JPH01163664A - 悪性腫瘍及び／又はビールス性疾患の診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は生体から採取した体液中のプテリジン含量を
体外に於いて測定して、人体または動物体の悪性Ｍ及び
ビールス性疾患を、殊に早期検出する診断薬に関する。

現在悪性腫瘍の診断は専ら臨床的、放射線学的、内視鏡
的、解剖学的又は生化学的調査によって行われている。

悪性腫瘍についての確実な予見を可能ならしめる様な臨
床化学的又は生化学的な知見は今日までなお存在してい
ない。ただ内分泌学的に作用しホルモン分泌を増大する
潰瘍の場合については、成る程、血清や尿中のホルモン
を定量的に測定することにより重要な診断的示唆が得ら
れる。しかしホルモン値の増大は必すしも悪性の新生物
（Ｎｅｏｐｌａｓｍ）と関連しておらす、別の病気の場
合にでも出現する。

近時、例えば癌胎生的（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎ
ａｌ　）な抗原（ＣＥＡ）又はα−フェトプロティンの
様な腫瘍と関連する抗原の測定もまた、ある程度の価値
を持って来ている。

これら抗原は一方では腫瘍次第で、腫瘍患者の精々僅か
に３０〜９０％の範囲で高まるものであり、他方他の疾
病患者の場合にも値が高まるから、この試験法の実用価
値は極めて限られている。

体液中の特定のプテリジン含量を測定することによる腫
瘍検診は、未た実際には使用されていないけれとも将来
役に立ちそうに思われる。ココリスやチーグラーは腫瘍
患者の血清にテトラヒドロビオプテリン値の増大を見出
した０＋：ｏＫｏｌｉｓ、　Ｎ、及びＺｉｅｇｌｅｒ　
Ｊ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

１９７７、　Ｖｏｌ、　２．　ｐｐ、　７９−８５）。

ハルベルン等の研究によると悪性細胞の組織培養中に、
前辺って葉酸を投与すると、その後、６−ヒトロキンメ
チルプテリンが増量する（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　３８，２３７−２３８４．１９７８）。

今、驚くへきこ七にビールス性疾病の場合にも特定のプ
テリジンが増量しており、それが体外で証明できること
が見出された。

ビールス性疾病の臨床的な試験室診断法は現在では、本
質的に３つの原則によっている。

１）病人のビールスを分離し、培養し且つ確認すること
（試験期間約６週間）。

２）病人の血清又は体液のビールス特異抗体を証明する
こと（試験期間約３週間）。

３）病人の細菌を培養し確認すること。その結果がマイ
ナスに出た場合は、細菌による疾病ではなく、ビールス
性疾患であると推定すること（間接証明、試験期間２〜
３日、反復試験の要あり）。

１）項の方法は「マジョールビールス診断」とも呼ばれ
るが、金がかかるし・冑も折れる。その方法は臨床にと
つて必すしも満足なものでない。即ち、例えば上気道の
羅患や４膜大脳炎徴候群を明らかにしなければならない
ときなとか、その例である。分離や確認はその様な状況
では個々の場合にとって決して診断の助けにならない。

というのは、その結果が余りにもおそくなって得られる
からである。

２）項の方法は、より簡単に実施できるので、臨床活動
にと９で、より宵意掩である。そして次の３工程からな
っている、即ち ａ）中和テスト ｂ）血球凝集反応抑制テスト（ヒルスト−テスト）Ｃ）
補体結合反応（ＫＢＲ） それらすべての調査にとっては、同じ病人の血清試料２
つにつき同時に定量的な調査を行う必要かある。

最初の試料は臨床的徴候の出現直後採取すべきであり、
第２回目の血清試料は約１４日後の採取される。それら
試料は採取後直ちに送附され試験室中で凍結される。こ
の一対の血清の調査は同じ日に行われるのが常である。

この「ビールスマイナー診断」の場合も時間的なファク
ターが存在し、診断上及び経済的な浪費が著しい。

３）項の方法の場合は、すべてのこの種の方法に付随す
る欠陥を伴う様な除外方法によっている。

この発明の課題は、従来知られていた方法に対比して一
４〜 改善された、人体や動物体の悪性腫瘍及び／又はビール
ス性疾患の臨床化学的な実務で使用できる殊に早期診断
そうして、この課題は、本発明により、体液中えのビオ
プテリンを除く、特定のプテリジンノ排出を利用するこ
とにより解決せられた。

即ち、本発明によると、体液中の７，８ジヒドロプテリ
ジン、若くはその酸化生成物又は還元生成物又はそれら
の誘導体（ビオプテリン及び還元生成物を除く）を定性
的に証明し及び／又は半定量的、若くは定量的に測定す
ることにより達成される。

７．８−ジヒドロプテリジンは次式を有する。

ジヒドロプテリジンの例としては下記のものがある。

７．８−ジヒドロプテリン ７．８−ジヒドロルマジン の外、７，８−ジヒドロ−７−キサントプテリンカルボ
ン酸、７，８−ジヒドロ−インキサントプテリン、７゜
８−ジヒドロ−６−インキサントプテリンカルボン酸等
が挙げられる。

基本的な物質代謝反応のコ因子としてのテトラヒドロビ
オプテリンの前述の公知の意義からすると、その他のプ
テリジンか腫瘍生育について、より大きな予見を与えう
るなどとは期待できなかった。

ところで実際は動物実験によって以下のことか判ったの
である。即ち例えば、エールリソヒーアツノテスー腫瘍
を有するマウスやビールス感染マウスの尿中には７゜８
−ジヒドロ−６−ヒドロキ／ルマジン（一種の７，８−
ジヒドロプテリジン）の分泌が極めて高くなるか、それ
は早期に証明できるし、また、モデル動物の腫瘍発育と
か感染の重篤性に極めて良好に相関連しているのである
。

人体でも、体外体液中での殊にネオプテリジンの増大は
悪性腫瘍生育の確実な証拠であることが証明された。７
゜８−ジヒドロプテリジンがビールス疾患の場合にも体
外体液中に増量しており、それ故、その測定がビールス
診断に使用できるという知見は、誠に、驚くべきことで
あった。

この発明の方法は、その上、体液殊に尿中て、殊にネオ
プテリン（６−エリスロー１，２．３トリヒドロキシプ
ロピル−プテリン）、若くはその水素化（還元）又は酸
化生成物又は置換生成物を定性的の証明及び／又は半定
量的、若くは定量的に測定することにより人の場合の特
殊条件によりよく適合させることができる。

この発明で証明すべきネオプテリンはＤ−ネオプテリン
、Ｌ−ネオプテリン、若くはそのラセミ体として存在す
る。

Ｄ−ネオプテリン Ｌ−不オプテリン この発明で証明すべきジヒドロプテリジン、殊に、ネオ
プテリンは、例えばＯＨ，ＮＨ２、ＣＨ３、ＣＨ２０Ｈ
１ＣＯＯＨ１ＣＨＯ、アルコール、リン酸又は糖類の様
な基により種々の方法で、置換されていることができる
。

従って、この発明の特別の構成は、糖類やリン酸と結合
したネオプテリン、若くはその還元又は酸化生成物又は
置換生成物を尿中で定量的に証明及び／又は半定量的、
若くは定量的に測定する。

ジヒドロプテリジン、ネオプテリン、若くはその水素化
又は酸化生成物又は置換生成物は各種体液、例えば血液
、血清、尿、だ液等に証明できる。

この発明による方法は調査すべき体液を採取すべき生体
に前辺ってプテリジン誘導体、若くはプテリジン代謝に
関与する製剤を投与することを必すしも必要としない。

むしろ、本発明にとって特徴的な点は、それが前もって
プテリジン誘導体、若くはプテリジン物質代謝に関与。

する製剤を投与することなしに実施できる点にある。本
発明によると、従って、人体又は動物体そのものの中に
生成した、殊に天然のプテリジン、若くはその誘導体を
測定するのである。

７、　８−ジヒドロプテリジン又はネオプテリン、若く
はその酸化生成物、還元生成物、若くは置換生成物の定
性的証明は、若し悪性の腫瘍やビールス性疾患の存在し
ない当該健康体が調査すべき体液中に７，８−ジヒドロ
プテリジンを排出しない場合は、充分である。そうてな
い場合は７，８−ジヒドロプテリジン又はネオプテリン
、若くはその酸化生成物、還元生成物又は置換生成物の
定量的、若くは半定量的測定が必要となる。そしてその
場合、その値はそれぞれ体液の特別の測定法に応じて、
（健康人の）通常値と比較されるべきである。プテリジ
ン誘導体又はネオプテリン（酸化、還元又は置換生成物
を含む）の証明又は定量的な測定には下記の普通の分析
法が適している。

一蛍光分析、若くは紫外線領域、若くは着色機可視領域
でのレミツンヨン測定（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｍｅａｓ
ｕｒｅｍｅｎｔ）＆の組み合わせで担体上でか又は担体
なしての低圧−又は高圧電気泳動法 −蛍光分析又は紫外線領域、若くは着色後可視領域での
レミノション測定と組み合わせた薄層クロマトグラフィ
ー 一蛍光分析又は紫外線領域、若くは着色後可視領域での
レミノション測定と組み合わせたペーパークロマトグラ
フィー 一ガスクロマトグラフィー 一質量分析との組み合わせでのガスクロマトグラフィー
基 一フイールド脱色質量分析（ｆｉｅｌｄ　ｄｅｓｏｒｐ
ｔｉｏｎ　ｍａｓｓＳｐｅｃｒｏｍｅｔｒｙ） 一化学反応又は電気化学検出の後高圧液体クロマトグラ
フィー−及び蛍光的測定又は紫外領域或いは可視領域に
おける測定 一高圧液体クロマトグラフィー及び質量分析−イオン交
換剤による液体クロマトグラフィー−分光法 一蛍光分析 一分析検査法（ＵＶ−１ＩＲ，核磁共鳴法、質量分析）
−免疫学的方法（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵
素結合イムノソーペントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素
イムノアッセイ（ＥＭＩＴ）、免疫電気泳動法等）−ア
イソトープ稀釈法 −例えばキサンチンオキンダーセによる酵素試験−染色
テスト 一生物学的テスト（クリ７ジア生長試験等）−イソエレ
クトリックホーカス化法 −動的比濁法（Ｋｉｎｅｔｉｃ　ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔ
ｒｙ）例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ及びＥＭＩＴの様な免
疫学的方法は一方では極めて特異的であり、他方ではル
ーチンな方法で比較的簡単な材料を用いて実施できるか
ら臨床的に適している。

この場合、例えばキサントプテリン、又はネオプテリン
なと測定すべきプテリジンに対する抗体を得ることが必
要である。この抗体は自体公知の方法で実験動物、殊に
家兎を適当なプテリジン複合体で免疫することによって
得られる。プテリジンの免疫担体、例えば血清アルブミ
ンへの結合は自体公知の方法で行われる。それぞれ測定
すべきプテリジン用の必要な抗体特異性は結合に使用さ
れるプテリジン誘導体の選択により得られる。

−膜内に６−位で側鎖により置換されたプテリジンの抗
体はハプテンの免疫担体への結合をその６−位を介して
行うことによって得られる。

〇 その際、例えばキサントプテリンを酸性触媒の存在Ｆエ
チレングリコールと反応させ、次いで末端のＯＨ−基を
カルボキシル基に酸化する。この反応性ヘプトン誘導体
を自体公知の方法でカルボンイミドを使用して、例えば
牛の血清アルブミンに結合させる。ネオプテリンに特オ 異な抗体ではネオプテリンのトリヒドロキノプロピル側
鎖は決定基として免疫担体にハプテンが結合する場合に
そのまま残存しなければならない。従って場合により附
加的に保護された別の反応基ををするアルキルハロゲニ
ドによる主としてその分子の３の位置で進行するアルキ
ル化が最も簡単な反応として実施せられるのである。

例えばネオプテリンとω−プロムバレリアン酸メチルエ
ステルとの反応によりネオブチリル−ω−バレリアン酸
メチルエステルが得られ、このものはメチルエステル−
１’３− ＝１２− 保護基を酸性加水分解した後カルボンイミド法によって
例えば牛血清アルブミンに複合される。

ｎ≧３ 同様にして、例えばω−ブロムバレロニトリルはネオプ
テリンと反応して３−（４−ンアノブチルー）ネオプテ
リンになり、このものが純メタノール中で塩化水素と反
応して対応するイミドエステルを生しる。このものは直
接牛血清アルブミンと反応させることができる。

ネオブチリ４まこの場合その所望の抗体次第てＤ−工特
異キサントプテリンー抗体は、免疫担体に３−位を介し
てハプテンを結合することによって得られる。さもなけ
ればを利な５位や６位の反応を排除するため、その位置
、例えば６位の酸素をメチル化して、−時的に前辺って
保護することが普通必要である。

Ｏ ３位の窒素原子のω−ブロムノλレリアン酸メチルエス
テルでのアルキル化は、前辺ってヘキサメチルンンラサ
ンと反応さぜ０−４−トリメチルノリル誘導体にするこ
とによって容易にすることができる。さもなければ０−
４−アルキル誘導体も生成する。酸の中で加温すること
によって６−メドキシー及びメチルエステル保護基は再
び除去される。

別の可能性は２位のアミノ基を介して免疫担体とキサン
トプテリンとを結合するに存する。加温下での無水こは
（酸との反応によりキサントプテリンのヘミサクンネー
トか得られ、このものは常法でカルボンイミドによりプ
テリジンの還元形のもの、例えば７，８−ジヒドロキサ
ントプテリンの測定用に同様に抗体を作ることができる
。そのためには既述の複合体をプテリジン化学の普通の
方法による還元に付するか、ここに説明した反応性にあ
るプテリジン誘導体を免疫担体に結合させる前に所望程
度水素化する。しかし乍ら、その際還元されたプテリジ
ン、殊に５．　６ｔ、　　７．　８−テトラヒドロ誘導
体は酵素に過敏であり酸化型のものよりも光に感受性か
高いということはｌ上目に値する。

これら反応性プテリジン誘導体は免疫担体との結合用の
外に免疫学的方法の場合に必要な（放射活性的又は酵素
により標識された）トレーサーをつくるためにも使用で
きる。

その際、例えば３−（４−カルボキンブチル−）ｒ）−
エリスローネオプテリンを殊に１２５１を用いるカルボ
ジイミド法によって３−ラジオヨードチラミンと反応さ
せる。このトレーサーはネオプテリンの放射免疫学的測
定に適している。

酵素複合徐一造する場合もやり方は同じである。例えば
パーオキシダーゼ（例えばメールレソチッヒ）と例えば
３−（４−カルボキシブチル−）Ｄ−エリスローネオプ
テリンとをカルボジイミド法で反応させると酵素複合以
下本発明の方法を例によって詳細に説明する。

実施例　１ 人体の悪性腫瘍及びビールス性疾患を証明するためには
庄原の薄層クロマトグラフィー分離による尿中７，８−
ジヒドロキ／サントプテリンの定量測定が適当である。

薄層板を乾燥した後、定量的な蛍光計による直接評価を
行う。

５μｍの人尿を熱風で中間的に乾燥し乍ら、セルロース
薄層板上に少しずつ適用する。薄層室中で展開剤ｎ−ブ
タノール／氷酢／水（２０／３／７）は１２ｃｍ移動す
る。

熱風で乾燥した後薄層板をクロマトグラフ分光蛍光計で
走査し、蛍光シグナルをミリボルト記録Ｊ１て記録する
。

励起波長はこの場合３７８ｎｍであり、測定波長は４８
４ｎｍである。この場合、酸化生成物即ちキサンプテリ
ンの蛍光が測定される。Ｒｔ＝２７での蛍光斑のバンド
の面積は尿中にυ１出した７、８−ジヒドロキサントブ
チリンと比例している。

実施例　２ マウスでのエーリノヒーアツ／テスー腫瘍及びビールス
性感染を証明するためには、生の尿を変電圧電気泳動法
にかけて尿中の７，８−ジヒドロ−６−ヒトロキンルマ
ヂンを分離し、次いで蛍光計て直接評価することによっ
て定量的に測定するのが適当である。１０μｌのマウス
尿をミバエリスバッファー（ｐＨ＝８．　６．　イオン
強度０．７５）に浸漬した紙に線状に３ｃｍの長さ適用
する。

展開は市販の高電圧電気泳動室中で２７００ボルトで４
５分間行う。空乾後電気泳動紙ノートを１６ｃｍ！！！
ｔＬ、てクロマトグラム蛍光スペクトル写真計中て走査
する。その際蛍光信号をミリボトル記録計に記する。励
起波長はその場合３７２ｎｍ１測定波長は４５６ｎｍで
ある。この場合７，８−ジヒドロキンルマヂンの酸化生
成物、即ち６−ヒドロキンマシンの酸化生成物の蛍光を
測定した。

相対的電気泳動移動度（４−ヒトロキヒプール酸＝１０
０に対し）ｈｒＭ＝５５でのバンド而は尿中にυト出し
た７、８−ジヒドロ−６−ヒドロキンマシンに比例して
いる。

実施例　３ ７．８−ジヒドロ−６−ヒトロキンルマヂンを測定する
ための別の分析方法は展開剤ｎ−ブタノール／氷酢／水
（２０／３／７）を用いるセルロース上での薄層クロマ
トグラフィーである。７，８−ジヒドロ−６−ヒトロキ
ンルマヂンのｈＲｆ−値はこのシステムでは２５にある
。この場合も７，８−ジヒドロ−６−ヒドロキ／マヂン
の定量測定を３７２ｎｍ励起、４５６ｎｍ測定でクロマ
トグラム分光蛍光計での直接蛍光法によって行う。３５
６ｎｍで励起し４４０ｎｍで測定を行うとｈＲｆ−値３
７での直接−蛍光法によりネオプテリンを定量的に検知
できる。

実施例　４ ７．８−ジヒドロ−６−ヒトロキシルマヂン及びその酸
化生成物、６−ヒトロキシルマヂンを同時の定量的に液
体クロマトグラフィーで測定する、この場合（ｒｅｖｅ
ｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ　ｍａｔｅｒｊａｌｌ　＋ｎａｔ
ｅｒｉａｌ　ボンダパタＣＩ８’粒子の大きさ３７−７
５μｍ１を入れた長さ８２ｃｍ内径６ｍｍの低圧柱に１
ｍｌの予め精製した試料液を入れる。次いでｐＨ４，５
の２５ｍμアンモニウムアセタート溶液を用い１．００
ｍ１／時の流速でインクラチ、りに溶出する。

７．８−ジヒドロ−６−ヒトロキシマヂンは４７−５３
ｍ１の保持容積を存し２５４ｎ、ｍでのＵＶ−吸吸によ
り測定される。

５４−Ｔ３０ｍｌの６−ヒトロキシルマヂンが溶出され
３８８ｎｍ励起４００ｎｍ以−にの測定波長で蛍光で測
定される。

実施例　５ 人体での悪性腫瘍及びビールス性疾患を証明するために
、例えば尿中のネオプテリンを庄原を定量的にクロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し蛍光計測定法で定量的
に測定する。

場合によりクロマトグラフィー分離を行う前に前柱等に
より予備分離を行うことかできる。

５ｍμに人尿、若くは予備精製後の相当量をＨＰＬＣ−
システムに付する。ＨＰＣＬ−システムてはインクラチ
ックに操作する。バッファーとしてはアンモニアセテー
ト／酢酸（３０ｍモル／立、ｐＨ＝８．０）に５％メタ
ノールを加えたものを使用する。充填剤としては逆層剤
を存する３０ｃＩＩｌ−柱が使用される。流速は２ｍｌ
／分であった。

ＨＰＬＣ−システムによってネオプテリンを他の物から
明らかに分離できるのでネオプテリンは蛍光検知器及び
附属記録計によって測定出来る。励起波長はこの場合３
８０ｎｍであり測定波長は４５０ｎｍである。

ネオプテリンの測定と同時に尿中に排出するクレアチニ
／が定量的に測定されるので、クレアチニンｍｇ当たり
のネオプテリンｎｇが記戦される。−日の全尿でなくて
普通の尿試料たけか提供されるときは常にクレアチニン
ヘの関連付けが適当である。

ネオプテリン測定のための別の分析方法は展開剤５％酢
酸酸を用いるセルローズでの薄層クロマトグラフィーで
ある。このシステムではネオプテリンのｈＲｆ−値は６
５である。ネオプテリンの定量測定は３６４ｎｍ励起及
び４５Ｅｉｎｍ測定波長でクロマトグラム分光蛍光計を
用いる直接蛍光測定で行われる。

実施例　６ ６−（２−カルボキノ−）エトキシプテリン。

暗所か又は薄明りで１ｇのキサントブチリ／を撹拌し乍
ら６０ｍ１の純プロパンジオール−（１，３）中で７０
°Ｃで油浴で加熱する。次いで乾燥塩化水素を約３時間
導入する。濃縮すると塩酸塩が得られ、この塩酸塩は水
と１５分間加熱することににより６−（３−ヒドロキシ
）プロピルオキシプテリンを生する。

このものの０．５ｇを２０ｍｌの０．ｌＮＮａＯＨ中で
ＫＭｎＯ４溶液と処理する。析出した沈殿を吸引ろ過す
る。ろ液から酸性にすると６−（２−カルボキン−）エ
トキシプテリンが得られる。

実施例　７ ３−（４−カルボキシブチル−）Ｄ−エリストロ−ネオ
プテリン。

４８ｍｇのＤ−エリスルーネオプテリンを２０ｍｌの純
ＤＭＦ中で湿気を遮断して室温で５０ｍｇの無水のに２
ＣＯ３及ヒ０．２ｍｌのω−プロムバレリアン酸メチル
エステルを加え更に５０ｈ撹拌する。次いて５ｍｌの２
ＮＨＣＬを酸性反応を呈するまで（ｐＨｃａ１〜２）加
える。

５時間後に高真空で濃縮し残渣を水と混和し吸引ろ過し
乾燥する。

この生成物は牛の血清アルブミンへの複合にそのまま用
いることか出来る。操作は以下の例に於いても暗所か又
は薄明りの中で行われる。

実施例　８ ３−（４−メトキシイミノカルボニルブチル−）Ｄ−エ
リスローネオプテリン。

４８ｍｇ−Ｄ−エリスローネオプテリンを１０ｍｌの純
ＤＭＦ中で湿気を遮断して４０°Ｃ（浴）で４０ｍ１の
無水に２　ＣＯ３及び０．４ｍｌのω−ブロムバレロニ
トリルと撹拌する。２日の後高真空で回転蒸発機で濃縮
し、残渣を少量のメタノール性ＮＨ３に溶解硅酸で層ク
ロマトグラムで分離する。３−（４−シアノブチル−）
Ｄ−エリスーネオプテリンに対応する層を溶出し回転式
蒸発機で濃縮する。３０ｍｇの生成物を１０ｍｌのＨＣ
Ｌ−飽和メタノール中に冷却下懸濁し乾燥ＨＣＬを更に
導入し除々に１０’Ｃに加温する。混合物を次いで２４
時間放置する。

２０ｍ１の純ンメチルエーテルを加え生成物を吸引、洗
滌そして乾燥する。

実施例　９ ３−（４カルボキシルブチル−）キサントプテリン３６
０ｍｇの６−メドキシプテリンを５０ｍ１のヘキサメチ
ルジシラザン中で湿気を遮断して還流加熱（２０ｈ）し
、次いて真空で濃縮する。残渣を４０＋ｏｌの純ＤＭＦ
中で１ｍｌのω−プロムバレリアン酸メチルエステルと
４０°Ｃで３０時間反応させる。溶液を高真空で吸引す
る。

残渣を層クロマトグラフで硅酸ゲルで精製する。３−（
４−カルボメトキシブチル−）６−メドキシブテリンに
対応する層を溶出する。

保護基を離脱するために１００ｍｇのこの生成物を３０
ｍ１の６ＮＨＶＬと４時間７０°Ｃに加熱する。次いて
真空で回転式蒸発機で濃縮し残渣をエタノール／水から
再結晶する。

実施例　１０ キサントプテリン−Ｎ２−ヘミサクシネート。

２００ｍｇのキサントプテリン５０ｍ１の純ビリデン中
で２５０ｍｇの無水くえん酸と７０’Ｃに加温する。１
６時間後氷に注ぎ沈殿を吸引し水で洗う。生成物はその
まま複合に使用することができる。

実施例　１１ ３−（ブチル−４−カルボン酸−［３′−１２ｑヨード
ーコチラミド）−Ｄ−エリスローネオプテリン。

約１ｍのＣ１３−１２５ヨードチラミンを例２の３−（
４−カルポキ／ブチル−）Ｄ−エリスローネオプテリン
０．１ｍｇと２００μｍの純ＤＭＦ中で５０μｍの純ジ
オキサン中の８０μｇジシクロへキシルカルボジイミド
と混合する。−夜装置し室温に加温したのちペイパーク
ロマトグラフィーによって（展開剤ｎ−プロパツール１
７３％水性アンモニア１．ｖ／ｖ）所望の１２５ヨード
−ネオプテリン誘導体を分離し、メタノール性ＮＨ３て
溶出する。

実施例　１２ Ｎ２−［３Ｈコアセチルキサントプテリン０、　１ｍｇ
キサントプテリン（０，５μモル）を密閉反応容器中で
６時間５ｍのＣｉ［’Ｈ］無水酢酸酸と２００μｍの純
ＤＭＦ中で１００°Ｃに加熱する。反応混合物をペーパ
ークロマトグラフィー（展開剤ｎ−ブタノール２１５Ｍ
酢酸Ｌ　Ｖ／Ｖ）で精製する。標識化合物をメタノール
性ＮＨ３で溶出する。

実施例　１３ キサンプテリンヘミサクンネートーβ−ガラクトンダー
ゼ複合体。

実施例７のキサントプテリン−に−ヘキサクンネート１
４ｍｇと９．２ｍｇのトリーｎ−ブチルアミンとを５０
０ｍ１の純ＤＭＦ中で水浴で冷却し、８．８ｍｇのクロ
ルぎ酸イソブチルエステルを加えて３０分撹拌する。次
いで５ｍｇのβ−Ｄ−ガラクトンダーゼを５＋ｎｌの水
に加える。この反応はＯ，ＩＮ　　ＮａＯＨを加えるこ
とによりｐＨ９で１０’Ｃ以下に保持される。５時間の
反応時間ののち一夜冷蔵庫に置く。この酵素複合体をセ
ファデックスＧ２５でクロマトグラフィーにかけて精製
する。

実施例　１４ ３−　（４−カルボキシブチル−）Ｄ＝エリスローネオ
プテリン−パーオキシダーゼ複合体。

例２の３−（４−カルボキシブチルー）Ｄ−エリスロー
ネオプテリン１７ｍｇを「混合無水物法」により純ＤＭ
Ｆ中でクロルぎ酸イソブチルエステルと混合する。２０
ｍｇのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）への複合はＤＭＦｌ
ｏ。

５％ＮａＨＣＯ３（１：５）中６時間１０’Ｃ以下で行
う。この複合体はセファデックスＧ−２５でクロマトグ
ラフィーにより精製できる。

実施例　１５ 酵素免疫測定法 小型遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｊ又は５ａｒｓｔｅ
ｄｔ）中の１００μｍの血清を４００μＩ　ＰＢＳ　　
／”ｙ７７　（０，０５Ｍ燐酸塩ｐＨ７，４：０．ＩＭ
　　ＮａＣＬ　：０．１％牛血清アルブミン）１００μ
Ｉキサントプテリン−抗血清（家兎１　：　１０００）
及び１００μｍキサントプテリン−β−Ｄ−ガラクトキ
ンダーゼー複合体（約５０ｍｇ）と５時間室温でインキ
ュベートする。１００μｍの第２抗体（羊、抗家兎）を
加えた後３時間室／ｌｉ（又は−昼夜冷蔵庫中）でイン
キュベートする。遠心分離したのち」二澄を吸引しペレ
ットを１ｍｌのＰＢＳ−バッファー中に再懸濁させる。

遠心分離と吸引ろ過を繰り返したのちＯ，１ｍｌの酵素
基質（０，１Ｍりん酸塩、Ｉ）Ｎ７．０１２．３ｍＭ０
−二トロフェニルーβ−Ｄ−ガラクスピラノノイド、１
　ｍＭＭｇ　Ｃｌ３．１０ｍＭメルカプトエタノール）
を加え２時間２３°Ｃてインキュベートする。標準品及
び試料について例えば２時間という同し時間の後１．５
＋ｎ１０゜２ＭＮａＣＯ３を加え光学濃度を４２０ｎｍ
で測定する。

実施例　１６ 放射免疫測定法（ラジオイムノアッセイ）小型遠心管（
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、　５ａｒｓｔｅｄｔ等）中で２０
μｍの尿、３００ｍ１の０．１Ｍりん酸塩ｐＨ７，４，
１００μｌキサントプテリン−抗血清（家兎；　１　：
１５００７μｇの家兎−γ−グロブリンを加える）及び
１００μｌの２−［’Ｈ−アセチル］キサントプテリン
（容器の計算収率（ｃｏｕｎｔｅｄ　ｙｉｅｌｄ）やト
レーサーの比活性に合致した量の）を４時間室温でイノ
キュベートする。次いで１００μｍの第２の抗体（抗−
家兎一γ−グロプリンー血清、ひつし１：２５）を加え
更に１．５時間インキュベートする。５００μｍの水を
加え、遠心分離し」−澄を吸引ろ過する。この沈殿を１
ｍｌの水に再懸濁し改めて遠心分離し」１澄を吸引ろ過
する。

この沈殿を次いで５０μｍのツルエンＴＭ１００に溶か
し合計１０ｍ１のインスターゲルーシンチレイシュン液
（両者共ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ
、）とンンチレーション瓶に入れ計数器（Ｐａｃｋａｒ
ｄ）中て測定する。

上述の例並びに実施例及び−船釣にいって本発明の方法
により実施できる検査法は極く僅かの時間しか必要とし
ない。即ち例１などによると６分て実施できる。この発
明による測定は任意にしばしば反復が出来、ビールス性
疾患の経過制御若くは悪性腫瘍の治療をも可能ならしめ
る。

元々のブチリデンそのもの又はそのものの光や空気の影
響で生しる分解生成物、酸化生成拘着くは還元生成物の
何れが測定されるかは体液中に在るプテリジン若くは使
用測定法により決まることである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ＯＨ、ＮＨ２、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｃ
   ＨＯ基、アルコール、りん酸または糖残基により置換さ
   れていることのできる式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される、７，８−ジヒドロプテリジン又はその酸化
   又は還元生成物又はそれらの誘導体（但しビオプテリン
   及びその還元生成物は除く）の複合体に、プテリジンの
   ３位又は６位において、免疫担体をカップリングするこ
   とによって得られる抗体を含有するか、プテリジン−誘
   導体の複合体に、プテリジンの３位又は６位において、
   酵素又は放射活性的に標識した基をカップリングするこ
   とによって得られたトレーサーを含有することを特徴と
   する、人体又は動物体が免疫反応で応答する疾病、例え
   ば、悪性腫瘍又はビールス性疾患の診断薬。 ２）複合体として、尿又は血清中のグリコシッド又はホ
   スファートと複合した７，８−ジヒドロプテリジン又は
   その酸化又は還元生成物又はそれらの誘導体を使用する
   特許請求の範囲１の診断薬 ３）７，８−ジヒドロブテリジン誘導体がネオプテリン
   誘導体である特許請求の範囲１記載の人体又は動物体が
   免疫反応で応答する疾病の診断薬。 ４）ネオプテリンがＤ体又はＬ体又はラセミ体である特
   許請求の範囲３の診断薬