JP2000000092A - 抗―ヒト乳癌モノクロ―ナル抗体 - Google Patents
抗―ヒト乳癌モノクロ―ナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗−ヒト乳癌モノクローナル抗体を提供する
こと。 【解決手段】 ヒト乳癌抗原に結合する乳癌のイメージ
ングのために適当なネズミモノクローナル抗体であっ
て、該モノクローナル抗体が、寄託されたハイブリドー
マＩＶＩ １００７９（ＡＴＣＣ ＨＢ １０８０８）
により産生される７５９Ｅ３である、モノクローナル抗
体。
こと。 【解決手段】 ヒト乳癌抗原に結合する乳癌のイメージ
ングのために適当なネズミモノクローナル抗体であっ
て、該モノクローナル抗体が、寄託されたハイブリドー
マＩＶＩ １００７９（ＡＴＣＣ ＨＢ １０８０８）
により産生される７５９Ｅ３である、モノクローナル抗
体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学並びに癌の
診断および治療の分野に属する。さらに詳しくは、この
発明はネズミモノクローナル抗−ヒト乳癌抗体、これら
の抗体を生産するハイブリドーマ、これらの抗体から製
造される免疫化学物質、並びにこれらの免疫化学物質を
使用する診断および治療方法に関する。
診断および治療の分野に属する。さらに詳しくは、この
発明はネズミモノクローナル抗−ヒト乳癌抗体、これら
の抗体を生産するハイブリドーマ、これらの抗体から製
造される免疫化学物質、並びにこれらの免疫化学物質を
使用する診断および治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】1970年代の中ごろから、ヒト乳癌関連抗
原と相互作用するネズミモノクローナル抗体の多くの報
告が存在する。これらの報告された研究においては、マ
ウスがヒト乳脂肪球タンパク質、乳癌セルラインまたは
乳癌膜抽出物により免疫感作されそして追加免疫され
た。免疫脾細胞がマウス骨髄腫細胞と融合され、そして
ハイブリドーマが乳房または乳癌抗原に対する培地の幾
らかの特異性に基いて選択された。Taylor-Papadimitri
ou,J.等、Int.J.Cancer(1981)28:17-21；Yuan,D.等JNCI
(1982)68:719-728；Ciocca,D.R.等、Cancer Res.(1982)
42:4256-4258。これらの従来技術の抗体の正常組織反応
性はこの発明の抗体の正常組織反応性と異る。
原と相互作用するネズミモノクローナル抗体の多くの報
告が存在する。これらの報告された研究においては、マ
ウスがヒト乳脂肪球タンパク質、乳癌セルラインまたは
乳癌膜抽出物により免疫感作されそして追加免疫され
た。免疫脾細胞がマウス骨髄腫細胞と融合され、そして
ハイブリドーマが乳房または乳癌抗原に対する培地の幾
らかの特異性に基いて選択された。Taylor-Papadimitri
ou,J.等、Int.J.Cancer(1981)28:17-21；Yuan,D.等JNCI
(1982)68:719-728；Ciocca,D.R.等、Cancer Res.(1982)
42:4256-4258。これらの従来技術の抗体の正常組織反応
性はこの発明の抗体の正常組織反応性と異る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】抗−ヒト乳癌モノクロ
ーナル抗体を提供すること。
ーナル抗体を提供すること。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の抗体は、乳癌の
イメージングのために適当なネズミモノクローナル抗体
であって、 （ａ）血液細胞に結合せず； （ｂ）少なくとも１つのヒト乳癌腫瘍または乳癌セルラ
インを選択的に認識し； （ｃ）該モノクローナル抗体を用いたイムノペルオキシ
ダーゼ染色により染色される正常組織が９％以下であ
り； （ｄ）ＧまたはＭアイソタイプを有し； （ｅ）イメージング成分に接合された場合に、乳癌をイ
メージングするのに十分なシグナルを生じさせ；そして （ｆ）9C6、32A1、35E10、41B4、87H7、106A10、120H
7、140A7、200F9、203E2、219F3、254H9、387H9、421E
8、451C3、452E12、454A12、457D7、650E2、697B3、759
E3からなる群およびこの群の構成員と機能的に同等なモ
ノクローナル抗体から選択される；ことを特徴とするモ
ノクローナル抗体である。
イメージングのために適当なネズミモノクローナル抗体
であって、 （ａ）血液細胞に結合せず； （ｂ）少なくとも１つのヒト乳癌腫瘍または乳癌セルラ
インを選択的に認識し； （ｃ）該モノクローナル抗体を用いたイムノペルオキシ
ダーゼ染色により染色される正常組織が９％以下であ
り； （ｄ）ＧまたはＭアイソタイプを有し； （ｅ）イメージング成分に接合された場合に、乳癌をイ
メージングするのに十分なシグナルを生じさせ；そして （ｆ）9C6、32A1、35E10、41B4、87H7、106A10、120H
7、140A7、200F9、203E2、219F3、254H9、387H9、421E
8、451C3、452E12、454A12、457D7、650E2、697B3、759
E3からなる群およびこの群の構成員と機能的に同等なモ
ノクローナル抗体から選択される；ことを特徴とするモ
ノクローナル抗体である。
【０００５】
【発明の実施の形態】この発明の主たる観点は、ネズミ
モノクローナル抗体であって、 （ａ）血液細胞に結合せず； （ｂ）0.25以上の乳癌結合範囲を有するか、または0.25
以上の乳癌セルライン範囲を有し； （ｃ）0.09以下の選択性を有し； （ｄ）ＧまたはＭアイソタイプを有し；そして （ｅ）イメージング成分に接合された場合に、乳癌をイ
メージングするのに十分なシグナルを生じさせることを
特微とするモノクローナル抗体に関する。
モノクローナル抗体であって、 （ａ）血液細胞に結合せず； （ｂ）0.25以上の乳癌結合範囲を有するか、または0.25
以上の乳癌セルライン範囲を有し； （ｃ）0.09以下の選択性を有し； （ｄ）ＧまたはＭアイソタイプを有し；そして （ｅ）イメージング成分に接合された場合に、乳癌をイ
メージングするのに十分なシグナルを生じさせることを
特微とするモノクローナル抗体に関する。
【０００６】これらの抗体の好ましい具体例は、2G3,9C
6,32A1,33FB,35E10,41B4,87H7,106A10,113F1,120H7,140
A7,200F9,203E2,219F3,245E7,254H9,260F9,266B2,317G
5,369F10,387H9,421E8,451C3,452E12,452F2,454A12,454
C11,457D7,520C9,650E2,697B3,741F8,759E3,788G6と称
されるもの、およびこれらと機能的に同等なものであ
る。
6,32A1,33FB,35E10,41B4,87H7,106A10,113F1,120H7,140
A7,200F9,203E2,219F3,245E7,254H9,260F9,266B2,317G
5,369F10,387H9,421E8,451C3,452E12,452F2,454A12,454
C11,457D7,520C9,650E2,697B3,741F8,759E3,788G6と称
されるもの、およびこれらと機能的に同等なものであ
る。
【０００７】上記の抗体を生産するネズミ×ネズミ−ハ
イブリドーマ、およびそれらの子孫がこの発明の他の観
点である。
イブリドーマ、およびそれらの子孫がこの発明の他の観
点である。
【０００８】この発明の他の観点は、（Ａ）上記のモノ
クローナル抗体、および（Ｂ）検出可能なイメージング
成分、の接合体であるイムノイメージング剤に関する。
クローナル抗体、および（Ｂ）検出可能なイメージング
成分、の接合体であるイムノイメージング剤に関する。
【０００９】この発明の他の観点は、イメージングに有
効な量のイムノイメージング剤を投与し、そして患者中
のイムノイメージング剤を適当な検出装置により検出す
ることによる、乳癌のイメージングを必要とする患者に
おいて乳癌をイメージングする方法に関する。
効な量のイムノイメージング剤を投与し、そして患者中
のイムノイメージング剤を適当な検出装置により検出す
ることによる、乳癌のイメージングを必要とする患者に
おいて乳癌をイメージングする方法に関する。
【００１０】この明細書において使用する場合、「モノ
クローナル抗体」なる語は均一な抗体集団を有する抗体
組成物を意味する。抗体の由来またはそれが作られた方
法に関して限定されない。
クローナル抗体」なる語は均一な抗体集団を有する抗体
組成物を意味する。抗体の由来またはそれが作られた方
法に関して限定されない。
【００１１】この発明のモノクローナル抗体生産性ハイ
ブリドーマに関してこの明細書において使用する場合、
「子孫」なる語は、世代または核型の同一性に関係な
く、親により生産されるものと同じモノクローナル抗−
ヒト乳癌抗体を生産する、親ハイブリドーマのすべての
派生体、子孫、および結果物を包合することが意図され
る。
ブリドーマに関してこの明細書において使用する場合、
「子孫」なる語は、世代または核型の同一性に関係な
く、親により生産されるものと同じモノクローナル抗−
ヒト乳癌抗体を生産する、親ハイブリドーマのすべての
派生体、子孫、および結果物を包合することが意図され
る。
【００１２】例示的なネズミモノクローナル抗−ヒト乳
癌抗体に関してこの明細書で使用する場合、「機能的に
同等」なる語は、（ａ）例示されたモノクローナル抗体
と同じ抗原またはエピトープに結合し、（ｂ）0.25以上
の乳癌結合範囲を有するかまたは0.25以上の乳癌セルラ
イン範囲を有し、（ｃ）0.09以下の選択性を有し、
（ｄ）ＧまたはＭアイソタイプを有し；そして（ｅ）イ
メージング成分と接合された場合、乳癌をイメージング
するのに十分なシグナルを生じさせるモノクローナル抗
体を意味する。
癌抗体に関してこの明細書で使用する場合、「機能的に
同等」なる語は、（ａ）例示されたモノクローナル抗体
と同じ抗原またはエピトープに結合し、（ｂ）0.25以上
の乳癌結合範囲を有するかまたは0.25以上の乳癌セルラ
イン範囲を有し、（ｃ）0.09以下の選択性を有し、
（ｄ）ＧまたはＭアイソタイプを有し；そして（ｅ）イ
メージング成分と接合された場合、乳癌をイメージング
するのに十分なシグナルを生じさせるモノクローナル抗
体を意味する。
【００１３】上記のように、この明細書において使用さ
れる「機能的に同等」なる語は5つの規準を含む。これ
らの規準の第1、すなわち例示されるモノクローナル抗
体と同一の抗原またはエピトープヘの結合は、機能的に
同等なモノクローナル抗体による例示されたモノクロー
ナル抗体の交差ブロックを示す実験により証明すること
ができる。交差ブロックは、例示された抗体の1つによ
り結合されるそれと同じエピトープ（抗原上の）に抗体
が結合する結果として、または1つのエピトープヘの抗
体の結合が第２のエピトープヘの抗体の結合をブロック
する程接近して同じ抗原上に位置する異るエピトープに
抗体が結合する結果として生ずる。従って、交差ブロッ
クは、機能的に同等なモノクローナル抗体が例示された
モノクローナル抗体と同じ抗原またはエピトープに結合
することを決定し得る規準の1つである。
れる「機能的に同等」なる語は5つの規準を含む。これ
らの規準の第1、すなわち例示されるモノクローナル抗
体と同一の抗原またはエピトープヘの結合は、機能的に
同等なモノクローナル抗体による例示されたモノクロー
ナル抗体の交差ブロックを示す実験により証明すること
ができる。交差ブロックは、例示された抗体の1つによ
り結合されるそれと同じエピトープ（抗原上の）に抗体
が結合する結果として、または1つのエピトープヘの抗
体の結合が第２のエピトープヘの抗体の結合をブロック
する程接近して同じ抗原上に位置する異るエピトープに
抗体が結合する結果として生ずる。従って、交差ブロッ
クは、機能的に同等なモノクローナル抗体が例示された
モノクローナル抗体と同じ抗原またはエピトープに結合
することを決定し得る規準の1つである。
【００１４】いわゆる、「サンドイッチ」アッセイは、
抗体が同じ抗原またはエピトープと結合するか否かを決
定するための他の方法である。これらのアッセイにおい
ては、第１のモノクローナル抗体が支持体、例えばタイ
タープレートウェルの表面に結合される。非特異的結合
を回避するための処理の後、非常に可溶化された抗原調
製物が結合している抗体に添加される。次に、検出可能
なラベル、例えば、蛍光色素を有する第２抗体が添加さ
れる。第２抗体が抗原に結合すれば、異るエピトープ特
異性、または同じ抗原上同じエピトープの多数のコピー
が示される。第２抗体が結合に失敗すれば、同じエピト
ープ特異性または異る抗原特異性が示される。交差ブロ
ックおよびサンドイッチアッセイの両者の結果は、第２
シリーズの試験、例えば両抗体により結合された抗原が
同じ分子量を有することを示すウエスタンブロッティン
グまたは免疫沈澱によりさらに確認される。
抗体が同じ抗原またはエピトープと結合するか否かを決
定するための他の方法である。これらのアッセイにおい
ては、第１のモノクローナル抗体が支持体、例えばタイ
タープレートウェルの表面に結合される。非特異的結合
を回避するための処理の後、非常に可溶化された抗原調
製物が結合している抗体に添加される。次に、検出可能
なラベル、例えば、蛍光色素を有する第２抗体が添加さ
れる。第２抗体が抗原に結合すれば、異るエピトープ特
異性、または同じ抗原上同じエピトープの多数のコピー
が示される。第２抗体が結合に失敗すれば、同じエピト
ープ特異性または異る抗原特異性が示される。交差ブロ
ックおよびサンドイッチアッセイの両者の結果は、第２
シリーズの試験、例えば両抗体により結合された抗原が
同じ分子量を有することを示すウエスタンブロッティン
グまたは免疫沈澱によりさらに確認される。
【００１５】モノクローナル抗体の生産 この発明のハイブリドーマを作るために使用される抗体
生産性融合パートナーは、マウスを生ヒト乳癌細胞また
はそれから調製された膜抽出物により免疫感作すること
により得られる。マウスに免疫原量の細胞または抽出物
を腹腔内接種し、そして次に類似の量の免疫原により追
加免疫感作する。最終追加免疫の数日後に、免疫感作さ
れたマウスから脾臓を集め、そして脾臓から融合におい
て使用するための細胞懸濁液を調製する。
生産性融合パートナーは、マウスを生ヒト乳癌細胞また
はそれから調製された膜抽出物により免疫感作すること
により得られる。マウスに免疫原量の細胞または抽出物
を腹腔内接種し、そして次に類似の量の免疫原により追
加免疫感作する。最終追加免疫の数日後に、免疫感作さ
れたマウスから脾臓を集め、そして脾臓から融合におい
て使用するための細胞懸濁液を調製する。
【００１６】ハイブリドーマを脾細胞およびネズミ腫瘍
パートナーから、Buck,D.W等、In Vitro(1982)18:377-3
81により改変されたKohler,B.およびMilstein,C.,Natur
e(1975)256:495−497の一般的体細胞ハイブリダイゼー
ション技法を用いて調製する。このハイブリダイゼーシ
ョンにおいて、入手可能なネズミ骨髄腫セルライン、例
えば、サルク研究所、細胞分配センター、サンジエゴ、
カリホルニア、米国から得られるそれを使用することが
できる。基本的には、この技法は、ポリエチレングリコ
ールのごとき融合剤を用いて腫瘍細胞と脾細胞を融合せ
しめることを含む。融合の後、細胞を融合媒体から分離
し、そしてHAT培地のごとき選択増殖培地中で増殖せし
めてハイブリダイズしなかった親細胞を除去する。所望
により、ハイブリドーマを拡張し、そして上清を抗−ヒ
ト乳癌活性について、常用のイムノアッセイ法(例え
ば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ、またはフルオレッセンスイムノアッセイ)により、
抗原として免疫剤（乳癌細胞または膜抽出物）を用いて
アッセイする。陽性クローンをさらに特微付けて、それ
らがこの発明の抗体の規準に合致するか否かを決定す
る。
パートナーから、Buck,D.W等、In Vitro(1982)18:377-3
81により改変されたKohler,B.およびMilstein,C.,Natur
e(1975)256:495−497の一般的体細胞ハイブリダイゼー
ション技法を用いて調製する。このハイブリダイゼーシ
ョンにおいて、入手可能なネズミ骨髄腫セルライン、例
えば、サルク研究所、細胞分配センター、サンジエゴ、
カリホルニア、米国から得られるそれを使用することが
できる。基本的には、この技法は、ポリエチレングリコ
ールのごとき融合剤を用いて腫瘍細胞と脾細胞を融合せ
しめることを含む。融合の後、細胞を融合媒体から分離
し、そしてHAT培地のごとき選択増殖培地中で増殖せし
めてハイブリダイズしなかった親細胞を除去する。所望
により、ハイブリドーマを拡張し、そして上清を抗−ヒ
ト乳癌活性について、常用のイムノアッセイ法(例え
ば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ、またはフルオレッセンスイムノアッセイ)により、
抗原として免疫剤（乳癌細胞または膜抽出物）を用いて
アッセイする。陽性クローンをさらに特微付けて、それ
らがこの発明の抗体の規準に合致するか否かを決定す
る。
【００１７】このような抗体を生産するハイブリドーマ
は既知の方法を用いてインビトロまたはインビボで増殖
せしめることができる。モノクローナル抗体は、事情に
応じて培地または体液から、常用の免疫グロブリン精製
法、例えば硫酸アンモニウム沈澱、ゲル電気泳動、透
析、クロマトグラフィー、および限外濾過により、所望
により単離することができる。
は既知の方法を用いてインビトロまたはインビボで増殖
せしめることができる。モノクローナル抗体は、事情に
応じて培地または体液から、常用の免疫グロブリン精製
法、例えば硫酸アンモニウム沈澱、ゲル電気泳動、透
析、クロマトグラフィー、および限外濾過により、所望
により単離することができる。
【００１８】モノクローナル抗体の選択／特徴付け モノクローナル抗体の重要な特徴は、（１）それらの免
疫グロブリンクラス、（２）ヒト乳癌細1胞に対するそ
れらの選択性、（３）それらが結合するヒト乳癌腫瘍細
胞の範囲、（４）それらが結合するヒト乳癌腫瘍凍結切
片の範囲、および（５）効果的な抗−ヒト乳癌イムノイ
メージング剤の製造におけるそれらの有用性である。
疫グロブリンクラス、（２）ヒト乳癌細1胞に対するそ
れらの選択性、（３）それらが結合するヒト乳癌腫瘍細
胞の範囲、（４）それらが結合するヒト乳癌腫瘍凍結切
片の範囲、および（５）効果的な抗−ヒト乳癌イムノイ
メージング剤の製造におけるそれらの有用性である。
【００１９】与えられた抗体の選択性および範囲は、
（１）ヒト乳癌腫瘍組織、（２）ヒト乳癌セルライン、
および（３）正常ヒト組織または乳房もしくは他の由来
の細胞、のパネルに対してその抗体を試験することによ
り決定される。特許請求の範囲に記載されている抗体の
選択においては、約22,000の増殖するハイブリドーマ培
養物をまず免疫感作用乳癌膜またはセルライン、７種の
正常組織膜のパネル、線維芽細胞セルラインおよび乳癌
凍結切片に対してスクリーニングした。新生物材料と反
応するが正常材料とは反応しないクローンをこの最初の
スクリーニングにおいて同定し、そしてアイソタイプの
決定並びに選択性および範囲の追加のスクリーニングの
ために選択した。追加のスクリーニングは、16種類の正
常組織切片、５種類の正常血液細胞タイプ、11種類の非
乳房新生物切片、21種類の乳癌切片、および14種類の乳
癌セルラインを用いた。
（１）ヒト乳癌腫瘍組織、（２）ヒト乳癌セルライン、
および（３）正常ヒト組織または乳房もしくは他の由来
の細胞、のパネルに対してその抗体を試験することによ
り決定される。特許請求の範囲に記載されている抗体の
選択においては、約22,000の増殖するハイブリドーマ培
養物をまず免疫感作用乳癌膜またはセルライン、７種の
正常組織膜のパネル、線維芽細胞セルラインおよび乳癌
凍結切片に対してスクリーニングした。新生物材料と反
応するが正常材料とは反応しないクローンをこの最初の
スクリーニングにおいて同定し、そしてアイソタイプの
決定並びに選択性および範囲の追加のスクリーニングの
ために選択した。追加のスクリーニングは、16種類の正
常組織切片、５種類の正常血液細胞タイプ、11種類の非
乳房新生物切片、21種類の乳癌切片、および14種類の乳
癌セルラインを用いた。
【００２０】この発明の目的のため、選択性および特異
性は相互交換的に使用され、そして16の正常組織凍結切
片中染色されたサブストラクチュアー(substructure)の
数と結合された血液細胞タイプの数の合計を、それに対
してモノクローナル抗体が試験された全組織中モノクロ
ーナル抗体のいずれかにより結合されたサブストラクチ
ュアー(substructure)の全数と試験された５種類の血液
細胞タイプの合計で除したものとして定義される。
性は相互交換的に使用され、そして16の正常組織凍結切
片中染色されたサブストラクチュアー(substructure)の
数と結合された血液細胞タイプの数の合計を、それに対
してモノクローナル抗体が試験された全組織中モノクロ
ーナル抗体のいずれかにより結合されたサブストラクチ
ュアー(substructure)の全数と試験された５種類の血液
細胞タイプの合計で除したものとして定義される。
【００２１】「癌範囲」(tumor range)なる語は、染色
された乳癌凍結切片の数を試験された乳癌凍結切断の数
で除したものとして定義される。抗体は、それらが0.09
以下の選択性、および0.25以上の乳癌結合範囲または0.
25以上の乳癌セルライン結合範囲を有する場合に、乳癌
イムノイメージング目的のために適当であるものと認め
られた。
された乳癌凍結切片の数を試験された乳癌凍結切断の数
で除したものとして定義される。抗体は、それらが0.09
以下の選択性、および0.25以上の乳癌結合範囲または0.
25以上の乳癌セルライン結合範囲を有する場合に、乳癌
イムノイメージング目的のために適当であるものと認め
られた。
【００２２】許容される選択性および結合範囲を示す抗
体を、種々のイメージング成分、例えば、放射性同位元
素、または核磁気共鳴イメージングにより検出可能な材
料に接合せしめることができる。幾つかの場合には、カ
ップリング剤、例えばキレート剤を用いてイメージング
剤を抗体に連結することができる。
体を、種々のイメージング成分、例えば、放射性同位元
素、または核磁気共鳴イメージングにより検出可能な材
料に接合せしめることができる。幾つかの場合には、カ
ップリング剤、例えばキレート剤を用いてイメージング
剤を抗体に連結することができる。
【００２３】33の寄託されたハイブリドーマの内５種類
の抗体が同じ200Kダルトンの抗原を認識することが見出
された。33の内４種類の抗体が230Kダルトンの細胞内抗
原に結合した。３種類が1または複数の高分子量ムチン
(mucin)(HMW)に結合し、そして２種類が97Kダルトン抗
原の形のトランスフェリンリセプターに結合した。ここ
に記載する全ての抗原の分子量は既知の方法を用いる還
元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリ
ルアミドゲルにより決定された。
の抗体が同じ200Kダルトンの抗原を認識することが見出
された。33の内４種類の抗体が230Kダルトンの細胞内抗
原に結合した。３種類が1または複数の高分子量ムチン
(mucin)(HMW)に結合し、そして２種類が97Kダルトン抗
原の形のトランスフェリンリセプターに結合した。ここ
に記載する全ての抗原の分子量は既知の方法を用いる還
元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリ
ルアミドゲルにより決定された。
【００２４】これらの抗体の特微付けのこれ以上の詳細
は例において後記する。
は例において後記する。
【００２５】免疫化学物質 最も重要なこの発明のモノクローナル抗体の免疫化学誘
導体は、イメージング成分、例えば放射性同位元素、放
射線不透過基質、または核磁気共鳴により検出可能な材
料によりラベルされる。このような免疫化学誘導体(イ
メージング成分が、ラベルされた抗体を含む免疫複合体
を同定するための手段を提供する)を、乳癌腫瘍のイン
ビボでのイメージングに用いることができる。
導体は、イメージング成分、例えば放射性同位元素、放
射線不透過基質、または核磁気共鳴により検出可能な材
料によりラベルされる。このような免疫化学誘導体(イ
メージング成分が、ラベルされた抗体を含む免疫複合体
を同定するための手段を提供する)を、乳癌腫瘍のイン
ビボでのイメージングに用いることができる。
【００２６】0.25以上の乳癌腫瘍結合範囲または0.25以
上の乳癌セルライン結合範囲のいずれかを示し、そして
さらに0.09以上の選択性を示しそして血液細胞に結合し
ない抗体が、乳癌イムノイメージング目的のために選択
的であると考えられた。そして、これらを検出可能なイ
メージング成分と接合せしめることがてきる。これらの
イメージング成分はモノクローナル抗体に直接結合せし
めることができ、またはリンク剤またはキレート剤によ
りモノクローナル抗体に結合せしめることができる。イ
メージング成分によってラベルされたモノクローナル抗
体の誘導体は当業界において知られている種々の方法に
より作ることができる。このようなラベルされた誘導体
もまた、イムノイメージング剤として好ましい。
上の乳癌セルライン結合範囲のいずれかを示し、そして
さらに0.09以上の選択性を示しそして血液細胞に結合し
ない抗体が、乳癌イムノイメージング目的のために選択
的であると考えられた。そして、これらを検出可能なイ
メージング成分と接合せしめることがてきる。これらの
イメージング成分はモノクローナル抗体に直接結合せし
めることができ、またはリンク剤またはキレート剤によ
りモノクローナル抗体に結合せしめることができる。イ
メージング成分によってラベルされたモノクローナル抗
体の誘導体は当業界において知られている種々の方法に
より作ることができる。このようなラベルされた誘導体
もまた、イムノイメージング剤として好ましい。
【００２７】固相酸化剤、1,3,4,6−テトラクロロ3α,6
α−ジフェニルグリコウリル(商標Iodo−genのもとに販
売されている)、またはＮ−クロロ−ｐ−トルエンスル
ホンアミド(クロラミンＴ)を用いて、ヨウ素の放射性同
位元素によりモノクローナル抗体をヨード化することが
できる。
α−ジフェニルグリコウリル(商標Iodo−genのもとに販
売されている)、またはＮ−クロロ−ｐ−トルエンスル
ホンアミド(クロラミンＴ)を用いて、ヨウ素の放射性同
位元素によりモノクローナル抗体をヨード化することが
できる。
【００２８】この明細書において使用するリンカーなる
語は、イメージング成分に結合することができ、そして
さらにモノクローナル抗体に結合することができる化学
物質を包含することが意図される。適当なリンカーは、
モノクローナル抗体に結合し、そして放射性核種をキレ
ートするリンカーを包含するであろう。他のリンカー、
例えば、モノクローナル抗体の炭水化物担持領域に選択
的に結合することができるもの、またはモノクローナル
抗体のタンパク質領域の遊離アミノ側基に結合すること
ができるもの（例えばアミジン化剤またはイミジン化
剤）であって、イメージング成分に共有結合することが
できるものもこの明細書で使用するリンカーなる語の範
囲に含まれる。
語は、イメージング成分に結合することができ、そして
さらにモノクローナル抗体に結合することができる化学
物質を包含することが意図される。適当なリンカーは、
モノクローナル抗体に結合し、そして放射性核種をキレ
ートするリンカーを包含するであろう。他のリンカー、
例えば、モノクローナル抗体の炭水化物担持領域に選択
的に結合することができるもの、またはモノクローナル
抗体のタンパク質領域の遊離アミノ側基に結合すること
ができるもの（例えばアミジン化剤またはイミジン化
剤）であって、イメージング成分に共有結合することが
できるものもこの明細書で使用するリンカーなる語の範
囲に含まれる。
【００２９】適当なリンカーは3つの特徴を有するであ
ろう。第１にこれらはイメージングのため読み取られる
ために望ましい特徴を有するイメージング成分を結合す
ることができなければならない。第２に、リンカーはモ
ノクローナル抗体の結合選択性に有意な影響を与えては
ならず、または結合されるべき抗原に対する親和性を実
質的に低下せしめてはならない。最後に、リンカーは、
イメージング剤と抗体が他方から分離しないように、イ
メージング剤とモノクローナル抗体との安定な結合を形
成しなければならない。
ろう。第１にこれらはイメージングのため読み取られる
ために望ましい特徴を有するイメージング成分を結合す
ることができなければならない。第２に、リンカーはモ
ノクローナル抗体の結合選択性に有意な影響を与えては
ならず、または結合されるべき抗原に対する親和性を実
質的に低下せしめてはならない。最後に、リンカーは、
イメージング剤と抗体が他方から分離しないように、イ
メージング剤とモノクローナル抗体との安定な結合を形
成しなければならない。
【００３０】この発明のイムノイメージング剤の製造の
ために使用される特定のリンカーおよびイメージング成
分は、特定のイメージング成分またはイメージング成分
とリンカーが標的抗原に対するモノクローナル抗体の結
合特性に対して有する効果に依存して、抗体ごとに異る
であろう。すなわち、1つのモノクローナル抗体はヨウ
素の放射性同位元素を用いてモノクローナル抗体内のチ
ロシン残基において、モノクローナル抗体の親和性また
は選択性に有意な影響を与えることなくヨード化するこ
とができるであろうが、この発明の第２のモノクローナ
ル抗体の同じ処理が他のモノクローナル抗体の親和性ま
たは結合特異性を有意に低下せしめるであろう。異るラ
ベルまたはリンカー、例えば、異るアミノ酸残基におい
て抗体に結合するものを、第２の抗体の選択性または親
和性に影響を与えることなく使用することができる。す
なわち、ヨウ素放射性同位元素を第２の抗体に、例え
ば、Wood,F.T.等、Analy.Biochem. 69:339(1975)の方法
およびリンカーであるメチル−ｐ−ヒドロキシベンズイ
ミデートを用いて、またはBolton‐Hunterの方法、Bolt
on,A.E.およびHunter,W.M.,Biochem.J.133:529-539(197
3)およびリンカーであるＮ−サクシンイミジル−３−
（４−ヒドロキシフェニル)プロピオネートを用いて連
結することができる。キレート剤、例えば、抗体のリジ
ン残基に結合する無水ジメチレントリアミンペンタ酢
酸、またはエチレントリアミン四酢酸を用いて抗体を11
1−インジウム(111-In)でラベルすることができ、そし
てさらに抗体をイメージング成分に連結せしめるための
他の手段として使用され得る。例えば、Goodwin等、Che
late Conjugates of Monoclonal Antibodies for lnagi
ng Lymphid Structures in the Mouse',J.Nucl.Med.26
(5):493-502(1985)、およびMeares等、"Conjugation of
Antibodies with Biofunctional Chelating Agents Be
aring Isothiocyanate or Bromoacetamide Groups and
Subsequent Addition ofMetal Ions" Analy.Biochem.14
2:68-78(1984)を参照のこと。
ために使用される特定のリンカーおよびイメージング成
分は、特定のイメージング成分またはイメージング成分
とリンカーが標的抗原に対するモノクローナル抗体の結
合特性に対して有する効果に依存して、抗体ごとに異る
であろう。すなわち、1つのモノクローナル抗体はヨウ
素の放射性同位元素を用いてモノクローナル抗体内のチ
ロシン残基において、モノクローナル抗体の親和性また
は選択性に有意な影響を与えることなくヨード化するこ
とができるであろうが、この発明の第２のモノクローナ
ル抗体の同じ処理が他のモノクローナル抗体の親和性ま
たは結合特異性を有意に低下せしめるであろう。異るラ
ベルまたはリンカー、例えば、異るアミノ酸残基におい
て抗体に結合するものを、第２の抗体の選択性または親
和性に影響を与えることなく使用することができる。す
なわち、ヨウ素放射性同位元素を第２の抗体に、例え
ば、Wood,F.T.等、Analy.Biochem. 69:339(1975)の方法
およびリンカーであるメチル−ｐ−ヒドロキシベンズイ
ミデートを用いて、またはBolton‐Hunterの方法、Bolt
on,A.E.およびHunter,W.M.,Biochem.J.133:529-539(197
3)およびリンカーであるＮ−サクシンイミジル−３−
（４−ヒドロキシフェニル)プロピオネートを用いて連
結することができる。キレート剤、例えば、抗体のリジ
ン残基に結合する無水ジメチレントリアミンペンタ酢
酸、またはエチレントリアミン四酢酸を用いて抗体を11
1−インジウム(111-In)でラベルすることができ、そし
てさらに抗体をイメージング成分に連結せしめるための
他の手段として使用され得る。例えば、Goodwin等、Che
late Conjugates of Monoclonal Antibodies for lnagi
ng Lymphid Structures in the Mouse',J.Nucl.Med.26
(5):493-502(1985)、およびMeares等、"Conjugation of
Antibodies with Biofunctional Chelating Agents Be
aring Isothiocyanate or Bromoacetamide Groups and
Subsequent Addition ofMetal Ions" Analy.Biochem.14
2:68-78(1984)を参照のこと。
【００３１】イメージングのために適当な種々の成分が
知られている。例えば、モノクローナル抗体がイメージ
ングのために適当な多数の放射性核種、例えば131−ヨ
ウ素(I−131)およびI−123により放射性ラベルされてい
る。Levin等、"Localizationof I-131 Labeled Tumor B
earing Balb/c Mouse",J.Nuclear Medicine 21:570-572
(1980);Farrands等、"Radioimmunodetection of Human
Co1orectal Cancers by an Anti-Tumor Monoclonal Ant
iboby",Lancet 397-399(1982);Zimmer等、"Radioimmuno
imaging of Human Small Cell Lung Carcinoma with I-
131 Tumor Specific Monoclonal Antibody", Hybridom
a,4(1)1-11(1985)。ヨウ素の放射性同位元素によるモノ
クローナル抗体の直接ラベル化は、Contreras等、Metho
ds in Enzymology(1973)97:277に記載されている方法に
従って行うことができる。テクネチウム-99をイメージ
ング成分として使用することができる。Khaw等、"Monoc
lonal Antibody to Cardiac Myosin：Imaging of Exper
imental Myocardial lnfection",Hybridoma,３:11-23(1
984)。111−Inが抗体のラベルとして適用されている。K
rejack等、"Covalent Attachment of Chelating Groups
to Macromolecules", Biochem.Biophys.Res.Comm.,77:
581-585(1977)；Hnatowich等、"RadioactiveLabeling o
f Antibody A Simple and Efficient Method",Science,
220:613-615(1983)；およびSchienberg,D.A.等、"Tumo
r Imaging with Radioactive Metal Chelates Conjugat
ed to Monoclonal Antibodies",Science,215:1511-1513
(1982)。
知られている。例えば、モノクローナル抗体がイメージ
ングのために適当な多数の放射性核種、例えば131−ヨ
ウ素(I−131)およびI−123により放射性ラベルされてい
る。Levin等、"Localizationof I-131 Labeled Tumor B
earing Balb/c Mouse",J.Nuclear Medicine 21:570-572
(1980);Farrands等、"Radioimmunodetection of Human
Co1orectal Cancers by an Anti-Tumor Monoclonal Ant
iboby",Lancet 397-399(1982);Zimmer等、"Radioimmuno
imaging of Human Small Cell Lung Carcinoma with I-
131 Tumor Specific Monoclonal Antibody", Hybridom
a,4(1)1-11(1985)。ヨウ素の放射性同位元素によるモノ
クローナル抗体の直接ラベル化は、Contreras等、Metho
ds in Enzymology(1973)97:277に記載されている方法に
従って行うことができる。テクネチウム-99をイメージ
ング成分として使用することができる。Khaw等、"Monoc
lonal Antibody to Cardiac Myosin：Imaging of Exper
imental Myocardial lnfection",Hybridoma,３:11-23(1
984)。111−Inが抗体のラベルとして適用されている。K
rejack等、"Covalent Attachment of Chelating Groups
to Macromolecules", Biochem.Biophys.Res.Comm.,77:
581-585(1977)；Hnatowich等、"RadioactiveLabeling o
f Antibody A Simple and Efficient Method",Science,
220:613-615(1983)；およびSchienberg,D.A.等、"Tumo
r Imaging with Radioactive Metal Chelates Conjugat
ed to Monoclonal Antibodies",Science,215:1511-1513
(1982)。
【００３２】イメージングのために適切な抗体に最初に
接近するために、抗体を、蛍光色素のごとき直接検出可
能な成分により、および検出されるために反応しまたは
誘導体化されなければならない酵素のごとき成分により
ラベルすることができる。このようなラベルの例はフル
オレッセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその
誘導体、ダンシル(dangyl)群、ウムベリフェロン、ルシ
ュフェリン、2,3−ジヒドロフタラジンジオン、ホース
ラディッシュ・パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファ
ターゼ、リゾチーム、およびグルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼである。抗体をこのようなラベル
により既知の方法により標識することができる。例え
ば、カップリング剤、例えば、アルデヒド、カルボジイ
ミド、ジマレイミド、イミデート、サクシンイミド、ビ
ス−ジアゾ化ベンジジン等を用いて、上記の蛍光ラベ
ル、化学発光ラベル、および酵素ラベルにより抗体を標
識することができる。
接近するために、抗体を、蛍光色素のごとき直接検出可
能な成分により、および検出されるために反応しまたは
誘導体化されなければならない酵素のごとき成分により
ラベルすることができる。このようなラベルの例はフル
オレッセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその
誘導体、ダンシル(dangyl)群、ウムベリフェロン、ルシ
ュフェリン、2,3−ジヒドロフタラジンジオン、ホース
ラディッシュ・パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファ
ターゼ、リゾチーム、およびグルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼである。抗体をこのようなラベル
により既知の方法により標識することができる。例え
ば、カップリング剤、例えば、アルデヒド、カルボジイ
ミド、ジマレイミド、イミデート、サクシンイミド、ビ
ス−ジアゾ化ベンジジン等を用いて、上記の蛍光ラベ
ル、化学発光ラベル、および酵素ラベルにより抗体を標
識することができる。
【００３３】抗体およびラベルされた抗体を種々のイム
ノイメージングまたはイムノアッセイ法において用い
て、患者における乳癌の存在を検出することができ、ま
たはそれを有することがすでに診断されている患者にお
いてその癌の状態をモニターすることができる。患者の
体内での腫瘍の存在、その位置および拡散並びに腫瘍負
荷の改善のための治療の進展を検査するためにインビボ
・イムノイメージングで使用される場合、イメージング
成分によりラベルされたモノクローナル抗体は非経口的
に、好ましくは静脈内にまたは皮下に、腫瘍部位に蓄積
しそして選択された検出手段によって検出されるのに十
分な量で投与されるてあろう。典型的には、イメージン
グ成分でラベルされたモノクローナル抗体は、当業者に
よりよく知られているタイプの適当な医薬として許容さ
れるキャリャーと共に投与されるであろう。このような
キャリャーは患者に影響を与えないものである。投与さ
れるべきモノクローナル抗体の量は、モノクローナル抗
体に付加された検出可能なイメージング成分の量、イメ
ージング剤によりラベルした後のモノクローナル抗体の
残留結合効率に依存するであろう。
ノイメージングまたはイムノアッセイ法において用い
て、患者における乳癌の存在を検出することができ、ま
たはそれを有することがすでに診断されている患者にお
いてその癌の状態をモニターすることができる。患者の
体内での腫瘍の存在、その位置および拡散並びに腫瘍負
荷の改善のための治療の進展を検査するためにインビボ
・イムノイメージングで使用される場合、イメージング
成分によりラベルされたモノクローナル抗体は非経口的
に、好ましくは静脈内にまたは皮下に、腫瘍部位に蓄積
しそして選択された検出手段によって検出されるのに十
分な量で投与されるてあろう。典型的には、イメージン
グ成分でラベルされたモノクローナル抗体は、当業者に
よりよく知られているタイプの適当な医薬として許容さ
れるキャリャーと共に投与されるであろう。このような
キャリャーは患者に影響を与えないものである。投与さ
れるべきモノクローナル抗体の量は、モノクローナル抗
体に付加された検出可能なイメージング成分の量、イメ
ージング剤によりラベルした後のモノクローナル抗体の
残留結合効率に依存するであろう。
【００３４】イメージング成分によりラベルされたモノ
クローナル抗体の残留結合効率は腫瘍細胞結合アッセイ
を用いてインビトロで決定される。一般に、放射性同位
元素でラベルされたモノクローナル抗体の残留結合効率
を測定する放射免疫反応性は、既知の免疫反応性腫瘍セ
ルライン、例えばSKBR-3、MCF-7、およびMX-1の固定さ
れた組織培養物への放射性同位元素でラベルされたモノ
クローナル抗体の特異的結合を、モノクローナル抗体を
特界的に結合しない固定されたセルラインヘの非特異的
結合と比較することにより決定される。
クローナル抗体の残留結合効率は腫瘍細胞結合アッセイ
を用いてインビトロで決定される。一般に、放射性同位
元素でラベルされたモノクローナル抗体の残留結合効率
を測定する放射免疫反応性は、既知の免疫反応性腫瘍セ
ルライン、例えばSKBR-3、MCF-7、およびMX-1の固定さ
れた組織培養物への放射性同位元素でラベルされたモノ
クローナル抗体の特異的結合を、モノクローナル抗体を
特界的に結合しない固定されたセルラインヘの非特異的
結合と比較することにより決定される。
【００３５】ラベルされたモノクローナル抗体の最適放
射免疫反応性は、この系において、モノクローナル抗体
の濃度を一定に維持しながら、モノクローナル抗体に結
合するために利用可能なイメージング剤の濃度を変える
ことによって決定される。次に、ラベルされたモノクロ
ーナル抗体は、上記の固定細胞イムノアッセイにおい
て、抗原過剰の条件において固定された細胞にラベルさ
れたモノクローナル抗体を添加することにより試験され
る。最高の検出可能な結合を与えるラベルされたモノク
ローナル抗体が決定され、そしてまずインビボでのラジ
オイムノイメージングのために使用され得る。
射免疫反応性は、この系において、モノクローナル抗体
の濃度を一定に維持しながら、モノクローナル抗体に結
合するために利用可能なイメージング剤の濃度を変える
ことによって決定される。次に、ラベルされたモノクロ
ーナル抗体は、上記の固定細胞イムノアッセイにおい
て、抗原過剰の条件において固定された細胞にラベルさ
れたモノクローナル抗体を添加することにより試験され
る。最高の検出可能な結合を与えるラベルされたモノク
ローナル抗体が決定され、そしてまずインビボでのラジ
オイムノイメージングのために使用され得る。
【００３６】インビトロでのイムノアッセイを使用して
癌患者の状態をモニターする場合、定量的イムノアッセ
イ法を使用しなければならない。このようなモニターに
おいては、定期的にモニターを行い、そして結果を比較
して患者の腫瘍負荷が増加しているかまたは減少してい
るかを決定する。使用することができる一般的アッセイ
法には直接アッセイおよび間接アッセイが含まれる。直
接アッセイは、患者からの組織サンプルまたは細胞をラ
ベルされた抗体と共にインキュベートすることを含む。
サンプルが乳癌細胞を含有すれば、ラベルされた抗体が
それらの細胞に結合するであろう。組織または細胞を洗
浄して未結合のラベル化抗体を除去した後、組織サンプ
ルをラベルされた免疫複合体の存在について読み取る。
間接アッセイにおいては、組織または細胞サンプルを未
ラベルのモノクローナル抗体と共にインキュベートす
る。次に、サンプルを、モノクローナル抗体に対するラ
ベルされた抗体(例えば、ラベルされた抗ネズミ抗体)で
処理し、そしてラベルされた３成分複合体の存在につい
て読みとる。
癌患者の状態をモニターする場合、定量的イムノアッセ
イ法を使用しなければならない。このようなモニターに
おいては、定期的にモニターを行い、そして結果を比較
して患者の腫瘍負荷が増加しているかまたは減少してい
るかを決定する。使用することができる一般的アッセイ
法には直接アッセイおよび間接アッセイが含まれる。直
接アッセイは、患者からの組織サンプルまたは細胞をラ
ベルされた抗体と共にインキュベートすることを含む。
サンプルが乳癌細胞を含有すれば、ラベルされた抗体が
それらの細胞に結合するであろう。組織または細胞を洗
浄して未結合のラベル化抗体を除去した後、組織サンプ
ルをラベルされた免疫複合体の存在について読み取る。
間接アッセイにおいては、組織または細胞サンプルを未
ラベルのモノクローナル抗体と共にインキュベートす
る。次に、サンプルを、モノクローナル抗体に対するラ
ベルされた抗体(例えば、ラベルされた抗ネズミ抗体)で
処理し、そしてラベルされた３成分複合体の存在につい
て読みとる。
【００３７】インビトロでの診断的使用のため、抗体は
典型的にはキットとして分配されるであろう。これらの
キットは典型的には、適当な容器中ラベルされた形また
はラベルされていない形の抗体、インキュベーションお
よび洗浄のための試薬類、キットが間接アッセイのため
のものであればラベルされた抗ネズミ抗体、ならびに、
ラベルの種類に依存して基質または誘導体化剤を含んで
成るであろう。インビボイメージング用のため、抗体は
やはりキットの形で分配され、そして典型的には上記と
同じタイプの構成要素を包含するであろう。抗体は使用
されるべき放射性同位元素にすでに結合しているかまた
はそれとキレート化している薬剤により誘導体化されて
供給され、あるいはモノクローナル抗体は結合剤または
キレート剤のみにより誘導体化されて供給され、そして
使用されるべき放射性同位元素は別々に供給され得る。
使用されるべき放射性同位元素は使用直前に加えて、患
者にラジオイムノイメージング剤を投与する時点におい
てイメージングのための最適放射能レベルが達成され得
るようにすることができる。試験のために適当であれ
ば、ヒト乳癌抗原対照および指示書もまた包めることが
できる。
典型的にはキットとして分配されるであろう。これらの
キットは典型的には、適当な容器中ラベルされた形また
はラベルされていない形の抗体、インキュベーションお
よび洗浄のための試薬類、キットが間接アッセイのため
のものであればラベルされた抗ネズミ抗体、ならびに、
ラベルの種類に依存して基質または誘導体化剤を含んで
成るであろう。インビボイメージング用のため、抗体は
やはりキットの形で分配され、そして典型的には上記と
同じタイプの構成要素を包含するであろう。抗体は使用
されるべき放射性同位元素にすでに結合しているかまた
はそれとキレート化している薬剤により誘導体化されて
供給され、あるいはモノクローナル抗体は結合剤または
キレート剤のみにより誘導体化されて供給され、そして
使用されるべき放射性同位元素は別々に供給され得る。
使用されるべき放射性同位元素は使用直前に加えて、患
者にラジオイムノイメージング剤を投与する時点におい
てイメージングのための最適放射能レベルが達成され得
るようにすることができる。試験のために適当であれ
ば、ヒト乳癌抗原対照および指示書もまた包めることが
できる。
【００３８】次の例は、この発明の代表的なモノクロー
ナル抗体の調製、特徴付けおよび使用についての詳細な
記載を提供する。これらの例は、この発明の範囲をなん
ら限定するものではない。
ナル抗体の調製、特徴付けおよび使用についての詳細な
記載を提供する。これらの例は、この発明の範囲をなん
ら限定するものではない。
【００３９】免疫感作 ヒトの手術後の新鮮な乳癌組織および種々の正常組織を
用いて、ホモジネーションおよび非連続シュークロース
グラジエント遠心により、膜抽出物を調製した。ヒト乳
癌セルラインは、ブレスト・キャンサー・タスク・フォ
ース(Breast Cancer Task Force)、アメリカン・タイプ
・カルチュア・コレクション(ATCC)、およびメモリアル
・スローン・ケッタリング(Memorial Sloan Kettering)
のJorgenFogh博士から入手した。ブレスト・キャンサー
・タスク・フォース、ATCC、およびFogh博士により推奨
されるようにして細胞を維持し、そして継代した。免疫
感作のため、100μｇのタンパク質(Lowryアッセイ）を
含有する膜抽出物または１千万個の生乳癌細胞を、５週
冷のBalb/cマウスに腹腔内接種した。最終追加免疫の３
日後、細胞融合のために脾臓を摘出した。
用いて、ホモジネーションおよび非連続シュークロース
グラジエント遠心により、膜抽出物を調製した。ヒト乳
癌セルラインは、ブレスト・キャンサー・タスク・フォ
ース(Breast Cancer Task Force)、アメリカン・タイプ
・カルチュア・コレクション(ATCC)、およびメモリアル
・スローン・ケッタリング(Memorial Sloan Kettering)
のJorgenFogh博士から入手した。ブレスト・キャンサー
・タスク・フォース、ATCC、およびFogh博士により推奨
されるようにして細胞を維持し、そして継代した。免疫
感作のため、100μｇのタンパク質(Lowryアッセイ）を
含有する膜抽出物または１千万個の生乳癌細胞を、５週
冷のBalb/cマウスに腹腔内接種した。最終追加免疫の３
日後、細胞融合のために脾臓を摘出した。
【００４０】ハイブリドーマ法 体細胞ハイブリドをネズミ骨髄腫セルラインSp-2/0/Ag1
4を用いてBuck,D.W.等、前掲の方法により調製した。全
てのハイブリドーマセルラインは限界希釈法によりクロ
ーン化した。融合の半分は乳癌膜抽出物により免疫感作
されたマウスからの脾細胞を用い、半分は生乳癌セルラ
インにより免疫感作されたマウスからの脾細胞を用い
た。これらの融合から、83424ウェルが得られ、その内2
2,459がハイブリドーマの増殖を示した。
4を用いてBuck,D.W.等、前掲の方法により調製した。全
てのハイブリドーマセルラインは限界希釈法によりクロ
ーン化した。融合の半分は乳癌膜抽出物により免疫感作
されたマウスからの脾細胞を用い、半分は生乳癌セルラ
インにより免疫感作されたマウスからの脾細胞を用い
た。これらの融合から、83424ウェルが得られ、その内2
2,459がハイブリドーマの増殖を示した。
【００４１】スクリーニング法 ハイブリドーマ上清を、免疫用乳癌膜抽出物を用いる固
相エンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ(ELI
SA)により、または免疫用乳癌セルラインを用いる間接
イムノフルオレッセンスアッセイによりアッセイした。
固相膜ELISAのため、40μlの0.1mg/ml乳癌膜タンパク質
をポリ塩化ビニル(PVC)ミクロタイターウェル中に４℃
にて12時間置いた。抽出物を吸引除去し、そしてウェル
を１％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸緩衝
化塩溶液(PBS)で洗浄した。次に、ウェルをハイブリド
ーマ上清の１：10希釈物45μlと共にインキュベートし
た。希釈剤は、20mMの緩衝剤、10％ウシ血清、および0.
1％ナトリウムアジドを含有する媒体であった。室温に
て30分間の後、ウェルを再度洗浄し、そして37℃にて45
分間、パーオキシダーゼ接合ヤギ抗−マウスIgGの１：2
00希釈物で洗浄した。希釈剤はPBSであった。次にウェ
ルをPBSで洗浄し、そして0.1Ｍクエン酸ナトリウム緩衝
液(pH4.2)中200μlの1,2-アジノ−ジ(３−エチルベンズ
チアゾリンスルホン酸)と室温にて30分間反応せしめ
た。光学濃度を405nmにてミクロエリサ・リーダー(Micr
o Elisa Reader)上で測定した。各実験のため、陽性対
照としての5μg/mlの抗−β2ミクログロブリンを正常な
ヒト腎膜と反応せしめた。これは、0.1±0.1(標準偏差)
の光学濃度を与えた。バックグラウンドは、マウスモノ
クローナル抗体を含まない媒体を用いて0±0.1光学濃度
(O.D.)であった。乳癌膜抽出物に対して0.7O.D.より大
きな反応をもたらすウェルを貯蔵した。
相エンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ(ELI
SA)により、または免疫用乳癌セルラインを用いる間接
イムノフルオレッセンスアッセイによりアッセイした。
固相膜ELISAのため、40μlの0.1mg/ml乳癌膜タンパク質
をポリ塩化ビニル(PVC)ミクロタイターウェル中に４℃
にて12時間置いた。抽出物を吸引除去し、そしてウェル
を１％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸緩衝
化塩溶液(PBS)で洗浄した。次に、ウェルをハイブリド
ーマ上清の１：10希釈物45μlと共にインキュベートし
た。希釈剤は、20mMの緩衝剤、10％ウシ血清、および0.
1％ナトリウムアジドを含有する媒体であった。室温に
て30分間の後、ウェルを再度洗浄し、そして37℃にて45
分間、パーオキシダーゼ接合ヤギ抗−マウスIgGの１：2
00希釈物で洗浄した。希釈剤はPBSであった。次にウェ
ルをPBSで洗浄し、そして0.1Ｍクエン酸ナトリウム緩衝
液(pH4.2)中200μlの1,2-アジノ−ジ(３−エチルベンズ
チアゾリンスルホン酸)と室温にて30分間反応せしめ
た。光学濃度を405nmにてミクロエリサ・リーダー(Micr
o Elisa Reader)上で測定した。各実験のため、陽性対
照としての5μg/mlの抗−β2ミクログロブリンを正常な
ヒト腎膜と反応せしめた。これは、0.1±0.1(標準偏差)
の光学濃度を与えた。バックグラウンドは、マウスモノ
クローナル抗体を含まない媒体を用いて0±0.1光学濃度
(O.D.)であった。乳癌膜抽出物に対して0.7O.D.より大
きな反応をもたらすウェルを貯蔵した。
【００４２】間接イムノフルオレッセンス・セルライン
・アッセイのため、免疫用セルラインの100,000個の乳
癌細胞を一夜、適当な媒体と共に、８個のチャンバーを
有する１セットのスライドの各チャンバー中に置いた。
同様に、セルラインCC95からの100,000個の線維芽細胞
をチャンバーを有するスライドウェル中で一夜インキュ
ベートした。細胞を１％BSAを含有するPBSにより洗浄し
た。乳癌および線維芽細胞の両者のウェルを、４℃にて
30分間、ハイブリドーマ上清の１：10稀釈物と共にイン
キュベートした。細胞を再び洗浄し、そして４℃にて30
分間、フルオレッセイン・イソチオシアネート(FITC)−
接合ヤギＦ(ab1)2抗−マウスIgの１：50稀釈物と共にイ
ンキュベートした。細胞を３回洗浄し、PBS中1.5％ホル
ムアルデヒドの中で５分間固定し、チャンバーを取り出
し、そしてPBS中ですすいだ。次に、スライドを、ポリ
ビニルアルコール、グリセリン、緩衝剤および防腐剤を
含有する組成物中に配置し、そして蛍光顕微鏡で試験し
た。乳癌細胞に対して強い蛍光結合を示すが線維芽細胞
に対して蛍光結合を示さないハイブリドーマウェルを貯
蔵した。5156個のハイブリドウェルが、最初のスクリー
ニングにおいて乳癌反応性を示した。
・アッセイのため、免疫用セルラインの100,000個の乳
癌細胞を一夜、適当な媒体と共に、８個のチャンバーを
有する１セットのスライドの各チャンバー中に置いた。
同様に、セルラインCC95からの100,000個の線維芽細胞
をチャンバーを有するスライドウェル中で一夜インキュ
ベートした。細胞を１％BSAを含有するPBSにより洗浄し
た。乳癌および線維芽細胞の両者のウェルを、４℃にて
30分間、ハイブリドーマ上清の１：10稀釈物と共にイン
キュベートした。細胞を再び洗浄し、そして４℃にて30
分間、フルオレッセイン・イソチオシアネート(FITC)−
接合ヤギＦ(ab1)2抗−マウスIgの１：50稀釈物と共にイ
ンキュベートした。細胞を３回洗浄し、PBS中1.5％ホル
ムアルデヒドの中で５分間固定し、チャンバーを取り出
し、そしてPBS中ですすいだ。次に、スライドを、ポリ
ビニルアルコール、グリセリン、緩衝剤および防腐剤を
含有する組成物中に配置し、そして蛍光顕微鏡で試験し
た。乳癌細胞に対して強い蛍光結合を示すが線維芽細胞
に対して蛍光結合を示さないハイブリドーマウェルを貯
蔵した。5156個のハイブリドウェルが、最初のスクリー
ニングにおいて乳癌反応性を示した。
【００４３】次に、5156個の陽性ウェルからの上清を、
７種類の正常組織膜抽出物(肝臓、肺、結腸、胃、腎、
扁桃腺および脾臓)を用いる固相ELISAにおいて試験し
た。0.3より大きいELISA O.Dを与えるすベてのウェル上
清を廃棄した。11101個の上清が正常組織抽出物と反応
しないことが見出された。
７種類の正常組織膜抽出物(肝臓、肺、結腸、胃、腎、
扁桃腺および脾臓)を用いる固相ELISAにおいて試験し
た。0.3より大きいELISA O.Dを与えるすベてのウェル上
清を廃棄した。11101個の上清が正常組織抽出物と反応
しないことが見出された。
【００４４】1101のハイブリドーマ上清をヒト乳癌組織
の凍結切片上で試験した。６ミクロンの切片をスライド
に付着せしめ、アセトン中で４℃にて10分間固定し室温
にて10分間乾燥し、ウマ血清によりブロックし、そして
室温にて20分間100μlのそのままのハイブリドーマ上清
と共にインキュベートした。スライドをPBSで洗浄し、
そして最後に37℃にて20分間、パーオキシダーゼ接合ラ
ビット抗−マウスIgの１：50希釈物とともにインキュベ
ートし、PBSで再度洗浄し、そして最後に37℃にて7.5分
間、0.01％過酸化水素を含有する0.05M Tris緩衝液(pH
7.2)中0.5mg/mlジアミノベンジジンと共にインキュベー
トした。スライドをヘマトキシリンで染色し、脱水し、
そして35.9％メチル／ｎ−ブチルメタクリレートコポリ
マー、7.1％ブチルベンジルフタレートおよび0.3％2,6
−ジtertブチル−ｐ−クレゾールを含有する媒体中に置
いた。124個のウェルが乳癌選択的結合をもたらし、そ
して、これらをクローン化した。
の凍結切片上で試験した。６ミクロンの切片をスライド
に付着せしめ、アセトン中で４℃にて10分間固定し室温
にて10分間乾燥し、ウマ血清によりブロックし、そして
室温にて20分間100μlのそのままのハイブリドーマ上清
と共にインキュベートした。スライドをPBSで洗浄し、
そして最後に37℃にて20分間、パーオキシダーゼ接合ラ
ビット抗−マウスIgの１：50希釈物とともにインキュベ
ートし、PBSで再度洗浄し、そして最後に37℃にて7.5分
間、0.01％過酸化水素を含有する0.05M Tris緩衝液(pH
7.2)中0.5mg/mlジアミノベンジジンと共にインキュベー
トした。スライドをヘマトキシリンで染色し、脱水し、
そして35.9％メチル／ｎ−ブチルメタクリレートコポリ
マー、7.1％ブチルベンジルフタレートおよび0.3％2,6
−ジtertブチル−ｐ−クレゾールを含有する媒体中に置
いた。124個のウェルが乳癌選択的結合をもたらし、そ
して、これらをクローン化した。
【００４５】精製およびクラスの決定 モノクローナル乳癌選択的抗体の免疫グロブリンクラス
およびサブクラスを、McDougal等、J.Immunol.Meth.63:
281-290(1983)に記載されているのと実質的に同じイム
ノドットアッセイにより決定した。抗体はまた、２〜３
×106個のハイブリドーマ細胞をメチオニン不含有培地
に0.2μCiの35Ｓメチオニンを加えた培地中で増殖せし
めることにより内的にラベルされた35Ｓ−ラベル化抗体
を固定されたスタフィロコッカス(staphylococcus)Ａ細
胞と共に、またはラビット抗−マウス免度グロブリンに
よりプレコートされた固定されたスタフィロコッカスＡ
細胞と共に、免疫沈澱せしめ、そして免疫沈澱物をSDS
−PAGEにより分析して抗体ライト鎖およびヘビー鎖移動
度、余分の鎖の欠落、およびスタフィロコッカス・プロ
テインＡに結合する各抗体の能力を決定した。
およびサブクラスを、McDougal等、J.Immunol.Meth.63:
281-290(1983)に記載されているのと実質的に同じイム
ノドットアッセイにより決定した。抗体はまた、２〜３
×106個のハイブリドーマ細胞をメチオニン不含有培地
に0.2μCiの35Ｓメチオニンを加えた培地中で増殖せし
めることにより内的にラベルされた35Ｓ−ラベル化抗体
を固定されたスタフィロコッカス(staphylococcus)Ａ細
胞と共に、またはラビット抗−マウス免度グロブリンに
よりプレコートされた固定されたスタフィロコッカスＡ
細胞と共に、免疫沈澱せしめ、そして免疫沈澱物をSDS
−PAGEにより分析して抗体ライト鎖およびヘビー鎖移動
度、余分の鎖の欠落、およびスタフィロコッカス・プロ
テインＡに結合する各抗体の能力を決定した。
【００４６】抗体をインビボで拡張した。Balb/cまたは
F1(C57B/６×Balb/c)マウスを0.5mlのプリスタンにより
腹腔内(ip)プライムし、そして10〜14日後にPBS中100万
個の対数期のハイブリドー細胞を接種した。腹水を−70
℃にて貯蔵し、解凍し、そして0.8ミクロンのフィルタ
ーユニットを通して濾過した後、さらに精製した。
F1(C57B/６×Balb/c)マウスを0.5mlのプリスタンにより
腹腔内(ip)プライムし、そして10〜14日後にPBS中100万
個の対数期のハイブリドー細胞を接種した。腹水を−70
℃にて貯蔵し、解凍し、そして0.8ミクロンのフィルタ
ーユニットを通して濾過した後、さらに精製した。
【００４７】スタフィロコッカス・プロテインＡに結合
する幾つかのIgG抗体を、アガロース、デキストランお
よび／またはアクリルアミドのいずれかを含有するプロ
テインＡ−クロマトグラフ樹脂上でのpH段階グラジエン
ト溶出を用いるアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製した。プロテインＡに結合しなかったIgG抗体は
０℃にて40％飽和への硫酸アンモニウムの添加により、
またはDEAEもしくはアフィゲル(Affigel)(ビオラド、リ
ッチモンド、カリホルニア)ヘの結合により沈澱せしめ
た。別の方法として、IgG抗体を記載されているように
して、セファクリルS−200カラムおよびこれに続くDEAE
セルロースを用いるクロマトグラフィーにより精製す
る。沈澱物をPBSに再溶解し、20mM Tris(pH7.2)に透析
し、そしてジエチルアミノエチルセルセルロース(DEAE)
の1.6×50cmカラム上で、４℃、１ml/分の流速で1.5ｌ
の０〜600mM NaClグラジエントを用いて溶出することに
こよりクロマトグラフ処理した。各場合において、カラ
ム画分をSDS−PAGEによりモニターし、そして最も純粋
な抗体画分をプールし、１〜２mg/mlに濃縮し、PBS/0.0
2％ NaN3に透析し、そして４℃にて貯蔵した。
する幾つかのIgG抗体を、アガロース、デキストランお
よび／またはアクリルアミドのいずれかを含有するプロ
テインＡ−クロマトグラフ樹脂上でのpH段階グラジエン
ト溶出を用いるアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製した。プロテインＡに結合しなかったIgG抗体は
０℃にて40％飽和への硫酸アンモニウムの添加により、
またはDEAEもしくはアフィゲル(Affigel)(ビオラド、リ
ッチモンド、カリホルニア)ヘの結合により沈澱せしめ
た。別の方法として、IgG抗体を記載されているように
して、セファクリルS−200カラムおよびこれに続くDEAE
セルロースを用いるクロマトグラフィーにより精製す
る。沈澱物をPBSに再溶解し、20mM Tris(pH7.2)に透析
し、そしてジエチルアミノエチルセルセルロース(DEAE)
の1.6×50cmカラム上で、４℃、１ml/分の流速で1.5ｌ
の０〜600mM NaClグラジエントを用いて溶出することに
こよりクロマトグラフ処理した。各場合において、カラ
ム画分をSDS−PAGEによりモニターし、そして最も純粋
な抗体画分をプールし、１〜２mg/mlに濃縮し、PBS/0.0
2％ NaN3に透析し、そして４℃にて貯蔵した。
【００４８】IgM抗体は、セファクリルS−300の2.6×40
cmカラム上でのゲル濾過または他のゲル濾過により、あ
るいはアガロース、デキストリンおよび／またはアクリ
ルアミドを含有する樹脂により、室温、１ml/分の流速
にてPBS/0.01％ナトリウムアジドで溶出しながら精製し
た。
cmカラム上でのゲル濾過または他のゲル濾過により、あ
るいはアガロース、デキストリンおよび／またはアクリ
ルアミドを含有する樹脂により、室温、１ml/分の流速
にてPBS/0.01％ナトリウムアジドで溶出しながら精製し
た。
【００４９】選択性の決定 乳癌に対するそれらの選択性を評価するため、精製され
た抗体を16種類の正常組織の切片上でのイムノパーオキ
シダーゼ切片染色により、および４種類の血液細胞タイ
プ上での免疫蛍光セル−ソーティングにより試験した。
イムノパーオキシダーゼ染色は上記のようにして行った
が、但しハイブリドーマ上清ではなくPBS中精製抗体の
既知の稀釈物を１〜40μg/mlの範囲で使用した。まず、
純粋な抗体をタイトレーションして乳癌切片上で強いイ
ムノパーオキシダーゼ染色を与える最小濃度を見出し、
そして正常組織試験のためにその濃度で使用した。末梢
血細胞(血小板、リンパ球、赤血球、顆粒球、および単
球)を、多形核白血球から単球を分離する媒体を用いて
遠心分離により調製した。細胞を上に決定した最適濃度
において４℃にて30分間抗体と反応せしめ、洗浄し、フ
ルオレッセイン・イソチオシアネート−接合ヤギ抗−マ
ウスIgの１：50稀釈物と４℃にて30分間反応せしめ、再
度洗浄し、そしてセルソーター中で試験した。洗浄緩衝
液および稀釈剤は１％ゼラチンおよび0.02％ナトリウム
アジドを含むPBSであった。セルソーターは、76ミクロ
ンのノズルおよび488nmの１ワットアルゴンイオンレー
ザーを装置していた。80mmの共焦点レンズを焦点を合わ
せるための光学レール装置上で使用した。使用された他
のフィルターは515nm干渉フィルターおよび515nm吸収フ
ィルター(散乱レーザー光のため)および前方角光散乱の
ための中性濃度1.5フィルターであった。フルオレッセ
イン蛍光の対数対前方角光散乱の輪郭線プロットをサン
プル分析のために用いた。検出可能な結合を示す血液細
胞タイプは存在しなかった。
た抗体を16種類の正常組織の切片上でのイムノパーオキ
シダーゼ切片染色により、および４種類の血液細胞タイ
プ上での免疫蛍光セル−ソーティングにより試験した。
イムノパーオキシダーゼ染色は上記のようにして行った
が、但しハイブリドーマ上清ではなくPBS中精製抗体の
既知の稀釈物を１〜40μg/mlの範囲で使用した。まず、
純粋な抗体をタイトレーションして乳癌切片上で強いイ
ムノパーオキシダーゼ染色を与える最小濃度を見出し、
そして正常組織試験のためにその濃度で使用した。末梢
血細胞(血小板、リンパ球、赤血球、顆粒球、および単
球)を、多形核白血球から単球を分離する媒体を用いて
遠心分離により調製した。細胞を上に決定した最適濃度
において４℃にて30分間抗体と反応せしめ、洗浄し、フ
ルオレッセイン・イソチオシアネート−接合ヤギ抗−マ
ウスIgの１：50稀釈物と４℃にて30分間反応せしめ、再
度洗浄し、そしてセルソーター中で試験した。洗浄緩衝
液および稀釈剤は１％ゼラチンおよび0.02％ナトリウム
アジドを含むPBSであった。セルソーターは、76ミクロ
ンのノズルおよび488nmの１ワットアルゴンイオンレー
ザーを装置していた。80mmの共焦点レンズを焦点を合わ
せるための光学レール装置上で使用した。使用された他
のフィルターは515nm干渉フィルターおよび515nm吸収フ
ィルター(散乱レーザー光のため)および前方角光散乱の
ための中性濃度1.5フィルターであった。フルオレッセ
イン蛍光の対数対前方角光散乱の輪郭線プロットをサン
プル分析のために用いた。検出可能な結合を示す血液細
胞タイプは存在しなかった。
【００５０】特許請求の範囲に記載した抗体の結合挙動
を下記の表１に示す。抗体により結合される構造を示す
ために次の略号を使用する。Ａｃ＝腺房(acini)；Ｇ＝
腺；Ｔ＝細管(tubules)；Ｄ＝脈管(duct)；Ｌ＝管腔(lu
men)；Ｗ＝汗腺(sweat gland)；Ｅ＝上皮(epitheliu
m)；Ｓ＝皮脂腺(sebaceous gland)；Ｇｒ＝願粒球(gran
ulocyte)；Ｍｋ＝巨核球(megakaryocyte)；Ｍ＝マクロ
ファージ(macrophage)；Ｌｙ＝リンパ球(lymphocyte)；
Ｂ１＝基底層(Basal layer)；Ｆｅ＝病巣上皮(focal ep
ithelium)；Ａ＝肺胞内膜細胞(alveolar lining cel
l)；Ｂ＝ボーマンのう(Bowman's capsule)；Ｍｕ＝筋(m
uscle)；Ｉ＝小島(islet)；Ｈ＝毛のう(hair follicle
s)；Ｕ＝糸球体(glomeruli)；およびＶ＝脈管／内皮(ve
ssels／endothelial)。
を下記の表１に示す。抗体により結合される構造を示す
ために次の略号を使用する。Ａｃ＝腺房(acini)；Ｇ＝
腺；Ｔ＝細管(tubules)；Ｄ＝脈管(duct)；Ｌ＝管腔(lu
men)；Ｗ＝汗腺(sweat gland)；Ｅ＝上皮(epitheliu
m)；Ｓ＝皮脂腺(sebaceous gland)；Ｇｒ＝願粒球(gran
ulocyte)；Ｍｋ＝巨核球(megakaryocyte)；Ｍ＝マクロ
ファージ(macrophage)；Ｌｙ＝リンパ球(lymphocyte)；
Ｂ１＝基底層(Basal layer)；Ｆｅ＝病巣上皮(focal ep
ithelium)；Ａ＝肺胞内膜細胞(alveolar lining cel
l)；Ｂ＝ボーマンのう(Bowman's capsule)；Ｍｕ＝筋(m
uscle)；Ｉ＝小島(islet)；Ｈ＝毛のう(hair follicle
s)；Ｕ＝糸球体(glomeruli)；およびＶ＝脈管／内皮(ve
ssels／endothelial)。
【００５１】
【表１】
【００５２】乳癌腫瘍結合範囲の決定 各抗体によっていかに広い範囲の乳癌が認識され得るか
を決定するため、乳癌選択性抗体を、27種類の異る乳癌
腫瘍の凍結切片に対するイムノパーオキシダーゼ染色に
より試験した。切片染色のために使用された乳癌はすべ
て湿潤腺管内癌であり、抗体結合と乳癌の組織学的タイ
プとの相関は行われ得なかった。さらに、抗体結合と結
節状態またはエストロゲンリセプター状態との間の相互
関係も、提供者の情報が入手可能であった12の腫瘍にこ
ついて見出されなかった。抗体は転移癌および一次乳癌
と同様に良好に反応した。特許請求の範囲に記載された
抗体についてのこれらの結果を次の表２および表３に記
載する。
を決定するため、乳癌選択性抗体を、27種類の異る乳癌
腫瘍の凍結切片に対するイムノパーオキシダーゼ染色に
より試験した。切片染色のために使用された乳癌はすべ
て湿潤腺管内癌であり、抗体結合と乳癌の組織学的タイ
プとの相関は行われ得なかった。さらに、抗体結合と結
節状態またはエストロゲンリセプター状態との間の相互
関係も、提供者の情報が入手可能であった12の腫瘍にこ
ついて見出されなかった。抗体は転移癌および一次乳癌
と同様に良好に反応した。特許請求の範囲に記載された
抗体についてのこれらの結果を次の表２および表３に記
載する。
【００５３】
【表２】
【００５４】
【表３】
【００５５】乳癌セルライン結合範囲の決定 14種類の乳癌セルラインに対するイムノフルオレッセン
スアッセイにより乳癌セルライン認識の範囲について抗
体をさらに評価した。下記の表４に、特許請求の範囲に
記載された抗体についてのこれらの結果を示す。
スアッセイにより乳癌セルライン認識の範囲について抗
体をさらに評価した。下記の表４に、特許請求の範囲に
記載された抗体についてのこれらの結果を示す。
【００５６】
【表４】
【００５７】イメージングモノクローナル抗体の非−乳
癌への結合 最後に、11種類の非−乳癌に対するイムノパーオキシダ
ーゼ染色により試験した。特許請求の範囲に記載された
抗体についての結果を下記の表５に示す。
癌への結合 最後に、11種類の非−乳癌に対するイムノパーオキシダ
ーゼ染色により試験した。特許請求の範囲に記載された
抗体についての結果を下記の表５に示す。
【００５８】
【表５】
【００５９】この発明のモノクローナル抗体の乳癌腫瘍
範囲、乳癌細胞結合範囲、血液細胞結合特性および選択
性特性を表６に要約する。
範囲、乳癌細胞結合範囲、血液細胞結合特性および選択
性特性を表６に要約する。
【００６０】
【表６】
【００６１】抗体親和性および抗原濃度 特許請求の範囲に記載された抗体の幾つかをヨード化
し、そしてMCF-7、CAMA1、SKBR3またはZR7530細胞への
結合について試験した。抗体を、125Ｉによりクロラミ
ンＴを用いて約10μCi/μgの比活性にラベルした。イム
ノラジオケミカル純度を決定するため、0.5mlのウシ胎
児血清中100,000cpmの２つのラベル化抗体を標的細胞の
５つのアリコート(一般にアリコート当り4,000,000細
胞)で順次０℃にて15分間吸収し、そして各吸収後の上
清中の残留放射能を決定した。
し、そしてMCF-7、CAMA1、SKBR3またはZR7530細胞への
結合について試験した。抗体を、125Ｉによりクロラミ
ンＴを用いて約10μCi/μgの比活性にラベルした。イム
ノラジオケミカル純度を決定するため、0.5mlのウシ胎
児血清中100,000cpmの２つのラベル化抗体を標的細胞の
５つのアリコート(一般にアリコート当り4,000,000細
胞)で順次０℃にて15分間吸収し、そして各吸収後の上
清中の残留放射能を決定した。
【００６２】会合定数の測定のため、既知濃度のラベル
されたモノクローナル抗体および未ラベルのモノクロー
ナル抗体をウシ胎児血清中で標的細胞と共に氷中で15分
間インキュベートした。次に、細胞／抗体混合物のアリ
コートをγ−カウンター中で計数し、またはミクロフォ
ルド(Microfold)フィルタープレート(Ｖ＆Ｐサイエンテ
ィフィック)を通して濾過し、そしてそのフィルターを
計数した。フィルター上の液体中に残留する未結合の抗
体を考慮するため、同じ濃度の抗体を含むが細胞を含ま
ない対照を平行して行った。会合定数、および標的当り
の抗原コピー数を、親和性試験結果から計算し、そして
下記の表７に示す。
されたモノクローナル抗体および未ラベルのモノクロー
ナル抗体をウシ胎児血清中で標的細胞と共に氷中で15分
間インキュベートした。次に、細胞／抗体混合物のアリ
コートをγ−カウンター中で計数し、またはミクロフォ
ルド(Microfold)フィルタープレート(Ｖ＆Ｐサイエンテ
ィフィック)を通して濾過し、そしてそのフィルターを
計数した。フィルター上の液体中に残留する未結合の抗
体を考慮するため、同じ濃度の抗体を含むが細胞を含ま
ない対照を平行して行った。会合定数、および標的当り
の抗原コピー数を、親和性試験結果から計算し、そして
下記の表７に示す。
【００６３】
【表７】
【００６４】この発明のモノクローナル抗体により認識
される抗原を同定するため、次の方法に従って抗原の免
疫沈澱を行った。直径８mmのポリスチレンボール(プレ
シション・プラスチック・ボール社)を氷酢酸中10％発
煙硝酸で覆い、そして50℃の水浴中で３時間インキュベ
ートした。この酸処理の後、ボールを蒸留水で３回すす
ぎ、0.1M NaOH中１％のナトリウムジチオニトで覆い、
そして50℃の水浴中で３時間インキュベートした。ボー
ルを蒸留水で再び３回洗浄し、0.1％6の1-エチル-3-(3-
ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDAC)、0.2
％スベリン酸(ジメチルホルムアミドに溶解したスベリ
ン酸)で覆い、そして室温にて一夜インキュベートし
た。ボールを3回蒸留水ですすぎ、そして同定のために
標識を付した。
される抗原を同定するため、次の方法に従って抗原の免
疫沈澱を行った。直径８mmのポリスチレンボール(プレ
シション・プラスチック・ボール社)を氷酢酸中10％発
煙硝酸で覆い、そして50℃の水浴中で３時間インキュベ
ートした。この酸処理の後、ボールを蒸留水で３回すす
ぎ、0.1M NaOH中１％のナトリウムジチオニトで覆い、
そして50℃の水浴中で３時間インキュベートした。ボー
ルを蒸留水で再び３回洗浄し、0.1％6の1-エチル-3-(3-
ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDAC)、0.2
％スベリン酸(ジメチルホルムアミドに溶解したスベリ
ン酸)で覆い、そして室温にて一夜インキュベートし
た。ボールを3回蒸留水ですすぎ、そして同定のために
標識を付した。
【００６５】精製されたモノクローナル抗体を2-(N-モ
ルホリノ)エタンスルホン酸緩衝液中0.2mg/mlに稀釈
し、そしてあらかじめ処理されそして標識を付されたボ
ールを個々のチューブに入れ、そして450μlの稀釈され
た抗体および50μlの新鮮な１％EDACで覆った。チュー
ブにキャップを付し、そして25℃にて24時間インキュベ
ートした。このインキュベーションの後、ボールをPBS
で２回すすぎ、そして新鮮なままで使用し、５または４
℃にて数日間貯蔵した後に使用した。
ルホリノ)エタンスルホン酸緩衝液中0.2mg/mlに稀釈
し、そしてあらかじめ処理されそして標識を付されたボ
ールを個々のチューブに入れ、そして450μlの稀釈され
た抗体および50μlの新鮮な１％EDACで覆った。チュー
ブにキャップを付し、そして25℃にて24時間インキュベ
ートした。このインキュベーションの後、ボールをPBS
で２回すすぎ、そして新鮮なままで使用し、５または４
℃にて数日間貯蔵した後に使用した。
【００６６】新しくラベルされた標的細胞抽出物を、Ma
rchalonis, J.“An Enzymic Methodfor the Trace Iodi
nation of Immunoglobulines and other Proteins”, B
iochem.J.113:299-305(1969)のラクトパーオキシダーゼ
法により125-Iで、または35-Sメチオニン中での増殖に
より35-Sでラベルされたヒト乳癌セルラインから調製し
た。ラベルされた細胞を可溶化緩衝液(1v/v％トリトンX
−100,150mM NaCl,5mMEDTA,25mM Tris‐HCl,pH7.5)中に
溶解した。ラベル化抽出物４部を容器中で、50mg/mlの
ウシ血清アルブミンを含有する可溶化緩衝液１部と混合
し、10mg/ml BSAの最柊濃度を与えた。モノクローナル
抗体でコートされたボールを容器に加え、そして振とう
しなから氷上で４時間インキュベートした。ラベルされ
た抗原を容器からピペットで除去し、そしてボールを可
溶化緩衝液で４回すすいだ。次に、ボールを取り出し、
100μlのレムリー(Laemmli)SDSゲルサンプル緩衝液を含
む個々のチューブに入れ、そして沸騰水中で３分間イン
キュベートした。ボールを取り出し、そしてサンプルを
適当な標準と共にSDSゲル上で泳動せしめた。
rchalonis, J.“An Enzymic Methodfor the Trace Iodi
nation of Immunoglobulines and other Proteins”, B
iochem.J.113:299-305(1969)のラクトパーオキシダーゼ
法により125-Iで、または35-Sメチオニン中での増殖に
より35-Sでラベルされたヒト乳癌セルラインから調製し
た。ラベルされた細胞を可溶化緩衝液(1v/v％トリトンX
−100,150mM NaCl,5mMEDTA,25mM Tris‐HCl,pH7.5)中に
溶解した。ラベル化抽出物４部を容器中で、50mg/mlの
ウシ血清アルブミンを含有する可溶化緩衝液１部と混合
し、10mg/ml BSAの最柊濃度を与えた。モノクローナル
抗体でコートされたボールを容器に加え、そして振とう
しなから氷上で４時間インキュベートした。ラベルされ
た抗原を容器からピペットで除去し、そしてボールを可
溶化緩衝液で４回すすいだ。次に、ボールを取り出し、
100μlのレムリー(Laemmli)SDSゲルサンプル緩衝液を含
む個々のチューブに入れ、そして沸騰水中で３分間イン
キュベートした。ボールを取り出し、そしてサンプルを
適当な標準と共にSDSゲル上で泳動せしめた。
【００６７】抗体に対する免疫沈澱試験は、これらの内
５種類(454C11,452P2,520C9,741F8,および759E3)のすべ
てが癌性乳房組織中に見出される約200Ｋダルトンのモ
ノマータンパク質を結合することを示した。５種類の内
の２種類(520C9および741F8)は200Ｋダルトンタンパク
質上の同じエピトープを認識するものと信じられる。45
4C11および759E3は同じ抗原上の第２のエピトープを結
合し、そして452F2は同じ抗原上の第３のエピトープを
結合する。抗体の内４種類(41B4,87H7,452E12,457D7)は
230,000ダルトンの細胞内抗原に結合した。７種類の抗
体(2G3,200F9,203E2,245E7,369F10,697B3,および788G6)
は高分子量(HMW)ムチンに結合した。２種類の抗体(51C3
および454A12)は97,000ダルトン抗原の形のトランスフ
ェリンリセプターに結合した。451C3および454A12のい
ずれもリセプターヘのトランスフェリンの結合をブロッ
クしなかった。この発明のモノクローナル抗体の抗原結
合特性を表８に要約する。
５種類(454C11,452P2,520C9,741F8,および759E3)のすべ
てが癌性乳房組織中に見出される約200Ｋダルトンのモ
ノマータンパク質を結合することを示した。５種類の内
の２種類(520C9および741F8)は200Ｋダルトンタンパク
質上の同じエピトープを認識するものと信じられる。45
4C11および759E3は同じ抗原上の第２のエピトープを結
合し、そして452F2は同じ抗原上の第３のエピトープを
結合する。抗体の内４種類(41B4,87H7,452E12,457D7)は
230,000ダルトンの細胞内抗原に結合した。７種類の抗
体(2G3,200F9,203E2,245E7,369F10,697B3,および788G6)
は高分子量(HMW)ムチンに結合した。２種類の抗体(51C3
および454A12)は97,000ダルトン抗原の形のトランスフ
ェリンリセプターに結合した。451C3および454A12のい
ずれもリセプターヘのトランスフェリンの結合をブロッ
クしなかった。この発明のモノクローナル抗体の抗原結
合特性を表８に要約する。
【００６８】
【表８】
【００６９】(a)＝260F9および266B2により結合される
エピトープと異るエピトープ。 (b)＝106A10により結合されるエピトープと異るエピト
ープ；260F9および266B2の両者は同じエピトープに結合
するようである。 (c)＝相互に交差ブロック。
エピトープと異るエピトープ。 (b)＝106A10により結合されるエピトープと異るエピト
ープ；260F9および266B2の両者は同じエピトープに結合
するようである。 (c)＝相互に交差ブロック。
【００７０】抗体のアイソタイプ 抗体のアイソタイプを次のようにして決定した。ニトロ
セルロースシート上に鉛筆で５mm四方の格子を軽く描
き、そして１mlの抗アイソタイプ血清(リットンバイオ
ネティクス、ケンシントン、メリーランド、マウスκ，
λ，α，γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３，およびμ鎖に対
するラビット抗血清を、四角形の各横列が１スポットの
各ヘビーおよびライト鎖試薬を受理するように適用す
る。シートを湿室中室温にて１時間インキュベートし、
１w/v％を含有するPBS-BSA中で迅速にすすぎ、そしてPB
S-BSA中で４℃にて一夜置いた。ストリップをはさみで
切り離す。これを0.02％ナトリウムアジドを含有するPB
S-BSA中で４℃にて貯蔵することができる。他の方法と
して、ストリップを空気乾燥し、そして４℃にて乾燥貯
蔵することができる。３mlのハイブリドーマ培養上清ま
たはPBS-BSAで稀釈された上清を収容する一連の小チュ
ーブを用意する。１：10稀釈が一般に好結果をもたら
し、そして幾つかの上清は１：200という大幅に稀釈す
ることができる。ニトロセルロースのストリップを各チ
ューブ中で室温にて１時間インキュベートする。ストリ
ップをPBS-BSA中で３回すすぎ、そして稀釈されたラビ
ット抗−マウス−ホースラディッシュパーオキシダーゼ
中で室温にて1時間インキュベートする。ストリップをP
BS-BSA中で２回すすぎ、そしてTris緩衝液中で２回すす
ぐ。抗−アイソタイプスポット上に十分発色が行われる
まで(通常３〜４分間)、ジアミノベンジジンおよび過酸
化水素を含有するTlis緩衝液中に置く。抗体のアイソタ
イプを表９に示す。
セルロースシート上に鉛筆で５mm四方の格子を軽く描
き、そして１mlの抗アイソタイプ血清(リットンバイオ
ネティクス、ケンシントン、メリーランド、マウスκ，
λ，α，γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３，およびμ鎖に対
するラビット抗血清を、四角形の各横列が１スポットの
各ヘビーおよびライト鎖試薬を受理するように適用す
る。シートを湿室中室温にて１時間インキュベートし、
１w/v％を含有するPBS-BSA中で迅速にすすぎ、そしてPB
S-BSA中で４℃にて一夜置いた。ストリップをはさみで
切り離す。これを0.02％ナトリウムアジドを含有するPB
S-BSA中で４℃にて貯蔵することができる。他の方法と
して、ストリップを空気乾燥し、そして４℃にて乾燥貯
蔵することができる。３mlのハイブリドーマ培養上清ま
たはPBS-BSAで稀釈された上清を収容する一連の小チュ
ーブを用意する。１：10稀釈が一般に好結果をもたら
し、そして幾つかの上清は１：200という大幅に稀釈す
ることができる。ニトロセルロースのストリップを各チ
ューブ中で室温にて１時間インキュベートする。ストリ
ップをPBS-BSA中で３回すすぎ、そして稀釈されたラビ
ット抗−マウス−ホースラディッシュパーオキシダーゼ
中で室温にて1時間インキュベートする。ストリップをP
BS-BSA中で２回すすぎ、そしてTris緩衝液中で２回すす
ぐ。抗−アイソタイプスポット上に十分発色が行われる
まで(通常３〜４分間)、ジアミノベンジジンおよび過酸
化水素を含有するTlis緩衝液中に置く。抗体のアイソタ
イプを表９に示す。
【００７１】
【表９】
【００７２】特許請求の範囲に記載されたモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマのサンプルはザ・コレ
クション・オブ・インビトロ・インターナショナル(the
Collection of In Vitro International)、7885ジャク
ソンロード、スイト４、アン・アルボール、ミシガン48
103、米国に寄託されている。
ル抗体を生産するハイブリドーマのサンプルはザ・コレ
クション・オブ・インビトロ・インターナショナル(the
Collection of In Vitro International)、7885ジャク
ソンロード、スイト４、アン・アルボール、ミシガン48
103、米国に寄託されている。
【００７３】
【実施例】例１．この例は、この発明の抗体をヨウ素の
放射性同位元素、すなわち125-Iまたは131-Iのいずれか
で、チロシン残基をヨード化するための既知の方法を用
いてラベルするための１つの方法を示す。
放射性同位元素、すなわち125-Iまたは131-Iのいずれか
で、チロシン残基をヨード化するための既知の方法を用
いてラベルするための１つの方法を示す。
【００７４】この発明のモノクローナル抗体は次のミク
ロ法によりラベルすることができる。0.1mgの精製した
モノクローナル抗体を10ミリキュリー量の125-Iにより
次のようにしてラベルする。１インチの21ゲージ針を３
mlのバイアルのセプタムを通して部分的に挿入し、そし
てガラス綿を詰めた3.0mlのディスポーサブル注射器筒
をその針に取り付ける。0.1N NaCl中の抗体を、好まし
くは0.2mlを超えない容量で、あらかじめ硼酸緩衝液で
すすいでおいた20ゲージ針を装着したツベルクリン注射
器で加える。好ましくは0.2〜0.3mlを超えない容量のナ
トリウム125−ヨウ素溶液を、緩衝液によりあらかじめ
すすがれた18ゲージ針に取り付けられた注射器で加え
る。混合物を短時間撹拌してタンパク質と125−ヨウ素
溶液を混合する。モル当り10ミリキュリーの比活性を有
する約1.25×10-5モル(M)の塩化125−ヨウ素0.2mlを混
合することにより塩化ヨウ素(iodine chloride)の最終
稀釈を行う。約１分間の後、ヒト血清アルブミンまたは
動物アルブミン、例えばウシ血清アルブミンの6.25％溶
液の過剰量を前記の溶液に加える。ラベルされた抗体を
適当なカラムに通して未結合の放射性ヨウ素を除去す
る。イオン交換樹脂またはゲル濾過媒体、例えばセファ
デックスG-25を使用することができる。セファデックス
カラム精製のため、ラベルされた抗体を約１ml/分の速
度で樹脂に通した後、樹脂を追加の１〜1.5mlの上記の
ヒトアルブミン溶液ですすぐ。
ロ法によりラベルすることができる。0.1mgの精製した
モノクローナル抗体を10ミリキュリー量の125-Iにより
次のようにしてラベルする。１インチの21ゲージ針を３
mlのバイアルのセプタムを通して部分的に挿入し、そし
てガラス綿を詰めた3.0mlのディスポーサブル注射器筒
をその針に取り付ける。0.1N NaCl中の抗体を、好まし
くは0.2mlを超えない容量で、あらかじめ硼酸緩衝液で
すすいでおいた20ゲージ針を装着したツベルクリン注射
器で加える。好ましくは0.2〜0.3mlを超えない容量のナ
トリウム125−ヨウ素溶液を、緩衝液によりあらかじめ
すすがれた18ゲージ針に取り付けられた注射器で加え
る。混合物を短時間撹拌してタンパク質と125−ヨウ素
溶液を混合する。モル当り10ミリキュリーの比活性を有
する約1.25×10-5モル(M)の塩化125−ヨウ素0.2mlを混
合することにより塩化ヨウ素(iodine chloride)の最終
稀釈を行う。約１分間の後、ヒト血清アルブミンまたは
動物アルブミン、例えばウシ血清アルブミンの6.25％溶
液の過剰量を前記の溶液に加える。ラベルされた抗体を
適当なカラムに通して未結合の放射性ヨウ素を除去す
る。イオン交換樹脂またはゲル濾過媒体、例えばセファ
デックスG-25を使用することができる。セファデックス
カラム精製のため、ラベルされた抗体を約１ml/分の速
度で樹脂に通した後、樹脂を追加の１〜1.5mlの上記の
ヒトアルブミン溶液ですすぐ。
【００７５】例２．この発明のモノクローナル抗体はま
た、リンキング剤を用いてヨード化することもできる。
この例はヨード化されたイミジン化剤によるモノクロー
ナル抗体の放射性ラベル化を記載する。イミドエステ
ル、メチルパラヒドロキシベンズイミデートHCl(MPHBI
M)は、Wood等、“The Radio active Labeling of Prote
in Withan Iodinated Imidination Reagent”，Analyti
cal Biochem. 69：339-349(1975)により記載されている
方法に従って合成される。MPHBIMを次のようにしてヨー
ド化する。3.7mlのMPHBIMを50mM硼酸ナトリウム緩衝液
(pH8.5)１mlに溶解して20mM MPHBIMストック溶液を得
る。１mlの40mMナトリウムヨウ素(sodium iodine)およ
びこれに続き約２ミリキュリー／モルの比活性を有する
ヨウ化ナトリウム(125-I)溶液10μlを１mlのMPHBIMスト
ック溶液に添加する。１mlの40mMクロラミンＴを急速に
撹拌しながら加える。
た、リンキング剤を用いてヨード化することもできる。
この例はヨード化されたイミジン化剤によるモノクロー
ナル抗体の放射性ラベル化を記載する。イミドエステ
ル、メチルパラヒドロキシベンズイミデートHCl(MPHBI
M)は、Wood等、“The Radio active Labeling of Prote
in Withan Iodinated Imidination Reagent”，Analyti
cal Biochem. 69：339-349(1975)により記載されている
方法に従って合成される。MPHBIMを次のようにしてヨー
ド化する。3.7mlのMPHBIMを50mM硼酸ナトリウム緩衝液
(pH8.5)１mlに溶解して20mM MPHBIMストック溶液を得
る。１mlの40mMナトリウムヨウ素(sodium iodine)およ
びこれに続き約２ミリキュリー／モルの比活性を有する
ヨウ化ナトリウム(125-I)溶液10μlを１mlのMPHBIMスト
ック溶液に添加する。１mlの40mMクロラミンＴを急速に
撹拌しながら加える。
【００７６】混合物を約15分間20〜22℃に保持し、そし
て次に0.1mlの1.0M β-メルカプトエタノールを加えて
クロラミンＴおよび残留ヨウ素を添加する。次に、溶液
のpHを、20μlの1.0M酢酸を添加することにより中性ま
で低下せしめ、凝集した白色沈澱を形成せしめる。未反
応のMPHBIMヨウ化物およびクロラミンＴは溶解したまま
残る。ヨード化アミノエステルの沈澱を10,000rpmにて
５分間の遠心により集め、２mlの50mM硼酸ナトリウム緩
衝液(pH8.5)に37℃にて溶解する。抗体のヨード化を次
のようにして行う。20mgの精製された抗体を１mlの４mM
ヨード化リンカー、50mM硼酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)
に懸濁する。所望量の結合を達成するのに十分な時間37
℃にて反応を行う。これらの条件下で放射性ラベルが抗
体上に約１〜２％／時の速度で導入され、125-Iラベル
の約30％の最大導入が達成される。5mMリン酸ナトリウ
ム(pH7.4)を含有する0.15M塩化ナトリウムに対して透析
することにより未反応リンカーを除去する。
て次に0.1mlの1.0M β-メルカプトエタノールを加えて
クロラミンＴおよび残留ヨウ素を添加する。次に、溶液
のpHを、20μlの1.0M酢酸を添加することにより中性ま
で低下せしめ、凝集した白色沈澱を形成せしめる。未反
応のMPHBIMヨウ化物およびクロラミンＴは溶解したまま
残る。ヨード化アミノエステルの沈澱を10,000rpmにて
５分間の遠心により集め、２mlの50mM硼酸ナトリウム緩
衝液(pH8.5)に37℃にて溶解する。抗体のヨード化を次
のようにして行う。20mgの精製された抗体を１mlの４mM
ヨード化リンカー、50mM硼酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)
に懸濁する。所望量の結合を達成するのに十分な時間37
℃にて反応を行う。これらの条件下で放射性ラベルが抗
体上に約１〜２％／時の速度で導入され、125-Iラベル
の約30％の最大導入が達成される。5mMリン酸ナトリウ
ム(pH7.4)を含有する0.15M塩化ナトリウムに対して透析
することにより未反応リンカーを除去する。
【００７７】例３．Hnatowich等、Science 220：613-61
5(1983)の方法(この記載を引用によりこの明細書に組み
入れる)に従ってキレート剤ジエチレントリアミンペン
タ酢酸(DTPA)を用いて111-Inによりモノクローナル抗体
をラベルすることができる。抗体113F1を11mg/mlで調製
しNaHCO3(pH7)に透析する。１mgのPTPA環状無水物を10m
lのCHCl3に溶解した。４μlのこの溶液を５ｍ／ガラス
試験管に入れ、そしてＮ2の流れによりCHCl3を蒸発せし
めた。100μlの113F1(タンパク質1.1μg)を４μgの無水
物を含有するチューブに加え、そしてチューブを短時間
渦動混合した。１分間後、0.5M酢酸ナトリウム(pH5.8)
中111-In(約3.28×1010cpm/mlの比活性を有する)５μl
を加えた。２本のＰＤ10(ファルマシア)カラムを20mlの
リン酸緩衝化塩１％ウシ血清アルブミン溶液を用いて用
意した。サンプルを、2.2mlのボイドボリウムを有する
ＰＰ10カラムに通した。2.2mlのタンパク質ピークおよ
び2.5mlの小分子ピークがPBS１％BSAにより溶出するこ
とが見出された。対照は４μlの１μg/μl DTPAを伴う1
13F1のサンプル100μl、および５μlの111-Inであり無
水物を伴わなかった。DTPA無水物でラベルされた113F1
タンパク質ピークは75％のカウントを含有し、そして小
分子ピーク画分は約25％のカウントを含んでいた。対照
においては、約92％のカウントが小分子画分に残った。
5(1983)の方法(この記載を引用によりこの明細書に組み
入れる)に従ってキレート剤ジエチレントリアミンペン
タ酢酸(DTPA)を用いて111-Inによりモノクローナル抗体
をラベルすることができる。抗体113F1を11mg/mlで調製
しNaHCO3(pH7)に透析する。１mgのPTPA環状無水物を10m
lのCHCl3に溶解した。４μlのこの溶液を５ｍ／ガラス
試験管に入れ、そしてＮ2の流れによりCHCl3を蒸発せし
めた。100μlの113F1(タンパク質1.1μg)を４μgの無水
物を含有するチューブに加え、そしてチューブを短時間
渦動混合した。１分間後、0.5M酢酸ナトリウム(pH5.8)
中111-In(約3.28×1010cpm/mlの比活性を有する)５μl
を加えた。２本のＰＤ10(ファルマシア)カラムを20mlの
リン酸緩衝化塩１％ウシ血清アルブミン溶液を用いて用
意した。サンプルを、2.2mlのボイドボリウムを有する
ＰＰ10カラムに通した。2.2mlのタンパク質ピークおよ
び2.5mlの小分子ピークがPBS１％BSAにより溶出するこ
とが見出された。対照は４μlの１μg/μl DTPAを伴う1
13F1のサンプル100μl、および５μlの111-Inであり無
水物を伴わなかった。DTPA無水物でラベルされた113F1
タンパク質ピークは75％のカウントを含有し、そして小
分子ピーク画分は約25％のカウントを含んでいた。対照
においては、約92％のカウントが小分子画分に残った。
【００７８】例４．インジウムの種々の活性による抗体
のラベル化 前の実験からのモノクローナル抗体113F1を50mM NaHCO3
(pH7)に、100，10および１μg/100μlの濃度に稀釈し
た。113F1の各稀釈物100μlを、例３におけるようにガ
ラスチューブ中４μlのDTPA無水物に加えた。111-Inを
0.5M酢酸ナトリウム(pH5.8)に100マイクロキュリー/10
μlに稀釈した。10マイクロリッターの溶液中100マイク
ロキュリーの111-Inを、抗体を収容するチューブに加え
た。混合物を、例３におけるようにして処理した。76％
のカウントが１μl/100μl稀釈のタンパク質画分中に見
出され、そして86％のカウントが100μg/100μl稀釈中
に見出された。
のラベル化 前の実験からのモノクローナル抗体113F1を50mM NaHCO3
(pH7)に、100，10および１μg/100μlの濃度に稀釈し
た。113F1の各稀釈物100μlを、例３におけるようにガ
ラスチューブ中４μlのDTPA無水物に加えた。111-Inを
0.5M酢酸ナトリウム(pH5.8)に100マイクロキュリー/10
μlに稀釈した。10マイクロリッターの溶液中100マイク
ロキュリーの111-Inを、抗体を収容するチューブに加え
た。混合物を、例３におけるようにして処理した。76％
のカウントが１μl/100μl稀釈のタンパク質画分中に見
出され、そして86％のカウントが100μg/100μl稀釈中
に見出された。
【００７９】例５．111-インジウムによる抗体245E7の
ラベル化 この例は111-Inによるこの発明の他の抗体のラベル化を
示す。
ラベル化 この例は111-Inによるこの発明の他の抗体のラベル化を
示す。
【００８０】１mg DTPA環状無水物を10mlの乾燥CHCl3に
溶解した。40μlの溶解したDTPA無水物を５mlガラスチ
ューブ中に入れ、そしてＮ2で蒸発せしめて、チューブ
の内側にコートされた約４μgのDTPA環状無水物を得
た。
溶解した。40μlの溶解したDTPA無水物を５mlガラスチ
ューブ中に入れ、そしてＮ2で蒸発せしめて、チューブ
の内側にコートされた約４μgのDTPA環状無水物を得
た。
【００８１】50mM NaHCO3(pH7)中15mg/mlの濃度の抗体2
45E7を100μl DTPA環状無水物に加えた。チューブを短
時間渦動し、そして約１分間放置してDTPA-245E7複合体
を形成せしめた。
45E7を100μl DTPA環状無水物に加えた。チューブを短
時間渦動し、そして約１分間放置してDTPA-245E7複合体
を形成せしめた。
【００８２】５個の試験サンプルを次のように調製し
た。
た。
【００８３】(1)90μlのNaHCO3中10μlのDTPA-245E7複
合体 (2)90μlのNaHCO3中10μlのDTPA-245E7複合体 (3)90μlのNaHCO3中10μlの245E7 (4)90μlのNaHCO3中10μlの245E7 (5)90μlのNaHCO3および0.4μgDTPA(無水物形でない)中
10μlの245E7。
合体 (2)90μlのNaHCO3中10μlのDTPA-245E7複合体 (3)90μlのNaHCO3中10μlの245E7 (4)90μlのNaHCO3中10μlの245E7 (5)90μlのNaHCO3および0.4μgDTPA(無水物形でない)中
10μlの245E7。
【００８４】111-Inを0.5M酢酸ナトリウム(pH5.8)中100
cpm/μlの比活性に稀釈した。10mlのこの111-In溶液を
各チューブに加えた。非無水物形のDTPAを10μgチュー
ブ２および４に加えた。各チューブの内容物を、例３の
場合のように、NaHCO3で平衡化されたＰＤ10カラムに通
した。サンプルを集め、そしてタンパク質ピークおよび
小分子ピークを常法による液体シンチレーションカウン
ター中でカウントした。結果を表１０に示す。
cpm/μlの比活性に稀釈した。10mlのこの111-In溶液を
各チューブに加えた。非無水物形のDTPAを10μgチュー
ブ２および４に加えた。各チューブの内容物を、例３の
場合のように、NaHCO3で平衡化されたＰＤ10カラムに通
した。サンプルを集め、そしてタンパク質ピークおよび
小分子ピークを常法による液体シンチレーションカウン
ター中でカウントした。結果を表１０に示す。
【００８５】
【表１０】
【００８６】結果は、77％の111-InがDTPAでラベルされ
た245E7に結合したことを示した。これに続く過剰の遊
離DTPAの付加はDTPA-245E7抗体複合体からインジウムを
除去しない。サンプル３は、インジウムが感知できる量
において非特異的に抗体に結合しないことを示す。しか
しながら、インジウムは小分子画分と共に溶出するので
はなくカラムに保持されるようである。インジウムの前
または後に加えられたDTPAは、インジウムを小分子ピー
ク中に溶出せしめる。
た245E7に結合したことを示した。これに続く過剰の遊
離DTPAの付加はDTPA-245E7抗体複合体からインジウムを
除去しない。サンプル３は、インジウムが感知できる量
において非特異的に抗体に結合しないことを示す。しか
しながら、インジウムは小分子画分と共に溶出するので
はなくカラムに保持されるようである。インジウムの前
または後に加えられたDTPAは、インジウムを小分子ピー
ク中に溶出せしめる。
【００８７】例６．乳癌組織への111-インジウムラベル
化モノクローナル抗体の取り込み この例は、111-Inでラベルされたモノクローナル抗体が
ヒト乳癌組織により効果的に結合されることを示す。
化モノクローナル抗体の取り込み この例は、111-Inでラベルされたモノクローナル抗体が
ヒト乳癌組織により効果的に結合されることを示す。
【００８８】６種類の抗−乳癌腫瘍モノクローナル抗体
113F1，245E7，260F9，280D11，2G3，266B2，および陰
性対照MOPC21を、例３において前記した方法により無水
DTPAに共有結合せしめた。抗体−DTPA複合体を111-Inと
のキレート化により約１μCi/μgの比活性で放射性ラベ
ルした。必要により、111-Inでラベルされた抗体をセフ
ァデックスG50の0.4×17cmカラム上で約90％のラジオケ
ミカル純度に精製した。２種類の非−乳房特異的抗体、
すなわちメジ−フィジックス(Medi-Physics)、エメリー
ビル、カリホルニアから得られる抗−癌胎児性(carcino
embryonic)抗原モノクローナル抗体、およびニューイン
グランドニュクレアコーポレーション、ボストン、マサ
ツーセッツから得られる抗−前立腺酸性ホスファターゼ
抗体(抗−PAP)を抗−乳癌腫瘍抗体と同様にしてラベル
し、そして陽性結合対照として役立てた。ヒト乳癌組織
および直腸結腸癌組織を手術の直後に得、そして10％ウ
シ胎児血清、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン
およびストレプトマイシンを補充された新鮮なイーグル
最少必須培地(MEM)中に入れて輸送した。新鮮な組織は
受領後３時間以内に使用し、他方深冷貯蔵された組織は
−70℃にてMEM中に保持した。組織を手術用メスで1.0±
0.2mmの立方体に切断し、そして視覚マイクロメーター
を用いてサイズの正確さについてチェックした。無菌技
法を用いて組織立方体を、200μlのMEM、および1.0μg
または10μgのいずれかの111-Inラベル化抗体を収容す
る96−ウェルミクロタイタープレートに移した。組織を
１〜24時間37℃にて、５％CO2−水ジャケット付インキ
ュベーター中でインキュベートした。インキュベーショ
ンの後、組織の分散を最少にしながら、自動ピペッター
により培地を注意深く除去し、そして新鮮な培地を加え
た。さらに、20分間インキュベートした後、培地を再び
除去し、そして組織をさらに20分間インキュベートし
た。この最後の洗浄の後、培地を除去し、そして組織を
乾燥した風袋を秤った秤量用紙に移した。組織を70℃に
て20分間乾燥し、そして次に秤量し、そして試験管に入
れ、NaIウェルカウンター中でカウントした。結果を、
乾燥した組織の単位重量当たり、組織中の適用された放
射能に対する％として示す。各組織立方体のサイズの小
さな相違は補正した。
113F1，245E7，260F9，280D11，2G3，266B2，および陰
性対照MOPC21を、例３において前記した方法により無水
DTPAに共有結合せしめた。抗体−DTPA複合体を111-Inと
のキレート化により約１μCi/μgの比活性で放射性ラベ
ルした。必要により、111-Inでラベルされた抗体をセフ
ァデックスG50の0.4×17cmカラム上で約90％のラジオケ
ミカル純度に精製した。２種類の非−乳房特異的抗体、
すなわちメジ−フィジックス(Medi-Physics)、エメリー
ビル、カリホルニアから得られる抗−癌胎児性(carcino
embryonic)抗原モノクローナル抗体、およびニューイン
グランドニュクレアコーポレーション、ボストン、マサ
ツーセッツから得られる抗−前立腺酸性ホスファターゼ
抗体(抗−PAP)を抗−乳癌腫瘍抗体と同様にしてラベル
し、そして陽性結合対照として役立てた。ヒト乳癌組織
および直腸結腸癌組織を手術の直後に得、そして10％ウ
シ胎児血清、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン
およびストレプトマイシンを補充された新鮮なイーグル
最少必須培地(MEM)中に入れて輸送した。新鮮な組織は
受領後３時間以内に使用し、他方深冷貯蔵された組織は
−70℃にてMEM中に保持した。組織を手術用メスで1.0±
0.2mmの立方体に切断し、そして視覚マイクロメーター
を用いてサイズの正確さについてチェックした。無菌技
法を用いて組織立方体を、200μlのMEM、および1.0μg
または10μgのいずれかの111-Inラベル化抗体を収容す
る96−ウェルミクロタイタープレートに移した。組織を
１〜24時間37℃にて、５％CO2−水ジャケット付インキ
ュベーター中でインキュベートした。インキュベーショ
ンの後、組織の分散を最少にしながら、自動ピペッター
により培地を注意深く除去し、そして新鮮な培地を加え
た。さらに、20分間インキュベートした後、培地を再び
除去し、そして組織をさらに20分間インキュベートし
た。この最後の洗浄の後、培地を除去し、そして組織を
乾燥した風袋を秤った秤量用紙に移した。組織を70℃に
て20分間乾燥し、そして次に秤量し、そして試験管に入
れ、NaIウェルカウンター中でカウントした。結果を、
乾燥した組織の単位重量当たり、組織中の適用された放
射能に対する％として示す。各組織立方体のサイズの小
さな相違は補正した。
【００８９】結合の特異性 腫瘍組織中での放射性ラベルされた抗体の蓄積が非特異
的吸着によるのではなく特異的結合によることを確立す
るため、対照として放射性ラベル化抗−CEA抗体および
抗−PAP抗体を、CEAを発現する新鮮なおよび深冷貯蔵さ
れたヒト直腸結腸腫瘍組織と共にインキュベートした。
図１は放射能の取り込み（％）対インキュベーション時
間を、両抗体について37℃にて、それぞれ１μｇおよび
10μg/ウェルにて、１つの腫瘍組織について示す。
的吸着によるのではなく特異的結合によることを確立す
るため、対照として放射性ラベル化抗−CEA抗体および
抗−PAP抗体を、CEAを発現する新鮮なおよび深冷貯蔵さ
れたヒト直腸結腸腫瘍組織と共にインキュベートした。
図１は放射能の取り込み（％）対インキュベーション時
間を、両抗体について37℃にて、それぞれ１μｇおよび
10μg/ウェルにて、１つの腫瘍組織について示す。
【００９０】１μg/ウェルの濃度において、抗−PAP抗
体はいずれの時間においても殆ど取り込みを示さない。
これに対して抗−CEA抗体は約20倍の増加した蓄積を示
す。10μg/ウェルにおいて、特異抗体および非特異抗体
についての放射能の蓄積の相違は非常に少なく、抗原部
位の飽和が示された。
体はいずれの時間においても殆ど取り込みを示さない。
これに対して抗−CEA抗体は約20倍の増加した蓄積を示
す。10μg/ウェルにおいて、特異抗体および非特異抗体
についての放射能の蓄積の相違は非常に少なく、抗原部
位の飽和が示された。
【００９１】抗-CEA対照抗体の特異的結合を競争的結合
研究によりさらに証明した。腫瘍組織を飽和レベル(25
μg) の非ラベル抗-CEA抗体と共に17時間プレインキュ
ベートした後に１μgのラベル化抗−CEA抗体を用いる通
常のアッセイを行った。対照ウェルには非ラベル化抗体
を入れなかった。表１１に示すように、非特異抗体の場
合、プレインキュベーションによる放射能の組織蓄積の
変化は実質的に存在せず、他方、特異抗体の場合、非ラ
ベル化-CEA抗体と共にプレインキュベートされた組織に
おいて蓄積の大きな減少が生じた。
研究によりさらに証明した。腫瘍組織を飽和レベル(25
μg) の非ラベル抗-CEA抗体と共に17時間プレインキュ
ベートした後に１μgのラベル化抗−CEA抗体を用いる通
常のアッセイを行った。対照ウェルには非ラベル化抗体
を入れなかった。表１１に示すように、非特異抗体の場
合、プレインキュベーションによる放射能の組織蓄積の
変化は実質的に存在せず、他方、特異抗体の場合、非ラ
ベル化-CEA抗体と共にプレインキュベートされた組織に
おいて蓄積の大きな減少が生じた。
【００９２】
【表１１】
【００９３】結合の選択性 ラベル化抗-CEAおよび抗-PAP並びに６種類の抗−乳癌腫
瘍モノクローナル抗体から成るパネルを２種類のヒト腫
瘍組織を用いて試験した。同じサンプルにおける同じ抗
体の結合の反復測定はわずかな相違のみを示し、他方異
なる組織における同じ抗体または同じ組織における異な
る抗体の結合の相違は、図１に示すごとく非常に大きか
った。
瘍モノクローナル抗体から成るパネルを２種類のヒト腫
瘍組織を用いて試験した。同じサンプルにおける同じ抗
体の結合の反復測定はわずかな相違のみを示し、他方異
なる組織における同じ抗体または同じ組織における異な
る抗体の結合の相違は、図１に示すごとく非常に大きか
った。
【００９４】抗体113F1は腫瘍組織の１つにおいて中程
度の結合を示したが、他方において最大の結合を示し
た。予想通り、抗−CEA抗体は乳癌腫瘍組織の１つにお
いて抗−PAP抗体と同じ程度の結合を示したが、試験し
た他方の腫瘍組織において、前者は後者に比べて増加し
た結合を示した。
度の結合を示したが、他方において最大の結合を示し
た。予想通り、抗−CEA抗体は乳癌腫瘍組織の１つにお
いて抗−PAP抗体と同じ程度の結合を示したが、試験し
た他方の腫瘍組織において、前者は後者に比べて増加し
た結合を示した。
【００９５】さらに、図１(左パネル)中には、最初に分
析された(直線の棒)および３日後に分析された(斜線を
有する棒)同じ抗体および同じ組織の反復測定の結果が
示されている。個々の抗体の取り込みのレベルにわずか
な相違が存在するか、抗体の蓄積に従ってランクされる
順序は変化しない。
析された(直線の棒)および３日後に分析された(斜線を
有する棒)同じ抗体および同じ組織の反復測定の結果が
示されている。個々の抗体の取り込みのレベルにわずか
な相違が存在するか、抗体の蓄積に従ってランクされる
順序は変化しない。
【００９６】例７．19匹の８週令の雌性ヌードマウスに
MX-1腫瘍を右背脇に皮下移植した。マウスには餌および
水を自由に摂らせた。移植から14日後、皮下腫瘍は約0.
5cm3に達した時、水を0.1％ＫＬを含有する水で置き換
えた。
MX-1腫瘍を右背脇に皮下移植した。マウスには餌および
水を自由に摂らせた。移植から14日後、皮下腫瘍は約0.
5cm3に達した時、水を0.1％ＫＬを含有する水で置き換
えた。
【００９７】モノクローナル抗体260F9を125-I 1,3,4,6
−テトラクロロ−3α、6α−ジフェニルグリコウリル
(ヨードゲン)により、次のようにしてラベルした。10μ
lのヨードゲンを無菌ガラス試験管に入れ、そして約17C
i/mg比活性を有するNaI塩としての１UCiの125-I(ニュー
イングランドニュークレア)をヨードゲンに加えた。ア
ジドを含まないリン酸緩衝化塩溶液中のモノクローナル
抗体260F9をヨードゲン125-Iに加えて抗体を５μCi/μg
抗体の比活性でラベルした。
−テトラクロロ−3α、6α−ジフェニルグリコウリル
(ヨードゲン)により、次のようにしてラベルした。10μ
lのヨードゲンを無菌ガラス試験管に入れ、そして約17C
i/mg比活性を有するNaI塩としての１UCiの125-I(ニュー
イングランドニュークレア)をヨードゲンに加えた。ア
ジドを含まないリン酸緩衝化塩溶液中のモノクローナル
抗体260F9をヨードゲン125-Iに加えて抗体を５μCi/μg
抗体の比活性でラベルした。
【００９８】モノクローナル抗体MOPC21を同様にしてラ
ベルして対照として使用した。約10μCi I-125を含有す
る約２μgのラベル化抗体を各マウスに投与した。ラベ
ル化抗体は１％BSAを含有する約0.1mlのPBSの容量で、
マウスの尾静脈を介して投与した。ラベル化抗体を投与
して４日後、眼穿刺により瀉血した。血液をヘパリン処
理し、遠心し、そして血漿を保持した。組織を摘出し、
約１mm3の片に切断し、そして塩水で洗浄して過剰のカ
ウントを除去した。切断された組織を秤量し、そしてLK
B-γ-カウンター中で放射能を測定した。
ベルして対照として使用した。約10μCi I-125を含有す
る約２μgのラベル化抗体を各マウスに投与した。ラベ
ル化抗体は１％BSAを含有する約0.1mlのPBSの容量で、
マウスの尾静脈を介して投与した。ラベル化抗体を投与
して４日後、眼穿刺により瀉血した。血液をヘパリン処
理し、遠心し、そして血漿を保持した。組織を摘出し、
約１mm3の片に切断し、そして塩水で洗浄して過剰のカ
ウントを除去した。切断された組織を秤量し、そしてLK
B-γ-カウンター中で放射能を測定した。
【００９９】ヨード化MOPC21で処理された６匹のマウス
の組織を対照として使用した。I-125ラベル化260F9で処
理された13匹のマウスの組織を試験組織として使用し
た。カウント／分／ｇ(cpm／ｇ)組織または腫瘍を決定
し、そして取り込みの指標をcpm／ｇ腫瘍とcpm／ｇ器官
との比率(Ｔ／Ｏ比率)により決定した。
の組織を対照として使用した。I-125ラベル化260F9で処
理された13匹のマウスの組織を試験組織として使用し
た。カウント／分／ｇ(cpm／ｇ)組織または腫瘍を決定
し、そして取り込みの指標をcpm／ｇ腫瘍とcpm／ｇ器官
との比率(Ｔ／Ｏ比率)により決定した。
【０１００】表１２は、試験された各動物における、MX
-1腫瘍についての10μCi I-125の260F9のＴ／Ｏ比率を
示す。表１３は、試験された各動物における。MX-1腫瘍
についての10μCi1-125のMOPC21のＴ／Ｏ比率を示す。
表１４は試験されたすべての動物についての平均および
標準偏差を示す。
-1腫瘍についての10μCi I-125の260F9のＴ／Ｏ比率を
示す。表１３は、試験された各動物における。MX-1腫瘍
についての10μCi1-125のMOPC21のＴ／Ｏ比率を示す。
表１４は試験されたすべての動物についての平均および
標準偏差を示す。
【０１０１】
【表１２】
【０１０２】
【表１３】
【０１０３】
【表１４】
【０１０４】例８．瀉血に先立ち、例７の方法に従って
ラベル化260F9により処理された21匹のマウスおよびラ
ベル化MOPC21により処理された１匹のマウスを、ピンホ
ールコリメーターを有するサール・フォーガンマ(Searl
e Pho-gamma)カメラを用いてイメージングした。なまデ
ータを集めそしてコンピューター増強した。処理された
マウスおよび対照マウスのイメージを図３に示す。
ラベル化260F9により処理された21匹のマウスおよびラ
ベル化MOPC21により処理された１匹のマウスを、ピンホ
ールコリメーターを有するサール・フォーガンマ(Searl
e Pho-gamma)カメラを用いてイメージングした。なまデ
ータを集めそしてコンピューター増強した。処理された
マウスおよび対照マウスのイメージを図３に示す。
【０１０５】図３の第１ラインにおいて、左から右に、
腫瘍の外科除去前、125-Iラベル化260F9により処理され
た担癌マウスのイメージ、なまデータ；同じマウスのコ
ンピューター増強データ；外科処置後、マウスのイメー
ジのなまデータ；および外科処置後、同じマウスのコン
ピューター増強イメージを示す。検出可能な放射の局在
の顕著な領域は125-Iラベル化260F9で処理されたマウス
の背右脇上のMX-1腫瘍に対応する位置に見出される。
腫瘍の外科除去前、125-Iラベル化260F9により処理され
た担癌マウスのイメージ、なまデータ；同じマウスのコ
ンピューター増強データ；外科処置後、マウスのイメー
ジのなまデータ；および外科処置後、同じマウスのコン
ピューター増強イメージを示す。検出可能な放射の局在
の顕著な領域は125-Iラベル化260F9で処理されたマウス
の背右脇上のMX-1腫瘍に対応する位置に見出される。
【０１０６】図３の第２ラインにおいて、左から右に、
125-Iラベル化MOPC21(対照として使用された腫瘍に特異
的でない抗体)で処理された担癌マウスのイメージ、な
まデータ；および同じマウスのコンピューター増強イメ
ージを示す。125-Iラベル化260F9で処理されたマウスに
おけるような背右脇上の検出可能な放射の局在の対応す
る領域は存在しない。さらに、対照マウスにおけるラベ
ルの分布は125-Iラベル化260F9で処理された術後マウス
におけるラベルの分布に対応するようである。
125-Iラベル化MOPC21(対照として使用された腫瘍に特異
的でない抗体)で処理された担癌マウスのイメージ、な
まデータ；および同じマウスのコンピューター増強イメ
ージを示す。125-Iラベル化260F9で処理されたマウスに
おけるような背右脇上の検出可能な放射の局在の対応す
る領域は存在しない。さらに、対照マウスにおけるラベ
ルの分布は125-Iラベル化260F9で処理された術後マウス
におけるラベルの分布に対応するようである。
【０１０７】図３の第３ラインには、左から右に、125-
Iラベル化260F9で処理された担癌マウスの術前のイメー
ジのなまデータ；および同じマウスのコンピューター増
強イメージである。検出可能な放射の局在の顕著な領域
はマウスの右背脇上MX-1腫瘍に対応する位置中に見出さ
れる。
Iラベル化260F9で処理された担癌マウスの術前のイメー
ジのなまデータ；および同じマウスのコンピューター増
強イメージである。検出可能な放射の局在の顕著な領域
はマウスの右背脇上MX-1腫瘍に対応する位置中に見出さ
れる。
【０１０８】図３の第４ラインにおいて、左から右に、
第３ラインからの担癌マウスの術後イメージ、なまデー
タ；術後の、同じマウスのコンピューター増強イメー
ジ；同じマウスから摘出された腫瘍のイメージのなまデ
ータ；および同じ摘出された腫瘍のコンピューター増強
イメージである。有意な量のラベル化腫瘍特異抗体が腫
瘍中に局在したことが示される。術後に残留する検出可
能な腫瘍特異抗体の量は、この限定されたサンプル中第
２ライン中の対照マウスにおける検出可能な抗体の量よ
り少ない。
第３ラインからの担癌マウスの術後イメージ、なまデー
タ；術後の、同じマウスのコンピューター増強イメー
ジ；同じマウスから摘出された腫瘍のイメージのなまデ
ータ；および同じ摘出された腫瘍のコンピューター増強
イメージである。有意な量のラベル化腫瘍特異抗体が腫
瘍中に局在したことが示される。術後に残留する検出可
能な腫瘍特異抗体の量は、この限定されたサンプル中第
２ライン中の対照マウスにおける検出可能な抗体の量よ
り少ない。
【０１０９】この発明のモノクローナル抗体は、ラベル
化成分により誘導体化された後、多数の用途を有する。
このイムノイメージングモノクローナル抗体は、一次悪
性乳腫瘍の診断のために使用され得る。悪性乳腫瘍の可
能性を示す固まりを有する患者は現在日常的に一連の乳
房造影試験を受ける。乳房造影法に加えて、この発明の
イムノイメージング抗体を皮下または静脈内に投与する
ことにより、固まりがこの発明のラベル化抗体の取り込
みについて陽性であるか否かを決定することができる。
ラベル化抗体の蓄積は、生検または一層広範な外科的試
験の必要性を示唆する追加の指標として役立つであろ
う。
化成分により誘導体化された後、多数の用途を有する。
このイムノイメージングモノクローナル抗体は、一次悪
性乳腫瘍の診断のために使用され得る。悪性乳腫瘍の可
能性を示す固まりを有する患者は現在日常的に一連の乳
房造影試験を受ける。乳房造影法に加えて、この発明の
イムノイメージング抗体を皮下または静脈内に投与する
ことにより、固まりがこの発明のラベル化抗体の取り込
みについて陽性であるか否かを決定することができる。
ラベル化抗体の蓄積は、生検または一層広範な外科的試
験の必要性を示唆する追加の指標として役立つであろ
う。
【０１１０】この発明のラベル化モノクローナル抗体は
また、悪性乳腫瘍の除去のための乳房切除術または腫瘍
切除術を受けたことのある患者の臨床予後を検査するた
めに明瞭に使用される。従来から、このような患者の腋
リンパ節が、癌の播種範囲を決定するために切り出され
る。今日の実際においては、陽性のリンパ節を有する患
者は補助的な化学療法を受ける。腋リンパ節のサンプリ
ングは全身麻酔を必要とする侵害的方法である。これ
は、感染および麻酔に対する反応を包含するあらゆる多
くの外科的方法のすべての危険を伴い、そして痛み、回
復および治癒の実質的な術後期間が必要である。
また、悪性乳腫瘍の除去のための乳房切除術または腫瘍
切除術を受けたことのある患者の臨床予後を検査するた
めに明瞭に使用される。従来から、このような患者の腋
リンパ節が、癌の播種範囲を決定するために切り出され
る。今日の実際においては、陽性のリンパ節を有する患
者は補助的な化学療法を受ける。腋リンパ節のサンプリ
ングは全身麻酔を必要とする侵害的方法である。これ
は、感染および麻酔に対する反応を包含するあらゆる多
くの外科的方法のすべての危険を伴い、そして痛み、回
復および治癒の実質的な術後期間が必要である。
【０１１１】この発明のモノクローナル抗体は、乳癌の
リンパ節関与を決定するための非侵害的方法として使用
することができ、そして常用の節摘出に対する補助的方
法として、またはそれに代る方法として役立つことがで
きる。
リンパ節関与を決定するための非侵害的方法として使用
することができ、そして常用の節摘出に対する補助的方
法として、またはそれに代る方法として役立つことがで
きる。
【０１１２】放射性ラベルされたモノクローナル抗体の
利用が多くの臨床的研究において、少なくとも予備的な
態様で示されている。Mckenzie等“Immunoscintigraphy
forDetection of Lymph Node Metastases From Breast
Cancer”，Lancet No.8414：1245(1984)が示したとこ
ろによれば、ヒト悪性乳腫瘍に対して特異的なI-131ラ
ベル化モノクローナル抗体の皮下指間(subcutaneous in
terdigital)注射を用いて、腋リンパ節をまき込む腫瘍
を有することがすでに疑われている患者において転移の
存在を確認することができ、そして腫瘍の存在が疑われ
ていない場合にはリンパ節中の腫瘍を検出するために使
用することができる。東芝GCA402ガンマーカウンターカ
メラ、およびインホーマテック・シメス(Iformatek Sim
es)４コンピューターを用いる高エネルギー平行ホール
コリメーター−コンピューター平衡化を用いて、注射の
24時間後、イムノシンチグラフィーは、取り出された節
中の転移の検出のための常用の臨床実験よりも鋭敏であ
った。
利用が多くの臨床的研究において、少なくとも予備的な
態様で示されている。Mckenzie等“Immunoscintigraphy
forDetection of Lymph Node Metastases From Breast
Cancer”，Lancet No.8414：1245(1984)が示したとこ
ろによれば、ヒト悪性乳腫瘍に対して特異的なI-131ラ
ベル化モノクローナル抗体の皮下指間(subcutaneous in
terdigital)注射を用いて、腋リンパ節をまき込む腫瘍
を有することがすでに疑われている患者において転移の
存在を確認することができ、そして腫瘍の存在が疑われ
ていない場合にはリンパ節中の腫瘍を検出するために使
用することができる。東芝GCA402ガンマーカウンターカ
メラ、およびインホーマテック・シメス(Iformatek Sim
es)４コンピューターを用いる高エネルギー平行ホール
コリメーター−コンピューター平衡化を用いて、注射の
24時間後、イムノシンチグラフィーは、取り出された節
中の転移の検出のための常用の臨床実験よりも鋭敏であ
った。
【０１１３】この発明のモノクローナル抗体のラベル化
誘導体を用いる静脈内投与による乳癌の位置決定はま
た、皮下投与経路に対する明僚な代替法である。この方
法においては、放射性ラベルされたモノクローナル抗体
が静脈内投与のために適当な溶液、例えば、１％ヒト血
清アルブミンを含む0.15M Nacl中溶液として患者に導入
される。放射性ラベルされたモノクローナル抗体は、好
ましくは静脈カテーテルを用いて一定量の塩溶液として
約30分間にわたって注入される。
誘導体を用いる静脈内投与による乳癌の位置決定はま
た、皮下投与経路に対する明僚な代替法である。この方
法においては、放射性ラベルされたモノクローナル抗体
が静脈内投与のために適当な溶液、例えば、１％ヒト血
清アルブミンを含む0.15M Nacl中溶液として患者に導入
される。放射性ラベルされたモノクローナル抗体は、好
ましくは静脈カテーテルを用いて一定量の塩溶液として
約30分間にわたって注入される。
【０１１４】皮下注射法および静脈内注射法の両者にお
いて、患者は、モノクローナル抗体生産性ハイブリドー
マの調製のために使用された動物の正常抗体に対するア
レルギーについて試験される。一般に、モノクローナル
抗体がヨウ素の放射性同位元素により誘導体化される場
合、患者は131-Iの甲状腺取り込みをブロックするため
にルゴルス(Lugols)ヨウ素溶液で前処置され、そしてイ
ムノイメージングモノクローナル抗体の投与の前にプロ
メタジン(promethazine)およびプレドニソロン(prodoni
solone)により前調停される。イムノイメージングモノ
クローナル抗体が投与された後、数時間〜数日間にわた
り、患者はスキャンニングされる。非特異的抗体を用い
るサブトラクション分析のごとき適当な対照法を含む放
射性同位元素イメージングのためのスキャンニング方法
は、核医学の分野における当業者により知られており、
そしてコンピューターを用いるフォートスキャンニング
およびコンピューターを用いる断面シンチグラフィーを
包含する。
いて、患者は、モノクローナル抗体生産性ハイブリドー
マの調製のために使用された動物の正常抗体に対するア
レルギーについて試験される。一般に、モノクローナル
抗体がヨウ素の放射性同位元素により誘導体化される場
合、患者は131-Iの甲状腺取り込みをブロックするため
にルゴルス(Lugols)ヨウ素溶液で前処置され、そしてイ
ムノイメージングモノクローナル抗体の投与の前にプロ
メタジン(promethazine)およびプレドニソロン(prodoni
solone)により前調停される。イムノイメージングモノ
クローナル抗体が投与された後、数時間〜数日間にわた
り、患者はスキャンニングされる。非特異的抗体を用い
るサブトラクション分析のごとき適当な対照法を含む放
射性同位元素イメージングのためのスキャンニング方法
は、核医学の分野における当業者により知られており、
そしてコンピューターを用いるフォートスキャンニング
およびコンピューターを用いる断面シンチグラフィーを
包含する。
【０１１５】この発明のラベルされたモノクローナル抗
体の他の臨床的用途は乳癌患者の管理の分野における当
業者に明らかである。このような用途は、化学療法剤、
イムノトキシン、免疫剤またはリンホカインを包含する
種々の療法剤を用いる療法において転移腫瘍の存在をモ
ニターするためのラベル化モノクローナル抗体の使用が
含まれる。
体の他の臨床的用途は乳癌患者の管理の分野における当
業者に明らかである。このような用途は、化学療法剤、
イムノトキシン、免疫剤またはリンホカインを包含する
種々の療法剤を用いる療法において転移腫瘍の存在をモ
ニターするためのラベル化モノクローナル抗体の使用が
含まれる。
【０１１６】この発明のラベルされたモノクローナル抗
体にまた、命を危険にさらす転移の存在を、それらの発
症に先立って、予防的または改善的放射線療法を可能に
するのに十分な早期に使用することもできる。この発明
の最も高度に選択的な抗体はまた、患者の正常組織中の
モノクローナル抗体の分布もしくは局在またはその不存
在を決定するためにラベルすることができ、そうして悪
性乳腫瘍の治療のためのイムノトキシンまたは免疫薬剤
のごとき抗体を基礎とした療法剤のための成分として有
利に使用されるであろう乳癌特異的モノクローナル抗体
を同定するための基礎を与える。
体にまた、命を危険にさらす転移の存在を、それらの発
症に先立って、予防的または改善的放射線療法を可能に
するのに十分な早期に使用することもできる。この発明
の最も高度に選択的な抗体はまた、患者の正常組織中の
モノクローナル抗体の分布もしくは局在またはその不存
在を決定するためにラベルすることができ、そうして悪
性乳腫瘍の治療のためのイムノトキシンまたは免疫薬剤
のごとき抗体を基礎とした療法剤のための成分として有
利に使用されるであろう乳癌特異的モノクローナル抗体
を同定するための基礎を与える。
【０１１７】この発明のこれらのそして他の観点は、こ
の発明が属する分野における当業者にとって明らかであ
ろう。
の発明が属する分野における当業者にとって明らかであ
ろう。
【０１１８】表１５のモノクローナル抗体生産性ハイブ
リドは、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ン(ATCC)、またはインビトロ・インターナショナル社(I
VI)に、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に
間するブタペスト条約、およびその規則(ブタペスト条
約)のもとに寄託された。これは、寄託の日から30年間
の生存培養物の維持を保証する。これらのハイブリドー
マはATCCからまたはIVIから、ブタペスト条約の規定の
もとに、そして関運する米国特許が与えられた後無制限
の入手可能性を保証する出願人とATCCまたはIVIとの間
の合意により入手可能にされるであろう。寄託された株
の入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとでその国
の特許法に従って認められた権利に反してこの発明を実
施する許諾であると解してはならない。
リドは、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ン(ATCC)、またはインビトロ・インターナショナル社(I
VI)に、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に
間するブタペスト条約、およびその規則(ブタペスト条
約)のもとに寄託された。これは、寄託の日から30年間
の生存培養物の維持を保証する。これらのハイブリドー
マはATCCからまたはIVIから、ブタペスト条約の規定の
もとに、そして関運する米国特許が与えられた後無制限
の入手可能性を保証する出願人とATCCまたはIVIとの間
の合意により入手可能にされるであろう。寄託された株
の入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとでその国
の特許法に従って認められた権利に反してこの発明を実
施する許諾であると解してはならない。
【０１１９】左欄に記載される各ハイブリドーマの名称
はそのハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体の
名称と対応する。
はそのハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体の
名称と対応する。
【０１２０】
【表１５】
【０１２１】
【発明の効果】本願発明により乳癌のイメージングのた
めに適当なネズミモノクローナル抗体を得ることができ
る。
めに適当なネズミモノクローナル抗体を得ることができ
る。
【図１】 図１は、各種モノクローナル抗体の腫瘍組織
への結合を示す。
への結合を示す。
【図２】 図２は、MX-1腫瘍を有するマウスに投与され
たモノクローナル抗体の各種の臓器への分布を示す。
たモノクローナル抗体の各種の臓器への分布を示す。
【図３】 図３は、マウスのラジオイメージングを示
し、生物の形態を表わす図面に代る写真である。
し、生物の形態を表わす図面に代る写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 アーサー イー．フランケル アメリカ合衆国，ノース カロライナ 22710，ダラム，ボックス 3898，デュー ク ユニバーシティ
Claims (1)
- 【請求項１】 ヒト乳癌抗原に結合する乳癌のイメージ
ングのために適当なネズミモノクローナル抗体であっ
て、該モノクローナル抗体が、寄託されたハイブリドー
マＩＶＩ １００７９（ＡＴＣＣ ＨＢ １０８０８）
により産生される７５９Ｅ３である、モノクローナル抗
体。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78507685A | 1985-10-07 | 1985-10-07 | |
| US785076 | 1985-10-07 | ||
| US06/786,948 US4938948A (en) | 1985-10-07 | 1985-10-11 | Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
| US786948 | 1985-10-11 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8043761A Division JP2968474B2 (ja) | 1985-10-07 | 1996-02-29 | 抗−ヒト乳癌モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000000092A true JP2000000092A (ja) | 2000-01-07 |
Family
ID=27120360
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8043761A Expired - Lifetime JP2968474B2 (ja) | 1985-10-07 | 1996-02-29 | 抗−ヒト乳癌モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
| JP11161738A Pending JP2000000091A (ja) | 1985-10-07 | 1999-06-08 | 抗―ヒト乳癌モノクロ―ナル抗体を産生するハイブリド―マ |
| JP11161739A Pending JP2000000092A (ja) | 1985-10-07 | 1999-06-08 | 抗―ヒト乳癌モノクロ―ナル抗体 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8043761A Expired - Lifetime JP2968474B2 (ja) | 1985-10-07 | 1996-02-29 | 抗−ヒト乳癌モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
| JP11161738A Pending JP2000000091A (ja) | 1985-10-07 | 1999-06-08 | 抗―ヒト乳癌モノクロ―ナル抗体を産生するハイブリド―マ |
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| AT (1) | ATE85652T1 (ja) |
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| CA (1) | CA1338706C (ja) |
| DE (1) | DE3687736T2 (ja) |
| DK (1) | DK478886A (ja) |
| ES (1) | ES2053440T3 (ja) |
| FI (1) | FI864037A (ja) |
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| NZ (1) | NZ217829A (ja) |
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| US5032521A (en) * | 1984-12-05 | 1991-07-16 | The Salk Institute For Biological Studies | Monoclonal antibody specific for a mammary tumor cell surface antigen |
| AU601379B2 (en) * | 1985-11-07 | 1990-09-13 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Antigen indicative of human breast cancer and assays based thereon |
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| US5401638A (en) * | 1986-06-04 | 1995-03-28 | Oncogene Science, Inc. | Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans |
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| NZ222509A (en) * | 1986-11-19 | 1993-03-26 | Oncogen | Hybridoma cell line producing antibodies binding to tumour-associated mucin antigen |
| US6004761A (en) * | 1986-11-19 | 1999-12-21 | Sanofi | Method for detecting cancer using monoclonal antibodies to new mucin epitopes |
| US4863726A (en) * | 1987-05-29 | 1989-09-05 | Cetus Corporation | Combination therapy using immunotoxins with interleukin-2 |
| US5084266A (en) * | 1988-02-03 | 1992-01-28 | The University Of Melbourne | Method for tumor imaging utilizing a labelled tumor specific antibody and a non-tumor reactive antibody |
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| US5849877A (en) * | 1990-10-29 | 1998-12-15 | Chiron Corporation | Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens |
| US5948647A (en) * | 1990-10-29 | 1999-09-07 | Chiron Corporation | Nucleic acids encoding antigen-binding sites specific for cancer antigens |
| US5811267A (en) * | 1990-10-29 | 1998-09-22 | Chiron Corporation | Isolated nucleic acid molecules encoding antigen binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens |
| US5292524A (en) * | 1991-09-06 | 1994-03-08 | California Institute Of Technology | Blood platelet loaded with diagnostic or therapeutic-containing liposome or reconstituted Sendai virus |
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| FR2811323B1 (fr) * | 2000-07-07 | 2006-10-06 | Fuma Tech Gmbh | Materiau hybride, utilisation dudit materiau hybride et procede de sa fabrication |
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