JP2968910B2 - １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途 - Google Patents
１α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、１α，２５（ＯＨ）2
ビタミンＤ3 に対する抗体、該抗体を用いた１α，２５
（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 の測定法及びキットに関するも
のである。
ビタミンＤ3 に対する抗体、該抗体を用いた１α，２５
（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 の測定法及びキットに関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】ビタミンＤ3 は、皮膚で光化学的に合成
あるいは食物から摂取された後、肝臓で２５（ＯＨ）ビ
タミンＤ3 に代謝され、腎臓に転送されて１α，２５
（ＯＨ） 2 ビタミンＤ3 が生成された後、生体内（肝、
腎、小腸など）で２４，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 な
どの各種代謝物に変換される。これら各種代謝物の血中
レベルを正確に測定することは、臨床及び栄養診断上重
要なことである。
あるいは食物から摂取された後、肝臓で２５（ＯＨ）ビ
タミンＤ3 に代謝され、腎臓に転送されて１α，２５
（ＯＨ） 2 ビタミンＤ3 が生成された後、生体内（肝、
腎、小腸など）で２４，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 な
どの各種代謝物に変換される。これら各種代謝物の血中
レベルを正確に測定することは、臨床及び栄養診断上重
要なことである。
【０００３】現在、これら各種代謝物の測定法として
は、例えば、２５（ＯＨ）ビタミンＤ 3 、２４，２５
（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 については血清ビタミンＤ結合
タンパク質を用いるｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙが、１α，２５
（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 についてはレセプターを用いる
ラジオレセプターアッセイがそれぞれ主流を占めてい
る。しかしながら、これらの方法は生体試料の煩雑な前
処理が不可欠であり、検体処理の能力に問題がある。
は、例えば、２５（ＯＨ）ビタミンＤ 3 、２４，２５
（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 については血清ビタミンＤ結合
タンパク質を用いるｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙが、１α，２５
（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 についてはレセプターを用いる
ラジオレセプターアッセイがそれぞれ主流を占めてい
る。しかしながら、これらの方法は生体試料の煩雑な前
処理が不可欠であり、検体処理の能力に問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】最近、ラジオイムノア
ッセイに代表されるイムノアッセイが新しい方法論とし
て期待され、ビタミンＤ3 及びその各種代謝物に対する
抗体の産生が試みられている。しかしながら、従来の抗
体は、ビタミンＤ3 の３位水酸基あるいは１７位側鎖上
をキャリア結合部位とするハプテン誘導体により調製さ
れているため、十分な特異性を保持し得ないという欠点
を有していた。
ッセイに代表されるイムノアッセイが新しい方法論とし
て期待され、ビタミンＤ3 及びその各種代謝物に対する
抗体の産生が試みられている。しかしながら、従来の抗
体は、ビタミンＤ3 の３位水酸基あるいは１７位側鎖上
をキャリア結合部位とするハプテン誘導体により調製さ
れているため、十分な特異性を保持し得ないという欠点
を有していた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
ビタミンＤ3 類の１１α位が生体内代謝を受けにくい部
位であり、Ａ環及び１７位側鎖の両構造から十分離れた
位置に存在するという理由から、この部位をキャリアー
タンパク質との結合部位に用いれば、従来の抗体と比較
して特異性の優れた抗体を得ることができるものと仮定
し、１１α位にブリッジを有する新規なハプテンを合成
し、このハプテンに対する抗体の調製を試みた。
ビタミンＤ3 類の１１α位が生体内代謝を受けにくい部
位であり、Ａ環及び１７位側鎖の両構造から十分離れた
位置に存在するという理由から、この部位をキャリアー
タンパク質との結合部位に用いれば、従来の抗体と比較
して特異性の優れた抗体を得ることができるものと仮定
し、１１α位にブリッジを有する新規なハプテンを合成
し、このハプテンに対する抗体の調製を試みた。
【０００６】すなわち、下記式（１）
【化１】
【０００７】で表わされるハプテン誘導体を合成し、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド法によりウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を該ハプテン誘導体の１１α位のヘミグル
タリルオキシ基に結合させた得たハプテン−キャリアー
蛋白複合体を免疫原として用いて、これをウサギに免疫
することにより抗１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 抗
体が産生可能なことを見い出した。そこで、これをさら
に発展させ、ハプテン誘導体とＢＳＡのモル比を１５〜
２０に制御することにより、力価、親和性および特異性
に更に優れた目的とする抗体を効率よく産生させること
ができるという知見を得、本発明を完成させた。
−ヒドロキシスクシンイミド法によりウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）を該ハプテン誘導体の１１α位のヘミグル
タリルオキシ基に結合させた得たハプテン−キャリアー
蛋白複合体を免疫原として用いて、これをウサギに免疫
することにより抗１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 抗
体が産生可能なことを見い出した。そこで、これをさら
に発展させ、ハプテン誘導体とＢＳＡのモル比を１５〜
２０に制御することにより、力価、親和性および特異性
に更に優れた目的とする抗体を効率よく産生させること
ができるという知見を得、本発明を完成させた。
【０００８】すなわち、本発明は、下記の特性を有する
１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3に対する抗体に関す
るものである。 親和定数（Ｋａ値） ０．３４〜３．３×１０10（Ｍ-1） 交差反応性（％） １α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に対する反応性を１
００％とした時の他のビタミンＤ3 誘導体に対する反応
性は６％以下である。また、本発明は、上記抗体を使用
した１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 の測定法及びキ
ットに関するものである。以下、本発明を詳述する。
１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3に対する抗体に関す
るものである。 親和定数（Ｋａ値） ０．３４〜３．３×１０10（Ｍ-1） 交差反応性（％） １α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に対する反応性を１
００％とした時の他のビタミンＤ3 誘導体に対する反応
性は６％以下である。また、本発明は、上記抗体を使用
した１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 の測定法及びキ
ットに関するものである。以下、本発明を詳述する。
【０００９】（１）本発明の抗体 本発明の抗体は、少なくとも上記特性を有するものであ
るが、さらに詳細に本発明の抗体の特徴を述べれば、以
下の通りである。 親和定数（Ｋａ値） ０．３４〜３．３×１０10（Ｍ-1） 交差反応性（％） １α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に対する反応性を１
００％とした時の他のビタミンＤ3 誘導体に対する反応
性は６％以下、好ましくは２％以下、さらに好ましくは
１％以下である。 力価 至適希釈倍率が１３００倍以上、好ましくは１８０００
〜２２００００倍である。 測定感度 ＲＩＡにおける測定限界が２〜１０ｐｇ／チューブであ
る。
るが、さらに詳細に本発明の抗体の特徴を述べれば、以
下の通りである。 親和定数（Ｋａ値） ０．３４〜３．３×１０10（Ｍ-1） 交差反応性（％） １α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に対する反応性を１
００％とした時の他のビタミンＤ3 誘導体に対する反応
性は６％以下、好ましくは２％以下、さらに好ましくは
１％以下である。 力価 至適希釈倍率が１３００倍以上、好ましくは１８０００
〜２２００００倍である。 測定感度 ＲＩＡにおける測定限界が２〜１０ｐｇ／チューブであ
る。
【００１０】（２）本発明の抗体の調製法 本発明の抗体を調製するのに使用する免疫原としては、
１α，２５（ＯＨ）2ビタミンＤ3 の１１α位に導入し
たブリッジの先にＢＳＡなどのキャリアータンパク質を
結合させたものを用いることが肝要である。１α，２５
（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 の１１α位にカルボキシル基を
含有するブリッジ、例えばヘミグルタリルオキシ基を導
入する方法は公知であり（日本薬学会主催：第１０回生
体成分の分析化学シンポジウム講演要旨集、１０５〜１
０８頁、１９９２年９月）、この公知の方法に従って目
的とするハプテン誘導体を調製することができる。得ら
れたハプテン誘導体とキャリアータンパク質との結合
は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法により行うことが
できる。すなわち、水溶性カルボジイミドの存在下、ハ
プテン誘導体とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを反応
させてハプテン誘導体のブリッジの先にスクシンイミド
基を導入し、これとキャリアータンパク質とを反応させ
ることにより、目的とする免疫原を得ることができる。
１α，２５（ＯＨ）2ビタミンＤ3 の１１α位に導入し
たブリッジの先にＢＳＡなどのキャリアータンパク質を
結合させたものを用いることが肝要である。１α，２５
（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 の１１α位にカルボキシル基を
含有するブリッジ、例えばヘミグルタリルオキシ基を導
入する方法は公知であり（日本薬学会主催：第１０回生
体成分の分析化学シンポジウム講演要旨集、１０５〜１
０８頁、１９９２年９月）、この公知の方法に従って目
的とするハプテン誘導体を調製することができる。得ら
れたハプテン誘導体とキャリアータンパク質との結合
は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法により行うことが
できる。すなわち、水溶性カルボジイミドの存在下、ハ
プテン誘導体とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを反応
させてハプテン誘導体のブリッジの先にスクシンイミド
基を導入し、これとキャリアータンパク質とを反応させ
ることにより、目的とする免疫原を得ることができる。
【００１１】免疫原を調製するのに使用するキャリアー
タンパク質としては、ＢＳＡ、キーホールリンぺットヘ
モシアニンなどのハプテンの免疫原の際に通常利用され
るタンパク質を使用することができる。キャリアータン
パク質１モル当たりのハプテン誘導体のモル数は、その
モル比が１５〜２０（ハプテン／ＢＳＡ＝１５〜２０）
のものを用いることが大切である。このようなモル比を
有する免疫原を用いることにより、本発明の抗体を効率
よく取得することができる。免疫原を投与する動物とし
ては、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモッ
ト、イヌ、ブタ、ウサギ、サル、ハト、ニワトリなどい
ずれであってもよく、特にマウス、ラット、モルモッ
ト、ウサギ、ヤギなどが使用上好都合である。
タンパク質としては、ＢＳＡ、キーホールリンぺットヘ
モシアニンなどのハプテンの免疫原の際に通常利用され
るタンパク質を使用することができる。キャリアータン
パク質１モル当たりのハプテン誘導体のモル数は、その
モル比が１５〜２０（ハプテン／ＢＳＡ＝１５〜２０）
のものを用いることが大切である。このようなモル比を
有する免疫原を用いることにより、本発明の抗体を効率
よく取得することができる。免疫原を投与する動物とし
ては、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモッ
ト、イヌ、ブタ、ウサギ、サル、ハト、ニワトリなどい
ずれであってもよく、特にマウス、ラット、モルモッ
ト、ウサギ、ヤギなどが使用上好都合である。
【００１２】このような動物への免疫原の投与は常法に
従って行えばよく、たとえば、完全フロイントアジュバ
ント、不完全フロイントアジュバント、ミョウバンアジ
ュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳菌
アジュバントなどの各種アジュバントと上述の免疫原と
のエマルジョンを調製し、これを上記動物の静脈内、腹
腔内、皮下または皮内に投与すればよい。投与量は、動
物としてウサギ、モルモットを使用する場合には蛋白量
として０．０１〜１０mg／匹、またはマウス、ラットを
使用する場合には、０．００１〜１mg／匹程度が好適で
ある。
従って行えばよく、たとえば、完全フロイントアジュバ
ント、不完全フロイントアジュバント、ミョウバンアジ
ュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳菌
アジュバントなどの各種アジュバントと上述の免疫原と
のエマルジョンを調製し、これを上記動物の静脈内、腹
腔内、皮下または皮内に投与すればよい。投与量は、動
物としてウサギ、モルモットを使用する場合には蛋白量
として０．０１〜１０mg／匹、またはマウス、ラットを
使用する場合には、０．００１〜１mg／匹程度が好適で
ある。
【００１３】初回投与後、１〜４週間おきに１〜５回程
度の上記と同様の追加免疫を行うことにより、動物体内
で１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に対する抗体産生
を誘導する。次に、抗体産生を誘導した動物から血液を
採取し、遠心分離して得られた血清を抗血清として使用
しても良い。また、必要により血液中の抗体を公知の精
製法（硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロースなどの陰イオン
交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロ
テインＡ−セファロースなどを用いるアフィニティーク
ロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーなど）を
適宜に選択し、または組み合わせることにより、血清中
の本発明の抗体を単離精製することができる。
度の上記と同様の追加免疫を行うことにより、動物体内
で１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に対する抗体産生
を誘導する。次に、抗体産生を誘導した動物から血液を
採取し、遠心分離して得られた血清を抗血清として使用
しても良い。また、必要により血液中の抗体を公知の精
製法（硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロースなどの陰イオン
交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロ
テインＡ−セファロースなどを用いるアフィニティーク
ロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーなど）を
適宜に選択し、または組み合わせることにより、血清中
の本発明の抗体を単離精製することができる。
【００１４】（３）本発明の測定法 本発明の測定に使用するサンプルは、１α，２５（Ｏ
Ｈ）2 ビタミンＤ3 を含有し得るものであれば特に限定
されず、たとえば、血液、血清、尿、体液、培養細胞ま
たはその培養液などが例示される。サンプルは、必要に
よりＰＢＳなどの適当な緩衝液にて希釈して測定に供し
てもよい。本発明の測定法は、前記の本発明の抗体を抗
体試薬として使用することを特徴としている。このた
め、本発明の測定法で採用する測定原理及び条件は特に
限定されない。たとえば、以下の文献に記載されている
公知方法から１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 の測定
に好適な方法・条件を適宜選択し、採用すれば良い。
Ｈ）2 ビタミンＤ3 を含有し得るものであれば特に限定
されず、たとえば、血液、血清、尿、体液、培養細胞ま
たはその培養液などが例示される。サンプルは、必要に
よりＰＢＳなどの適当な緩衝液にて希釈して測定に供し
てもよい。本発明の測定法は、前記の本発明の抗体を抗
体試薬として使用することを特徴としている。このた
め、本発明の測定法で採用する測定原理及び条件は特に
限定されない。たとえば、以下の文献に記載されている
公知方法から１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 の測定
に好適な方法・条件を適宜選択し、採用すれば良い。
【００１５】入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」
（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行） 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）
医学書院、１９８２年１２月１５日発行） 臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のため
のイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、
１９８３年発行） 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、
１９８６年１０月９日発行） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．７０」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ）） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．７３」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ）） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．７４」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ）） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．８４」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．９２」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ）） ［〜はアカデミックプレス社発行］
（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行） 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）
医学書院、１９８２年１２月１５日発行） 臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のため
のイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、
１９８３年発行） 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、
１９８６年１０月９日発行） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．７０」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ）） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．７３」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ）） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．７４」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ）） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．８４」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）） 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖ
ｏｌ．９２」（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ）） ［〜はアカデミックプレス社発行］
【００１６】（４）本発明の測定用キット 本発明の測定用キットは、キットに添付する抗体試薬と
して前記の本発明の抗体を使用することを特徴としてお
り、その他の試薬は、採用した測定法に合わせて適宜組
み合わせれば良い。たとえば、キットに使用する抗体は
抗体そのものであってもよいが、非特異的な吸着を防止
する意味から抗体の活性フラグメントを使用するのが好
ましい。抗体の活性フラグメントは、抗体の特徴を保持
するもの〔たとえば、Ｆ（ａｂ’） 2 、Ｆａｂ’、Ｆａ
ｂなどの各種フラグメント〕であればいずれのものであ
ってもよい。これら活性フラグメントの調製は、精製抗
体をパパイン、ペプシン、トリプシンなどのプロテアー
ゼを用いて限定分解する方法など公知の方法を適用して
行うことができる（たとえば「免疫生化学研究法（続生
化学実験講座５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８
６年）参照）。
して前記の本発明の抗体を使用することを特徴としてお
り、その他の試薬は、採用した測定法に合わせて適宜組
み合わせれば良い。たとえば、キットに使用する抗体は
抗体そのものであってもよいが、非特異的な吸着を防止
する意味から抗体の活性フラグメントを使用するのが好
ましい。抗体の活性フラグメントは、抗体の特徴を保持
するもの〔たとえば、Ｆ（ａｂ’） 2 、Ｆａｂ’、Ｆａ
ｂなどの各種フラグメント〕であればいずれのものであ
ってもよい。これら活性フラグメントの調製は、精製抗
体をパパイン、ペプシン、トリプシンなどのプロテアー
ゼを用いて限定分解する方法など公知の方法を適用して
行うことができる（たとえば「免疫生化学研究法（続生
化学実験講座５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８
６年）参照）。
【００１７】また、本発明の抗体を標識して使用する場
合、抗体に結合させる標識剤としては、放射性同位体
（たとえば32Ｐ、 3Ｈ、14Ｃ、 125Ｉなど）、酵素（た
とえばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸
オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオ
キシダーゼなど）、補酵素・補欠分子族（たとえば、Ｆ
ＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、フルオ
レセイン誘導体（たとえば、フルオレセインイソチオシ
アネート、フルオレセインチオフルバミルなど）、ロー
ダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミンＢイ
ソチオシアネートなど）、ウムベリフェロンおよび１−
アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、
ルミノール誘導体（たとえば、ルミノール、イソルミノ
ール、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソル
ミノールなど）などを用いることができる。抗体または
その活性フラグメントと標識剤との結合は、成書〔たと
えば、「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）
東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２
頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択し
て実施すればよい。
合、抗体に結合させる標識剤としては、放射性同位体
（たとえば32Ｐ、 3Ｈ、14Ｃ、 125Ｉなど）、酵素（た
とえばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸
オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオ
キシダーゼなど）、補酵素・補欠分子族（たとえば、Ｆ
ＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、フルオ
レセイン誘導体（たとえば、フルオレセインイソチオシ
アネート、フルオレセインチオフルバミルなど）、ロー
ダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミンＢイ
ソチオシアネートなど）、ウムベリフェロンおよび１−
アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、
ルミノール誘導体（たとえば、ルミノール、イソルミノ
ール、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソル
ミノールなど）などを用いることができる。抗体または
その活性フラグメントと標識剤との結合は、成書〔たと
えば、「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）
東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２
頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択し
て実施すればよい。
【００１８】さらに、本発明の抗体を固相に結合させた
固相化抗体として使用する場合、抗体を固定するための
担体物質の材質としては、たとえばポリ塩化ビニル、ポ
リスチレン、スレチン−ジビニルベンゼン共重合体、ス
チレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニ
ルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニト
リル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートな
どの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セフ
ァデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バ
イオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙
など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーン
などの無機高分子化合物が挙げられ、これらはアミノ
基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水
酸基などの官能基を導入したものであってもよい。な
お、担体物質の材質は蛋白質の結合能の低いものが好ま
しく、このような材質としては未処理のポリスチレン、
ポリ塩化ビニルが例示される。
固相化抗体として使用する場合、抗体を固定するための
担体物質の材質としては、たとえばポリ塩化ビニル、ポ
リスチレン、スレチン−ジビニルベンゼン共重合体、ス
チレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニ
ルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニト
リル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートな
どの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セフ
ァデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バ
イオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙
など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーン
などの無機高分子化合物が挙げられ、これらはアミノ
基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水
酸基などの官能基を導入したものであってもよい。な
お、担体物質の材質は蛋白質の結合能の低いものが好ま
しく、このような材質としては未処理のポリスチレン、
ポリ塩化ビニルが例示される。
【００１９】担体物質の形状は、平板状（マイクロタイ
タープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズな
ど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状
（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などが
例示され、測定法に応じた適宜な形状の担体を選択する
ことができる。また、リポソーム（単層または多層の脂
質膜）なども抗体を固定するための担体物質として使用
することもできる。抗体と担体物質との結合は、物理的
吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の
方法（たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和５
０年３月２０日、（株）講談社発行）参照）を採用する
ことができる。とりわけ、物理的吸着法は簡便である点
で好ましい。また、上記結合は、直接行ってもよく、諸
物質の間に他の物質を介して行ってもよい。
タープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズな
ど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状
（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などが
例示され、測定法に応じた適宜な形状の担体を選択する
ことができる。また、リポソーム（単層または多層の脂
質膜）なども抗体を固定するための担体物質として使用
することもできる。抗体と担体物質との結合は、物理的
吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の
方法（たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和５
０年３月２０日、（株）講談社発行）参照）を採用する
ことができる。とりわけ、物理的吸着法は簡便である点
で好ましい。また、上記結合は、直接行ってもよく、諸
物質の間に他の物質を介して行ってもよい。
【００２０】
【発明の効果】本発明の抗体は、従来報告されている抗
体よりも１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に対する特
異性が高く、このような抗体を用いることにより、従来
のラジオレセプターアッセイとほぼ匹敵する感度で検体
中の１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 を測定すること
ができる。
体よりも１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 に対する特
異性が高く、このような抗体を用いることにより、従来
のラジオレセプターアッセイとほぼ匹敵する感度で検体
中の１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3 を測定すること
ができる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
する。 実施例１：抗体の調製 （１）ハプテン誘導体の合成 以下に示すフローチャートに従って、化合物３（１１
α，２５（ＯＨ）2 コレステロール）（Ｊ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，１９９３，
３１）から２１段階を経由して目的とする式（１）で表
わされるハプテン誘導体（１１α−ヘミグルタリルオキ
シ−１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 ）を調製した。
する。 実施例１：抗体の調製 （１）ハプテン誘導体の合成 以下に示すフローチャートに従って、化合物３（１１
α，２５（ＯＨ）2 コレステロール）（Ｊ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，１９９３，
３１）から２１段階を経由して目的とする式（１）で表
わされるハプテン誘導体（１１α−ヘミグルタリルオキ
シ−１α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 ）を調製した。
【００２２】
【化２】
【００２３】合成フローチャートに示した反応ｉ）〜xi
ii) の反応条件の詳細は以下の通りである。 ｉ）ａ：ＴＢＳＣｌ，イミダゾール，ＤＭＦ，室温、
ｂ：Ａｃ2 Ｏ，ピリジン，室温、ｃ：ＴＢＡＦ，ＴＨ
Ｆ，室温；ii) ＤＤＱ，ジオキサン，還流；iii)イソプ
ロペニルアセテート，ｐ−ＴｓＯＨ，ＢｕＯＡｃ，還流
（リサイクル３回）；iv) Ｃａ（ＢＨ4 ）2 ，ＭｅＯＨ
−ＥｔＯＨ，０→４℃；ｖ）ＰＴＡＤ，ＣＨ 2 Ｃｌ2 ，
室温；vi) ａ：ＴＢＳＣｌ，イミダゾール，ＤＭＦ，室
温、ｂ：１５％ＫＯＨ含有ＭｅＯＨ−ＴＨＦ，室温；vi
i)ｍ−ＣＰＢＡ，ＣＨＣｌ3 ，室温；viii) ａ：ＴＢＡ
Ｆ，ＴＨＦ，室温、ｂ：１，１，３，３−テトラメチル
グアニジン，１７０℃（浴温度）；ix) ＮａＢＨ4 ，ジ
グライム，８０℃（浴温度）；ｘ）ａ：ＴＢＳＣｌ，イ
ミダゾール，ＤＭＦ，室温、ｂ：Ａｃ2 Ｏ，ピリジン，
室温；xi) ａ：ｈν，Ｅｔ2 Ｏ，０℃、ｂ：ヘキサン−
ＴＨＦ，室温；xii)ａ：ＴＢＳＣｌ，イミダゾール，Ｄ
ＭＦ，室温、ｂ：５％ＫＯＨ含有ＭｅＯＨ，０℃；xii
i) ａ：無水グルタル酸，ピリジン，室温、ｂ：ＴＢＡ
Ｆ，ＴＨＦ，室温。
ii) の反応条件の詳細は以下の通りである。 ｉ）ａ：ＴＢＳＣｌ，イミダゾール，ＤＭＦ，室温、
ｂ：Ａｃ2 Ｏ，ピリジン，室温、ｃ：ＴＢＡＦ，ＴＨ
Ｆ，室温；ii) ＤＤＱ，ジオキサン，還流；iii)イソプ
ロペニルアセテート，ｐ−ＴｓＯＨ，ＢｕＯＡｃ，還流
（リサイクル３回）；iv) Ｃａ（ＢＨ4 ）2 ，ＭｅＯＨ
−ＥｔＯＨ，０→４℃；ｖ）ＰＴＡＤ，ＣＨ 2 Ｃｌ2 ，
室温；vi) ａ：ＴＢＳＣｌ，イミダゾール，ＤＭＦ，室
温、ｂ：１５％ＫＯＨ含有ＭｅＯＨ−ＴＨＦ，室温；vi
i)ｍ−ＣＰＢＡ，ＣＨＣｌ3 ，室温；viii) ａ：ＴＢＡ
Ｆ，ＴＨＦ，室温、ｂ：１，１，３，３−テトラメチル
グアニジン，１７０℃（浴温度）；ix) ＮａＢＨ4 ，ジ
グライム，８０℃（浴温度）；ｘ）ａ：ＴＢＳＣｌ，イ
ミダゾール，ＤＭＦ，室温、ｂ：Ａｃ2 Ｏ，ピリジン，
室温；xi) ａ：ｈν，Ｅｔ2 Ｏ，０℃、ｂ：ヘキサン−
ＴＨＦ，室温；xii)ａ：ＴＢＳＣｌ，イミダゾール，Ｄ
ＭＦ，室温、ｂ：５％ＫＯＨ含有ＭｅＯＨ，０℃；xii
i) ａ：無水グルタル酸，ピリジン，室温、ｂ：ＴＢＡ
Ｆ，ＴＨＦ，室温。
【００２４】（２）免疫原の調製 以下に示すフローチャートに従って、ハプテン誘導体１
４．１μｍｏｌ、ＢＳＡ２３．４mg用いて上記のハプテ
ン誘導体とＢＳＡとの複合体を調製した。得られた複合
体は、ＢＳＡ１分子当たり１７分子のハプテン誘導体が
結合されたものであった。
４．１μｍｏｌ、ＢＳＡ２３．４mg用いて上記のハプテ
ン誘導体とＢＳＡとの複合体を調製した。得られた複合
体は、ＢＳＡ１分子当たり１７分子のハプテン誘導体が
結合されたものであった。
【００２５】
【化３】
【００２６】（３）抗体の調製 上記免疫原と完全フロイントアジュバントとのエマルジ
ョンをウサギに免疫し、得られた抗血清をプロテインＡ
カラムにかけ、４種類の抗体（ＩｇＧ画分）を得た。
ョンをウサギに免疫し、得られた抗血清をプロテインＡ
カラムにかけ、４種類の抗体（ＩｇＧ画分）を得た。
【００２７】実施例２：抗体の性質 得られた抗体の性質は、図１に示すＲＩＡ法により評価
した。その結果、得られた抗体はいずれも高力価（至適
希釈倍率；１３００〜２２００００倍）であって、ドー
ズレスポンスカーブ（図２）から得られる検出限界は２
〜１０ｐｇ／チューブであった。また、公知の方法（Ａ
ｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１，６６０（１
９４９））により算出された抗体の親和定数（Ｋａ）
は、０．３４〜３．３×１０10（Ｍ-1）であった。
した。その結果、得られた抗体はいずれも高力価（至適
希釈倍率；１３００〜２２００００倍）であって、ドー
ズレスポンスカーブ（図２）から得られる検出限界は２
〜１０ｐｇ／チューブであった。また、公知の方法（Ａ
ｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１，６６０（１
９４９））により算出された抗体の親和定数（Ｋａ）
は、０．３４〜３．３×１０10（Ｍ-1）であった。
【００２８】さらに、抗体の交差反応性を公知の方法
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａ
ｂ．，２９，８６６（１９６９））で検討した結果、下
記表に示すように、１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3
に対する反応性を１００％とした時の他のビタミンＤ3
誘導体に対する反応性は６％以下であった。
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａ
ｂ．，２９，８６６（１９６９））で検討した結果、下
記表に示すように、１α，２５（ＯＨ）2 ビタミンＤ3
に対する反応性を１００％とした時の他のビタミンＤ3
誘導体に対する反応性は６％以下であった。
【００２９】
【表１】
【００３０】実施例３ 下記の試薬からなる図１に示すＲＩＡ法を実施するため
のキットを調製した。（ＲＩＡキット） 抗体試薬（本発明抗体） １α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 標準液 トレーサー（［２６，２７−メチル− 3Ｈ］−１α，
２５（ＯＨ）2 Ｄ3さらに必要により、デキストラン−
チャコール溶液または第二抗体溶液を添付してもかまわ
ない。
のキットを調製した。（ＲＩＡキット） 抗体試薬（本発明抗体） １α，２５（ＯＨ）2 Ｄ3 標準液 トレーサー（［２６，２７−メチル− 3Ｈ］−１α，
２５（ＯＨ）2 Ｄ3さらに必要により、デキストラン−
チャコール溶液または第二抗体溶液を添付してもかまわ
ない。
【図１】ＲＩＡ法の測定法を説明したものである。
【図２】本発明の抗体のドーズレスポンスカーブを示し
たものである。
たものである。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−262555（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−91074（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/53
Claims (4)
- 【請求項１】 下記の特性を有する１α，２５（ＯＨ）
２ビタミンＤ３に対する抗体。 親和定数（Ｋａ値） ０．３４〜３．３×１０１０（Ｍ−１） 交差反応性 １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する反応性を１
００％とした時の他のビタミンＤ３誘導体に対する反応
性は６％以下である。 - 【請求項２】 下記の特性を有する１α，２５（ＯＨ）
２ビタミンＤ３に対する抗体。 親和定数（Ｋａ値） ０．３４×１０１０（Ｍ−１）以上 交差反応性 １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する反応性を１
００％とした時の２５（ＯＨ）ビタミンＤ３に対する反
応性１．５％以下である。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の抗体を使用する
ことを特徴とする、１α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３
の測定法。 - 【請求項４】 請求項１または２記載の抗体を構成試薬
として含有することを特徴とする、１α，２５（ＯＨ）
２ビタミンＤ３の測定に使用するためのキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17410193A JP2968910B2 (ja) | 1993-07-14 | 1993-07-14 | １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17410193A JP2968910B2 (ja) | 1993-07-14 | 1993-07-14 | １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0727763A JPH0727763A (ja) | 1995-01-31 |
| JP2968910B2 true JP2968910B2 (ja) | 1999-11-02 |
Family
ID=15972670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17410193A Expired - Lifetime JP2968910B2 (ja) | 1993-07-14 | 1993-07-14 | １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2968910B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7745226B2 (en) | 2005-04-06 | 2010-06-29 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting vitamin D metabolites |
| EP1931999B1 (en) * | 2005-09-29 | 2011-10-26 | Roche Diagnostics GmbH | Release reagent for vitamin d compounds |
| US7972868B2 (en) | 2007-11-28 | 2011-07-05 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting dihydroxyvitamin D metabolites by mass spectrometry |
| US7977117B2 (en) | 2009-12-03 | 2011-07-12 | Quest Diagnostics Investments Incorprated | Vitamin D metabolite determination utilizing mass spectrometry following derivatization |
| CA3013468C (en) | 2009-12-11 | 2020-11-10 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Mass spectrometry of steroidal compounds in multiplex samples |
| US20120025067A1 (en) | 2009-12-11 | 2012-02-02 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Mass spectrometric determination of non-derivatized, non-metabolized vitamin d |
-
1993
- 1993-07-14 JP JP17410193A patent/JP2968910B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0727763A (ja) | 1995-01-31 |
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