JP2688759B2 - シュードウリジン誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なシユードウリジン誘導体に関する。

従来技術とその問題点 ガンの治療には、その早期発見が不可欠であり、従来
よりこれを目的とする各種ガンマーカーの研究、開発が
行なわれてきており、現在もなお上記マーカーの開発を
含めたガンの早期発見のための技術の開発が種々試みら
れている。

しかして、一般に生体が癌化すればt-RNAの代謝が活
発となり、生体内での消費もDNAに比し相対的に早くな
り、その結果、生体内産生量も増加すると考えられる。
しかもこのt-RNAは生命科学のドグマであるDNA-mRNA・t
RNA−蛋白質（酵素）のプロセスを見ても明らかな通
り、従来より種々提案されている一般的腫瘍マーカー例
えばAFP（アルファ−フェトプロティン、Proc.South Af
r.Assoc.Pathol.,７,67（1969）;Bull.Soc.Chim.Biol.,
49,1389-1398（1967））が蛋白であることと対比して、
之等に比し生体内でより早く産生される。従って、該t-
RNAは現在知られている一般的腫瘍マーカーに比し、ガ
ンの早期発見を可能とするマーカーとしての可能性が非
常に高い。しかるに、組織中のt-RNAの測定には実際上
非常な困難が伴われ不可能に近い。これに対し、上記t-
RNAの特異的な構成成分であるシュードウリジン（Pseud
ouridine）は、生体の代謝経路では代謝されずそのまま
の形で尿中に排出される。この尿中のシュードウリジン
を正確に測定できる簡便な方法が確立できれば、これに
よって間接的にt-RNA量を調べることができ、このシュ
ードウリジンを腫瘍マーカーとする新しい測定系の確立
が、t-RNA測定の代用として、ガンの早期発見に貢献す
るものと期待できる。

一方、シュードウリジンが血中及び尿中に存在するこ
とは確認されており、また健常人の血中及び尿中量に比
べて、癌患者ではそれぞれ一桁程高値を示す旨の報告も
ある〔Cancer,50,2457-2464（1982）;Cancer,57,1571-1
575（1986）。〕 しかして、従来より一般に抗体を利用する免疫測定法
（immunoassay）はよく知られているが、かかるシュー
ドウリジンを該免疫測定法により測定しようとしても、
該測定法に利用できる抗体自体未だ未知である。しかも
通常の抗体作成法に従ってシュードウリジンの塩基部分
のアミノ基を利用したり、糖鎖部分を過ヨウ素分解して
生じるアルデヒド基を利用して抗体を作成しようとして
も、之等の方法ではシュードウリジンの基本骨格として
の特性が壊れてしまい、得られる抗体自体特異性がなく
なり、かかる抗体の利用では正確な測定は困難である。
また現在、シュードウリジンの測定法としては、高速液
体クロマトグラフィーを利用する方法が知られている
が、この方法はその簡便性は勿論のこと正確性等の面で
も、到底ガンの早期診断法としての実用性は見出せな
い。

問題点を解決するための手段 本発明者らは上記現状に鑑み、シュードウリジンをマ
ーカーとする癌の早期発見のための診断技術乃至測定系
の確立を最終目的として鋭意研究を重ねた。その過程で
上記シュードウリジンの免疫測定法（immunoassay）に
利用できる該シュードウリジンに対する抗体、該抗体の
作成のための免疫原、該免疫原のハプテンとしての新し
い誘導体の合成に成功し、ここに本発明を完成するに至
った。

即ち、本発明は一般式 〔式中R¹、R²及びR³はそのいずれか１つが基R-CO-A-CO
−を示し、他の２つは水素原子を示す。また上記基にお
いてＡは低級アルキレン基を示し、Ｒはヒドロキシル基
を示すか、又は低級アルキル部分に低級アルキル基で保
護されることのあるカルボキシル基を有するか又は有し
ない（４−ヒドロキシフェニル）低級アルキルアミノ基
を示す。〕 で表わされるシュードウリジン誘導体に係わる。

以下、本発明誘導体を表わす一般式（１）においてR¹
が基R-CO-A-CO−を示すものを「２′−誘導体」と、R²
が上記置換基であるものを「３′−誘導体」と、R³が上
記置換基であるものを「５′−誘導体」と区別する。ま
た上記各誘導体の有する置換基において、Ａで定義され
る低級アルキレン基には、例えばメチレン、エチレン、
トリメチレン、２−メチルトリメチレン、2,2−ジメチ
ルトリメチレン、１−メチルトリメチレン、メチルメチ
レン、エチルメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレ
ン、ヘキサメチレン基等の炭素数１〜６の直鎖又は分枝
鎖状アルキレン基が包含される。Ｒで定義される低級ア
ルキル部分に低級アルキル基で保護されることのあるカ
ルボキシル基を有するか又は有しない（４−ヒドロキシ
フェニル）低級アルキルアミノ基における低級アルキル
基には、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル基等が包含され
る。上記Ｒで定期されるアルキル部分に置換基を有しな
い（４−ヒドロキシフェニル）低級アルキルアミノ基の
具体例としては、チラミン残基（チラミル基） ［HO-C₆H₄-CH₂CH₂NH-］を、また低級アルキル部分にカ
ルボキシル基を有する（４−ヒドロキシフェニル）低級
アルキルアミノ基の具体例としては、チロシン残基（チ
ロシル基） を、更に低級アルキル部分に低級アルキル基で保護され
たカルボキシル基を有する（４−ヒドロキシフェニル）
低級アルキルアミノ基の具体例としては、低級アルキル
基で保護された上記チロシン残基［チロシン（低級アル
キルエステル）残基］、例えばメチルチロシル、エチル
チロシル基等を、それぞれ例示することができる。

本発明誘導体は、シュードウリジンの免疫測定法に有
用な特異抗体の作成のための免疫原、殊にそのハプテン
として有用である。即ち、本発明誘導体はこれをハプテ
ンとして通常の担体蛋白と結合させて得られる免疫抗原
より、一般的方法に従いシュードウリジンに対する特異
抗体を容易に製造でき、該抗体はその利用によりシュー
ドウリジンの免疫測定、ひいてはガンの測定に有用であ
る。

殊に、本発明誘導体は糖鎖の２′−位、３′−位及び
５′のいずれかに、ジカルボン酸又はこれから誘導され
る特定の官能基、特にサクシニル基で代表される置換基
を有することを特徴としており、これに基づいて、従来
の抗体作成法に見られるように、シュードウリジンの基
本骨格を破壊することなく抗原としての特異性を保持で
き、且つ所望の特異抗体の製造を可能とする。また、上
記本発明誘導体の有する置換基におけるカルボキシル基
又はフェノール性水酸基は、概して担体蛋白質との反応
性が高く、その結合が容易であり、尚且つ¹²⁵Iの標識体
への誘導が簡便であるという特徴をも有している。殊に
前記式（１）中、Ｒが低級アルキル部分に低級アルキル
基で保護されることのあるカルボキシル基を有するか又
は有しない（４−ヒドロキシフェニル）低級アルキルア
ミノ基、中でもチラミン残基、チロシン残基（チロシル
基）及びチロシン（低級アルキルエステル）残基である
本発明誘導体は、後述するように、上記¹²⁵I等の標識化
合物による標識化に適しており、かかる標識剤により標
識化された誘導体は、シュードウリジンの免疫測定にお
ける標識抗原として有用である。

以下、本発明誘導体の製造法につき詳述する。

本明誘導体の内、Ｒがヒドロキシル基である置換基を
有する化合物は、例えば式 で表わされるシュードウリジンを出発原料として、これ
に適当な不活性溶媒中、塩基性化合物の存在下に、一般
式 〔式中Ａは前記に同じ〕 で表わされるジカルボン酸無水物を反応させることによ
り製造できる。

上記において不活性溶媒としては、通常のもの、例え
ばベンゼン、クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭
素、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ピリジン等を使
用できる。塩基性化合物としても通常のもの、例えば炭
酸ナトリウム、炭酸カリウム、ピリジン、トリエチルア
ミン等を使用できる。

上記反応におけるジカルボン酸無水物としては、例え
ば無水コハク酸、無水マレイン酸等を使用できる。該ジ
カルボン酸無水物のシュードウリジンに対する使用量
は、通常少なくとも等モル量程度、好ましくは等モル〜
約３倍モル量程度の範囲から選択されるのがよい。反応
温度は一般に約４℃〜37℃程度、好ましくは約20〜25℃
程度とされ、反応は約10〜24時間程度で終了する。

また本発明誘導体中、Ｒが低級アルキル部分に低級ア
ルキル基で保護されることのあるカボキシル基を有する
か又は有しない（４−ヒドロキシフェニル）低級アルキ
ル基である置換基を有する化合物は、例えば上記で得ら
れるＲがヒドロキシル基である本発明誘導体に、上記特
定のＲ基を与える適当なアミン類、例えば代表的にはチ
ラミン、チロシン、チロシン低級アルキルエステル等を
反応させることにより製造することができる。

該反応は通常のアミド結合生成反応に従い実施するこ
とができる。より詳しくは、上記反応は例えばジオキサ
ン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、メチ
ルエチルケトン等、より好ましくはジオキサン等の適当
な溶媒中で、通常のペプチド結合形成反応に用いられる
試薬、例えばN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド（D
CC）、Ｎ−エチル−Ｎ′−ジメチルアミノカルボジイミ
ド、１−エチル−３−ジイソプロピルアミノカルボジイ
ミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−
４−エチル）カルボジイミド等、より好ましくはDCC等
の脱水縮合剤を用いて実施できる。反応温度としては、
例えば０℃〜30℃程度、好ましくは０〜10℃程度が採用
され、一般に反応は12時間程度以上の時間を要して終了
する。

上記反応終了後、本発明誘導体は、通常の分離手段、
例えば溶媒抽出法、再結晶法、カラムクロマトグラフィ
ー等により反応系内より単離精製することができる。

かくして得られる本発明誘導体は、これをハプテンと
して用い、これにハプテン−担体結合試薬の存在下又は
非存在下に適当な担体を結合させることにより、所望の
免疫抗原を収得できる。

上記免疫抗原の製造において、用いられる担体として
は、通常抗原の作成に当り慣用される高分子の天然もし
くは合成の蛋白質を広く使用できる。該担体としては例
えば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、ウサギ血清
アルブミン、人血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン
等の動物の血清アルブミン類；馬血清グロブリン、牛血
清グロブリン、ウサギ血清グロブリン、人血清グロブリ
ン、ヒツジ血清グロブリン等の動物の血清グロブリン
類；馬チログロブリン、牛チログロブリン、ウサギチロ
グロブリン、人チログロブリン、ヒツジチログロブリン
等の動物のチログロブリン類；馬ヘモグロブリン、牛ヘ
モグロブリン、ウサギヘモグロブリン、人ヘモグロブリ
ン、ヒツジヘモグロブリン等の動物のヘモグロブリン
類；キーホールリンペツトヘモシアニン（KLH）等の動
物のヘモシアニン類；回虫より抽出された蛋白質（アス
カーリス抽出物、特開昭56-16414号公報、J.Immun.,11
1,260〜268（1973）、J.Immun.,122,302〜308（197
9）、J.Immun.,98,893〜900（1967）及びAm.J.Physio
l.,199,575〜578（1960）に記載のもの又はこれらを更
に精製したもの）；ポリリジン、ポリグルタミン酸、リ
ジン−グルタミン酸共重合体、リジン又はオルニチンを
含む共重合体等を挙げることができる。

ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の作成に
当り慣用されているものを広く使用できる。具体的に
は、アミノ基とカルボキシル基とをアミド結合させる通
常のペプチド結合形成反応に用いられる試薬、例えばN,
N−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、Ｎ−エチ
ル−Ｎ′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−エチル
−３−ジイソプロピルアミノカルボジイミド、１−シク
ロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カ
ルボジイミド等のカルボジイミド類等の脱水縮合剤等を
挙げることができる。また上記ハプテン−担体結合試薬
としては、ｐ−ジアゾニウムフエニル酢酸等のジアゾニ
ウムアリールカルボン酸類と通常のペプチド結合形成反
応試薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも使用
できる。

上記免疫抗原の製造反応は、常法に従うことができ、
一般には水溶液もしくはpH5〜10程度の通常の緩衝液
中、好ましくはpH6〜９程度の緩衝液中、０〜40℃、好
ましくは室温付近で行なわれる。該反応は通常約２〜５
時間程度で完結する。

上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試薬及び
担体の使用割合は、適宜に決定できるが、通常ハプテン
に対して担体を５〜20倍重量程度、好ましくは10〜20倍
重量程度、及びハプテン−担体結合試薬を１〜10倍モル
程度用いるのがよい。上記反応により本発明誘導体（ハ
プテン）と担体とが結合したハプテン−担体複合体から
なる所望の免疫抗原が収得される。

反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば透析
法、ゲル過法、分別沈澱法等により容易に単離精製で
きる。

かくして得られる免疫抗原は、これを利用してシュー
ドウリジンに対して特異反応性を有する所望の抗体（抗
シュードウリジン抗体）を製造することができる。該抗
体の製造は、一般的方法に従い、例えば具体的には上記
免疫抗原を哺乳動物に投与し、生体内に所望抗体（ポリ
クローナル抗体）を産生させ、これを採取するか、或い
は上記免疫抗原で免疫された哺乳動物の形質細胞（免疫
細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞とのハイブリドーマ
を作成し、これより所望抗体（モノクローナル抗体）を
産生するクローンを選択、培養することにより行なわ
れ、特に後者の方法は好ましい。

上記いずれの方法においても、抗体の製造に供せられ
る哺乳動物としては、特に制限はなく、ウサギ、モルモ
ット、マウス、ラット等の各種のものを利用できるが、
特に上記モノクローナル抗体の製造の場合には、細胞融
合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して、一
般にはマウス、ラット等を選択して用いるのが好まし
い。

上記抗体の製造法において免疫は一般的方法により、
例えば免疫抗原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔
内注射等により投与することにより実施できる。より具
体的には、免疫抗原を、所望により通常のアジュバント
と併用して、供試動物に２〜14日毎に数回投与し、総投
与量が、例えばマウスでは約10〜100μｇ程度になるよ
うにすることにより行ない得る。抗体の採取は上記最終
投与の１〜２週間経過後、免疫化された動物から採血
し、これを遠心分離後、血清を分離することにより行な
われる。

また上記モノクローナル抗体の製造において用いられ
る免疫細胞としては、上記最終投与の約３日後に摘出し
た脾臓細胞を使用するのが好ましい。

上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳
動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々のも
の、例えばp3（p3/×63-Ag8）〔Nature,256,495-497（1
975）〕、p3-U1〔Current Topics in Microbiology and
Immunology,81,1−７（1978）〕、NS-1〔Eur.J.Immuno
l.,６,511-519（1967）〕、MPC-11〔Cell,８,405-415
（1976）〕、SP2/0〔Nature,276,269-270（1978）〕、F
O〔J.Immunol. Meth.,35,1-21（1980）〕、×63.6.5.
3.〔J.Immunol.,123,1548-1550（1979）〕S194〔J.Exp.
Med.,148,313-323（1978）〕等や、ラツトにおけるR210
〔Nature,277,131-133（1979）〕等の骨髄腫細胞等を使
用できる。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知
の方法、例えばマイルスタイン（Milstein）らの方法
〔Method in Enzymology,Vol.73,pp3（1981）〕等に準
じて行なうことができる。より具体的には、上記融合反
応は、通常の融合促進剤、例えばポリエチレングリコー
ル（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等の存在下に、通
常の培地中で実施され、培地には更に融合効率を高める
ためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて
添加することもできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞との
使用比は、通常の方法と変りはなく、例えば形質細胞腫
細胞に対して免疫細胞を約１〜10倍程度用いるのが普通
である。融合反応時の培地としては、上記形質細胞腫細
胞の増殖に通常使用される各種のもの、例えばRPMI-164
0培地、MEM培地、その他のこの種細胞培養に一般に利用
されるものを例示でき、通常之等培地は牛胎児血清（FC
S）等の血清補液を抜いておくのがよい。融合は上記免
疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を、上記培地内でよ
く混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液、例えば平
均分子量1000〜6000程度のものを、通常培地に約30〜60
w/v％の濃度で加えて混ぜ合せることにより行なわれ
る。以後適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去
する操作を繰返すことにより所望のハイブリドーマが形
成される。

得られるハイブリドーマの分離は、通常の選別用培
地、例えばHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン
及びチミジンを含む培地）で培養することにより行なわ
れる。該HAT培地での培養は、目的とするハイブリドー
マ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時
間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得られる
ハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とする
抗体の検索及び単一クローン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、例えばELISA法（Engvall,
E.,Meth.Enzymol.,70,419-439（1980）〕、プラーク
法、スポツト法、凝集反応法、オクテロニー（Ouchterl
ony）法、ラジオイムノアツセイ（RIA）法等の一般に抗
体の検出に用いられている種々の方法〔「ハイブリドー
マ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニン
グ発行、第30-53頁、昭和57年３月５日）に従い実施す
ることができ、この検索には前記免疫抗原が利用でき
る。

かくして得られる所望のモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが
でき、また液体窒素中で長期間保存することができる。

上記ハイブリドーマからの目的抗体の採取は、該ハイ
ブリドーマを、常法に従って培養してその培養上清とし
て得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳
動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が
採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適
しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適してい
る。

上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、ゲル
過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の手段
により精製することができ、かくして所望の抗シュード
ウリジン抗体を製造できる。

得られる抗体は、シュードウリジンに特異反応性を有
するものであり、従ってその利用によれば、免疫測定法
によって各種検体、例えば血や尿等の中に存在するシュ
ードウリジン量を正確に測定することができ、この測定
値の対比によって、癌のスクリーニング及び診断を行な
うことができる。

本発明はかかる癌の診断方法及びそのための癌診断用
キットをも提供するものである。

本発明に従うシュードウリジンの測定は、上記特定の
抗体を使用することを必須の要件として、その基本的操
作は、通常の免疫検定法、例えばラジオイムノアッセイ
（RIA）法、酵素免疫測定法（EIA）等に従うことができ
る。之等各免疫検定法における操作、手順等は一般に採
用されているそれらと特に異ならず、例えば公知の直接
法、間接法、競合法等に準じることができる。

上記において検体としては、体液、例えば血液、尿等
を好ましく使用できる。

上記方法において標準抗原（スタンダード）として
は、前述した精製抗原を使用できる。不溶化法（不溶化
抗原又は不溶化抗体を用いる方法）を採用する場合は、
常法に従い上記標準抗原又は抗体は、不溶性担体に化学
的又は物理的に反応させることにより製造される。ここ
で不溶性担体としては、例えばセルロース粉末、セフア
デツクス、セフアロース、ポリスチレン、紙、カルボ
キシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラ
ン、プラスチツクフイルム、プラスチツクチユーブ、ナ
イロン、ガラスビース、絹、ポリアミン−メチルビニル
エーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エ
チレン−マレイン酸共重合体等を使用できる。不溶化
は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法（酸アミ
ド誘導体法、カルボキシクロリド樹脂法、カルボジイミ
ド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘
導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボ
ナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法等）、アルキ
ル化法、架橋試薬による担体結合法（架橋試薬としてグ
ルタールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート等
を用いる）、Ugi反応による担体結合法等の化学的反
応；或いはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン
結合法；ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用
いる物理的吸着法によつて行なわれる。

標識抗原又は標識抗体としては、前記標準抗原又は抗
体を、通常の放射性物質、酵素標識物質、螢光物質等の
各種標識剤で標識化したものを用い得る。ここで放射性
物質としては、¹²⁵I等の放射性ヨード等を、螢光物質と
しては、フルオレツセイン・イソチオシアナート（FIT
C）、テトラメチルローダミン・イソチオシアナート（T
RITC）、置換ローダミン・イソチオシアナート（XRIT
C）、ローダミンＢ・イソチオシアナート、ジクロロト
リアジンフルオレツセイン（DTAF）等を、酵素標識物質
としては、パーオキシダーゼ（POX）、マイクロパーオ
キシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペ
プチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、Ｐ−ナ
ーゼ等をそれぞれ挙げることができる。これら標識剤に
よる標識方法もまた常法に従うことができる（J.Biol.C
hem.,254,9349-9351（1979）;Nature,194,495（196
2）；螢光抗体法、医化学実験講座No.4,263-270;Acta.E
ndocrinol.Suppl.,168,206（1972）;Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA,57,713（1967）等参照〕。

上記方法における検体（体液）中のシュードウリジン
の測定・定量は、該検体と上記標準抗原、不溶化抗原、
不溶化抗体、標識抗原及び標識抗体のいずれかを免疫反
応させることにより実施される。その際測定系に利用さ
れる溶媒としては、反応に悪影響を与えない通常のも
の、例えばクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリスー塩
酸緩衝液、酢酸緩衝液等のpH4〜８程度の緩衝液を好ま
しいものとして例示できる。また測定の際の免疫反応条
件は特に制限はなく、通常のこの種測定法と同様のもの
とすることができる。即ち該免疫反応は一般に45℃以
下、好ましくは約４〜40℃の温度条件下、１〜40時間を
要して行なわれる。免疫反応終了後の結合体及び遊離体
（Ｂ−Ｆ）の分離も公知の方法に従い、例えば不溶化法
を採用したときは、遠心分離、別、洗浄、デカンテー
ション等の手段により固相−液相を分離して実施でき
る。その他の場合には例えばデキストラン−活性炭法、
第２抗体法等の常法に従えばよい。

本発明に従うシュードウリジンの測定操作を、液相法
を例にとり詳述すれば、該方法は、 （１）まず測定しようとする検体中の被検物質と一定量
の抗体とを、標識抗原の一定量と競合反応させ、次いで
デキストラン−チャコール法（Dextran-chacoal）でＢ
−Ｆ分離を行ない、そのいずれか一方の標識剤活性を測
定して被検物質量を定量する、 （２）まず被検物質と一定量の標識抗原とを、一定量の
抗体と競合反応させ、次いで第２抗体法によりＢ−Ｆ分
離し、そのいずれか一方の標識剤活性を測定して被検物
質量を定量する 等の方法により実施できる。

上記測定法の実施に特に便利な方法は、血液や尿等の
体液中のシュードウリジン量を測定するためのキットを
使用する方法である。このようなキットには、シュード
ウリジンと特異的に抗原抗体反応をする抗体、即ち抗シ
ュードウリジン抗体を含有せしめることが重要である。
この抗体試薬には、グリセロールやウシ血清蛋白のよう
な安定化剤及び／又は保存剤を添加することができる。
好ましくは、この抗体試薬は凍結乾燥したものであり、
キットには水溶性もしくは水と混和しうる溶媒を含有さ
せることができる。更にこの抗体試薬には再構成された
試薬系を一定のpHに保つための緩衝液及び／又は使用前
に試料が悪化するのを防ぐための保存剤及び／又は安定
剤を添加することができる。緩衝液はキット試薬の必須
成分ではないが、上記測定法の実施の際にpHを４〜８程
度とするものを用いるのが好ましい。また再構成剤は好
ましくは水を含んだものであるが、水の一部又は全部を
水と混和し得る溶媒で置き換えることもできる。水と混
和し得る溶媒は当業者に周知であり、例えばグリセリ
ン、アルコール類、グリコール類、グリコールエーテル
類等を使用できる。

発明の効果 本発明のシュードウリジン誘導体は、これをハプテン
として免疫抗原の製造を可能とし、該免疫抗原からは抗
シュードウリジン抗体が得られ、該抗体の利用によれ
ば、免疫検定法によって、非常に簡便に且つ高精度、高
感度にて体液中のシュードウリジン量を測定でき、この
測定値を健常人の当該値と比較することにより、被検者
における癌のスクリーニング及び／又は診断が可能であ
る。殊に上記抗体を利用する免疫検定法は、既存の癌マ
ーカーを利用するそれに比し、癌の早期発見に極めて有
効である。

実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため本発明誘導体
の製造例、免疫抗原の調製例及び免疫化例を実施例とし
て挙げる。

実施例１ シュードウリジン−サクシニル化体の製造 シュードウリジン（シグマ社製）240mg（1mM）を、２
〜3mlのジメチルホルムアミド（和光純薬社製）に溶解
後、5mlのトリエチルアミン（和光純薬社製）を加えて
混合し、その後、無水コハク酸200mg（2mM）をジオキサ
ン5mlに溶解させた液を加えて、約24時間室温に放置
後、減圧濃縮した。

次に、当該反応液を高速液体クロマトグラフィーに付
し、目的化合物の分離精製を行なった。

カラムはDEAE-5PW（トーソー（TOSOH）社製）を用
い、溶出は20mMから0.5Mの酢酸アンモニウムの濃度勾配
を用いた。

これにより得られたフラクション群を、紫外線吸収ス
ペクトル（OD₂₆₅）分析して、４つのフラクション（リ
テンションタイムの短い順にＡ、Ｂ、Ｃ及びＤという）
を得た。

上記フラクションをNMR分析に付すことにより、その
中の１つ、即ちフラクションＢ（２番目に溶出されるピ
ークフラクション）が、５′−モノ−サクシニル−シュ
ードウリジン（本発明５′−誘導体）の単一のフラクシ
ョンであることを確認した。

該フラクションのNMR分析図は第１図の通りであり、
主なNMRデーターは次の通りである。7.51（d,J＝0.
8）、4.65（dd,J＝12.7,2.0）、4.31（dd,J＝12.7,2.
0）、4.22（dd,J＝12.7,2.0）、4.18（t,J＝4.7）4.08
（m,H×２）、2.57（t,J＝6.7,H×２）、2.46（t,J＝6.
7,H×２） 該フラクションを集めて、モノ−サクシニル−シュー
ドウリジンを得た。その収量は、21.2％であった。

尚、上記NMRのデーターは次のように帰属される。即
ち、2.57及び2.46cpm（三重シグナル（ｔ）、結合定数
（Ｊ）＝6.7,2つのプロトン）のシグナルは、エステル
結合したコハク酸を示している。4.31及び4.22cpm（ダ
ブル、ダブル（d,d）Ｊ＝12.7,2つのプロトン）は、
５′−位の水酸基に化学シフトしていることから、コハ
ク酸が５′−位の水酸基に結合していることを示してい
る。4.65cpm（d,d,J＝4.7）のシグナルは１′−位のプ
ロトンを示している。7.51cpmのシグナルは、塩基のプ
ロトンを示している。之等のことから５′の位置のサク
シニル化が確認される。

また、赤外線分析を行なった結果、1670及び1560cm^-1
付近の吸収の増大が認められ、このことからエステル結
合が確認された。

更に紫外線分析より、260nm最大吸収により、ウラシ
ル基の存在を確認した。

また上記で得られた本発明の５′−誘導体が単一物質
であることは、DEAE及び逆相の高速液体クロマトグラフ
ィー（HPLC）にて単一ピークであることから確認され
た。

上記で得られたフラクションの内のフラクションＣ
（20μＭ）に、チロシンエチルエステル（ペプチド研究
会）24μＭ、DCC100μＭ及びジオキサン10mlを加え、10
℃で24時間放置した後、減圧濃縮した。

得られた反応濃縮液を、（トーソー（TOSOH）社製）O
DS120Tを用いたシリカゲル逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（溶出液:2％アセトニトリル＋0.1％TFA→100％ア
セトニトリル）にて精製した。

かくして、リテンションタイム8.68分に溶出するフラ
クションとして、シュードウリジン−２′−エチルチロ
シル−サクシニル化体（本発明２′−誘導体）を単離し
た。このものの出発原料であるシュードウリジンからの
収率は約11.6％であった。

また同クロマトグラフィーにより、リテンションタイ
ム9.58分に溶出するフラクションとして、シュードウリ
ジン−３′−エチルチロシル−サクシニル化体（本発明
３′−誘導体）を単離した。このものの出発原料である
シュードウリジンからの収率は約18.3％であった。

之等のそれぞれをNMR分析（D₂O中）に供した結果、主
なピークはそれぞれ次の通りであった。

本発明２′−誘導体 7.52（d,J＝0.4Hz,塩基プロトン） 7.02（d,J＝8.3Hz,チロシンの2,6位プロトン） 6.73（d,J＝8.3Hz,チロシンの3,5位プロトン） 5.18（dd,J＝6.7Hz,糖２′位プロトン） 4.61（dd,J＝0.4Hz,糖１′位プロトン） 4.49（ｍ） 2.50、2.60（t,J＝13.9Hz,サクシニル基のプロトン） 本発明３′−誘導体 7.58（d,J＝0.4Hz,塩基プロトン） 7.05（d,J＝8.3Hz,チロシンの2,6位プロトン） 6.75（d,J＝8.3Hz,チロシンの3,5位プロトン） 5.02（dd,J＝5.6Hz,糖３′位プロトン） 4.54（dd,J＝0.4Hz,糖１′位プロトン） 4.49（ｍ） 2.50、2.60（t,J＝13.9Hz,サクシニル基のプロトン） 実施例２ シュードウリジン−５′−チラミン−サクシニル化体の
製造 実施例１ので得た５′−モノ−サクシニル−シュー
ドウリジン10μＭとチラミン（和光純薬社製）12μＭと
を、ジオキサン5ml中に溶解させ、これにDCCの50μＭを
加え、10℃で24時間放置し、反応終了後、減圧濃縮し
た。

次いで得られた反応後をトーソーODS120Tを用いたシ
リカゲルカラム逆相高速液体クロマトグラフィー（溶出
液:2％アセトニトリル＋0.1％TFA→100％アセトニトリ
ル）により精製して、リテンションタイム18.56分に、
目的の５′−チラミン−サクシネート−シュードウリジ
ンを得た。

得られた化合物のNMR分析図（CD₃OD中）は第２図に示
す通りである。

実施例３ 本発明誘導体の¹²⁵Iによる標識化 ¹²⁵I‐Na（アマシャム社製）0.5mCiの50mMリン酸緩衝
液（pH7.4）10μｌ溶液、本発明誘導体［実施例１の
で得た２′−エチルチロシル−サクシネート−シュード
ウリジン又は３′−エチルチロシル−サクシネート−シ
ュードウリジン誘導体或いは実施例２で得た５′−チラ
ミン−サクシネート−シュードウリジンのいずれか］の
２μｇの同緩衝液20μｌ溶液及びクロラミンＴ（和光純
役薬社製）20μｇの同緩衝液10μｌ溶液を、１分間混合
した後、混合液にメタ重亜硫酸ナトリウムを20μg/20μ
ｌの割合で加えて反応を停止させる。

次いで、KIの2mg/200μｌを加えた後、トーソーODS12
0Tを用いたカラムクロマトグラフィーにより、目的とす
る各本発明誘導体のヨード化物を得た。

実施例４ 抗シュードウリジン抗体の分析 ウサギ血清100μｌ、上記実施例３で得たシュードウ
リジン−５′−チラミン−サクシニル化体の¹²⁵I標識化
物100μｌ（ca.20000cpm）及び50mMリン酸緩衝生理食塩
水（PBS、pH7.4、0.1％BSA含有）300μｌを混合し、４
℃で24〜48時間放置する。次いで、デキストランチャコ
ール500μｌを加えた後、3000rpmで30分間遠心分離し、
デカンテーションにより沈澱を分離し、その標識活性を
γ−カウンター（アロカ社製）によりカウントする。

かくして、標識抗原と抗体との結合物の標識活性を測
定できる。

実施例５ 免疫抗原及び抗体の調製 実施例１ので調製した５′−モノ−サクシニル−シ
ュードウリジン2mg（8.4mM）と、牛血清アルブミン（BS
A）11mgを50mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）
に溶解させ、N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド（D
CC）20mgを加えて、25℃にてカップリング反応させた。
これを一昼夜放置後、反応液を透析膜に移しかえ、蒸留
水中で４℃にて一昼夜透析を行なって、免疫抗原を得
た。

このカップリング反応の確認は、紫外線（UV）吸光度
で、O.D260nm付近の吸収が増したことで行なった。

次いで、上記で調製した免疫抗原200μｇをリン酸緩
衝食塩水（PBS）（pH7.4）に溶かし、得られる溶液1ml
を等量のフロインド コムプリート アジュバンド（Fr
eund complete adjuvant,DIFCO Laboratories,Detroit,
Michigan USA）と1:1の比率で混和し、懸濁させた。得
られた懸濁液を抗原100μｇ含有分だけとり、12週齢の
家兎に皮下投与した。以後、２週間目に同液を同量分皮
下投与し、東に２週間後に同液を抗原100μｇ含有分を
皮下投与した。

上記抗原投与による免疫化後、免疫された動物から採
血し、これを遠心分離して、所望抗体（抗血清）を得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１ので得た本発明誘導体のNMR分析図
であり、第２図は実施例２で得た本発明誘導体のNMR分
析図である。

フロントページの続き (72)発明者 大江 泰雄 徳島県徳島市南昭和町５―９―１ (72)発明者 平野 尚伸 徳島県徳島市川内町大松384 (72)発明者 寺本 英雄 徳島県徳島市北田宮２―６―７ (72)発明者 申 貞均 徳島県板野郡北島町新喜来字中竿40―20 (72)発明者 西野 友善 徳島県徳島市明神町１―33―５ (56)参考文献 特開 昭57−115193（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−108982（ＪＰ，Ａ) 特公 平６−92392（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式 （式中R¹、R²及びR³はそのいずれか１つが基R-CO-A-CO
   を示し、他の２つは水素原子を示す。また上記基におい
   てＡは低級アルキレン基を示し、Ｒはヒドロキシル基を
   示すか、又は低級アルキル部分に低級アルキル基で保護
   されることのあるカルボキシル基を有するか又は有しな
   い（４−ヒドロキシフェニル）低級アルキルアミノ基を
   示す。） で表わされるシュードウリジン誘導体。