JPS6210070A - ヒスタミン誘導体、免疫原接合体およびそれに対してレイズされた抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒスタミンは強力な血管活性仲介体であり、これは特異
的アレルゲンに対して暴露された後特異的に感作された
組織マスト細胞（ｔｉｓｓｕｅｍａｓｔ　　ｃｅｌｌ）
および塩基性染色細胞から放出され、こうして個体にお
いてアレルギーの応答を開始させる。アレルギー反応の
生体内の診断はアレルゲン皮膚試験により達成すること
ができるが、アナフィラキシ−反応の可能性のため危険
であることがあり、患者をアレルゲンに対して感作させ
、そして一般に不適当である。血清中のアレルゲン特異
的ＩｇＧ抗体の濃度を測定するための生体外試験法は利
用可能であるが、より有用な決定（ｄｅ　ｔ　ｅ　ｒｍ
ｉ　ｎａｔ　ｉ　ｏ　ｎ）はヒスタミンの放出のそれで
あり、これは生体内アレルギ一応答をより精確に反映す
ることができるであろう。したがって、本発明は、ヒス
タミン誘導体、免疫原担体物質に結合したヒスタミンま
たは前記ヒスタミン誘導体からなる免疫原接合体、およ
びこのような免疫Ｍ接合体に大して調製された抗体を提
供する。このような抗体は、例えば、アレルゲンのバッ
テリー（ｂａｔｔｅｒｙ）で感作された塩基性染色細胞
の対抗（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後、生物学的流体または
実験室の流体の中のヒスタミンの量を決定するための免
疫検定において有用である。

欧州特許出願１１０６４０　　Ａ２は、体液または実験
室の流体の中のヒスタミンのレベルを決定するための、
受容体に基づく拮抗阻害検定を開示している。また、「
ヒスタミン−指示体」接合体、例えば、ヒスタミン−セ
イヨウワサビのペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉ
ｓｈ　　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）接合体およびヒスタミ
ン−アルカリ性ホスファターゼ接合体が開示されており
、後者はｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミンプロピ
ル）カーポジイミドとの反応によりヒスタミンに接合さ
れる。上の発行された特許出願は、ヒスタミンを量的に
決定するための種々の方法、例えば、オルト−フタルア
ルデヒド接合の検定、酵素のアイソトープ検定およびク
ロマトグラフ技術の変法を概説している。

１、Ａｃａｄ、５ｃｉ−）ＵＳＡ、Ｖｏｌ、８１．２５
７２−２５７６ページ（１９８４年４月）には、ラット
の脳におけるヒスタミン含有細胞の免疫組織化学的研究
におけるヒスタミン抗血清の使用が開示されている。ヒ
スタミンが哺乳動物の中枢神経系における神経伝達物質
として作用するかどうかを決定するために、前記研究は
実施された。

ミタ（Ｍｉｔａ）ら［因子および作用（Ａｇｅｎｔ　　
ａｎｄ　　Ａｃｔｉｏｎｓ）、Ｖｏｌ、１４．５／６．
１９８４］は、ヒスタミンに対するポリクローナル抗体
をレイズ（ｒａｉｓｅ）するための試みにおいて使用し
た種々のハプテン担体接合体を開示している、しかしな
がら、著者らは認めているように、ヒスタミンに対して
特異的な抗体をレイズする試みは不成功に終った。

本発明は、 ＮＩＩ。

■ ＣＭ、ＮＨ。

■ 式中、 Ｒは結合基であり、モしてＸはカルボキシル、アミノ、
チオールまたはヒドロキシルから成る群より選択される
末端官能基である、 から成る群より選択されるある主のヒスタミン誘導体に
関する。

また、ヒスタミン誘導体またはヒスタミンに結合した免
疫原担体のヒスタミン免疫原接合体を開示し、前記接合
体は、 式中、 Ｒは結合基であり、Ｘｏは前記結合基Ｒを介して前記免
疫原担体へ前記誘導体を結合した後残る末端官能基Ｘか
らの残基であり、Ｐは約１〜約１２０であり、モして「
担体」は免疫原担体物質である、 から成る群より選択される。

本発明は、さらに、単一特異的（すなわち、モノクロー
ナル）抗体を包含する前記接合体に対して調製された抗
体および、生物学的流体または実験室の流体の中のヒス
タミンを決定するための試験キットおよび免疫学的方法
におけるそれらの使用に関する。

本発明のヒスタミン誘導体は、広い範囲の結合基Ｒおよ
び末端官能基Ｘを包含するような方法で調製することが
できる０例えば、Ｒは工ないし１５程度に多くの、より
通常ｌＯ以下の、通常６より少ない炭素原子からなる直
鎖状または分枝鎖状のアルキレン（すなわち、メチレン
、エチレン、ｎ−プロピレン、１ｓｏ−プロピレン、ｎ
−ブチレンなど）であることができる、さらに、このよ
うなアルキレンは、他の置換基、例えば、シアノ、アミ
ノ（置換アミンを包含する）、アシルアミノ、ハロゲン
、チオール、ヒドロキシル、カルボニル基、カルボキシ
ル（置換カルボキシル、例えば、エステル、アミドおよ
び置換アミドを包含する）を含有することができる。結
合基Ｒは、また、置換または非置換の７リール、アラル
キル、またはヘテロアリール（例えば、フェニレン、フ
ェネチジンなど）を含有するか、あるいはそれらから成
ることができる。さらに、このような結合は、窒素、イ
オウおよび酸素から選択される１または２以上の異種原
子をエーテル、エステル。

アミド、アミノ、チオエーテル、アミジノ、スルホン、
またはスルホキシドの形で含有することができる。また
、このような結合は、不飽和の基、例えば、オレフィン
系またはアセチレン系の結合、イミノまたはオキシミノ
基を包含することができる。好ましくはＲは１〜約２０
、より通常ｌ〜ｌＯの原子の鎖、通常脂肪族の鎖であり
、それらの原子は水素を排除し、それらのうち０〜５個
は窒素、酸素、およびイオウから選択される異種原子で
ある。したがって、結合基の選択は本発明にとって臨界
的でなく、そして当業者により安定な化合物が確実に製
造されるような通常の予備的注意を払って選択されうる
。同様に、末端官能基Ｘは広く変化することができるが
、アミノ、カルボキシル、チオールおよびヒドロキシル
が好ましい、好ましい誘導体のうちで１次の誘導体はと
くに好ましい： 種々の結合基Ｒおよび末端官能基Ｘを有するヒスタミン
誘導体を調製する代表的な方法を、ここで説明する。

Ｘがカルボキシルである式１のヒスタミン誘導。

体は、ヒスタミンをオメガ−ブロモアルカン酸（すなわ
ち、Ｂｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨｌここでｎは約１−
１０である）と反応させることによって調製することが
できる。Ｘが７ミノである式１の誘導体は、ヒスタミン
をオメガ−ブロモアルキルフタルイミドと反応させて式 式中、ｎは約１〜約ｌＯである、 の中間体を製造することによって合成することができる
。引き続いて、中間体ＸＩをヒドラジンで処理すると１
式１（すなわち、Ｒは−（ＣＨ２）ｎ−であり、モして
Ｘはアミノである）の対応するアミノ官能化ヒスタミン
誘導体を生成する。

Ｘがチオールである式■の誘導体は、対応するアミノ化
合物をＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ
）プロピオネートと、Ｊ、カールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ
）ら、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｊ、）、上ヱ旦、７２３　（１９８７）（その開示なら
びにその中に引用されている他の参考文献をここに引用
によって加える）の方法に従い反応させることによって
調製することができる。生ずる保護基の除去すると、式 式中ｎは約１〜約ｌＯの値を有する、 の式Ｉの誘導体が生成する。

あるいは、Ｘがチオールである式Ｉの誘導体は、また、
クロッブ（Ｋｌｏｔｚ）およびヘイネイ（Ｈｅ　ｉ　ｎ
ｅｙ）　、アーチーブス・オブ・バイオケミストリー・
アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、ＢｉｏｐｈｙＳ、）に記載されているようにして、
対応するアミン化合物をＳＡＭＳＡ試薬に反応させるこ
とにより調製することができる。保護基を引続いて除去
すると、式 ％式％ 式中ｎは約１〜約１０であることができる、を有する式
Ｉの誘導体が生成する。

Ｘがヒドロキシルである式Ｉのヒスタミン誘導体は１例
えば、対応するカルボキシル誘導体を、例えば、次のよ
うにして、水素化リチウムアルミニウムで還元すること
により容易に調製することができる： 式中、ｎは約１〜約１０である。

式■のヒスタミン誘導体は１例えば、Ｌ−ヒスチジノー
ルの化学的転位［アイスン（Ｉｓｎ）およびカシイ（Ｃ
ａｓｙ）、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミスト
リー（Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、）１３，１０２７．１９
７０１により、次の代表的な反応順序に従い調製するこ
とができる：Ｎｉｌ。

（ＸＩＶ＋ ＋ＸＶＩ禍 Ｌ−ヒスチジノール（ｘｒｖ）のアミノ官能性はｔ−ｂ
ｏｃ誘導体として保護し、そしてヒドロキシ　′ル基を
アセトニトリルと反応させて中間体Ｘｖを生成する（Ｒ
、Ｔ　、バラフラー（Ｂｕｃｋｌｅｒ）およびＦ、Ｅ、
ワード（Ｗａｒｄ）、米国特許第４，４９５，２８１号
］、シアノ基を接触還元し、次いでｔ−ｂｏｃ保護基を
希ＨＣＩで除去して化合物ＸＶＩ（すなわち、Ｒが−Ｃ
Ｈ２０ＣＨ２Ｃ）ｌｚ　ＣＨ２−テありかつｘがＮＨ２
である式■のヒスタミン誘導体のある種）を生成する。

弐■の官能化ヒスタミン誘導体は、例えば、イミダゾー
ル−４−アセトニトリルＸ■のＮ−）リフェニルメチル
（すなわち、トリチル）［Ｊ。

■、デグラウ（ＤｅＧｒａｗ）ら、ジャーナル拳オブ・
メディシナル拳ケミストリー（Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、
）　２０．１６７１．１９７７］により、次の代表的な
反応順序に従い調製することができる： Ｎ （ＸＸ１１１ 化合物Ｘ■をエチル５−ブロモバレレート［アルドリフ
ヒ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、）、ウィスコンシン州ミルウォー
キー］で水素化ナトリウムおよびヘキサメチルリン酸ト
リアミド（ＨＭＰＴＡ）の存在下にアルキル化する。生
成物ＸｖＩを、希アルカリでエステル官能を加水分解し
た後、還元して中間体ｘ■にする。この反応に種々の条
件、例えば、１５０気圧においてラネーニッケル−アン
モニア−水素、を使用することかでさる［例えば、Ｇ、
Ｊ、デュラント（Ｄｕｒａｎｔ）ら、英国特許１．３４
１．３７６号；ケミカル・アブストラクツ（Ｃｈｅｍ、
Ａｂｓ　、）、８０Ｆ、９５９８ｇ、１９７４］、）リ
チル保Ｍ基を除去するとＸＸ、式■（ここでＲは−（Ｃ
Ｈ２）４−でありかつＸはカルボキシルである）のヒス
タミン誘導体を生成する。

式■の代表的ヒスタミン誘導体は１例えば、Ｌ、に、ケ
スズチウス（Ｋｅｓｚｔｙｕｓ）ら、英国特許１，０１
７，４７９号およびケミカル嗜アブストラクツ（Ｃｈｅ
ｍ、Ａｂｓ、）、６４゜Ｐ１２４７０ｊに記載される手
順により調製することができる。このような手順は、次
の式を有する式■の代表的な誘導体を調製するであろう
：（ＸＸＩＩ 次いで、ヒスタミン誘導体を使用して前記誘導体の結合
基Ｒおよび末端官能基Ｘを介して免疫原担体物質へ前記
誘導体を結合することができる。

免疫原担体物質は普通に知られているものから選択する
ことができる。大抵の場合において、担体は蛋白質また
はポリペプチドであろうが、十分な大きさの他の物質、
例えば、炭水化物、多糖類、リボ多糖類、核酸類などを
使用することができ、そして免疫原性を同様に使用する
ことができる。

大抵の場合について、免疫原の蛋白質およびポリペプチ
ドは５．０００〜１０，０００，０００、好ましくは１
５，０００より大きく、より通常５０．０００より大き
い分子量を有するであろう、一般に、１つの動物種から
取った蛋白質は、他の種の血液の流れの中に導入すると
き、免疫原となるであろう、とくに有用な蛋白質は、ア
ルブミン、グロブリン、酵素、ヘモシアニン、グルテリ
ンまたは優位の蛋白質以外の構成成分、例えば、糖蛋白
質を有する蛋白質などである。従来の免疫原担体物質お
よびそれにハブテンを結合する技術に関する技術状態に
ついて１次の文献をさらに参照することができる：パー
カー（Ｐａｒｋｅｒ）、生物学的に活性な化合物の放射
線免疫検定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　ｏ
ｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　　Ａｃｔｉｖｅ　　
Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、プレンティス−ホール（Ｐｒｅ
ｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ）（米国ニュージャーシイ州エン
グルウッド・クリフス、１９７６）；パトラ−（Ｂｕｔ
　ｌ　ｅ　ｒ）　、ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メソ−、ズ（Ｊ　、Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ）７：　１−２４　（１９７５）およびファーマコ
ロジカル舎すビューズ（Ｐｈａｒｍａｃｏ　１　、　　
Ｒｅｖ、）２９　（２）：１０３−１６３　（１９７８
）；ワインリブ（Ｗｅ　ｉ　ｎ　ｒｙ　ｂ）およびシュ
ロッフ（Ｓ　ｈ　ｒ　ｏ　ｆ　ｆ）、ドラッグ・メタポ
リズム・リビューズ（Ｄｒｕｇ　　Ｍｅｔａｂ、Ｒｅｖ
、）１０：２７１−２８３　（１９７５）：ブラーフト
ン（Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ）およびストロング（Ｓｔｒｏ
ｎｇ）、クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅ
ｍ、）２２ニア２６−７３２　（１９７６）；およびプ
レイフェアー（ｐｌａｙｆａｉｒ）ら、プリティッシ拳
メディカル・ブレチン（Ｂｒ、Ｍｅｄ、Ｂｕｌ　１）３
０：　２４−３１　（１９７４）、本発明における使用
に好ましい免疫ａ担体物質は、ウシ血清アルブミンおよ
びキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ
　　ｌｉｍｐｅｔ　　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）である、
キーホールリンペ−／　）ヘモシアニンは本発明におけ
る使用にとくに好ましい。したがって、とくに好ましい
免疫原接合体は、式Ｘのヒスタミン誘導体をキーホール
リンペットヘモシアニンに結合することによって形成さ
れた接合体である。

ヒスタミン誘導体は、よく知られた技術に従って免疫原
担体物質へ結合することができる０例えば、ヒスタミン
誘導体の末端官偉基Ｘが７ミノであるとき、前記誘導体
は前記担体へ次の手段により直接結合することができる
。ヒスタミン部分のアミ７基は、アミノ含有担体（例え
ば、蛋白質またはポリペプチドの担体）へ、トルエン−
２，４−ジイソシアネー）［Ａ、Ｆ、シック（Ｓｃｈｉ
ｃｋ）およびＳ、Ｊ、シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）、ジャ
ーナル・才ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、
　Ｂ　ｉ　ｏ　ｌ　、Ｃｈｅｍ、）　２４４：４０６　
（１９６９））　　；グルタルアルデヒド［Ｌ、Ａ、７
０−マ７　（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、エンドクリノロジー
（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　、）８７　：１０５５　（１
９７０）］　　；］ビスーイミデートＡ、ダットン（Ｄ
ｕｔｔｏｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ　ｏｈｐｙｓ、
Ｒｅｓ、ｃｏｍｍ、）２３ニア３０　（１９６Ｂ）］お
よびクロロトリアジン［Ｔ、ラング（Ｌ　ａ　ｎ　ｇ）
ら、ジャーナル・才ブ・ケミカルシソサイアティ・パー
キン・トランサクション（Ｊ、Ｃ，Ｓ、Ｐｅｒｋｉｎ）
４：２１８９　（１９７７）］により取り付けることが
できる。また、前記アミ７基はカルボキシル含有担体（
例えば、再び、蛋白質またはポリペプチドの担体）へ、
汀通のペプチド結合形成反応により、混合無水物、活性
化エステル、アシルアジドの形成、カーポジイミドを使
用して結合することができる０例えば、次の文献を参照
：ペプチド類（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、グツドマン（Ｇｏ
ｏｄｍａｎ）およびメインホウ７ｙ−（Ｍｅ　ｉ　ｎｈ
ｏｆｅｒ）！、ジョン・ウィリー・アンド・サンプにュ
ーヨーク、１９７７）６ページ以降、およびペプチド類
、分析、合成、生物学（Ｔｈｅ　　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、
Ａｎａｌｙｓｉｓ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ）Ｖｏｌ、ｌ、アカデミツク・プレスにューヨーク、
１９７９）、カルボキシル化誘導体（すなわち、末端官
能基Ｘがカルボキシルであるヒスタミン誘導体）をアミ
ノ含有担体へ結合するために、同一の方法を同様に適用
する。

チオール化ヒスタミン誘導体（すなわち、末端官能基Ｘ
が千オールであるヒスタミン誘導体）は、対応するアミ
ン化合物から、Ｉ　、Ｍ、クロツク（Ｋ　ｌ　ｏ　ｔ　
ｚ）およびＲ，Ｅ、ヘイネイ（Ｈｅｆｎｅｙ）、アーチ
ーブス・オブーバイオケミストリー〇アンド・バイオフ
ィジックス（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ　ｏｐｈ
ｙｓ、）９５：６０５　（１９６２）の手順により調製
することができ、そしてこれらをチオール含有ポリマー
（工ｇＧまたはチオール化蛋白質）にジサルファイド交
換手順［Ｊ、マーチン（Ｍａ　ｒ　ｔ　ｉ　ｎ）ら、バ
イオケミストリー（Ｂｆ　ｏｃｈｅｍ、）２０：４２２
９　（１９８１）］により結合することができる。ある
いは、アミノ含有ポリマーを試薬ＭＢＳと反応させ、そ
して生成物をチオール含有誘導体にＴ、キタガワ（Ｋｉ
　ｔ　ａｇａｗａ）およびＴ。

アキカワ（Ａｋｉ　ｋａｗａ）、ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）７９：２３
３　（１９７６）に記載される方法により結合すること
ができる０本発明の種々のヒスタミン誘導体を従来の免
疫原担体物質と接合するために、種々の他の結合技術を
利用することができる。

接合体の残基Ｘ′は、もちろん、使用する特定のヒスタ
ミン誘導体にしたがって変化することができ、すなわち
、イミノ、スルホ、オキシなどであることができる。

あるいは、ヒスタミン分子自体の末端アミン基は、免疫
原担体物質（例えば、ウシまたはヒト血清アルブミン、
キーホールリンペ−／　）ヘモシアニンなど）に、中間
の結合基Ｒまたは本発明のヒスタミン誘導体について前
述した他の末端官能基Ｘを使用しないで、直接結合する
ことができる。しかしながら、これらの接合体の形成に
おいて、ヒスチジンとの優位の交差反応の不存在下に、
ヒスタミンに対して十分な特異性を有する抗体を形成す
るのにこの型の接合体（すなわち、中間体の結合基Ｒま
たは他の末端官能基Ｘを含有しないもの）を利用するた
めに、末端アミン基の塩基性特性を維持しなくてはなら
ない、しかしながら、この末端アミン官能の塩基性特性
が結合の間に失われる場合、この型の接合体は、それに
対する抗体をレイズするという以外の目的で、後述する
種々の免疫検定においてなお有用である。これの接合体
の結合は、前述したような普通の技術により、混合無水
物、活性化エステル、アシルアジドの形成、カーポジイ
ミドなどにより普通のペプチド結合形成反応によって実
施することができる。好ましくは、これらの接合体につ
いて、結合試薬はカーポジイミド、とくにｌ−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カーポジイミド塩
酸塩（Ｅ　Ｄ　Ａ　Ｃ）である。

ここにおける免疫ｒＸ接合体を説明する式において使用
したように、ｒＰＪは担体へ接合したヒスタミン部分の
数を表わす、数ｐは時には免疫原のエピトープ密度と呼
び、そして通常の場合において、平均約１〜約１２０、
より通常１〜約５０であろう、しかしながら、これらの
密度は使用する特定の担体に依存して大きく変化しうる
であろ本発明の免疫原接合体を使用する特異的抗体の調
製は、普通の技術に従うことができる。抗体の形成を誘
導する基本的な面を説明する多数の技術が利用可能であ
る：例えば、次の文献を参照することができる：パーカ
ー（Ｐａｒｋｅｒ）、生物学的に活性な化合物の放射線
免疫検定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　ｏｆ
　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　　Ａｃｔｉｖｅ　　Ｃ
ｏｍｐｏｕｎｄＳ）、プレンティス−ホール（Ｐｒｅｎ
ｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ）（米国ニュージャーシイ州エング
ルウッド・クリブス、１９７６）、通常の場合において
、宿主動物、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモッ
トまたはウマに、しばしばアジュバントと混合して、ｌ
または２以上の種々の部位に免疫原接合体を注射する。

それ以上の注射を同一または異なる部位において規則的
な間隔または不規則的な間隔で行い、その後採血し、最
適な力価に達成するまで、抗体の力価を評価する。宿主
動物を特異的抗血清の適当な体積が得られるまで採血す
る。望ましい場合、精製工程を実施して望ましくない物
質、例えば、非特異的抗体を除去した後、抗血清は実際
の検定の実施における使用に適すると考える。

好ましい実施態様において、抗体はツマチック細胞の交
雑技術により得られ、このような抗体はモノクローナル
抗体と普通に呼ばれる。モノクローナル抗体の産生は後
に詳述するが、このようなモノクローナル抗体の技術は
次の刊行物に概説されている：リンパ球ハイブリドーマ
類（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）
、　　メルチャ−（Ｍｅ　ｌ　ｃ　ｈ　ｅ　ｒ　Ｓ）ら
編、スブリンガーーベルラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ）にューヨーク１９７８）；ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）２６６：４９５　（１９７７）；サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０８：６９２　（１９８０）；
およびメソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ　１　ｏｇｙ）７３（部Ｂ
）：　３−４６　（１９８１）。

本発明の免疫原から調製した抗体は、種々の免疫検定法
、および対応する試薬手段で、ヒスタミンを決定するた
めに１例えば、凝集技術、放射線免疫検定、不均質酵素
免疫検定（例えば、米国特許第３，６５４，０９０号）
、不均質蛍光免疫検定（例えば、米国特許第４，２０１
，７６３号、米国特許第４，１７１，３１１号、米国特
許第４．１３３，６３９号および米国特許第３，９９２
．６３１号）、および均質（分離不合）免疫検定におい
て使用することができる。このような均質免疫検定は、
次のような技術を包含する：蛍光クエンチングまたは増
大（例えば、米国特許第４．１６０，０１６号）、蛍光
の偏光［ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メデ
ィシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）１２２：１０２９　（
１９６５）、酵素基質標識免疫検定（例えば、米国特許
第４，２７９，９９２号および英国特許明細書１．５５
２．６０７号）、補欠分子族標識免疫検定（例えば、米
国特許第４，２３８，５６５号）、酵素仲介体標識免疫
検定）、例えば、阻害剤の標識を使用するもの（例えば
、米国特許第４．１３４，７９２号および米国特許第４
，２７３．８６６号）、酵素標識免疫検定（例えば、米
国特許第３，８１７，８３７号）、エネルギー伝達免疫
検定（例えば、米国特許第３　、９９６　、３４５号）
、化学的に励起された蛍光免疫検定（米国特許第４，２
３８，１９５号）および二重抗体立体障害免疫検定（例
えば、米国特許第３，９３５．０７４号および米国特許
第３，９９８，９４３号）、その上、本発明の誘導体を
使用して、前述の免疫検定のあるものを実施するために
必要な標識接合体を調製することができる。適当な誘導
体は、標準法に従い、例えば、放射線で、蛍光部分、化
学ルミネセンス部分などで標識することができる。同様
に、均質技術のための適当な標識部分、例えば、酵素基
質、補欠分子族、酵素仲介体、または酵素（これは蛋白
質であり、そして同様に前述のような免疫原担体に結合
することができる）を誘導体に結合して標識された接合
体を生成することができる。好ましい実施態様において
、ヒスタミン開放免疫検定は酵素の免疫検定を経て便利
に実施され、ここで抗体（好ましくはモノクローナル抗
体）を酵素１例えば、セイヨウワサビ（ｈｏｒｓ１弓Ｍ
）のペルオキシダーゼ。

アルカリ性ホスファターゼ、リソチーム、グルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなどに結合する。結
合は汀通の技術により、種々の交差結合剤、例えば、グ
ルタルアルデヒド、シマレイミドまたはチオール試薬を
使用して、Ｊ、Ｗ、フレイタグ（Ｆｒｅｙｔａｇ）ら、
クリニカル・ケミストリー（ＣＩ　ｉ　ｎ、Ｃｈｅｍ、
）、３０．４１７−４２０　（１９８４）に記載される
ようにして達成される０次いで、酵素′Ｊｓ賀（例えば
、発色性酵素基質）を準備し、そして抗原濃度は標準の
抗原濃度に容易に関係づけることができる。

このような検定は典型的には生物学的流体または実験室
の流体について実施する。「生物学的流体または実験室
の流体」という用語は、ここで使用するとき、流体の調
製物、例えば、種々の生物学的物質１例えば、チーズ、
魚、ワインなどならびに自然の生理学的物質、例えば、
血液、尿、唾液などから調製された抽出物を呼ぶ、また
、この用語は、ヒスタミン含量を決定すべき任意の物質
を呼び１例えば、所定の試料中のヒスタミンの位置を決
定することが望ましいことがある組織化学的分野の領域
を包含する。

本発明の範囲内に、また、ヒスタミンについての免疫検
定を実施するたに商業的単位、例えば。

試験キットが提供される。このようなキットは１または
２以上の容器、例えば、マイクロタイター平板（ｍｉｃ
ｒｏｔｉｔｅｒ　　ｐｌａｔｅ）、固体の支持体、試験
管、トレーなどならびに、例えば、凍結乾燥した形態の
、抗血清を包含するであろう、このキットは、また、標
準量のヒスタミン（これにより標準曲線をｍ成すること
ができる）、観測可能なあるいは他の方法で測定可能な
反応を誘発するために必要な試薬を保持するための容器
などを含有することができる。明らかなように、当業者
は、任意の特定の免疫検定における使用に適するキット
を調製することができ、その精確な物理的実施態様は考
える型の検定に依存するであろう。

好ましい試験キットは、細胞から生物学的流体、例えば
、全血、塩基性染色細胞、尿、唾液などの中へ誘導ヒス
タミンの開放を決定するために調製された商業的単位で
ある。このようなキットの成分は、前述のような抗血清
、マイクロタイター平板、ヒスタミンの標準物質、試薬
などに加えて、例えば、ヒスタミンの開放を誘導する因
子、種々の希釈剤および緩衝液の１種または２種以上を
含むことができる。このキットは、また、固体の支持体
へ結合したヒスタミン接合体または抗体ならびに標識さ
れた抗体または標識されたヒスタミンの接合体を含有す
ることができる。

次の実施例により本発明を説明する。

実施例１ ヒスタミンプロピオン酸誘導体の調製 １０ｍ１のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１．１
１ｇのヒスタミン（遊離塩基）および３．０２ｍ１のト
リエチルアミンの溶液を、５ｍｌのＤＭＦ中の１．５３
ｇの３−プロモープロピオン酸の溶液に添加した。この
溶液を室温で２時間攪拌し、次いで８０℃に２．５時間
加熱し、その後溶媒を蒸発により除去すると、ゴム状残
留物が残った。前記残留物を１０　ｍ　ｌのＣＨＣ１３
／ＭｅＯＨ／ＮＨａ　ＯＨ（それぞれｌＯ：５：１）の
混合物からつくった緩衝液中に溶解し、そして５０ｇの
シリカゲルのカラム（同一緩衝液中に充填された）上に
適用した。このカラムをこの緩衝液で約２５ｍ１／分画
の速度で溶離した。所望生成物をプールしく分画３３−
６３）そして蒸発乾固した。残留物を１０ｍ１のエタノ
ールから結晶化すると、６００ｍｇの表題化合物（上の
式Ｘで表わされる）が得られた、融点１９０−１９１℃
。

Ｃ８Ｈ，３Ｎ３０・１／２Ｈ２０についての分析値：Ｃ
＝４９．９９．Ｈ＝７．３４；Ｎ＝２１゜８７、実測値
：Ｃ＝５０．６２；Ｈ＝７．５１　。

Ｎ＝２１．８９゜ 実施例２ ヒスタミンプロピオン酸−ウシ血清アルブミン免疫原接
合体の調製 ６８ｍｇのヒスタミンプロピオン酸（実施例１に記載す
るようにして調製した）およびウシ血清アルブミン（１
００ｍｇ）を１５ｍ１のＨ２Ｏ中に溶解した。生ずる溶
液を水浴中で冷却し、そしてｐＨを４．５に１規定（Ｎ
）のＩ（ＣＩで調節した。これに３２０ｍｇの１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カーポジイ
ミドｋＭｍ塩（Ｅ　Ｄ　Ａ　Ｃ）を少しずつ（Ｗｌ拌し
ながら）添加した。この反応混合物のｐ）ＩをＥＤＡＣ
の添加を通じて４．５−５．０　（ＬＨのＨＣＩで）に
維持し、次いでこの混合物を０℃で３時間攪拌し、次い
で５℃で一夜攪拌した０次いで、この混合物のｐＨＱＩ
ＮのＮａ０Ｈ（７）添加により７．０に調節し、次いで
この混合物をＰ−１０カラム（２，５Ｘ４０ｃｍ、０．
０２５モルのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７，０と平衡化した
）上に適用した０次いで、この同じ緩衝液を使用してこ
のカラムを溶離した。最初のＵＶ吸収蛋白質のピークを
集め、そして蛋白質濃度を２８０ｎｍにおける吸収によ
り決定した、すなわち、ｍｇ／ｍｌの溶液についてＡ２
８０＝０．６６゜ヒスタミンの量は、ハビーブ（Ｈａｂ
ｅｅｂ）のＴＮＢＳ法を使用して免疫原上の残留遊＠Ｎ
Ｈ２基により決定した。この手順を使用して、ウシ血清
アルブミンの約８０〜９０％が回収された。ヒスタミン
：ウシ血清アルブミンのモル比は１３〜２１であること
がわかった。

実施例３ ヒスタミンプロピオン酸−キーホールリンペットヘモシ
アニン免疫原接合体の調製 キーホールリンペットヘモシアニン（２００ｍｇ粗製、
カルーバイオケム［Ｃａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ）から商業
的に入手可能１を４ｍｌの５０ミリモルの炭酸１ｊ２緩
衝液（ｐＨ９，６）と混合し、そして短時間渦形成し、
そして超音波処理した。

生ずる溶液ｃ７）ｐＨを２Ｎ（７）Ｎ　ａｏＩ（ｔ’ｐ
Ｈ９、６に調節し、次いで室温で一夜攪拌した６次いで
、この混合物を１０．００Ｏｒｐｍで１５分間遠心し、
その後上澄み液を回収し、そして合計の蛋白質濃度を２
８０ｎｍにおける吸収により決定した（この溶液の２０
ＪＬｌを２．０ｍｌのＨ２Ｏで希釈し、モしてｍ　ｇ　
／　ｍ　Ｉの溶液についてＡ２８０＝１．６６を使用し
た；約１００ｍｇの蛋白質が回収された）、８２ｍｇの
ヒスタミンプロピオン酸（実施例１に記載するようにし
て調製した）を上の上澄み液に添加し、モしてｐＨをＩ
ＮのＨＣｌの添加によりｐＨ５，０に調節した０次いで
、水を使用して合計の体積を７．５ｍｌにし、そしてこ
の溶液を水浴中で冷却した。ｌ−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−カーポジイミド（１５５ｍｇ
）を冷却した溶液に攪拌しながら添加し、モしてｐＨを
４．７−４．９に２時間維持した（０℃）。次いで、こ
の溶液のＰＨを５６５に調節し、次いで５℃で一夜攪拌
した。この混合物を透析管に移しく限界１２，０００−
１４．０００ダルトンのカットオフ）そして５℃におい
てリン酸塩緩衝化食塩溶液（１リツトル）に対して透析
した。５回の交換（７日）後、管内の懸濁液を回収し、
その小部分を１０．００Ｏｒｐｍで１５分間遠心した。

この上澄み液を使用して２８０ｎｍにおける吸収により
蛋白質濃度を決定し、そしてヒスタミンの量をハビーブ
（Ｈａ　ｂ　ｅｅｂ）のＴＮＢＳ法により免疫原上の残
留遊離ＮＨ２基により決定した。この物質のすべては合
わせ、そしてリン酸塩緩衝化食塩溶液で５０ｍ１に希釈
して所望の免疫原接合体を得た。ヒスタミン：キーホー
ルリンペットヘモシアニンのモル比は８３〜１１６であ
ることがわかった。

実施例４ ヒスタミンプロピオン酸−ウシ血清アルブミン免疫原接
合体の調製 ７５　ｍ　ｇのウシ血清アルブミｙ　（ＢＳＡ）、３８
．４ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−カーポジイミドおよび１８４ｍｇのヒスタミン
を、０．１モルのホウ酸溶液中で混合して４．０ｍｌの
合計の体積にした（ｐＨは４−５に維持した）、−夜攪
拌（室温）した後、この混合物をリン酸塩緩衝化食塩溶
液に対してし゛て広範に透析した。２８０ｎｍにおける
吸収を測定し、そして蛋白質濃度を計算した。ヒスタミ
ンエピトープの濃度は、シンチレーションカウンティン
グにより、トリチル化ヒスタミンのトレーサーを使用し
て決定し、２回の代表的な実験は１７および５３のヒス
タミンエピトープの濃度を有した。２回の実験からの接
合体を合わせ、そして実施例６に記載する検定の手順に
おいて使用した。

実施例５ 抗体の産生 標準の技術に従い、雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスをヒスタミ
ン−ウシ血清アルブミンおよび／またはヒスタミンプロ
ピオン酸−キーホールリンペットヘモシアニン免疫原接
合体（それぞれ実施例２および３に記載するようにして
調製した）で免疫化し、そしてほぼ４か月間にわたって
周期的に採血した。免疫化したマウスからの肺細胞を非
分泌性骨髄腫細胞系統Ｘ６３．Ａｇ８　６５３　［受託
番号ＣＲＬ　　１５８０を有し、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から一
般に入手可能である］とそれぞれ２：ｌの比で混合し、
そしてウシ胎児血清を含有しないＲＰＭＩ　　１６４０
培地の存在下に５０％のポリエチレングリコール（分子
［１，５００）と融合した。生ずるハイブリドーマをフ
ィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）細胞としてマウスのリンパ球
を有する９６ウエルのマイクロタイター平板の中に接種
した。基本組織培地を１５％の胎児ウシ血清アルブミン
およびハイポキサンチンおよびチミジンを含有するＲＰ
ＭＩ　　１６４０から構成した。

雑種を培地への７ミノプテリンの添加により選択した。

全体の血清中の抗ヒスタミン活性を、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）の沈殿により検出した。７０．０００
−１００．０００力ウント／分（ｃｐｍ）を含有するｌ
Ｏ鉢ｌの３Ｈ−ヒスタミン［ニュー・イングランド・ニ
ュークリアー（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｇ　　Ｎｕｃｌ
ｅａｒ）］を、１１００ｇのマウス血清（リン酸塩緩衝
化食塩水で１＝１０に希釈）または１００ｇ１の組織培
養上澄み液とともに２〜３時間室温でインキュベーショ
ンした。組織培養上澄み液の場合において。

１００μｌのウシガンマグロブミン（２ｍ　ｇ　／　ｍ
ｌ）の添加した。抗体を６００１Ｌｌのポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）６０００　（２０％Ｗ／Ｖ）で沈殿
させた。沈殿物をＰＥＧ（２０％）で２回洗浄し、蒸留
水中に再懸濁し、そしてシンチレーションカウンティン
グのため３　ｍ　ｌの液状シンチレーションカウンティ
ング流体中に取った。

ＰＥＧ沈殿検定により陽性のハイブリドーマ細胞の培養
物を、単細胞選択技術により増殖およびクローニングし
た。倒立顕微鏡の助けにより、単細胞を希薄細胞懸濁液
から細長いパスツールピペットの中に抜出した１次いで
、単細胞をマウスリンパ球フィーダー細胞を含有するマ
イクロタイターウェル中に接種した。

クローニングしたハイブリドーマ（１０７／マウス）を
プリスタンプライムド（ｐｒｉｓｔａｎｅ　　ｐ　ｒ　
ｉｍｅｄ）ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける腹水中で増殖し
た。腹水からの抗体を、次にようにして、カプリル酸沈
殿により精製した。２体積の酢酸塩緩衝液（６０ミリモ
ル、ｐＨ４）を１体積の腹水と混合し、そしてｐＨを４
．８に調節した。カプリル酸（０，７４ｍ１／１０ｍ１
ｌｔｌｊ水）を室温において滴々添加し、そして生ずる
懸濁液を３０分間攪拌した。４，０００Ｘｇにおける遠
心後、上澄み液を集め、リン酸に１；１緩衝化食塩水に
対して４℃で広範に透析してＩｇ分画を得た。精製した
Ｉｇ分画の高性能液体クロマトグラフィーは、マウスＩ
ｇＧに相当する分子量において主要なピークを明らかに
した。ケミコン・マウス・アイソタイピング・キット（
Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　　Ｍｏｕｓｅ　　ｉｓｏｔｙｐｉｎ
ｇ　　ｋｉｔ）を使用する亜群およびアイソタイプ（ｉ
ｓｏｔｙｐｅ）の分析は、増殖した（ｅｘｐａｎｄｅｄ
）雑種の各々がＩ　ｇＧｌを産生じていることを決定し
た。

ムエラー（Ｍｕｅ　１１　ｅ　ｒ）のＲＩＡ阻害検定［
メソッズ・イン・エンジモロジ−（Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、９２（１９
８３）、５８９−６０１、アカデミツク・プレグ］を使
用して、抗体の親和性を測定した。この方法は、３Ｈ−
ヒスタミンの特定した量を結合するだめに要する抗体溶
液の分画の決定を包含する（ＰＥＧ沈殿検定により決定
した）０次いで、トレーサーの結合の５０％を阻止する
ために必要なコールド（ｃ　ｏ　ｌ　ｄ）ヒスタミンの
量を決定した。はぼ２Ｘ１０６モルー１の親和定数が、
選択したクローンについて決定された。この方法により
産生された抗体はヒスチジン（ヒスタミン代謝前駆体）
またはｌ−メチル−ヒスタミンとの実質的な交差反応性
を示さず、こうして前記抗体をヒスタミンについての全
血の検定において有用とする。前記抗体を産生ずるハイ
ブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に受託され、そして
受託番号ＨＢ８８３１を与えられた。

実施例６ ヒスタミン開放の検定 実施例４のビスタミンーウシ血清アルブミン接合体を、
ｏ、ｉモルのＮ　ａ　ＨＣＯ３、ＰＨ９、６に７５μｇ
　／　ｍ　ｌのＣ度に添加した。この溶液の５０ＪＬｌ
の７リコートを、丸底のマイクロタイタートレー（「コ
ーチインプレート」と呼ぶ）のウェル内に配置した。こ
れらのウェルの数個を開いたまま放置するか、あるいは
０．１モルのＮａＨＣＯ３緩衝液中の５０１Ｌｌのウシ
血清アルブミン（７５ＩＬｇ／ｍｌ）を充填して対照と
した０次いで、９６ペグ（ｐｅｇ）をもつふた［例えば
、ＮＵＮＣＴＳＰ・または７フルコｙ（Ｆａｌｃｏｎ）
ＦＡＳＴ・のふた］をコーチインプレート上に配置し、
約１時間室温においてインキュベーションした０次いで
、ペグをもつふたを除去し。

蒸留水中（７）０．０５％のライ−７（Ｔｗｅ　ｅ　ｎ
）２０の混合物の４００ｍ１で洗浄した。次いで、第２
のマイクロタイタートレー［以後「リリースブレー）（
ｒｅｌｅａｓｅ　　ｐｌａｔｅ）」と呼ぶ］を１次のよ
うにして、ヒスタミン開放プロセスのために調製した。

連続の重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェル内に５．５．
１のヒスタミンの標半溶液を入れることによって、ヒス
タミン標準曲線をつくった。これらの標準溶液は、蒸留
水またはトリス（Ｔｒ　ｉ　ｓ）ＡＣＭ希釈剤［すなわ
ち。

２５ミリモル、ｍＭのトリス（ｐＨ７，６）。

Ｑ　、　２％ｊＬ、ノＮａＣｌ　；５ミリモルのＫＣｌ
；０．３ｍｇのヒト血清アルブミン；ｌミリモルｃｙ）
ＣａＣ１２；および０．５ミリモルｃ７）ＭｇＣ１２］
の中に、それぞれ、１０，０００．３３３３．１１１１
．３７０，１２３および４１ナノモル（ｎＭ）のヒスタ
ミンを含有した。検定の過程において、ヒスタミン希釈
液の濃度をさらに１０倍に希薄にした。５０％のグリセ
ロール中の原料の（ｓｔａｃｋ）アレルゲンを、希釈剤
としてトリスＡＣＭまたは蒸留水を使用して、７種類の
系統的１０倍の希釈物に希釈した。各希釈物（原料を含
まない）からのアリニー）　（５，５ＪＬｌ）ｅリリー
スプレートの連続の重複ウェルに入れた。

このプロセスは、最終のリリースプレートが５゜５１Ｌ
１のヒスタミンの標準、アレルゲン希釈物またはトリス
ＡＣＭ緩衝液（対照のウェルについて）をすべての所望
ウェル内に有するまで、試験すべき各所望のアレルゲン
について反復した０次いで、リリースプレートはすぐに
使用できる状態にあった。

被検者の患者からのヘパリン添加血液を採取し、モして
トリスＡＣＭと混合（１：　１）　ｌ、た（各プレート
は２．５ｍｌのトリスＡＣＭと混合した２、５ｍｌの血
液を必要とした）、パウル・ナカネ（Ｐａｕ　ｌ　　Ｎ
ａｋａｎｅ）、免疫検定：１９８０年代のための臨床実
験技術（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｃ１１ｎｉｃａｌ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｔｅｃｑｕｎｉｑｕｅｓ　
　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　１９８０’ｓ）［編者、ナカム
ラ、８１Ｍ９、シト（Ｄｉｔｏ）、Ｗ、Ｒ，およびタッ
カ−（Ｔｕｃｋｅ　ｒ）、Ｅ、Ｓ　、］　、７ランＲ９
リス、インコーホレーテッド（ＡｌａｎＲ，Ｌｉ５ｓ、
Ｉｎｃ、）ニューヨーク（１９７８）に記載される過ヨ
ウ素酸塩ホウ水素化物の化合物法により、モノクローナ
ル抗−ヒスタミン抗体−セイヨウワサビのペルオキシダ
ーゼ接合体を調製した。この抗体−酵素接合体の少量を
トリスＡＳＭ／血液混合物に添加して、適切な前もって
決定した接合体濃度（約０．５１Ｌｇ／ｍｌ）を生成し
た。次いで、この混合物のアリコートをリリースプレー
トの各ウェルに入れ、そして３７℃で１５分間インキュ
ベーションしてヒスタミンを開放させた０次いで、９６
ペグをもつ前述のように調製したふたを、各ペグがウェ
ル中に導入されるようにして、リリースプレート上に配
置した。

次いで、この立体的配置を室温で３０分間インキュベー
ションし、その後ペグをもつふたを除去し、そして前述
のようにツイーン２０／ウエルの４００　ｍ　ｌの部分
で２回洗節した０次いで、とのペグをもつふたを第３の
マイクロタイタートレー【以後「クロマゲンプレー）　
（ｃｈｒｏｍａｔｅｎ　　ｐｌａｔｅ）Ｊと呼ぶ１の中
に配置した。このマイクロタイタートレーには、５０Ｉ
Ｌｌ／ウエルに次の溶液が添加されていた：０．８ｍｇ
／ｍｌの２，２°−アジノージ−（３−エチル−ベンズ
チアゾロン）−６−スルホン酸（すなわち、ＡＢＴＳ）
　：および０．１モルのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４，２
）中の２ミリモルの尿素過酸化物。

適当なインキュベーション時間（室温において約１５分
）後、ペグを除去し、モしてＥＬＩＤＡリーダーを使用
してクロマゲンプレートの各ウェルの内容物の吸収性（
４１５ナノモル）を決定した。ヒスタミンの開放の評価
は、とくにペグがまずコーチインプレート中でヒスタミ
ン−蛋白質接合体、好ましくは実施例４に従って調製し
たヒスタミン−ウシ血清アルブミン接合体で被覆されて
いる場合、視的検査により行うことができる。開放され
たヒスタミンの実際の濃度は、標準曲線（＃述のように
して作成した）から得ることができ、そして、必要に応
じて、アレルゲンの希釈物に対してしてプロットするこ
とができる。このようなプロヤトから、アレルゲンに対
する患者の感受性に関する判定を行うことができる。非
常に希薄なアレルゲンのレベルにおいて起こるヒスタミ
ンの開放は高い感受性を示すことができ、またその逆も
当てはまる。

チモシー草（Ｔｉｍｏｔ　ｈｙ　　ｇｒａｓｓ）抽出物
に対して感受性であることが臨床的に知られている患者
から取った血液試料からの、前述のヒスタミン開放検定
により、表Ｉに示すデータが得られた。この血液試料を
チモシー草の種々の希釈物と対抗させ、そして開放され
たヒスタミンの量を前述のヒスタミン標準曲線を参照し
て決定した。

表エ チモシー草抽出物に対して暴露したときのヒスタミンの
開放 相対的アレルゲン　ヒスタミン 吸収（ａ）　　　濃度（ｂ）　　　　の濃度（ｃ）０．
７３０　　　１０″″１　　　　　７２０．９１２　　
　１０−２　　　　５００．８９４　　　１０−３　　
　　　５４０．５９３　　　１０−４　　　　　９００
．４３１　　　１０−”　　　　　１２５０．９２０　
　　１０−６　　　　　４２１．５１８　　　１０−７
　　　　　　６１　．６３０　　　　　　　　０　　　
　　　　　　　　　０ａ　ふたに取り付けたペグの存在
下のインキュベーション後のクロマゲンプレートの各ウ
ェルの内容物の４１５ナノモルにおける２回の実験につ
いての平均の吸収、示す値はバックグラウンドの影響に
ついて調節した。

ｂ　　５０％のグリセロール中の１：２０（ｗ／Ｖ）で
ある原料のチモシー草抽出物に関して。

Ｃナノモル濃度（ｎａｎｏｍｏｌａｒｉｔｙ）で表わし
た濃度。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、群 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、 Ｒは結合基であり、そしてＸはカルボキシル、アミノ、
   チオールまたはヒドロキシルから成る群より選択される
   末端官能基である、 から成る群より選択されるヒスタミン誘導体。 ２、Ｒは１〜約１０個の炭素原子の線状アルキレン結合
   基であり、そしてＸはカルボキシル、アミノ、チオール
   またはヒドロキシルから成る群より選択される末端官能
   基である特許請求の範囲第１項記載のヒスタミン誘導体
   。 ３、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第２項記載のヒスタミン誘導体
   。 ４、ヒスタミン誘導体またはヒスタミンに結合した免疫
   原担体物質のヒスタミン免疫原接合体であって、前記接
   合体は、 ▲数式、化学式、表等があります▼担体 ▲数式、化学式、表等があります▼担体 ▲数式、化学式、表等があります▼担体 ▲数式、化学式、表等があります▼担体 ▲数式、化学式、表等があります▼担体 式中、 Ｒは結合基であり、Ｘ′は前記結合基Ｒを介して前記免
   疫原担体へ前記ヒスタミン誘導体を結合した後残る末端
   官能基Ｘからの残基であり、ｐは約１〜約１２０であり
   、そして「担体」は免疫原担体物質である、 から成る群より選択されるヒスタミン免疫原接合体。 ５、式： ▲数式、化学式、表等があります▼担体 式中、 Ｒは１〜約１０個の炭素原子の線状アルキレン結合基で
   あり、Ｘ′は、前記末端官能基がカルボキシル、アミノ
   、チオールまたはヒドロキシルであるとき、末端官能基
   の残基であり、ｐは約１〜約１２０であり、そして「担
   体」は免疫原担体物質である、 により表わされる特許請求の範囲第４項記載の免疫原接
   合体。 ６、式： ▲数式、化学式、表等があります▼担体 式中、 ｐは約１〜約１２０であり、そして「担体」は免疫原担
   体物質である、 により表わされる特許請求の範囲第５項記載の免疫原接
   合体。 ７、「担体」はウシ血清アルブミンまたはキーホールリ
   ンペットヘモシアニンである特許請求の範囲第６項記載
   の免疫原接合体。 ８、「担体」はキーホールリンペットヘモシアニンであ
   る特許請求の範囲第７項記載の免疫原接合体。 ９、式： ▲数式、化学式、表等があります▼担体 式中、 ｐは約１〜約１２０であり、そして「担体」はウシ血清
   アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンで
   ある、 により表わされる特許請求の範囲第４項記載の免疫原接
   合体。 １０、「担体」はキーホールリンペットヘモシアニンで
   ある特許請求の範囲第９項記載の免疫原接合体。 １１、特許請求の範囲第４項記載の接合体に対して調製
   された抗体。 １２、特許請求の範囲第５項記載の接合体に対して調製
   された抗体。 １３、特許請求の範囲第６項記載の接合体に対して調製
   された抗体。 １４、特許請求の範囲第７項記載の接合体に対して調製
   された抗体。 １５、特許請求の範囲第８項記載の接合体に対して調製
   された抗体。 １６、特許請求の範囲第７項記載の接合体に対して調製
   されたモノクローナル抗体。 １７、特許請求の範囲第８項記載の接合体に対して調製
   されたモノクローナル抗体。 １８、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
   （Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ
   ｌｌｅｃｔｉｏｎ）受託番号ＨＢ８８３１を有する細胞
   系統により産生されたモノクローナル抗体。 １９、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
   （Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ
   ｌｌｅｃｔｉｏｎ）受託番号ＨＢ８８３１を有する細胞
   系統。 ２０、ヒスタミンに対するＩｇＧ抗体を産生する雑種の
   連続的細胞系統からなり、前記細胞系統はヒスタミン免
   疫原接合体で免疫化したマウスからの脾細胞およびマウ
   ス骨髄腫細胞の雑種であることを特徴とする組成物。 ２１、生物学的流体または実験室の流体の中のヒスタミ
   ンを決定する免疫検定法において、ヒスタミンに対する
   抗体として特許請求の範囲第１６項記載の抗体を使用す
   ることを特徴とする免疫検定法。 ２２、生物学的流体または実験室の流体の中のヒスタミ
   ンを決定する免疫検定法において、ヒスタミンに対する
   抗体として特許請求の範囲第１７項記載の抗体を使用す
   ることを特徴とする免疫検定法。 ２３、生物学的流体または実験室の流体の中のヒスタミ
   ンを決定する免疫検定法において、アメリカン・タイプ
   ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ
   ｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）受託番
   号ＨＢ８８３１を有する細胞系統により産生された抗体
   を使用することを特徴とする免疫検定法。 ２４、固体の担体へ結合した特許請求の範囲第４項記載
   のヒスタミン免疫原接合体および標識された抗体からな
   ることを特徴とする生物学的流体または実験室の流体の
   中のヒスタミンを測定する試験キット。 ２５、固体の担体へ結合した特許請求の範囲第９項記載
   のヒスタミン免疫原接合体および標識された抗体からな
   ることを特徴とする生物学的流体または実験室の流体の
   中のヒスタミンを測定する試験キット。 ２６、固体の担体へ結合した特許請求の範囲第１０項記
   載のヒスタミン免疫原接合体および標識された抗体から
   なることを特徴とする生物学的流体または実験室の流体
   の中のヒスタミンを測定する試験キット。 ２７、抗体は標識された酵素である特許請求の範囲第２
   ６項記載の試験キット。 ２８、酵素はセイヨウワサビのペルオキシダーゼである
   特許請求の範囲第２７項記載の試験キット。 ２９、酵素で標識された抗体はモノクローナル抗体であ
   る特許請求の範囲第２８項記載の試験キット。 ３０、モノクローナル抗体は特許請求の範囲第１６項記
   載のモノクローナル抗体である特許請求の範囲第２９項
   記載の試験キット。 ３１、モノクローナル抗体は特許請求の範囲第１７項記
   載のモノクローナル抗体である特許請求の範囲第２９項
   記載の試験キット。 ３２、モノクローナル抗体はアメリカン・タイプ・カル
   チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
   Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）受託番号ＨＢ
   ８８３１を有する細胞系統により産生されたものである
   特許請求の範囲第２９項記載の試験キット。 ３３、固体の担体へ結合した抗体および標識されたヒス
   タミン接合体からなることを特徴とする生物学的流体ま
   たは実験室の流体の中のヒスタミンを測定する試験キッ
   ト。 ３４、接合体は標識された酵素である特許請求の範囲第
   ３３項記載の試験キット。 ３５、酵素はセイヨウワサビのペルオキシダーゼである
   特許請求の範囲第３４項記載の試験キット。 ３６、抗体はモノクローナル抗体である特許請求の範囲
   第３５項記載の試験キット。 ３７、モノクローナル抗体は特許請求の範囲第１６項記
   載のモノクローナル抗体である特許請求の範囲第３６項
   記載の試験キット。 ３８、モノクローナル抗体は特許請求の範囲第１７項記
   載のモノクローナル抗体である特許請求の範囲第３６項
   記載の試験キット。 ３９、モノクローナル抗体はアメリカン・タイプ、カル
   チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
   Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）受託番号ＨＢ
   ８８３１を有する細胞系統により産生されたものである
   特許請求の範囲第３６項記載の試験キット。