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社製）を１０〜１０
ｍ倍に希釈しておいた。こ、μ れらの溶液１０φに、前記遺伝子診断用試薬の１０倍７
μ 希釈溶液ｔｏ１ｇ、及び補体（モルモット血清；補体μ 価＝　２５（１）の８０倍希釈溶液５０ヅ２を添加し、
３７℃で３０分間反応させた０反応後、Ｏ，ＯＩＭのＥ
ＤＴＡ−ベロナた 一ル緩新液ｘｏｏｄａで反応を停止させ、各濃度のウサ
ギ抗−マウスＩｇＧ抗体溶液について、流出したＣＦ量
を蛍光分光光度計（ＭＴＰ−３２，コロナ電気ＩＩ）に
より励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍの条件で
測定した。

そして、次式に基づいて相対蛍光強度を計算した。

Ｆａ　−Ｆ。

相対蛍光強度（Ｌｙｓｉｓ）　＝−Ｘ　１００（％）Ｆ
ａ　−Ｆ。

ここで、Ｆｅ：実測した蛍光強度、Ｆｏ：ウサギ抗−マ
ウスＩｇＧ抗体を除いたとき（リボクームが全く破壊さ
れていないとき）の蛍光強度、ＦａＳ脱イオン水を添加
してリポソームそ全で破壊したときの蛍光強度である。

なお、標準値として１０−７及び１０１ＭのＣＦ温溶液
蛍光強度を用いた。

この測定結果を第１図に示す、モノクローナル反応後、
補体の働きによりリポソームが破壊されＣＦが流出する
はずである。第１ｖ！ｉから明らかなように、得られた
相対蛍光強度はＣＦの流出があったことを示しており、
■で調製した遺伝子診断用試薬は、リポソームの表面に
モノクローナル抗−二本鎖ＤＮＡ抗体が固定化されてい
ることが確検出 ■で調製した遺伝子診断用試薬を用いて、ドツトプロッ
トとしたヒト血清中の遺伝子からＨＢＶ遺伝子を検出し
てみた。試料は、第１表に示した１０検体より採取した
血清を用いた。またＨＢＶ遺伝子に対する遺伝子プロー
ブは、市販品（ライフテクノロジー社製）を使用した。

まず試料中の遺伝子を適当な制限酵素で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動によりその長さにしたがって分画した
後、ゲルをアルカリ溶液中に浸して、二本鎖の遺伝子を
変成させ一本鎖の遺伝子を＋１ＩＪＩ！した。次に、ド
ツトプロット装置を用いて試料の遺伝子をニトロセルロ
ースのメンブランフィルタ−上に移動、固定化した１次
に温度を６８℃に設定して、メンブランフィルタ−の各
スポット上に前記遺伝子プローブを添加した。この後で
、１０倍にＧＶＢ−で希釈した前記遺伝子診断用試薬の
懸濁液１０μ ＆ａをメンブランフィルタ−の各スポット上に添加し、
３７℃で３０分間インキュベートした０反応後。

μ ｘｏｏ、２ｆＱのＧＶＢ−で洗浄し未反応の遺伝子診断
用試薬μ を洗い流した１次いで、５０自の水を加えて遺伝子と反
応した遺伝子と反応した遺伝子診断用試薬を破壊して、
前記の蛍光分光光度計を用いて流出したきたＣＦ量を測
定した（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｒｕ＋＋
）　＠第１表に、１０検体のそれぞれについて得られた
相対蛍光強度を示す、この内＃１〜７は肝炎患者、＃８
〜１０は正常人の血清試料を示している。第１表から明
らかなように、肝炎患者のみからＨＢＶ遺伝子が検出さ
れたことになる。また。

標準のＨＢＶ遺伝子を用いて本実施例に係る遺伝子診断
用試薬の検出感度を検定したところ、約１ｐｇから検出
可能であり、放射性同位元素が導入された遺伝子プロー
ブを用いヅるサザンプロット法とほぼ等感度であること
が確認された。

第１表 実施例−２ 実施例−１で用いた遺伝子プローブ中のアミノ基にトリ
ニトロトルエンスルフォン酸を反応すせ、ハプテンとし
てトリニトロフェニル（ＴＮＰ）製 基が導入された遺伝子プローブを調整した。遺伝子診断
用試薬は、モノクローナル抗−二本ＪｌｉＤＮＡ抗体の
かわりにこのＴＮＰに対応するモノクロール抗体を用い
た以外は、実施例−１の場合と同様にして調製した。実
施例−１で検出した試料に対し、上述した遺伝子プロー
ブ及び遺伝子診断用試薬からなる遺伝子診断用キットを
用いて、実施例−１と同様の診断を行なったところ、実
施例−１とほぼ同様な結果が得られた。

〔発明の効果〕

以上詳述したように本発明によれば、信頼性が高く高感
度でしかも安全に、目的とする遺伝子断片が組み込まれ
た遺伝子の検出を行なうことが可能な遺伝子診断方法を
提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は演施例−１の遺伝子診断用試薬とウサギ抗−マ
ウスＩｇＧ抗体希釈液との反応による相対蛍光強度を示
す特性図である。 代理人　弁理士　則　近　憲　佑 同　　松山光之

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）被検物質である遺伝子断片が持つポリヌクレオチ
   ド配列と相補的なポリヌクレオチド配列を持つ遺伝子プ
   ローブと、二本鎖の遺伝子との抗原抗体反応性を有する
   生理活性物質が表面に固定化され標識物質が封入された
   リポソームからなる遺伝子診断用試薬とを用いる遺伝子
   診断方法であって、 試料中の遺伝子を処理して二本鎖の遺伝子を一本鎖の遺
   伝子に変性せしめる第一の工程と、第一の工程の後、試
   料に前記遺伝子プローブを加え被検物質である遺伝子断
   片が組み込まれた遺伝子とハイブリダイズさせる第二の
   工程と、前記遺伝子プローブがハイブリダイズすること
   により形成された二本鎖の遺伝子と前記遺伝子診断用試
   薬とを反応させる第三の工程と、第三の工程の後、未反
   応の遺伝子診断用試薬を試料より分離する第四の工程と
   、第四の工程の後、試料中に残留した遺伝子診断用試薬
   に含有された標識物質を検出する第五の工程とからなる
   遺伝子診断方法。
2. （２）抗原及びハプテンの少なくとも一種が導入された
   請求項１記載の遺伝子プローブと、前記遺伝子プローブ
   との抗原抗体反応性を有した生理活性物質が表面に固定
   化され標識物質が封入されたリポソームからなる遺伝子
   診断用試薬とを用いる遺伝子診断方法であって、 試料中の遺伝子を処理して二本鎖の遺伝子を一本鎖の遺
   伝子に変性せしめる第一の工程と、第一の工程の後、試
   料に前記遺伝子プローブを加え被検物質である遺伝子断
   片が組み込まれた遺伝子とハイブリダイズさせる第二の
   工程と、ハイブリダイズしなかった遺伝子プローブを試
   料より分離する第三の工程と、第三の工程の後、ハイブ
   リダイズした遺伝子プローブと前記遺伝子診断用試薬と
   を反応させる第四の工程と、第四の工程の後、未反応の
   遺伝子診断用試薬を試料より分離する第五の工程と、第
   五の工程の後、試料中に残留した遺伝子診断用試薬に含
   有される標識物質を検出する第六の工程とからなる遺伝
   子診断方法。