JPH02497A - ヒト前立腺特異性抗原に対する抗体組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は１９７９年１２月２８日に出願された、継続中
の共通に譲渡されたアメリカ合衆国特許出願第１０８，
２１７号の一部継続出願であり、該出願の内容をこ−に
参照として取り入れる。本発明はアメリカ合衆国公衆衛
生局国立ガン研究所から、交附金番号ＣＡ−１５１２６
およびＣＡ−１５４３７により一部援助されたものであ
る。

本分凱至茨五分互 本発明は、前立腺酸性フォスファターゼとは明確に異な
るヒト前立腺抗原の免疫学的検出のための診断試薬およ
び方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、実験室的
方法で前立腺ガン検出に使用するのに通した新規なヒト
前立腺抗原およびそれに対し特異的な抗体に関する。

丘旦肢歪 前立腺ガンは老年に非常に多く、７０才以上の男性の約
半分は前立腺ガンの発生を見ている。この前立腺ガンの
高い発生率はその検出に用いることのできるマーカーの
探索へと導いた。転移した前立腺ガンを有する患者にお
ける血漿酸性フォスファターゼ活性の上昇が最初にＧｕ
ｔｎ＋ａｎ　ｅＬ　ａｌ　　によりＪ、　Ｃｌ１ｎ、　
Ｉｎｖｅｓｔ、　１７：４７３　　（１９３８）に報告
された。前立腺ガンにおいて、前立腺酸性フォスファタ
ーゼがガン組織から血液中へ放出され、総血漿酸性フォ
スファターゼ濃度が正常値より大きく上昇する結果を伴
なう。その時からこの酵素およびその前立腺ガンとの関
係に関する多数の研究がなされた。ＹａｍによるＡｍｅ
ｒ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　５６　：６０４　（１９７４）
の総説を参照。しかしながら慣用の分光分析学的方法に
よる血漿酸性フォスファターゼの測定は、早期における
前立腺ガンの発見にしばしば失敗する。一般に、血漿フ
ォスファターゼ活性は、骨転移を有する前立腺ガンを有
する患者の約６５ないし９０％、骨転移のレントゲン的
証拠のない患者の約３０％、および臨床的に示し得る転
移を欠く患者のたった約５ないし１０％において上昇す
るに過ぎない。

前立腺酸性フォスファターゼの特異的テストを開発する
ための先行技術の努力は、いわゆる特異的基質に対する
酵素活性に依存する手法では前立腺起源の酵素活性に関
係のない多数の酸性フォスファターゼ間の他の生化学的
および免疫学的違いを考慮できないため、限られた成功
度しかなかった。イソ酵素、すなわち同じ特性酵素活性
および類似の分子構造を持つが、アミノ酸配列および／
または内容において異なり、従って免疫化学的に区別し
得る遺伝子的に洗練された酵素の場合、単に特定の基質
の選択だけで異なるイソ酵素形を区別することは本来不
可能に思われる。そのためこれら先行技術の方法のどれ
一つも前立腺酸性フォスファターゼ活性の直接の測定に
高度に特異でないことは驚くに値しない。例えばＣａｎ
ｃｅｒ　５：　２３６（１９５２）；　　Ｊ、　　Ｌａ
ｂ、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｗｅｄ、　　８２：４８６（１
９１３＞：Ｃ１１ｎ。

Ｃｈｅｗ、　Ａｃｔａ、旦；２１（１９７３）；　Ｊ、
　Ｐｈ１ｓｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、３５６；１７７５（１
９７５）参照。

前立腺酸性フォスファターゼの検出のために用いられる
先行技術試薬の多くには本来存在するように見える非常
特異性の前述の問題に加えて、他の病気に伴う血漿酸性
フォスファターゼの上昇の報告があり、それが前立腺ガ
ンの正確な臨床学的診断を得る問題を益々複雑にしてい
る。例えばＴｕｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌはＡｍ、　Ｊ、
　Ｍｅｄ、２７：９５９（１９５９）において、ゴーシ
ュー病患者に血漿酸性フォスファターゼ濃度の上昇が見
られることを記している。

前立腺酸性フォスファターゼに対する特異的基質の開発
における本質的な困難のため、ある研究者は前立腺酸性
フォスファターゼの免疫学的検出法を開発した。しかし
ながら以前報告された免疫化学的方法はそれ自体それら
の広範囲普及受は入れをはばむ欠点を持っている。例え
ばＳｃｈｕＩｍａｎｅｔ　ａｌはＩｍｍｕｎｏｌｏｇ３
’　９３：４７４（１９６４）においてヒト前立腺酸性
フォスファターゼの検出のための免疫拡散試験を記載し
た。前立腺病を有する患者から直腸マツサージによって
得られた前立胆液抗原から製造された抗血清を使用し、
二重拡散法において正常な腎臓、こう丸、肝臓および肺
臓の抽出液に対し、交差反応性沈降素ラインが観察され
なかった。しかしながらこの方法は多量の抗原を使って
さえも限られた怒度、および前立腺液中に存在する他の
抗原的には関係のない血清タンパク成分と交差反応し得
る抗血清を使用する欠点を有する国際特許出願公告Ｎα
ＷＯ７９１００４７５において（その内容はこ＼に参考
として取り入れる）Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌに上述の欠点の
多くを排除する、前立腺ガンに関連する前立腺酸性フォ
スファターゼイソ酵素パターンの検出のための新しい方
法を記載する。

しかしながら前立腺ガンに関連する診断学的に適切な前
立腺酸性フォスファターゼイソ酵素パターンは、それに
対する抗体の製造のためにそれから抽出されるガン性前
立１１１！ｆａのソースを必要とすることによって実施
上の問題を生ずる。

近年特異的診断試薬の開発を目指し、種々のタイプのガ
ンのための酵素または抗原マーカーを同定するために多
大の努力が費やされた。理想的な悪性しゅ瘍マーカーは
、他の特性の中でも、組織または細胞タイプ特異性を発
揮し、そして循環系または個人から容易に得ることので
きる他の生物学的環境中に放出されるものであろう。以
前の研究者はヒト前立腺組織特異性抗原の存在を証明し
た。例えばＲ，Ｈ，Ｆｌｏｃｋｓ　ｅｔ　ａｌ、、ｌ　
Ｊ、　Ｕｒｏｌ、８４；１３４　’　（１９６０）はＢ
ＰＨ（良性前立腺肥大）前立腺組織の抽出物でウサギを
免疫し、そしてゲル拡散法によって組織特異性抗前立腺
抗体の存在を証明した。しかしながら彼らは、反応性抗
原の性状を示すためのデータを全く提出しなかった。抗
血清および前立腺抽出物によって生成した沈デン線は、
前立腺酸性フォスファターゼとその抗体との反応による
ものと考えられる。

Ｒ，Ｊ、　Ａｂｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、１０４：１３２９（１９７０）およびＲ，Ｊ、　
Ａｂｌｉｎ、　Ｃａｎｃｅｒ　２９：１５７０（１９７
２）はまたヒト前立腺組織特異性抗原の存在を示した。

正常な前立腺抽出物で免疫化したウサギから得られた抗
血清を使用し、Ａｂｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ　はヒト前立腺
中に二つの抗原性成分を示した。それらの一つは前立膝
酸性フォスファターゼと同定されたが、他方の特異性は
非前立腺組織抗原であることが示された。第二の抗原に
対し反応性の異抗体は、抗血清をヒト前立腺液で処理す
ることにより消失することができなかった。さらにこの
抗原は良性および悪性前立腺組繊中に欠いていることが
示された。

これに対し、本発明の前立腺抗原はすべての前立腺組織
中に（正常、良性または悪性）殆んど同し量で存在する
。さらに、それは前立腺液により、培養したヒト前立腺
ガン細胞およびその培地により同様に検出可能である。

Ａｂｌｉｎの論文はそこに記載する抗原に対する抗血清
を前立腺液で吸収し、その後で沈降素ラインがなお検出
されたことを記載する。

本発明の抗原に対する抗体の前立腺液による吸収は沈降
素ラインを与えず、この抗原は、＾ｂｌｉｎｅｔ　ａｌ
の抗原ではそうでないが、前立腺液中に存在することを
示している。

Ｃ，Ｗ、Ｍｏｎｃｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｃａｎｃｅ
ｒ　Ｃｈｅ＋ｌ１ｏｔｈｅｒ、Ｒｅｐ。

５９：１０５（１９７５）は、本発明の抗原では結合す
るが、ｐ　Ｈ８，０においてＤＥＡＥセファローズへ結
合しないヒト前立腺＆ｌ１ｗ＆特異性抗原剤の存在を示
した。

この特徴は本タンパクとＭｏｎｃｕｒｅ　ｅｔ　ａｌの
間の有意な構造上の違いを最も確実に示している。

このように許容できる精度をもって、そして先行技術の
前述の困難なしに、前立腺ガンを検出するための簡単な
、信頼性ある、感受性のそして特異的試薬および手法に
対してなお需要が存在する。

本発明はこのような需要を満たす。

本発凱■皿丞 本発明の一般的目的は、血液、尿または他の体液中に循
環しているヒト前立腺抗原の免疫学的に特異的な検出に
適した改良された診断試薬の製造に有用な精製したヒト
前立腺抗原を提供することである。

本発明の他の目的は、前立腺ガンの早期発見に有用な、
急速で簡単で、しかし高度に特異的でそして感受性の、
免疫学的手法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、前立腺ガンおよびその治療
法の有効性を監視するための新しいマーカーを提供する
ことである。

本発明の他の目的は、ヒト前立腺抗原に対する有用な単
クローン性抗体を提供することである。

本明細書および請求の範囲を検討するとき、本発明のそ
れ以上の目的、特徴および利益が本発明が関係する技ｊ
ネｉ分野における当業者にはもっと完全に明らかになる
であろう。

、［Ｉ　の　　　の　　　　３１ 概略すれば、本発明の上述および他の目的、特徴および
利益は、その第一の局面において、前立腺酸性フォスフ
ァターゼとは区別される精製したヒト前立腺抗原を提供
することによって達成される。

第二の局面において、本発明は精製したヒト前立腺抗原
に高度に特異的であり、そして前立腺酸性フォスファタ
ーゼまたは他の組織を起源とする酸性フォスファターゼ
と交差反応しない抗血清を提供する。

本発明の第三の局面において、高い感度と、良好な特異
性とを示し、そして前立腺以外の悪性しゅ瘍に対しては
実質土偶の陽性結果を示さない前立腺ガンの検出のため
の免疫化学的方法が提供される。

第四の局面において、本発明は例えば前立腺ガンの試験
管内ラジオイムノ検出および前立腺ガンの免疫特異的化
学療法のキャリアーとして有用な、ヒト前立腺抗原に対
する特異的マーカーを提供する。

本発明によれば、正常またはガン性ヒト前立腺組織、前
立腺液、培養したヒト前立腺ガン細胞、またはその培地
からの抗原性製剤は、前立腺酸性フォスファターゼを含
まないヒト前立腺抗原より実質的になる製剤を得るよう
に精製される。これらの抗原性製剤は免疫学的ワクチン
注射および診断操作、特に免疫沈降素試験に使用される
。

免疫学的研究により、この抗原は正常、良性の肥大およ
びガン性前立腺に存在することを示すので、各種の前立
腺組織のプールを後での精製のための出発原料として使
用することができる。概略的には、而立腺′Ｍ１礒は４
°Ｃにおいて水性媒体中に最初抽出される。ＥＤＴＡ−
ＰＢＳ溶液が便利に使用されるが、食塩水、３ＭＫＣｌ
または０．０１％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　８０　（Ｌ
かし１Ｍ過塩素酸なし）も前立腺抗原の抽出に使用する
ことができる。この抗原はこのようにその過塩素酸に対
する感受性によってＣＥＡ　（ガン胎児性抗原）から区
別される。

遠心および口過によりホモジネートを清澄化した後、粗
抽出液からの上清を硫安分画にかける。

２０ないし８０％飽和の硫安濃度がＥＤＴＡ−ＰＢＳ抽
出液から前立腺抗原を殆んど定量的に回収し、最高収率
は４５ないし５０％飽和である。他のタンパクの汚染を
できるだけ避けるため、好ましくは硫安の３５ないし５
５％飽和度で沈澱を集めると、該沈澱は粗抽出液中の総
前立腺抗原の約７０％を含有する。

ヒト精液漿はある抗原を含み、二重免疫拡散法でウサギ
抗ＰＡ（前立腺抗原）血清と反応し、前立腺組織の粗抽
出液のそれと融合した免疫沈降素ラインを形成すること
が判明した。この結果は、精液漿中にヒト前立腺抗原（
ＰＡ）と免疫学的に同一のタンパクが存在することを明
らかにした。

その後の研究は、検査したすべての精液漿見本は０．４
ないし１．８　ｍｇ／ｍｌｌ　（ｎ　＝　９　、平均値
上標準偏差＝０．７１±０．４２　）の範囲でＰＡの実
質量を含むことを示した。精液漿２０ないし３０ｍ！中
のＰＡ含量は、１００ｇの前立腺組織中のそれに等しい
ことが推定される。クロマトグラフィーにおいてＰＡの
溶離態様は、抗原のソースとして前立腺組織を使用した
それと類似である。精液漿からそして前立腺組織から精
製したＦＡは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および
等電集束法によってそれぞれ示されるように、同一の移
動度および等電点（ＰＦ３．８７±０．０９　）を有す
る。両方の精製ＦＡは、セファデックスＧ−７５ゲルロ
過法によって示されるように、３３．０００−３４，０
００の分子量を示す。そのほかに、精製したＰＡ調製剤
抗ＰＡ血清と反応させるとき、同一性の一本の線が免疫
拡散において得られた。

精液漿は前立腺組織よりもたやすく入手し得て、そして
多量のＰＡを含有するので、それはＰＡを単離する理想
的なソースに見える。ＰＡ単離源として精液漿を使用す
ることはまた、前立腺組織の使用を上廻る利益を有する
ように見える。第一に、少なくとも４時間を要する当初
の抽出工程が省かれる。第二に、精液漿２０ないし３０
−はＰＡ含量に関して組織の１００ｇと等しいので、精
製の最初の段階において多量の組繊抽出液の取り扱いが
避けられる。第三に、精液漿はより少ない夾雑タンパク
を含有し、そして精製を容易にする。例えば、組織抽出
液中のヘモグロビンは、５０％飽和度以上の濃度で硫安
によりＰＡと同時に沈澱し、精製の後工程においてこの
ヘモグロビンの除去は最終的に精製したＰＡの収率の低
下をもたらす。

精液漿はより少量の汚染タンパクを含有するので、分画
沈澱工程中硫安濃度の上限カットオフ点を７５％飽和度
まで上げることにより、ＰＡのより多量を回収すること
が可能である。精製した形のＰＡのより良い回収は精液
漿から達成される。

Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−ＢｉｏＧｅｌ　　Ａ陰イオン交換カ
ラムは、前立腺抗体を効果的に保留し、そしてｐ　Ｈ８
，０におけるトリス−ＨＣｌ緩衝液による該カラムの洗
浄は該抗原のカラムから溶離しない。該抗原の溶離は同
じ緩衝液中１８ないし７８ｍＭ　　ＮａＣ＋により、そ
して続いてゲルクロマトグラフィーによるその後の精製
によって達成することができる。ＤＥＡＥカラムから溶
離したＰＡ製剤中の夾雑タンパクのバルクは４５，００
０以上の分子量を有し、従ってセファデックスＧ−１０
０カラム上のゲル口過によりＰＡ（分子量３３，０００
ないし３４゜０００）から分離することができる。

溶離液としてｐＨ勾配溶液を使用するＤＥＡＥカラム上
の陰イオン交換クロマトグラフィーにより、追加の工程
を実施することができる。７．６ないし６．７のｐＨ範
囲における分画量に、ＰＡを含有することを示した二つ
のタンパクピークが検出された。ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動において、最初のピーク分画にはタンパク不
均一性が見られたが、第２のピーク分画は単一のタンパ
クバンドを与えた。従って均一なＰＡを得るため、第２
のピーク分画だけを集めた。この溶離の終点において、
クロマトグラフィーにかけた全ＰＡの約２０％がなおり
ＥＡＥカラムに結合していた。これは０．０８Ｍ　　Ｎ
ａＣｌで溶離することにより定量的に回収することがで
きるが、しかし溶離したＰＡ製剤中にタンパク不均一性
が観察された。

上述のＰＡ精製過程において興味ある観察がなされた。

第１のピーク分画は、第２のピーク分画からの精製ＰＡ
のそれとは異なるｐＩを存するＰＡを含有していた。ま
た、ｐＨ勾配溶離の終点においてＤＥＡＥカラムによっ
て保有されているＰＡも異なるｐｌを示した。同様な観
察は精液漿からのＰＡ精製にもなされ、そしてノイラミ
ニダーゼによる処理は、これらＰＡ異性体のｐＩを高ｐ
Ｈ域へ上昇させた。このように本発明のヒト前立腺抗原
は多くの異なる異性体の形で存在するようである。

部分的に精製した抗原の調製的ポリアクリルアミドゲル
電気泳動は純粋な抗原製剤を得るのに有効である。この
精製した抗原はドデシル硫酸ナトリウムの添加および添
加なしで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により均一
であることを示す。

これは下部単位なしで分子９３３，０００ないし３４．
０００を有し、そして単一のｐＩ６．９を示す。

免疫沈澱および免疫細胞化学的手法を使用し、ＰＡは前
立腺上皮マーカータンパクであることが示された。ＰＡ
は前立腺および前立腺管の上皮層と、前立腺分泌液およ
び結石中に局在するが、しかし尿道周囲線、精のう、輸
精管、ぼうこう移行性上皮、前立腺尿道、フオンブルン
巣の腺内膜、またはこう丸中には存在しない。これらの
観察は精液葉中のＰＡは前立腺起源のものであることを
示唆する。

ＰＡの前立腺ガンにおける可能性ある臨床上の応用を示
すデータがこ−に提供される。Ｏ，１ｍｇ／ｄの感度を
もって循環するＰＡの定量は、酵素イムノアッセイ法に
よって達成された。ＰＡは正常な女性および女性ガン患
者からの血清中には検出されないが、非前立腺ガンの男
性患者からの血清は正常な男性と同範囲のＰＡを含有す
る。前立腺病の患者は循環ＰＡの上昇したレベルを有す
ることを示した。良性前立腺肥大患者と、Ａ段階の前立
腺ガン患者との間に、ＰＡレベルに定量的な差は見出せ
ないが、他の段階の前立腺ガン患者は、定量的および定
性的に著しく上昇したＰＡレベルを示す。免疫細胞学的
操作をもって、検討したすべての一次的および二次的前
立腺しゆ瘍は抗ＰＡ血清と陽性に反応したが、しかし非
前立腺起源のしゅ瘍は反応しなかった。従ってこれらの
結果は、前立腺ガンを診断し、そしてその処置の効果を
監視するための追加手段を示唆する。他の可能性ある応
用は、例えばり、　Ｐｒｅｓｓｍａｎ、　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ但：　２９６０　（１９８０）記載
の方法による、前立腺ガン、特に段階分けおよび処置が
非常に臨界的なミクロ転移の生体内ラジオイムノ検出に
特異的抗ＰＡ抗体を使用することである。免疫特異療法
も可能性ある分野であり、そこではＰＡ免疫試薬の入手
可能性により多くの研究が今や可能である。例えばＴ、
　Ｇｈｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　　Ｎａｔ、　　Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　　６旦６５７（１９７８）参
照。さらに、前立腺上皮に対するこの新しいマーカーの
助けにより、前立腺の生理を研究することができる。

前立腺組織および液中の酸性フォスファターゼ以外の抗
原の検出に使用できる抗血清を製造するため、雌ウサギ
に前立腺組織から単離された精製した前立腺抗原が注射
された。血清を集め、熱で不活性化し、そして使用まで
−２０’Ｃで貯蔵する。

不溶化した正常血漿タンパクで処理後（正常な血漿成分
に対する抗体を、該抗血清を正常な男性および女性大人
から得られたグルタルアルデヒドで不溶化した正常血漿
で処理して除去する）、該抗血清を二重免疫拡散法およ
びロケット免疫電気泳動技術を使用して特異的に前立腺
組織抽出液（４３／４３）と反応させる。前立腺以外の
組織から調製した抽出液の電池に対しては免疫反応性が
観察されなかった。前立腺抽出液からの前立腺抗原は、
ゲル口過クロマトグラフィー（分子量３０゜０００−４
０，０００）、等電集束（ｐＩ６．９）およびアガロー
ス電気泳動（ＭＲｏ、２．ウシ血清アルブミンに対して
）によって特徴付けられる。

前立腺抗原の濃度は、正常、良性肥大および悪性前立腺
＆１１ｔａから調製した抽出液間で著しく相違せず、そ
して該抗原は細胞化学的染色法により決定するとき、酸
性フォスファターゼ活性を示さなかった。さらにその大
概の分子ｆｆ１（３０，０００４０，０００）は、前立
腺酸性フォスファターゼの分子ｕ（ｌｏｏ、０００）と
著しく異なる。

血清中に検出された抗原は大きい見掛は分子量（８０，
０００−１００，０００）を持っていたが、抗原混合お
よびピーク増強実験は、環境中の前立腺抗原が前立腺組
織および前立Ｉｌｌ液中のヒト前立腺抗原と免疫学的に
同一であることを示す。

血清由来抗原は血漿タンパクと結合し得る。各種の抗原
およびホルモン様物質と血漿タンパクのこのような結合
は良く知られており、そしてＴ、ＰｅｔｅｒｓＪｒ、に
よって”Ｓｅｒｕｍ　ＡｌｂｕｌＩｌｉｎ”　Ｉｎ：　
Ｆ、　Ｗ、　Ｐｕｔｍａｎ（ｅｄ、）、　Ｔｈｅ　Ｐｌ
ａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ｖｏｌ、　ｌ　：　ｐ
ｐ、１３３−１３５＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、
　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　ｔ９７５によって
報告されている。しかしながらＰＰＤ−ＰＡＧＥは、前
立腺組織および精液葉中のものと同様に３６，０００の
分子量を明らかにした。

実験室内において農場動物から抗体を調製する慣用方法
の代りに、ＰＡに対する単クローン性抗体は公知のハイ
ブリドーマ細胞培養法を使用して調製することができる
。一般に、この方法は抗体産生融合細胞線、例えば骨ｌ
腫細胞の共存し得る連続線と融合した一次牌臓細胞をつ
くり、そして融合した細胞を大量培養により、または骨
髄腫細胞線がそれから誘導されたか、もしくはそれと共
存し得る動物種で成育させることを含む。このような抗
体は、高度に特異性で、そして感受性で、さらに免疫学
的に純粋であるので、動物の免疫化によって調製したも
のと比較して多くの利益を提供する。

現在この前立腺抗原の臨床応用の可能性は、それが腫瘍
特異性または病理学的連合を示さないのですべて知られ
ている訳ではない。しかしながらすべての前立腺ｌＩｉ
織中に存在する酸性フォスファターゼの場合のように、
この前立腺抗原は血清監視に際して存用な臨床上の情報
を提供する。われわれの研究室における最近の実験は、
ロケンｔ−免疫電気泳動および酵素結合イムノアッセイ
法により、ある前立腺ガン患者の血清中にこの前立腺抗
原が検出されるが、しかし正常な健康人または他のガン
患者の血清には検出されないことを示した。

その後の実験は、ＰＡは前立腺組織および前立腺起源の
確立した連続組織培養線の両方に組織学的に検出可能で
あり、そして生体内および試験管内の両方で前立腺腫瘍
細胞によって放出されることが示された。さらに前立腺
ガンに冒されている患者の血清中のＰＡレベルは前立腺
酸性フォスファターゼの血清レベルと関連がなく、その
ため循環するＰＡと循環する酸性フォスファターゼの同
時定型は、前立腺ガンの改良された診断手段をよく提供
し得ることが示された。ヒト前立腺抗原は前立腺の正常
成分の一つであるが、このように前立腺ガンの発見に大
きな役割を果たすことができる。

ヒト前立腺抗原に対する診断用抗体の製造に適当な免疫
原の調製のため、慣用のワクチン製造技術を使用するこ
とができる。好ましくは非抗原性のアジュバント、例え
ば明ばん、フロイントの完全アジュバント、サポニン、
第４級アンモニウム界面活性剤、アルキルアミン等が適
当な免疫学的に許容できる非抗原性の担体中で精製した
前立腺抗原と混合され、そして得られる混合物は、例え
ば口過によって滅菌することができる。

このワクチンは免疫沈澱性の抗体の産生を促進する他の
タンパクをもって免疫化するために既知の方法に従って
非経口的に投与することができ、好ましくは一次投与は
少なくとも一回の１ないし１０週間後の追加注射によっ
て補完される。良い成績はウサギに一次免疫の１ケ月後
２週間隔で４回の補完投与を使用して得られた。ウサギ
、ヤギおよび他の哺乳頚動物中の注射回数当りのタンパ
ク含量は変化し得るが、しかし一般に体重１　ｋｇ当り
タンパク約マイクログラムである。抗体は免疫化学の当
業者に良く知られた方法で採取し、処理することができ
、そして種々の免疫化学概作、例えば免疫沈澱法、螢光
抗体法、血清中和法などにおいて前立腺特異抗原の免疫
学的検出に有用な試薬を提供する。このような抗体は後
で詳述する前立腺ガンの診断試験において対照試薬とし
て有用である。

もっとも簡単な免疫沈降試験は、別々の抗体および抗原
溶液が毛細管中の共通の界面で反応することが許され、
そして該界面に沈澱の生成により陽性反応が示される、
毛細管沈降素試験を包含する。この方法は、界面を越え
て二つの溶液の避けられない拡散のため、比較的不感受
性で不正確であり、そしてさらに最終結果が保存できな
い。

寒天ゲル拡散はこれら欠点を避けるもっとも簡単な方法
である。抗原溶液（または血清サンプル）が連続する寒
天ゲルにバンチされた中央凹み中に置かれ、そしてそれ
に対する抗体（または対応して抗原）を含む血清の適当
な希釈液が中央凹みを同心的に囲む凹み中に入れられる
。陽性反応は一つまたはそれ以上の同心凹みと中央くぼ
みとの間の沈降素線によって記録される。この方法は比
較的不感受性で、かなりおそく、試験結果を読み取るの
に１ないし４日を要する。

ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）　、例えばラジオイ
ムノ沈降素試験は極めて感受性であるが（古い方法の数
倍のオーダー）、シかし実施に数日を要し、そして複雑
な設備を必ずしも広く得られない高度に訓練した人員を
必要とする。

向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）は、実施にわずか約１時
間はどを要し、そして寒天ゲル拡散法よりもかなり怒受
性の広く使用される免疫沈降素法である。反応成分は寒
天ゲル中にカットされた対立する凹み中に入れられ、小
さい電流がそれへ加えられ、抗原と抗体の両方が相手に
向って移動する。陽性反応は抗原−抗体界面において沈
降素の生成によって指示される。この試験法は合理的に
信頬でき、容易に実施でき、そして安価であるので、こ
れは本発明のこの局面の好ましい具体例を代表する。

免疫電気泳動試験の目的のため、本発明の診断用抗体製
剤は、精製することなく使用するときはその抗体力価に
応じ、体積比で１：１０ないし１：　５００でリン酸緩
衝食塩水によって一般に希釈される。この範囲の下限の
制限要因は、存在する総タンパク中の抗体含量の関数で
ある。沈降線中に達成される区別の程度である。精製し
た抗体製剤は勿論低い総タンパク濃度を有し、そして未
精製製剤さえもそのタンパク含量は使用する特定の免疫
化学的試験法に適合するように変えることができ、最ｉ
Ｉ！ｉ量は例えば簡単な連続的希釈液を試験して決定さ
れる。

本発明の好ましい別の局面において、循環するヒト前立
腺抗原は今や免疫化学的手法により、好ましくは抗体−
抗原沈降素複合体のタンパク染色によって検出すること
ができる。前述の特Ｗ的抗血清を使用し、それに慣用の
抗原−抗体複合体検出方法を組み合わせることにより今
や血清サンプルから特異的ヒト前立腺抗原を免疫化学的
に分離することが可能である。

この抗原−抗体複合体は、この方法の感度を上昇するた
め多数の公知の組織化学的染色法により、例えば螢光抗
体等により染色することができる。

その代り、定量のため放射性抗体を使用することができ
、それはより良い定量値を与えるばかりでなく、定量の
感度を上昇する。所望ならば、酵素結合イムノアッセイ
に使用するため、加藤らのＪ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、■虹
１５５４　（１９７６）記載の方法（その内容を参照と
じてこ−に取り入れる）に類似の方法を使用して、酵素
、例えばβ−ガラクトシグーゼまたはペルオキシダーゼ
を精製した抗体に結合することができる。特に好ましい
方法は栗山らのＣａｎｃｅｒ　Ｉ？ｅｓ、　４０；４６
５８（１９８０）であり、その内容を参照としてニーに
取り入れる。

これら抗体は酵素定量のため水不溶性支持体上に結合す
ることが好ましい。多数のそのような支持体およびそれ
へタンパクを結合する方法はこの分野で良く知られ、そ
して無機およびを機支持体を含む。目下好ましいのは、
例えばＡｘｅｎ　ｅｔ　ａｌの米国特許第３，６４５，
８５２号が教えるように、それへ抗体を共有結合する前
にハロゲン化シアン、好ましくは臭化シアンで活性化す
ることのできる水不溶性支持体である。該特許を参照と
してこ＼に取り入れる。このような支持体は市販されて
おり、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｉ、ａｂｉｒａｔｏｒｉ
ｅｓよりのＥｎｚｙｒａｏｂｅａｄｓがある。

さらに骨折りなしに、当業者はこれまでの説明を使用し
て、本発明をその全範囲にわたって使用することができ
るものと信じられる。以下の好ましい特定の具体例は、
そのため単に例示であり、開示の残部を少しも制限する
ものでないと解すべきである。以下の実施例において、
温度はことわりのない限り未補正の°Ｃであり、すべて
の部およびパーセントは重量による。

タンパク濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを使用
し、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅｒＩｌ、　１９３　：２６
５（１９５１）に記載のＬｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌの方法
によって測定した。酸性フォスファターゼ活性は、基質
としてα−ナフチルホスフェートを使用するＢａｂｓｏ
ｎおよびＰｈ１ｌｌｉｐｓ法で測定した。

免疫沈澱法は、Ｂ、　ｈｅｅｋｅ、　５ｃａｎｄ、Ｊ、
Ｉｍｒｓｕｎｏｌ。

（ＳｕｐｐｌｅＩＩｌｅｎｔｌ）　２：３７−４６（１
９７３）から改良した。ロケット−ＩＥＰはセルロース
アセテート膜上で、１、３　ｍ　Ｍ乳酸カルシウムおよ
び０，０２％アジ化ナトリウムを含む。０．０８　Ｍ　
ｌ−リス−０，０２４Ｍトリシン−０，０２４Ｍパルビ
タールナトリウム（ＴＴＢ級衝液）中の０．８３％アガ
ロース（Ｓｉｇｍａｌｏｗ　ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｎｄｏ
−ｏｓｍｏｓｉｓ）を使用して実施した。

各種最終濃度（０，５−２，０％）において抗血清をプ
レートへ流す前に５５゛Ｃでアガロース中へ加えた。ロ
ケット−ＪＥＰサンプルを円形くぼみ（５゜Ｏｍｍ）へ
入れ、そしてＴＴＢランニングｌ１ｍ液を用いて４°Ｃ
で一夜５ボルト／ｃｍで電気泳動した。

交差免疫電気集束は、ロケッｌ−−ｒＥＰと同様に、第
二の寸法で実施した。等集束したアクリルアミドゲル（
５Ｘ１００ｍｍ）をＪ、　Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍ　ｅｔａ
ｌ、、５ｃａｎｄｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（Ｓｕｐｐｌｍ
ｅｎＬ　２）４：１０７−１１３（１９７５）から変法
した免疫電気泳動の前に、抗体−アガロース中へ成形し
た。第一寸法の等集束は、２％両性電解質を含む７．５
％ポリアクリルアミド中、ｐ　Ｈ範囲４−８，２００ボ
ルトで一夜４　”Ｃで実施した。いくつかの実験では等
集束したゲルは酢酸セルロース膜の上に置き、１％アガ
ロースでカバーした。埋め込んだアクリルアミドゲルに
接近したみぞを切り、平行なみぞの中へ入れた抗血清を
２５°Ｃで２４−４８時間拡散することを許容し、そし
て得られる免疫沈降素を記録した。

交差免疫電気泳動（交差−ＩＥＰ）はロケット−ＩＥＰ
と同様に第二の寸法で実施した。第一寸法の電気泳動は
１％アガロースで実施し、そしてサンプル（四角形くぼ
み中７５μｌ）は１５ボルト／　ｃｎ＋で２時間４℃で
電気泳動した。移動をブロムフェノールブルー染料で監
視した。

使用した略号は以下のとおり。

ＰＢ−ＮａＣＩ、０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ　　含量０，
０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，２；ＩＥＰ、免疫電気泳動
；ＴＴＢ、０．３ｍＭ　　乳酸カルシウムと０．０２％
アジ化ナトリウム含有トリスートリシンーバルビタール
（０，０８Ｍ、　　０．０４２Ｍ、　　０．０２４　Ｍ
）緩衝液；ＭＲ，相対電気泳動移動度；ｐ１１等電点；
ｍ０ｗ、　、分子量 実施例１ 皿濁びｌ１■ ヒト前立腺組織（正常、良性肥大、ガン）および他のヒ
ト組織を剖検および外科手術中に得た。

各組織の組織学を病理学者によって確認した。約ｌｏｇ
の組織をミンチし、生理食塩水３０ｍ１で３回洗い、そ
して０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡジナトリウム塩−０
，１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）。

ｐ　Ｈ６，８と混合した。混合物を５ｏｒｖａｌｌ　Ｏ
ｍｎｉｍｉｘｃｒの氷水冷却混合室に入れ、そして間歇
的な冷却時間３分をもって羽根速度２５，０００ｒｐｍ
で５分間ブレンドした。ホモジネートを４°Ｃで一夜か
きまぜ、そして２５，０００ｇで３０分間遠心した。

生成する上清は粒組織抽出液を構成した。

実施例２ Ｕ支分■ プールした前立腺組織１００ｇを、前記のように３００
　ｍｌのＥＤＴＡ−ＰＢＳで抽出した。硫安（６０ｇ）
を粗抽出液２８５Ｉｄへ加え（３５％飽和）、３０分間
混合し、遠心（２６，０００ｇ３０分）した。得られた
上清２９５　ｍｌへ硫安３８ｇを加え（５５％飽和）、
３０分間混合し、遠心した。沈澱を５５％飽和硫安溶液
へ分散し、遠心した。沈澱の洗浄を２回繰り返し、次に
沈澱を２Ｑ　ｍｌｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８，
０へ溶解した。残りの硫安を４２のトリス−ＨＣｌ緩衝
液に対し４８時間透析し、緩衝液を透析中１回取り替え
て除去した。透析した溶液は透析中止じた沈澱を除去す
るため４６，０００ｇで３０分間遠心した。

実施例３ のイオン六　クロマトグラフィー 実施例２からの上清２８ｍ２を、あらかじめ０．ＯＩＭ
Ｉ−リス−ＨＣｌ緩衝液、ｐ　Ｈ８，０で平衡化したＤ
　Ｅ　Ａ　Ｅ　−ＢｉｏＧｅｌ　　Ａカラム（２，５Ｘ
９３ｃｍ）に適用した。カラムを最初４２０　ｔｔｄｌ
の緩衝液で洗い、次にＯ−０，２Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＩ　
　６度勾配（ミキサー中０．ＯＩＭトリスーＨＣｌ緩衝
液、ｐＨ８，０゜Ｉｆ容器中０．２Ｍ　　ＮａＣｌ　　
０．ＯＩＭ　　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，Ｉｆ）を
もって６．５ｍｆｌ／ｈ　ｒ　／　ｃ＋ａの流星におい
て溶出した。流出液を集め（１０＋ｙｊ！／分画）、そ
して前立腺抗原について監視した。各種のクロマトグラ
フィー分画中の前立腺抗原の存在の測定には、Ｔ、Ｍ、
Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ、　ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔ、　Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ　６１　　：１９３（１９７７）の方法を
使用した。全操作は４　’Ｃてだ行った。前立腺抗原含
有分画をプールし、そしてＵＭ２限外口過膜を用いたア
ミコン濃縮器を用いて４．５　ｄに濃縮した。

実施例４ 前立腺択互少ヱ止旦遇 濃縮溶液の一部＜４．３１ｄ）をあらかじめ０．０１Ｍ
トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８，０で平衡化したセファ
デックスＧ−１００カラム（２，５Ｘ１１０ＣＩＯ）に
適用し、同じ緩衝液で３．５　ｒｔｔｉ／　ｈ　ｒ　／
Ｃｌ１ｌの流量で溶出した。前立腺抗原を含有するプー
ルしたＤＡＥＡ−ＢｉｏＧｅｌ　　Ａ分画１００−１５
０は、セファデックスＧ−１００クロマトグラフイーに
かけるとき、いくつかのタンパクピークに分割された。

前立腺抗原は分画４６−５６中に発見された。再び前立
腺抗原反応性を示す分画はプールされ、そして３．８　
ｍｌに濃縮された。

実施例５ ゴ鬼　・−７のそれｐ上の　、Ｉ＋ 前立腺抗原を含有する上の分画は、あらかじめトリス−
ＨＣｌで平衡化されたセファデックスＧ−７５カラム（
２，５Ｘ　１１３ｃｍ）上に適用され、該カラムは５．
５　ｍｌｌ　ｈ　ｒ　／ｃｒｌの流量で溶出された。

これは前立腺抗原反応性に関係する大きな対称タンパク
ピーク−つと、二つの小さいタンパクピークとを与えた
。前立腺抗原を含有する分画を同じカラムで再度クロマ
トグラフすると、同じ対称タンパクビークが得られ、そ
して小さいタンパクピークは消失した。α−ナフチルホ
スフェートを基質として使用し、Ｂａｂｓｏｎ　ｅｔ　
ａｌ、、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｉｍ。

Ａｃｔａ　１と２６４−２６６（１９６６）の方法によ
って酸性フォスファターゼ活性を比色法および組織化学
的に測定した。このタンパクピークのクロマトグラフィ
ー分画には前立腺酸性フォスファターゼは検出されなか
った。

実施例６ ポリアクリルアミド″〜゛ アクリルアミドゲル（７，５％）カラム（５０×６０園
）を会社の指示マニュアル（Ｓｈａｎｄｏｎ　Ｓｏｕｔ
ｈｅＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｌｔｄ、、Ｃｈａｍｂ
ｅｒｌｅｙ、　５ｕｒｒｅｙ、　Ｅｎｇｌａｎｄに従っ
てｊＪｌ　％し、５０μｌのサンプルョ垢？容液中タン
パク１０−４０ｄｇ）を各ゲルカラムへ適用した。次に
１０％ショ糖溶液をサンプル溶液の上に注意深く層とし
て重ね、ゲルを含有するチューブの頂部へ０．　０　５
　Ｍ　）リス−グリシン緩衝液，ｐＨ８．５を重ねた。

トリス−グリシン緩衝液はショ糖溶液の調製に使用し、
また電解質として使用した。チューブ当り５ｍＡの一定
電流をもって４０分間電気泳動した後、ゲルをＣｏｏｍ
ａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ　Ｇ−２５０
−過塩素酸溶液をもってタンパクを染色した。

実施例７ ドデシル　　ナトリウム　ＳＤＳ　　ポリアクリル、　
Ｓ」」シΩ虹軌 この方法は実質上Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｏｓｂｏｒｎ，
　Ｊ．Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｎ＋．　皿４４０６（１９６９）の方法である。

２５０Ｉｆｆｉ宛のＳＤＳおよび２−メルカプトエタノ
ールを含む０．０５　Ｍ　）リス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ
８，５，５０ｍｌ中のサンプル（クンバク１０１０−２
０ｔｔを３７℃で２時間インキュベートした。インキュ
ベート後、サンプルを同容積の５０％ショ娠と混合し、
そして５０μ！を、前に記載したようにポリアクリルア
ミドゲル（０，１％ＳＤＳ含有）電気泳動にかけた。電
気泳動後、ゲルをエタノール−酢酸−水（４５：　ｌｏ
：４５ｖ／ｖ）中の０．５％（ｗ　／　ｖ　）　Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｒ＋Ｌ　ｂｌｕｅ　Ｇ−
２５０でタンパクを染色した。

実施例８ ポリアク１ルアミド゛ル″″ セファデックスＧ−７５クロマトグラフイーは前立腺抗
原の免疫学的反応性を示す対称タンパクピークを生成し
たが、実施例６および７の分析的ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動はこの製剤中にいくつかのタンパク成分を明
らかＧこした。従って調製的ポリアクリルアミド電気泳
動（ＰＡＧＥ）を前立腺抗原の精製にさらに用いた。

標本１ｄ（タンパク４．５■）を５０％（Ｗ／Ｖ）シー
Ｉυ９溶液と混合し、そして環状の７．５％ゲルカラム
（ゲルの断面積４．４ｃ＋ｉｌ、高さ９．２　ｃｍ　）
に適用し、その後１０％ショｔＪ！　２　ｄおよび０．
０５　Ｍ　ｌ−リスーグ’）　シンｍｊ３Ｖ７ｒｆ７．
．　　ｐ　Ｈ８，５ヲｌ＋ｌｆ（次ｆｆｉネタ。３０ｍ
Ａの一定電流を最初１時間逆電し、その後８０ｍＡとし
た。トリス−グリシン緩衝液を１４−１５　ｍｌ／　ｈ
　ｒ　／ｃｎ！の流星のカラムの底に位置する溶出プレ
ートの中へ連続的にポンプ送りし、カラムから出る物質
を分画コレクター中へ運んだ。最終精製した製剤である
前立腺抗原を含有する分画をプールし、０．５　ｄへ濃
縮した。前立腺抗原は分画２８−６２　（電気泳動後４
−９時間の間に得られる溶離液）中に発見された。これ
らの分画をプールし、分析的ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけるとき、多数のタンパクバンドがなお存在
した。しかしながら分ｉｉ！１ｉ５６−６２（電気泳動
の８、１−９．２時間の間）のプールすることにより、
分析的ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳＤＳポ
リアクリルアミド電気泳動において単一クンバクバンド
が得られた。

最終前立腺抗原製剤が純粋であることは、ドデシル硫酸
ナトリウムの存在および不存在下のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動において夾雑タンパクがない単一のタンパ
クバンドによって指示された。精製した前立腺抗原は、
下単位成分なしで、セファデックスＧ−７５ゲルロ適法
で３３，０００、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で３４，０００の分子量を
持つことが示された。等集束法は等電点６．９を明らか
にした。

実施例９ ）らの′″２、の　　゛−夏法 前出実施例で報告したＰＡの精製操作は少なくとも２週
間か＼す、そして前立腺組織１００ｇ当り精製Ｐ　Ａ　
Ｏ，５ｍｇ以下を得る。さらに精製の最終工程のために
、ポリアクリルアミドゲルカラムの苦心を要する製作お
よび特別の電気泳動装置が必要であり、そＵ７て操作中
溶出路のつまりのような問題がしばしば発生する。この
ｎ４易化された操作では、セファデックスＧ−７５クロ
マトグラフィーおよび短かいＤＥＡＥカラムへの通用の
省略のほかに、退屈な調製的ゲル電気泳動は簡単なりＥ
ＡＥカラムのｐＨ勾配溶出によって置き換えられた。精
製したＰＡの収率は前立腺Ｕ織１００ｇ当り１ないし２
ｍｇへ増加し、そして全体の操作は８ないし９日へ短縮
された。

良性肥大前立腺組織（約１００ｇ＞を、ホモジネートを
一夜でなくたった２時間かきまぜることを除いて実施例
Ｉ記載のようにＥＤＴＡジナトリウム−リン酸緩衝食塩
水で抽出した。粗抽出液を次に硫安（３０ないし５０％
飽和）による分画沈澱にかけた。沈澱を０．ＯＩＭｌ−
リス−ＨＣｌ緩衝？（Ｒ，ｐＨ７，８のＩＯないし１５
ｄに溶解し、同じ緩衝液４　ｍｌに対し、緩衝液を一回
交換して４８時間透析した。透析した物質を遠心しく４
６，０００ｇ、３０分）、そして上清（１２ないし１８
ｍｆ）をあらかじめ０．ＯＩＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液、
ｐＨ７，８で平衡化した２、　５　Ｘ　ｌ　５　ｃｍの
ＤＥＡ巳−ＢｒｏＧｅｌ　　Ａカラムに通用した。カラ
ムを同じ緩衝液のｊ”７３００　ｍｌで洗い、続いて０
．０８Ｍ　　ＮａＣＩ−０，０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩ｊ
ｊｉ液、ｐＨ１，８で溶出した。ＰＡを含有する分画を
プールし、濃縮しく５ないし５．５ｍＮ）、そしてあら
かじめＯ，ＯＩ　Ｍトリス−ｆ（ＣＩ緩衝液、ｐＨ１，
８で平衡化した２゜５Ｘ１００ｃｍセファデンクスＧ−
１００カラムにＪ川し、次に同じ緩衝液で５　ｍｌ／　
ｈ　ｒ　／ｃｒｌの流量において溶出した。ＰＡを含有
する２６，０００ないし３７，０００の分子量域をカバ
ーする分画をプールし、濃縮しく５ＩＩｄり、そしてあ
らかじめ０、ＯＩＭ）リス−ＨＣＩ　ｌｆｉ衝液、ｐＨ
７，８で平衡化した２、　５　Ｘ　２０ｃｏ＋Ｄ　ＥＡ
巳カラムへ通用した。

該カラムを同じ緩衝液１０滅で洗い、ｐＨ勾配溶ン疫（
ミキサー：０．ＯＩＭ）リス−ＨＣｌ、ｐ）ｒ７゜０．
３００ｄ、容器：Ｏ，ＯＩＭｌ−リス−ＨＣＩｐＪ（６
，０，５００ＩＩＩｌ）により、５　ｒｒｄｌ／　ｈ　
ｒ　／ｃｎｌの流量において溶出した。２番目のピーク
の分画がＰＡを含有し、それをプールし、：ａ縮した。

表１はこの簡略化操作による前立腺組織からのＰＡの典
型的精製の結果を要約する。硫安沈澱工犯ツマ七Ｉ＋１
カ亦１＋　Ｍ−１，Ｎ　Ｄ＾面菅泣八へ１．Ｎ９９表（
ヘエグロビンのような夾雑タンパクの大量が除去され、
それによりＰＡのその後の精製を容易化した。この研究
に使用した放射状免疫拡散は、改変したＭａｎｃｉｎｉ
　ｅＬ　ａｔ、　ｒｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　２：２３５
−２５４（１９６５）の方法であった。抗ＰＡ血清（１
００μ２）を１％アガロース溶液（０，１５４Ｍ　　Ｎ
ａＣｌ−０，０１７Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０中
）ｌＯｉｊ！と５５°Ｃで混合し、ペトリ皿（直径８．
３　ｃｍ　）中へ注いだ。次にアガロースゲル中にくぼ
み（直径２　ｃｍ　）をつくり、各くぼみへサンプル１
０μｌを加えた。

クロマトグラフィー分画中のＰＡを監視するため、−夜
の拡散が沈降素を明らかにするためには充分であり、Ｐ
Ａの定量には、拡散を４８時間継続させ、次いでゲルを
０．１５４　Ｍ食塩水で２日間洗い、そしてＣｏｏｍａ
ｓｓｉｅ　Ｂｒｉ目１ａｎｔＢｌｕｅ　Ｇ−２５０で染
色した。

（以下余白） 表」ニー見」−口　　七°からのｎ、の　１「工程　　
　総体積　総１７Ｒ９総”°　精製　回収率（ｍｌ　）
　　　　（ｍｇ　）　　　（ｍｇ　）　　倍数　（％）
（ａ） 粗抽出液　　　２５８．０　１？５４．４　２０．６　
１　　　１００硫安　　１３．８　２７８．８１０．０
３．１　４８．５（３０−５０χ） １回目　ＤＥＡＥ　　　５．５　　　８０．９　　７．
９　　８．３　　３８．３セフアゾ・ンクス　５．０　
　　９．３　　４．３　３９．４　　２０．９Ｇ−１０
０ ２回目　ＤＥＡＥ　　　５．０　　　１．５　　１．５
　８５．２　　７．３（ａ）　　良性肥大前立腺組織１
１８ｇより実施例１Ｏ ン　゛からの一原の　１１ 抽出工程を省略し、そして第二工程においてＰＡを３０
ないし７５％飽和の濃度において硫安で沈澱したことを
除き、実施例９の操作によってＰＡを２０ｍ１の精液漿
から精製した。結果を第２表に示す。

−２ヒト　ン將か゛の１１−原の　−′１工程　　　総
体積　総夕″゛′　　総′°　精製　回収率（ｄ　）　
　　　（ｍｇ　）　　　（ｍｇ　）　　倍数　（％）精
液漿　１６．２５９５．２　８．８　１　１００硫安　
　２０．０２６６．２　７．４　１．９　８４．１（３
０−７５χ） １回目ＤＥＡＥ５．３　　６１．０　　　５．７　　６
．３　　６４．８セフアデツクス６．４　　１２．８　
　　４．５　２３．８　　５１１−１００ ２回目ＤＥＡＥ　　　４．５　　１．５　　　１．５　
６７．６　　１７．０実施例１１ 光ヱ旦夾定 粗前立腺抽出液および抗原に陽性の患者の血清中の前立
腺抗原の大体の分子量を得るため、これらのサンプルを
セファデックスＧ−２００ゲルロ過クロマトグラフイー
へかけた。ロケット−ｒＥＰによって前立腺抗原陽性を
もって示した血清サンプル（０，５ｔｄ）、または前立
腺組繊抽出液（タンパク８　ｍｇを含む０．５　ｍｌ　
）をＰＢ−ＮａＣ１中のセフアゾ・ンクスＣ−２００ゲ
ルを充填したカラム（０，９Ｘ６０ｃｍ）へ適用した。

溶出したサンプルを２８０ｎｍにおける吸収について分
析し、そして前立腺抗原レベルをロケット−ＩＥＰによ
り、サンプルサイズ：　０．８　ｍｌ　；　溶出速度：
１０ｍ１／ｈｒ平衡化緩衝液：ＰＢ−ＮａＣ１（ｐＨ７
，２）；分画サイズ：　Ｑ、　８ｍｌを使用して測定し
た。前立腺組織抽出液中に示されたピークの抗原活性は
、３００００−４０，０００分子量の間に溶出された。

分子量参照マーカーは、ヒトイムノグロブリンＧ（１６
０，０００）、　ウシ血清アルブミン（６８０００）、
卵アルブミン（４３，０００）、　キモトリプシノーゲ
ンＡ（２５，０００）およびリボヌクレアーゼＡ（１３
，７００）を含んでいた。

ゲルロ適法で検討した抗原陽性患者血清においては、前
立腺抗原は８０，０００−１００，０００分子足の間に
単一の対称ピークとして溶出された実施例１２ バ血盪勿袈遣 雌ウサギを前に記載したように、Ｔ、Ｍ、Ｃｈｕ　ｅｔ
ａｌ、、ｌｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　ＩＪｒｏｌｏｇ
ｙ　１５：３１９−３２３（１９７Ｂ）の方法によって
、正常人前立腺組織の粗抽出液（抗血清Ｐ、のため）、
または上に記載したセファデンクスＧ−７５工程で得ら
れた精製前立腺抗原（抗血清ＰＩＴのため）をもって免
疫化した。血清を採集し、熱不活性化し、そして使用す
るまで一２０゛Ｃで貯蔵した。正常雌血清（Ｎ　Ｆ　Ｓ
　）または組織抽出液（タンパク１０ｍｇ／ｙＱ）によ
る抗血清の吸収をＴ、Ｍ、Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｓ６１　
：　１９３−２００　（１９７７）記載のように実施し
た。

実施例１３ に　して上　　せた　　゛の 牲 免疫電気泳動を９．５　Ｘ　１０．２　ｃｍアガＯ−ス
（Ｏ。

６５％、Ｗ／Ｖ）プレート上で実施した。バルビタール
緩衝液（ｐＨ８，２，イオン強度０．０４　）を電解質
として用い、そして一定した９０ボルトの電圧を１時間
通用した。電気泳動およびゲル拡散（２０時間）の後、
プレートを０．１５４　Ｍ食塩水をもって２日間洗い、
そして最初酸性フォスファターゼに対して０．１　Ｍ酢
酸アンモニウム中のα−ナフチルホスフェートーｆａｓ
ｔ　ｇａｒｎｅＬ　ＧＢＣ塩溶液により、次にタンパク
についてＣｏｏｍａｓｓａｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔｂ
ｌｕｅ　Ｇ−２５０−過塩素酸溶液により染色した。

正常な前立腺組織から調製した粗抽出液と、該正常前立
腺の粗抽出液に対して上昇させた抗血清、抗血清ＰＩｌ
の免疫電気泳動は、３本の沈降素アークを生じた。これ
らのアークの一つは、該抗血清を正常雌血゛漬（ＮＦＳ
−Ｐ＠）で吸収した後は消失するので、正常なヒト血清
成分によって生成したものである。各種の正常なヒト組
織抽出液（尿道、ぼうこう、心臓、肺臓、すい臓、骨、
腎臓、腸、肝臓およびひ臓、各１０−２０１１１ｇ／ｄ
）により抗血清ＮＦＳ−Ｐｌ＋の吸収は、残りの２本の
沈降素アークの除去に失敗し、そのうちの一つは、それ
がα−ナフチルホスフェートｆａｓｔ　ｇａｒｎｅｔ　
ＧＢＣ塩溶液によって染色されたので、前立腺酸性フォ
スファターゼであると同定された。他方の沈降素アーク
は酸性フォスファターゼ活性について染色されず、タン
パクであることが同定された前立腺）Ｊｌ繊織特異抗原
であることが示され、それはＩＥＰ分析においてβ−移
動度をもって移動した。正常ヒト前立腺の抽出液による
吸収は抗血清ＮＦＳＰａから反応性の抗体を除去し、そ
して両方の沈降素アークを消失した。さらにこの抗原は
正常前立腺２０検体中２０すべてに示され、そして同じ
結果は良性肥大組織抽出液（１５／１５）およびガン性
前立腺組織抽出液（８／８）についても得られた。これ
らのデータは、正常、良性肥大およびガン性前立腺は、
前立腺酸性フォスファターゼのほかに、前立腺組織特異
性抗原を含有することを示した。

実施例１４ した　）　　　に　して上　　せた　　゛の称異件 実施例１１の操作に従って、前立腺酸性フォスファター
ゼを欠いている精製した前立腺抗原製剤に対し上界させ
た抗血清ＰＩ７を使用し、追加の確認が提供された。正
常な大人男性および女性血清で吸収した抗血清Ｐｌ’ｌ
を使用するゲル拡ｆｉｔおよび免疫電気泳動の両者は、
前立腺抗原の単一の免疫沈澱を生じた。前立腺以外の組
織から調製した抽出液は、正常な女性血清で吸収した抗
血清ＰＩ？と反応しなかった。

実施例Ｉ５ および　゛　　）　　　　の　　　　　−血清起源抗原
が前立腺組織抽出液中に検出された抗原と免疫学的また
は生化学的特徴を共通にするかどうか決定するため、以
下の実験を実施した血清および前立腺組織抽出液のサン
プルを個々にそして両抗原ソースを合体直後にロケッ）
ＩＥＰにかけた。各実験において、サンプルは緩衝液希
釈を使用して同じ最終タンパク濃度に調節した。

典型的な実験は、患者の血清を収容する２個のサンプル
のくぼみ、前立腺組織抽出液を収容する２個のサンプル
のくぼみ、そしてピークの増強を示すための患者血清お
よび組織抽出液混合液を収容する２個のサンプルのくぼ
みを使用した。血清および組織抽出液は適当量の希釈用
緩衝液（ＰＢ−ＮａＣＩ）の使用により同一最終タンパ
ク濃度であった。すべてのサンプルは２５μ！で、０，
８３％アガロース中抗体重％、５ボルト／ｃｍ、４″Ｃ
において２時間実施した。すべてのサンプルは個々に検
査するとき単一の免疫沈澱を生じた。ピーク増強実験に
おける混合サンプルは、個々のサンプルのそれよりも大
きい高さの単一の反応を生成した。抗原陽性血清サンプ
ルおよび前立腺組繊抽出液を混合し、そして直ちに交差
−ｒＥＰにかけるとき、融合した免疫沈澱ピークが生じ
た。ピーク増強および免疫沈澱融合を示す定量的免疫電
気泳動の二つの方法は、Ｎ、Ｈ，ＡｘｅＩｓｏｎ　ｅｔ
　ａｌ、　５ｃａｎｄ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（Ｓｕｐｐｌｅｎ＋ｅｎｔ　１
）２：９ｌ−９４（１９７３）の方法により、それが組
織および血清中に存在するものとして、前立腺抗原の免
疫学的同一性を確認した。

組繊中に検出された前立腺抗血に関する結果は、正常、
良性肥大および悪性前立腺標本から調製した抽出液にも
当てはまり、前立腺抗原についてこれら抗原ソース間に
物理的相違（すなわちＭＲ。

ｐＨまたはｍ、　ｗ、　）は観察されず、そして良性お
よび悪性前立腺標本から調製した抽出液は、二重免疫拡
散法により抗前立豚抗原抗血清に対して試験するとき、
正常な前立腺と同一の免疫沈澱線を示すことを注意すべ
きである。ロケット−ｒＥＰ（表３）によって測定する
とき、これら抗原ソース間に抗原レベルの統計学的に有
意差が認められず、そして抗原レベルの広い変動（計算
した大きい標準差によって指示される）が試験した各カ
テゴリーのＭｉ織抽出液におこることが認められた。

ａ） 一ミ３　口１１自　　　１ン　の１立　−レベルｂ） ＪｌＬＪ比　　触麗■色芹＋Ｓ　Ｄ。

正　常（４）　　　　　　　　１４．３単位　（±８．
７）Ｃ） 良性肥大（８）　　　　　　　１８．４単位　（±２１
．３）ｃ）　　　　　　ｄ） 一次力ルチノーマ（８）　　　　１３．０単位　（±１
３．８　）ａ）各組織抽出液はロケット免疫電気泳動に
よる前立原線抗原の分析前に、タンパクＬｍｇ／／Ｉ１
１へ調節した。

ｂ）すべての組織標本は組繊化学的に確認した。

Ｃ）この実験においては、参照前立腺抽出液の抗原レベ
ルの１％を表わすように１単位を任意に選定した。参照
抽出液は希釈系列で定量し、そして実験的抽出液として
同じプレート上で使用した。

ｄ　）　５ｔｕｄｅｎｔのＬ−テストを使用して解析す
るとき、統計学的に有意差はこの群間て認められなかっ
た。

実施例１７ および　゛　　１　　　　の　　　　　−前立腺酸性フ
ォスファターゼは前立腺組織および精液中の両方に報告
されているので、われわれはＰＡが精液中にも存在する
かどうかを決定することを意図した。前立腺組織から単
離したＰＡに対し上界させた抗ＰＡ血清を、前立腺組織
の粗抽出液と、そして精液漿とに免疫拡散で反応させ、
前立腺組織中のＰＡと精液葉中のそれとの免疫学的同一
性を指示する融合した線を形成した。

前に記載した放射状免疫拡散操作により、精液葉中のＰ
Ａ濃度は０．４ないし１．８ｍｇ／ｍであることが認め
られ、他方前立膝組！８１ｇは、ＥＤＴＡジナトリウム
−リン酸緩衝食塩水（ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）で抽出し得る
ＰＡを０．１５ないし０．４５　ｍｇ含存していた。

実施例Ｉ８ 肛立腺違凰夏排撮学煎旦血止 前立腺中のＰＡの局在化およびＰＡの特異性は、１１ｅ
ｙｄｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｎｅｖｉｌｌｅ、　Ｊ、　Ｃ
ｌ１ｎ、　Ｐａｔｈ、　３０：１３８１４３（１９７７
）のイムノペルオキシダーゼが染色法によって検定され
た。新たに固定された前立腺組織の切片はキジロールの
２個交換によって脱パラフイン化され、エタノールの段
階系列によって再水和され、そして蒸留水で洗浄された
。７．５％Ｈ＝　０２による外因性ペルオキシダーゼの
阻害に続いて、抗ＰＡの反応性をウサギ抗ＰＡ血清をせ
って評価した。インキュベーションおよび洗浄後、組繊
片をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＴ−グロブリン
でさらにインキユヘートした。過剰の酵素標識第２抗体
を次に洗浄により除去し、Ｍｌ織片をペルオキシダーゼ
活性について染色−した。対照として、基質単独、基質
プラス複合体、あらかじめ免疫したウサギ血清、および
あらかじめ特異抗原で吸収した抗ＰＡを使用した。

染色は前立腺管エレメントよりなる上皮細胞中に限られ
ることが認められた。強い染色はこれら細胞の頂端細胞
質に認められたが、しかし細胞核には染色が見られなか
った。いくつかの管エレメント中に、陽性に染色する物
質が検査した切片中に観察された。特異性染色は支質お
よび脈管エレメントを含む他の細胞エレメントには観察
されなかった。同じ手法を用い、ＰＡはすい臓、結腸、
胃、肝臓、精のう、こう丸を含む他の臓’Ｊ５　Ｍｉ　
ｔａから得られた切片中には検出することができなかっ
た。同様な免疫組織化学的手法を用い、ＰＡは試験した
すべての一次的および転移前立腺しゅ瘍には認められた
が、しかし非前立腺ガンＭｉ繊中には認められなかった
。

実施例１９ れた　　　　　　　　の　１　　″　の悪性しゅ癌細胞
が長期間培養においてＰＡの表明を保有しているかどう
かを決定するため、３種の確立された前立腺細胞株（Ｌ
ＮＣａＰ、ＰＣ３およびＤｕ−１４５）をしらべた。こ
れらの細胞および他の非前立腺起源の培養細胞の抽出液
を１ｎｇＰＡ／ｍを検出することのできる前に述べた酵
素イムノアッセイ（ＥＩＡ）法によってＰＡの存在につ
いて分析した。

不動化面ＰＡはＣＮＢ　ｒ−活性化セファローズｌ　Ｂ
　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）を用いて調製した。反応混合物は５ｇのＣＮＢ　ｒ
−活性化セファローズおよび０．５Ｍ　　ＮａＣｌを含
む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）中のＩｇＧ（抗
ＰＡ）１３０ｍｇからなっていた。４°Ｃで１８時間イ
ンキュベーション後、粒子をホウ酸緩衝液で洗い、そし
て未反応基をブロックするため１Ｍエタノールアミン溶
液（ｐＨ９，０）で後処理した。共有結合した粒子はさ
らに洗浄し、ＰＢＳ中４°Ｃで貯蔵するＥＩＡのため、
抗原サンプルの１００μ２を５０倍希釈不動化抗体の３
００ｕｆと混合し、室温で３時間インキュベートした。

定量緩衝液（ＢＳＡ１％含有ＰＢＳ）１ｍｊｉを加えた
後、混合物を粒子の洗浄のため１．０００ｇで遠心した
。この操作を２回繰り返した。洗浄した粒子へ定量緩衝
液中のペルオキシダーゼＩｇＧ（抗ＰＡ）複合体１００
μｌを加えた。さらに室温で１８時間インキュベートし
た後、粒子を再び前述のように洗浄しそして存在する結
合ペルオキシダーゼ活性について定量した。反応混合物
は０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）中
ジアニシジン０．０８％およびＨ２０□０．００３％を
含有し、そして粒子と９０分間反応することを許された
。次に酵素反応をＩＮ　　ＭＣＩ　　１００μ！で止め
、そして４０３ｎｍにおける吸収を測定した。各実験は
既知前立腺抗原濃度の標準液を含んでいた。この定量操
作を使用し、■ないし２０ｎｇＰＡ／ｍｌの間で投与量
応答曲線の平行性が得られた。再試験する前、高レベル
の抗原を含有するサンプルを定ｆｆ１ｉｌ衝液で系列的
に希釈した。結果は前立腺ガンの２系統、ＬＮＣａＰお
よびＰＣ−３がＤｕ−１４５および他の検査した細胞系
統中のそれ（４ｎ　ｇ／ｍｌ以下）に比較して有意なＰ
Ａレベル（５０−７００ｎｇ／Ｉｎｆｌ）を含有してい
ることを示した。ＰＡは該抗原を産生ずる前立腺培養物
から誘導した調製した使用済培地にも存在した。

実施例２０ グロブリン　　に　する　　した 弾止 抗体特異性をさらに評価するため、われわれは培養した
細胞についてそれらの放射標識した抗体断片を特異性に
付着する能力を調べた。これらの実験には、前立腺（Ｌ
ＮＣａ　Ｐ）、結腸（ＨＴ２９）および胸（ＭＣＦ−７
）から誘導された細胞が含まれていた。免疫グロブリン
断片のＪ　型のため、ｒｇｃ、抗ＰＡおよびウサギのあ
らかじめ免疫した血清のサンプルを０．１　Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ４，０）中に溶解した。［ｇ０５０
ｍｇ毎に、結晶ペプシン１■を加え、そして反応混合物
を３７°Ｃで一夜インキユベートした。Ｆ（ａｂ’断片
をＰＢＳ緩衝液で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−
３００５−３００（Ｆａｒ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）上のゲル口過により、未反応ＩｇＧおよび小さいペ
プチドから分離した。

カラム（２，６Ｘ　７０ｃｍ）をＩｇＧ、ＢＳＡおよび
卵アルブミンからなる分子量標準品のクロマトグラフィ
ーによって較正した。単離したＦ（ａｂ’）断片はＡｍ
１ｃｏｎ　　Ｐ　Ｍ　　１０膜および陽圧を使用する限
外口過によって濃縮した。

Ｆ（ａｂ’）ｚＵｒ片のトレース標準化は固相ラクトペ
ルオキシダーゼグルコースオキシダーゼ（εｎｚｙｍｏ
ｂｅａｄｓ、　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）を使用して実施した。Ｉ　ｍｇのＦ　（ａ　ｂ　
’　）　２へＥｎｚｙｍｏｂｅａｄｓ５０μ１．Ｂ−Ｄ
−グルコース１％、０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７
，０）２００μ！、および担体不含有＋３１７または”
Ｊ　　ｌｍＣ１を加えた。

反応は室温で３０分間進行させた。未反応ヨー化物はセ
ファデックスＧ−２５上のゲル口過により標識したタン
パクから分離した。トレース標識したＦ（ａｂ”）２調
製物の比活性は０．６ないし０゜８μＣｉ／μｇの範囲
であった。

各くぼみが１．５ＸＩＯ６の細胞を収容する２４個のく
ぼみを有する培養皿に生育させた細胞を新しい培地中で
Ｉｚｓ（４５識Ｆ（ａｂ’）２（抗ＰＡ）およびＬｆｆ
ｌ　ｌ標識Ｆ（ａｂ’）ｚ（あらかじめ免疫）の対にな
った放射能標識混合物とインキュベートした。この混合
物は各核種について］、５ＸＩＯ５ｃｐｍを含有し、そ
して標準条件下で一夜培養した付着する細胞と反応を許
された。放射性摂取を測定するため、細胞を（ぼみから
かき取り、各放射性核種についてＰａｃｋａｒｄ自動Ｔ
−シン自動−シゴンカウンターでカウントする前に、Ｐ
ＢＳ中で３回洗浄した。特定の放射性核種の優先的摂取
を局在比＝　（細胞結合１２ｓ［細胞結合＋１１１）　
　、　　（添加ＩＺｓＪ添加１：１ＩＩ）として計算し
た。各細胞タイプについて特定局在比を計算し、そして
結果はＨＴ−２９またはＭＣＦ−７細胞に対してよりも
ＬＮＣａＰＮＣａ上る著しく高い抗体摂取を示した。

実施例２１ し　　　　による　鬼　　　の 無毛マウスに悪性しゅ瘍細胞の外からの移植が確立した
ときに、ＬＮＣａＰＮＣａ上れら動物の循環系中に検出
し得るレヘルのＰＡを放出した。

ｎ　ｕ　／　ｎ　ｕ対立形質のため同形接合性の先天性
無町腺無毛マウスをＲｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍ
ｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅにおいて、ＢＡＢＬ／
Ｃｎｕ／ｎｕ同形接合性誰と、ＢＡＬＢ／Ｃｔ／ｎｕ異
形接異形接合性交配して繁殖させた。

ＰＡ分析のため血清を得る前に、培養した細胞懸濁液を
注射することにより、ヒトしゅ瘍を無毛マウスに皮下的
に確立させた。このため細胞のＰＢＳで洗浄し、生育性
をカウントし、そして０．９％無菌ＮａＣｌ溶液中所望
濃度へ調節した。小形節形成後、無毛マウスの血清を後
眼球孔叢を切断することによって収集し、そして−２０
゛Ｃで貯蔵した。ヒトしゅ瘍移植の確立に使用した細胞
培養Ｔｈハ、ＬＮＣａＰ（前立腺のアデノカルチノーマ
）ＲＴ−４（ぼうこうの移行性細胞カル千ノーマ）。

Ｐａｌａｒｍｏ（悪性黒色しュ）、およびＡｓＰＣ−１
（すい臓力ルチノーマ）を含んでいた。

調べたヒトしゅ瘍のうち、ＬＮＣａＰＮＣａ系統だけが
ＰＡを循環系中に放出し、これは培養した細胞の定量か
ら得た結果と相関している。あらかじめＲＴ−４＄ｌＪ
胞、Ｐａｌａｒｍｏ　ＩＩＩ胞、またはＡｓＰＣ−１細
胞を移植された対照マウスはそれらの循環系中に検出し
得るＰＡを示さなかった。目下のところ血清抗原レベル
がしゅ瘍負荷と比例するかどうかは評価されていない。

この現象はヒト外来移植により放出される乳酸デヒドロ
ゲナーゼ酵素について、ε、　Ｊ、　Ｐｅ５ｃｅ　ｅｔ
　ａｌによりＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。

３７　：１９９８−２００３　（１９７７）に報告され
ている。もしそうであれば、ヒト前立腺しゅ瘍−無毛マ
ウス系は、ＰＡの検出と組み合わせて抗しゅ癌治療法の
効果およびヒト前立腺ガンのための生物学的反応改変剤
の効果を監視するための価値ある臨床的モデルを提供す
る。

実施例２２ 扱査拵称異件 ロケッｌ−−Ｉ　ＥＰ操作に必要な吸収された抗血清の
Ｑ通濃度は、変化する濃度の抗前立腺抗原抗血清を含有
するゲル中における前立腺抗原の移動を調べることによ
って決定された。各種の組繊の反応性はロケッ）ＩＥＰ
によって試験された。表４に示すように、正常な前立腺
、良性肥大および悪性前立腺組織から調製した抽出液は
反応性を示し、単一の免疫沈降反応を生成した。非前立
腺組織は、その性質が正常であろうと悪性であろうと、
免疫学的反応性を与えなかった。

（ａ） 表４　修力計Ｐ瀝１創Ｖ聾ユｌ」訃１点」ｌＬ　ｒ　　
　　’　”’−”門ｉ■肝臓　正常　　　０（０／２）
　　　Ｏ（０／１）ひ臓　正常　　　Ｑ（０／Ｉ）　　
０（０／ｌ）肺　　正常　　　０（０／１）　　Ｏ（０
／１）アデノカルチノーマ　０（０／１）　　　　０（
０／１）骨髄　正常　　　　　　０（０／１） ぼうこう　正　常　　　　　　０（０／ｌ）　　　　Ｏ
（０／１）胸　　正常　　　０（Ｑ／１） アデノカルチノーマ　０　（０１５） 腸　　正常　　　０（０／１）　　Ｏ（０／１）アデノ
カルチノーマ　Ｏ（０／１）　　　　Ｏ（０／ｌ）心臓
　正常　　　０（０／１）　　Ｏ（０／１）すい臓　ア
デノカルチノーマ　０（０／２）　　　　０（０／Ｉ）
腎臓　正常　　　０（０／１）　　０（０／１）脳皮質
　　正　常　　　　　　０（０／１）　　　　Ｏ（０／
１）前立腺　　正　常　　　　　１００（４／４）　　
　１００（２０／２０）良性肥大　　　　１００（８／
８）　　　１００（１５／１５）アデノカルチノーマ１
００（８／８）　　　１００（８／８）ａ）すべての組
織抽出物は分析物１０ｍｇタンパク／　ａｌｌへ調節し
た。

実施例２３ 葭販肚異立 前立腺抗原の可能性さる診断的価値を調べるため、正常
血漿タンパクに対する抗体を除去するため正常なヒト血
漿で処理した抗前立腺抗原抗血清を使用し、ロケッ）−
Ｉ　ＥＰ法によりその存在について血清サンプルを調べ
た（表５）。５５才以上の正常な大人健康人２０人と女
性ボランティア２０人から得た血清サンプルは、この分
析において抗血清に対して反応性を示さなかった。また
、肺、結腸、直腸、胃、すい臓、甲状腺、胸の悪性しゅ
瘍および骨髄しゅを持った患者を含む各種の進行した悪
性しゅ瘍を持った全部で１７５人の患者から血清を採取
した。非前立腺悪性しゅ傷を持つ患者から得られた血清
のすべては、ロケ・ンＦＩＥＰ法によって定量するとき
前立腺抗原陰性であった。しかしながら進行した前立腺
ガン患者からの検査した血清全部で２１９検体のうち、
１７すなわち８％が循環系中に前立腺抗原の存在を示し
た。前立腺抗原陽性反応を示すすべての血清はその後同
じ定量法にかけ、そしてこの試験の再現性は１００％で
あった。

ａ） ７°赫十ｍ骨組訂…購１ ・゛　１　　　　　　　　　−■性反疫％−−正常な大
人（男性および女性）　　　０　（０／２０）年令およ
び性別の一致した対称　　０　（０／２０）進行したガ
ン患者 肺カルチノーマ　　　　　　　　　　０　（０／８３）
甲状腺力ルチノーマ　　　　　　　Ｏ（０／１）結腸−
直腸力ルチノーマ　　　　　Ｏ（０／２２）胃−すい臓
力ルチノーマ　　　　　Ｏ（０／３／ｌ）胸カルチノー
マ　　　　　　　　　　Ｏ（０／３３）骨髄しゅ　　　
　　　　　　　　　　Ｏ（０／２）前立腺力ルチノーマ
　　　　　　　８（１７／２１９）ａ）すべての血清は
部分標本とし、必要時まで一２０°Ｃまたは一７０°Ｃ
で貯蔵した。すべての実験にサンプル量２５μｌを用い
た。

ｂ）すべての場合病理学的に確認した。

実施例２４ リンクイムノアンセイー 精製した前立腺特異抗原に対する■ｇＣ抗体、ワサビペ
ルオキシダーゼおよびＣＮＢ　ｒ活性化セファローズ４
Ｂを試薬として用い、前立腺抗原Ｏ１ｌｎｇ／ｌ１ｒ１
を検出することできるサンドインチ型（セファローズ４
Ｂ−抗前立腺抗原ｒｇｃ：前立腺抗原：抗前立腺抗原ｆ
ｇＧ−ペルオキシダーゼ）酵素リンクイムノアッセイを
検討した。調べた各種の正常および悪性しゅ瘍組織のう
ち、ヒト前立線Ｍｌ織だけが前立腺抗原を含有すること
を示した（正常前立腺ＩＯ±２１．９μ２前立腺抗原／
ｍｇタンパク、ｎ＝６；良性肥大１８：３±２９．５．
ｎ＝Ｉ２；ガン性前立腺１９．１±１５．３．ｎ＝１３
）前立腺抗原の循環レベルを同じ定量法で定量したが正
常な女性（ｎ＝１７）および女性ガン患者（ｎ＝２５）
からの血清中には前立腺抗原が検出できなかった。その
ほかの結果（ｎｇ／ｄ）は表６に示す。

表６　酵素リンクィムノアンセイ結果 工群ユ　−王且−Ｓ、　Ｄ、　　−１皿−ユ　α２．３
゜正常女性　　０．４７　　０．６６　０．１−２．６
　５１　　２非前立７１９！　　　０．５２　　０．６
２　０．１−３．０　９２　　３ガン女性 前立腺ガン 段階Ａ　　　８．００　　５．６４　２．８−１４　　
３　　３段階Ｂ　　　？、１５　　３．０５　４６−１
１　　　４　　４段１ｔｌ　　１０．５２　　１７．０
６　０．３−１００　４４　　３１段段階　　２２．８
４　　３０．９７　０．２−２７０　２５０　１９３Ｎ
、Ｓ。

０．０２ ｏ、ｏｏｉ Ｏ，００１ ０，００１ （Ｐ対正常女性は５ｔｕｄｅｎｔ　ｔテストによる。Ｎ
、Ｓ＝有意でない。） 前立腺ガン患者の血清からの前立腺抗原は精製し、そし
て正常な前立腺組繊からの前立腺抗原と免疫学的に同一
であることを示した。従ってこのデータは、正常前立腺
の組織タイプ特異性抗原であるけれども、こ−に記載す
る前立腺抗原は前立腺ガンの免疫学的検出に使用できる
ことを示している。

実施例２５ リンクイムノア　セイー　の Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４０：４６５８（１９８０）に
報告された感受性酵素イムノアッセイ法を用いて、前立
腺ガン患者の循環しているＰＡを臨床的に評価した。病
気の進行した段階（Ｄ２）にありそして化学療法を受け
ている９６人の患者には、患者の生存に関して前処理血
清ＰＡレベルは予後価値があることが見出された。１２
ケ月以上住存した患者（ｎ＝ＩＱ）は血清ＰＡレベル１
１．２ｎｇ／ｍ１±１２．７（平均±Ｓ、　　Ｄ、　）
を有し、５ケ月以内に死亡した患者（ｎ＝５９）は血清
ｐＦ（レベル２８．５±３１．９を示し、６−１１ケ月
生存した患者には１３．７±１８．２のレベルが認めら
れた。これらの患者のうち１９人を６ケ月以上２２０の
系列的ＦＡ定量により監視し、そしてＰＡレベルと臨床
的経過との間の臨床病理学的相関関係が１４人の患者（
７４％）に見られた。さらに前立腺ガンを局所化する治
療法を受けている３２人の患者の別のグループでは、１
６１の血清サンプルを１２ないし１１４週（平均５６週
）の期間中に分析した。これら患者のうち、５人は予後
期間中転移を発生し、そして全員病気再発の臨床的診断
の０−６８週前に上昇した血清ＰＡ値を示すことが判明
した。これら結果は、ＰＡが前立腺ガンの監視のための
有用な新いしマーカーであることを示す。

実施例２６ ハイブリドーマ　　　　の Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　皿１５４８−１５５０（１９
７９）に記載のＢａ１ｂ／ｃ起源の非分泌性骨髄しゅ細
胞系統を使用した。この系統Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３
は、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８生産γ−ＩＫタイプがら誘導され
る。

Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を１５％熱不活性化胎児
ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００　Ｕ／
ｍｌペニシリン、およびＩ　ＯＯＵ／ｍｌストレプトマ
イシンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改良したＥａｇｌ
ｅ培地（ＤＭＥＭ）中、１０％ＣＯ２／空気調湿インキ
ュベーター内で３７′ｃで保った。

雌Ｂｂｌｂ／ｃマウス（８−１０退会）に、前立腺抗原
（ＰＡ）をＩｎｖｅｓｔｇａｔｉｖｅ　Ｕｒｏｌｏｇｙ
　１７：１５９−１６３（１９７９）記載のように精製
したものを１０μｇ１日目に腹腔的注射した。３ないし
６週間後、マウスは無菌食塩水中１０μｇのＰＡの静注
を受けた。

融合実験に使用したすべてのマウスは、精製したＰＡに
対する二重免疫拡散法を使用して検出するとき、ＰＡに
対する血清抗体の存在を示した。

最後の免疫化後、免疫マウスから無菌的にひ臓を除去し
、ＤＭＥＭ−１５％ＦＢＳＩＯ＋ｄ！中に入れ、そして
カーブしたかん子ですり潰すことにより細胞懸澗液をつ
くった。凝集塊および膜断片を沈降させ、そして得られ
た単細胞を６００ｇ、１０分間の遠心によって１回洗っ
た。赤血球は０．８４％ＮＨ，ＣＩでインキュベートす
ることにより溶かし、そして細胞を洗浄し、Ｄ　Ｍ　Ｅ
　Ｍ中２Ｘ１０’細胞／−０の濃度で再懸濁した。骨髄
しゅ細胞は同（ｐに洗浄し、そしてＤＭＥＭ中２Ｘ１０
７細胞／ｍｌに調節した。ひ臓細胞３　ｍｆｌを骨髄し
ゅ細胞３　ｍｌへ加え、そして６００ｇＴ：１０分間共
粒状化し、そして培地を完全に除去した。融合のため、
細胞をゆっくりＤＭＥＭ中３０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチ
レングリコール（ＰＥＣ；）、平均分子量１　、０００
の１　ｒｔｒｆｌ中Ｇこｐ　Ｈ８，０で再懸濁した。試
験管を１分間ゆすり、そして６００ｇで６分間遠心した
。ＰＥＧへの全露出時間８分の後、上清を除き、そして
ＤＭＥＭＬＯｍｌを試験管を連続的に円形にがきまぜな
がらゆっくり加えた。細胞を次に６００ｇにおいて１０
分間遠心し、ＨＡＴ選別培地（ＤＭＥＭ−］、］６Ｘ１
０−’ＭチミジンｌＸｌ０−’Ｍヒボキサンチン、およ
びＩ　Ｘ　１０−’Ｍアミノプテリン含含有１亢 した。１ｍｌ量を多数くぼみ皿に４８くぼみ中に分注し
、そしてプレートを空気中ｌＯ％ＣＯ２の湿った雰囲気
中で３７°Ｃでインキュベートした。ヒポキサンチン／
チミジン（ＨＴ）培地を添加する２１日目まだ４日毎に
ＨＡＴ培地を補充した。くぼみが酸性になるとき（通常
融合後８−１２日）。

上清を抗体活性について試験した。陽性抗体反応を示し
たくぼみからの交雑細胞のサンプルを希釈を制限するこ
とによりクローンし、そして同じくぼみからのいくらか
の細胞を２ＸＩＯ−’細胞が得られたまで２５ｃ＋１１
のＭｉ職培養フラスコへ移し、それを液体窒素中１０％
ジメチルスルホキシド−９０％ＦＢＳ中に凍結した。

実施令２７ 、へ４　７’　ＩＪ　）’ニ１１１１ｂ１則融合上清を
抗ＰＡ抗体について固相酵素イムノアッセイによってス
クリーンした。使い捨て９６くぼみマイクロタイタープ
レートを固相吸収表面として使用した。くぼみをポリー
Ｌーリジンスクシ茅−ト（０．　２　５　ｍｇ／ｍ１Ｈ
ｚｏ　）　　１　０　０　ｍｌでみたし、２３゛Ｃで１
５分間インキュベートした。ＰＢ−ＮａＣｌ，ｐＨ７。

２（５０ｍＭリン酸ナトリウム：１４０ｍＭ塩化ナトリ
ウム）で３回洗った後精製したＰＡｌｏｏｍｌをｌ０ｍ
Ｍ炭酸塩緩衝液。

ｐ　Ｈ　９．　６中５０μｇ　／　ｔｄの濃度で加えた
。３７°Ｃで２４時間インキュベーション後、ＰＢＮａ
Ｃ暖衝液中１％（　ｗ　／　ｖ　）のウシ血清アルブミ
ン溶液を３７゛Ｃでさらに３時間で加えた。

抗体スクリーニングアッセイを実施する前に、マイクロ
タイターくぼみをＰＢ−ＮａＣＩ緩衝液（２００μ２）
を用いて３回洗った。試験すべき培養物液（１００μり
を個々のくぼみへ加え、そして３７°Ｃで３時間インキ
ュベートし、その後ＰＢ−ＮａＣＩ緩衝液で３回洗った
。その後でＪ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．門Ｈｈｏｄｓ　１釘
３０５−３１０（１９７７）に記載の方法によって調製
したペルオキシダーゼを結合したマウスＩｇに対する抗
血清１００μｌを各くぼみへ加え、そして３７゛Ｃで３
時間インキュベートした。ＰＢ−ＮａＣＩで３回洗った
後、０−ジアニシジン０．０８％：Ｈ２０□Ｏ．　Ｏ　
Ｏ　３％ニリン酸ナトリウム０．０１Ｍを含有する５’
ｌ溶液，ｐＨ６。

０を使用して酵素活性を測定した。酵素反応はＩＮ　　
ＭＣＩ　　２５ｕｌを使用して２３°Ｃで６０分後に停
止した。

各定量において、陽性対照サンプルが含まれ、そして精
製ＰＡに対して上昇させた系列的に希釈した高免疫マウ
ス血清からなっていた。Ｐ３×６３Ａｇ８培養物（ｒｌ
−ガッパ）および非経口非分泌性骨髄しゅ系統からの組
繊培養上清を陰性対照として用いた。このスクリーニン
グ定量は［ｇＧ．ＩｇＭおよびＩｇＡクラスの免疫グロ
ブリンを検出する。

実施令２８ ハイプリードマ　　のクローニング 所望の骨髄しゅ交雑株をクローニング効率を上昇するた
め腹腔大食細胞の存在下、希釈を制限することによりク
ローンした。交雑細胞を９６くぼみ培養皿に、ＤＭＥＭ
−１５％ＦＢＳ完全培地中０．５細胞／くぼみの密度で
プレートした。８−１２日後激しい発育が観察され、そ
のとき上清を単一コロニーを示すくぼみから試験した。

抗体活性を示す培養物をこの方法で集団均一性を確かめ
るために再クローンした。

腹腔大食細胞は、Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの腹腔を水冷した
無菌０．３４　Ｍショ糖５　ｍｌで洗い流すことによっ
て調製した。大食細胞の高収率（５−１５Ｘ１０’／マ
ウス）を得るため、動物は細胞採取４日前に無菌チオグ
リコレート培地０．５　ｍの腹腔的注射を受けた。大食
細胞は６００ｇで５分間遠心することによって１回洗浄
され、そして組織培養培地中に１０”／ｄで再懸濁され
た。各ＩＪＩｔａ培養くぼみは大食細胞懸濁液１００μ
２を受けた。こ＼に記載したハイブリドーは、アメリカ
合衆国メリーランド州２０８５０、ロックビルのアメリ
カン、タイプ、カルチャー、コレクションに寄託され、
そしてＡＴＣＣＮｏ、Ｉ（Ｂ２Ｏ２１と命名された。

実施例２９ 一クローン　、−の　−＋１ 使用済培養液からの単クローン性抗体を、ウサギ抗マウ
スｆｇ：セフ７０−ズ４Ｂゲルマトリックス（Ｒ−αＭ
１ｇ：セファローズ）による免疫アフィニテークロマト
グラフィーを使用して精製した。Ｒ−αＭ１ｇ：セファ
ローズ２０Ｉｄをクロマトグラフィーカラム（１，５Ｘ
３０ｃｍ）に充填し、ＰＢ−ＮａＣＩ緩衝液で平衡化し
た。培養液のサンプルをカラム中をゆっくり通過させ（
５ｍｌ／ｈｒ＞。

そして０．１　Ｍグリシン：ＩＭ　　ＮａＣ１，ｐＨ９
゜０の１００ｄによる溶出により非特異性反応成分を除
去した。反応性タンパクを次に４Ｍ　　ＫＳＣＮ　：　
０．　ＯＩ　Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２の３ベツ
ド星で溶出した。透析した物質を陽圧限外口過を用いて
濃縮した。

実施例３０ したハイブリドーマ　　　の ｒｇ　（Ｒ−αＭＩｇ）２００１１ｇを臭化シアン活１
’ｌ　化セファローズ４８５ｇへ結合することによりア
フィニティーマトリックスを調製し、マウスＩ［Ｇ　（
Ｈ＋Ｌ）に対するウサギ、抗血清のＩｇＧ分画をＪ、　
ｒｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ長：３０５−３１０
（１９７７）記載のりパノール法によって調製した。結
合は製造者（Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａ
ｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、）から提供された指針に従い、重炭
酸塩緩衝液中ｐ　Ｈ８，０で実施した。学ばした抗ＰＡ
抗体のクラスおよびサブクラスは、ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ１．　　夏ｇＧ２ａ、１ｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３．ＩｇＭ
、抗−におよび抗−λ鎖を用い、０．６％アガロース中
の二重免疫拡散によって決定した。

もっとも激しい生育する培養物９６からの上清を固相酵
素イムノアッセイを用いて、ＰＡに対する抗体活性につ
いて２系列でスクリーンした。結果は、培養物の約４％
（４／９６）は最初から抗体陽性であることを示した。

これら培養物を再定澄するとき、一つのハイブリドーマ
（Ｆ５−Ａ−１／２２）は陽性を保った。この培養物を
腹腔大食細胞上で希釈を制限することによりクローンし
、そして巨視的に単一生育コロニーを示す３０の培養物
を得た。陽性培養物の一つを再クローンし、そしてそれ
から誘導された培養物全部を抗体陽性であった。これら
細胞（クローンＦ５−Ａ−１／２２．８．１３．Ｃ１，
８，１３，という）を大量培養に拡大し、そして抗体含
量について調べた（表７）。この実験のための陽性対照
として、■ｇＧＩカッパ型免疫グロブリンを産生ずるこ
とが既知の、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８細胞からの培養液を使用
した。該Ｐ３ｘ６３Ａｇ８株の細胞は約１２μｇ／ｄの
単離された免疫グロブリンを産生じ、それはＩｇＧ１お
よびに一鎖へ特異性の抗血清に対し反応性であった。（
表８）。他のグロブリンサブクラス抗血清試薬では沈澱
が発生しなかった。

抗ＰＡ活性に示すＣ１，８，１３からの培養液は、Ｒ−
αＭ１ｇ：セファローズ精製を使用する単離された物質
約１０μｇ　／　ｍｌを含有していた。この単離物はＩ
ｇＭ　　Ｋ−タイプサブクラスのマウス免疫グロブリン
であることが同定された（表８）。

この製剤は抗血清の他のサブクラスに対しては沈澱せず
、単離した免疫グロブリン製剤の単クローン性を示した
。

表７　　Ｒ−αＭＡ　：セファローズ４Ｂクロマト号＋
子ナテ圭件に立垂９ｏ−７＝（７）７１ｇ収量　μｇ１
ｇ＃＋ｊ！ 吸着体へ適用し　　　　ｂ） 賠−１−劣　　た旦止孜」ぺＬ　　ユ亘り一　培悶斂−
Ｐ３　Ｘ　６ａ八ｇ８　　　　　　　　　　　　１２５
　　　　　　　　　　１．６　　　　　　　　１３Ｆ５
−八−１／２２．８．１３　　　　　　３　０　０　　
　　　　　　３．　１　　　　　　　１　０ａ）清澄化
した培養液を記載したＲ−αＭ１ｇ：セファローズ４Ｂ
吸着体を通した。ゲルをＩＭＮａＣＩ　　ｐＨ９，ｏで
２８０ｎｍの吸収がヘースラインに達するまで（０，０
２００，Ｄ、単位）洗った。

ｂ）Ｒ−αＭ１ｇ−反応性物質を４Ｍ　　ＫＳＣＨの解
離条件下で溶出した。単離されたＩｇの収率は光学密度
測定によって決定し、そこではマウスｒｇｃｔ％（Ｗ／
Ｖ）溶液は吸光率１４を示した。

７°　″１１劣奮冒゛（アペづ・−−・・しぢ畳ｔ′）
７配信２′、＝１５′ 十　　　　　　　　　　　　　　− Ｒ−α−１ｇＣＩ Ｒ−αｒ　ｇＧ２　ａ Ｒ−αＩｇＧ２ｂ Ｒ−αＩ　ｇＧ３ Ｒ−αに鎖　　　　　　　　＋　　　　　　　　　＋Ｒ
−αλ鎖 Ｒ−αＩ　ｇＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　＋以上の実施例は一般的にまたは具体的に記載された
試薬および／または実施例中に具体的に用いた本発明の
作業条件で置き換えることにより、同じような成功度を
もって反復することができる。

以上の記載から本発明の関係する分野における熟練者は
その必須の特徴を容易に確かめることができ、そして本
発明の精神と範囲から逸脱することなく、それを各種の
用途および条件に適応させるために各種の改変および変
更を加えることができる。

竜】」Ｊ冴旧１庄 本明細書および実施例から理解されるように、本発明の
いくつかの局面において産業上有用である。この前立腺
抗原は正常産生物であるけれども、それは他の分別する
細胞産生物、例えば前立腺酸性フォスファターゼおよび
サイロカルシトニンのようにを用な悪性しゅ瘍マーカー
のように見える。

前立腺抗原抗血清の特異性は未知の一次起源をもった単
離した転移中の悪性しゅ瘍細胞の同定を可能にする。さ
らに腺の発達中の前立腺組織の抗原間の正常分別の表明
と、前立腺病変とにおける変動の研究は、前立腺細胞の
生育調節の現象と転移可能性の予見を特徴する

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、正常およびガン性前立腺組織中に発生しそして分析
   的ポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電集束にお
   いて単一タンパクバンドを示すように精製されたヒト前
   立腺特異性抗原に対するモノクロナール抗体の免疫化学
   的に有効な濃度および量を含む試験管内組成物にして、
   前記抗原はセファデックスＧ−７５ゲルロ過により測定
   するとき約３４，０００の分子量をサブユニットなしで
   有し、そして６．９の等電点ｐＩを有し、前記抗原はま
   た過塩素酸に不溶であり、前記組成物はヒト前立腺酸性
   フォスファターゼに対する抗体を含まないことを特徴と
   する前記組成物。 ２、前記モノクロナール抗体は、 （ａ）抗体産生細胞と、 （ｂ）融合したハイブリドーマ中に免疫グロブリンの均
   一集団を産生し得る骨髄しゅ細胞とより実質的に構成さ
   れた融合した細胞ハイブリッドによって産生される第１
   項の組成物。 ３、前記融合した細胞ハイブリッドはＡＴＣＣ　ＨＢ８
   ０５１である第２項の組成物。