JPH05506241A - ３５ｋｄ腫瘍関連タンパク質抗原および免疫複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３５ｋＤ腫瘍関連タンパク質抗原および免疫複合体及豆旦亙１ 種々の刊行物を本出願で引用した。これらの刊行物は本発明をより十分に説明す るために参考として本出願に組み込まれる。

本発明は認可番号ＣＡ　３００１９、ＣＡ　１２５８２、およびＣＡ　２９６０ ５の援助を受けた。米国政府は本発明に権利を有する。

インビボでの新生物転換の後、細胞が生化学的および形態学的に変化することが 動物モデルで数多く記録されている。

そのような悪性転換された新生物細胞は十分な数がある場合、続いて生きた癌細 胞が接種された同系動物における腫瘍発育を抑制するＦｉ御免疫を誘導し得る。

この防御免疫は、新生物細胞により発現される１、儂瘍特異的移植抗原と呼ばれ るある新規な細胞成分のためであると決定された。

悪性細胞による同様な独特の成分の発現は腫瘍免疫学が基礎とする、根元をなす 仮説である。今日では、新生物転換が哺乳類細胞表面上の抗原の変化と関連があ るという概念を明らかに支持する、実質的な確信的な証拠がある（Ｒｅｉｓｆｅ ｌｄ　ＲＡおよびＣｈｅｒｅｓｈ　ＤＡ：　Ａｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　４０：３２ ３−３７７、１９８７）　。ヒトの膿瘍細胞上での発現が少なくとも増大してい ると思われる細胞表面抗原の多くの群を特定するために、種々の血清学的が方法 が行われた（Ｏｌｄ　ＬＪ：　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　４１：３６１−３７５， １９８１；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ＳＡ、　（ｅｄ、）　Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ　Ａ ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ＣａｎｃｅｒＡｎｔｉｇｅｎｓ、　Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８０．）　ｏ　／’イブ リドーマ技術の到来は、ヒト腫瘍の細胞表面抗原の研究に役立つ高度に特異的で あり再現性のある試薬を提供した。

モノクローナル抗体により特定された多くの抗原は塘タンパク質であると判明し た（Ｌｉａｏ　ＳＫら、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　３０：５７３−５８０．　 １１８２．　Ｌｏｏｐ　ＳＭら、　Ｊｎｅ　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　２７：７７５− ７８１．　１９８１゜Ｍｆｔｃｈｅｌｌ　ＫＦら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａ ｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７：７２８７−７２９１゜１９１１０、Ｗｏｏｄｂｕｒ ｙ　ＲＧら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７：２１ｇ３ −２１８７、１９８０）。不ズミのモノクローナル抗体を利用して、多数の他の メラノーマ関連抗原が記載されている（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　ＫＦら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７７：７２８？−７２９１，１９８０ ；ｆｏｏｄｂｕｒｙ　ＲＧら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、Ｓｅｔ、。ＵＳ Ａ、７７：２１８３−２１８７、　１９８０ＨＤｉｐｐｏｌｄ　ＷＧら、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　７７：６１１４−６１１８．　１ ９８０ＨＣｈｅｒｅｓｈ　ＤＡら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

、ＵＳＡ、８１：５７６７−５７７１．　１９８４；　Ｐｕｋｅｌ　ＣＳら、Ｊ 、Ｅｘｐ、Ｍａｄ、、ＩＳ５：１１３３−１１４７．　１９８２；　Ｙｅｈ　Ｍ Ｙら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　２９：２６９−２７５、１９８２）。これら の抗原の多くが、異種間系での交叉反応により特定された。ネズミのモノクロー ナル抗体が、強い種−特異的抗原のみを最もしばしば特定することは明らかであ る。

よって、悪性細胞の制御されない増殖におそらく最も決定的に関与していると思 われる腫瘍細胞表面でのわずかな変性が検出されないかもしれない。

ネズミモノクローナル抗体により特定された抗原がヒト官主において免疫原性で あるという証拠はない。よって、異物として認識されヒトにおいて免疫原性であ る腫瘍関連抗原は、特に重要であり、また癌の制御並びに同様に診断および／ま たは治療の試薬としても不可欠であり得る。

ヒト新生物中の自己および同種異系の抗体により検出された腫瘍関連抗原は、そ の分布において広範に変化し得る。いくつかの腫瘍関連抗原は、個々のＩＩｌ瘍 細胞系または腫瘍によってのみ発現される。その他は、組織学的に類似した膿瘍 によって発現され、さらに他は、腫瘍が生じる臓器および胎児組織を含む、組織 学的に異なる種々の癌によって発現される。

個々の腫瘍によってのみ発現される抗原は癌の免疫診断および治療においてその 重要性が制限されている。なぜなら腫瘍細胞系は一般に全ての腫瘍からは確立さ れ得ず、また他の患者には適用され得ないからである。対照的に、組織学に同じ タイプである異なる腫瘍に、または組織学的に異なる腫瘍に共通する腫瘍抗原に は、種々の悪性疾患を患っている異なる患者の免疫診断、免疫予後判定、および 治療に応用される可能性がある。

抗原を有するｍａｒ、ｍ胞を用いて能動免疫処置を行うことにより、ヒトの新生 物増殖に対する免疫が増強され得る事例が数多く記録されている。そのような能 動Ｆ？異的免疫治療の百的は、新生物の増殖によって自然に誘導されるレベルを 越えて抗腫瘍免疫を増強することである。増殖する新生物は宿主細胞内で、それ が有する膿瘍関連抗原に対する最大免疫応答を誘導しないと考えられている。ヒ ト腫瘍関連抗原の単離および精製についての進歩が遅いため、これまでほとんど の免疫治療の試みが腫瘍細胞全体から調製されたワクチンを用いている。生きて いる自己の腫瘍細胞は接種部位においてａＳ増殖を引き起こす可能性があるため 、そのようなワクチンのヒトへの使用は抑制されてきた。しかし、高レベルでの 共通の腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞は、異なる患者を免疫するのに用いられ 得る（　Ｍｏｒｔｏｎ、　Ｄ、　Ｌ、ら、Ｉｎ　Ｔａｒｒｙ、　Ｗ、Ｄ、、　Ｒ 。

ｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、Ａ、　（ｅｄｓ）：　１ｍ１Ｉｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｏ ｆ　Ｉｌｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　 Ｎｏｒｔｈ■ｏｌｌａｎｄ、　ｐｐ２４５−２４９（１９８２）：　Ｌｉｖｉｎ ｇｓｔｏｎ　Ｐ、０．ら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３１：５６７（１９ ８３））　。そのような同種異系ワクチンを用いる利点には２点ある：（１）同 種異系のワクチン接種した腫瘍細胞上にある異物のＨＬＡ移植抗原に対　′して 誘導された免疫応答は、それらの拒絶を生じるであろうこと；（２）この免疫処 置が、抗原に対してヒト白血球抗原（ＨＬＡ）がヘルパーとして機能して、共通 した交叉反応性の腫瘍関連抗原に対する強い免疫応答を誘導するであろうこと。

約４０％のメラノーマ血清が、メラノーマ細胞系の部分的に精製された使用済培 地に存在する抗原に対する抗体を含有することが示された（Ｇｕｐｔａら、ＪＮ Ｃｌ　６３：３４７−３５６（１９７９））　ｏ続けてこの抗原をメラノーマ細 胞系の使用済培地から部分的に精製した。解離しない条件下、勾配ポリアクリル アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析により、抗原は約４５０ｋＤの複合体であ ることが判明し、これは、ＳＤＳ　（ＰＡＧＥ）分析を解離条件下で行うと、ク ーマシーブルーで染色される少なくとも５つの帯に分離した。６０から７０ｋＤ の範囲のこれらの帯の１つか２つは、同種異系血清に存在する抗体と反応した。

この抗原は、胎児組織との交叉反応性のため、胎児抗原（ＦＡ）と命名された（ Ｇｕｐｔａ　ＲＫおよびＭｏｒｔｏｎ　ＤＬ：　ＪＮＣＩ：Ｔｏ：９９３−１０ ０３（１９８３））　。癌および癌でない血清中のこの抗原に対する抗体の発生 率は高かった（５６−８８％）。抗原はメラノーマ、感層、肉層、並びにヒト胎 児肝臓および脳に幅広く発現するが、癌でない患者から得た正常組織にはまれに しか発現しないようである。部分的に精製された抗原調製物の免疫化学的な特徴 付けから、この抗原は糖タンパク質であることが示唆された。ヒト抗血清により 認識されるエピトープは熱に安定であり、分子の免疫応答性部分は抗原複合体分 子の炭水化物部分であった。

明らかに、さらに追加のｆｌ！瘍関連抗原を同定することは、特に抗原が腫瘍細 胞にかなり大きな割合で存在するが正常細胞にはない時は、癌の診断および治療 に極めて重要となる。

本発明はｍｓ関連抗原を提供することによりその要望に答えるものである。胎児 抗原（ＦＡ）の研究に関連して開発されたこの抗原は、新規な腫瘍関連抗原であ る。

１豆立！１ 本発明は、ヒト癌の免疫診断、免疫予後判定、および治療に用いられ得る、膿瘍 関連抗原の単離および特徴付けを提供するものである。本抗原は分子量が約３５ ｋＤのタン、＜り質分子である。本抗原は癌。去者の血清中に検出されている。

象！旦星亙ユ皿皿 図１は抗原特異的免疫複合体の予後分析を示す。直線はメラノーマ患者の一連の 分析に対する１次直線回帰を表し、大多数の患者において最大結合に対するパー セントの増加が示されている。２４人の患者が再発した。これらの患者の内１８ 人が臨床上の再発の前またはその時点で最大結合に対するパーセントが上昇して いた。

λ豆座１皿ユ翌里 本出願に用いられているｒ　３５ｋＤタンパク質」とは細胞表面上にまたはこれ らの細胞の培養培地に他の分子と共に凝集物として存在し得る、腫瘍細胞によっ て産生されるタンパク質を指す。タンパク質自体は、免疫複合体の形態で癌患者 の血清に存在し得る。ネズミモノクローナル抗体、ＭＡｂは、特異的にこの分子 上のエピトープを認識する。この分子は、癌患者のその他の体液においても見つ けられ得る。３５ｋＤタンパク質はまた、本質的な免疫学的特徴を変えないタン パク質に対する任意の改変をも含む。よって、３５ｋＤタンパク質にはタンパク 質の免疫原性断片が含まれる。

本出願に用いられている「実質的に精製された」とは天然の環境下でタンパク質 に随伴している汚染を実質的に有さないことを意味する。

本出願に用いられている「特異的に結合する」とは試薬が３５ｋＤタンパク質に 、このタンパク質を検出し、および他の所望でないタンパク質と区別するために 十分なアフイニテイで、結合することを意味する。約１０８または１０７より大 きいアフイニテイが好ましい。

本発明は新規な３ＳｋＤｆｆｌ＊関連抗原を提供する。ＪＳＩと命名されたネズ ミモノクローナル抗体（ＭＡｂ　ＪＳＩ）を用いて免疫アフィニティークロマト グラフィーにより、３５ｋＤタンパク質を主要な正常血清タンパク質から分離し た。よって本発明は、ＭＡ・　ｂ　ＪＳＩこより認識される新規なエピトープを も提供する。ネズミモノクローナル抗体は、メラノーマ細胞系の使用済培地の部 分的に精製された両分を眉いて開発した。この画分は６Ｏ−７０ｋＤの胎児抗原 （ＦＡ）を含有していた。３５ｋＤのサブユニット上および胎児抗原（ＦＡ）上 の、ＭＡｂ　ＪＳＩにより認識されるエピトープの分子サイズおよび化学的性質 に基づくと、これら２つの成分は異なっている。その違いは、プロテアーゼによ る３５ｋＤ分子の処理がＭＡｂ　ＪＳＩとの反応性を著しく消失させるが胎児抗 原（ＦＡ）の反応性には作用しないことにより示された。よって、３５ｋＤ分子 の反応性部分はタンパク質であり、一方胎児抗原（ＦＡ）の反応性部分は炭水化 物である。しかしβ−ガラクトシダーゼまたはヒアルロニダーゼを用いた処理は 、使用済培地の部分的に！ＩＩ製された画分における胎児抗原（ＦＡ）活性を完 全に消失させた。

ハイブゾドーマ上清を免疫に用いた物質、即ちメラノーマ細胞系の使用済培地の 部分的にＩ製した両分に対してスクリーニングすることにより、腫瘍関連タンパ ク質に特異性を宵する数個の抗体産生クローンを同定することが可能であった。

しかし１つのクローンＭＡｂ　ＪＳＩだけが抗体を産生じ続けた。このＭＡｂは 、正常個体または自己免疫疾患患者の血清よりも癌患者の血清において非常に高 い頻度で発生するタンパク質エピトープを認識する。よって、このネズミモノク ローナル抗体はヒト癌の免疫診断および免疫予後判定に有用である。

本発明は、メラノーマ細胞によって産生された、また癌患者の循環血中に存在す る、ＳＤＳポリアクリアミドゲル電気泳動で還元および分離した後の分子量が約 ３５ｋＤである実質的に精製された抗原タンパク質を提供する。このタンパク質 には特異的にＭＡｂ　ＪＳＩが結合する。　３５ｋＤタンパク質は７５％の再発 疾患のメラノーマ患者の血清中で検出されたが、見かけ上正常な個体の血清から はほとんど検出されなかった（５％）。

罹病患者の体液からの３ＳｋＤ抗原を試薬と接触させることにより、体液の所定 量当りの抗原量を同等な試料の予め測定された量と比較することができる。抗原 の変動は悪性腫瘍の状態の変化を示す。よって、悪性腫瘍をモニターすることは 、罹病患者の体液を何度もアッセイして、体液中に存在する３５ｋＤタンパク質 の量を測定する過程のことを意味する。

アッセイは患者の治療の早い時期に、並びに最中および治療後に行われ得る。最 初、３５ｋＤタンパク質抗原レベルはかなり高いかもしれないが、このことは抗 原の高いターンオーバーまたは脱落を示す。しかし、治療および例えばワクチン 接種による腫瘍細胞の増眉の抑制後、患者の体液のレベルは減少し得る。

本発明は被検者の試料から３５ｋＤタンパク質の存在を検出する工程を包含する 、被検者の癌を検出する方法を提供する。

その検出方法には、３　ＳｋＤタンパク質抗原を試薬と結合させる工程、および その試薬を検出する工程を包含する。検出方法の一例では３５ｋＤタンパク質抗 原が第２試薬により直接的または間接的に結合される。試薬は好ましくは抗体で あるが、適切であればどのような試薬でもよい。

免疫原性の断片を包含する３５ｋＤタンパク質および製薬的に容認し得るキャリ アを含有するワクチンが、３５ｋＤタン７４り質に対する抗体または細胞媒介性 免疫を誘導または増強するために提供される。加えて、３５ｋＤタンパク質を有 する腫瘍細胞そのものが、ワクチンとして有用であり得る。ワクチンは、癌にか かっている被検者において、分子量が３５ｋＤのタンパク質と反応する抗体の産 生を誘導または増強し得る。その方法には被検者にワクチンの有効量を接種する 工程を包含する。

本発明における被検者は、通常ヒトであるが、他の動物でも適用し得る。ワクチ ン接種後に個体で産生された抗体は癌、例えばメラノーマを抑制または治療する 。癌の抑制とは腫瘍細胞を細胞の増殖を防御し得る試薬と接触させて、腫瘍の細 胞の死滅および大きさの減少をもたらす能力を指す。あるいは、抑制とは、腫瘍 細胞に対する直接的な細胞障害効果の意味を含む。

加えて、本発明は３５ｋＤタンパク質腫瘍関連抗原と反応する抗体と反応する試 薬を得る方法を提供する。これらの試薬は、問題の抗原の内部イメージを育する 抗イデオタイブ抗体であり得る。イデオタイブは抗体結合部位の抗原決定基であ るので、抗イデオタイブ抗体は抗原の抗原性エピトープを模擬する。本発明は被 検者に抗イデオタイブ抗体の治療量を注入する工程を包含する免疫治療の方法を 提供する。治療量は、膿瘍細胞の増殖抑制、または細胞障害の効果が得られる任 意の量であり、容易に当業者により決定され得る。

３５ｋＤタンパク質が１１瘍細胞膜に付随するという発見により、腫瘍細胞膜に 付随する３５ｋＤタンパク質と反応する腫瘍抑制試薬を被検者に注入する工程を 包含する、被検者でこの抗原を発現する腫瘍を治療する方法が示される。試薬は 抗体または細胞増殖抑制性または細胞障害性の薬剤に付けられた抗体であり得る 。細胞増殖抑制性または細胞障害性の薬剤は、例えばトキシン、放射性樟識され た成分、および化学療法用薬剤から選択され得る。本発明はさらに、腫瘍細胞を それと特異的に反応する試薬と接触させる工程、および結合した試薬を検出する 工程を包含する、例えば生検から得られるような膿瘍細胞上に３５ｋＤタンパク 質を検出する方法を提供する。そのような検出は、当業者に周知の適切な手段で 行われ得る。

３５ｋｌンバク質をフードする核酸およびそのコードする核酸と選択的にハイブ リダイズし得る核酸プローブもまた提供される。コードする核酸は３５ｋＤタン パク質上の抗原性部分をコードし得る。加えて、核酸は抗イデオタイブ抗体上の 抗原性配列に相当し得る。

被検者の腫瘍をインビボで検出する方法もまた提供される。

その方法は、被検者に腫瘍細胞表面上の３５ｋＤタンパク質と反応する試薬、例 えば抗体を注入する工程、３５ｋＤタンパク質と反応する試薬の存在を検出する ことにより腫瘍を検出する工程を包含する。この腫瘍は、例えばメラノーマ、肉 腫、または癌腫であり得る。

さらに本発明は、αまたはγインターフェロンを用いて、まｌ＝は他の生物学的 反応修飾因子、例えばレチノイン酸を用いて癌細胞のタンパク質の発現を増強す る工程、３５ｋＤタンパク質をそれと特異的に反応する試薬と接触させる工程、 およびその試薬の存在を検出する工程を包含する、低レベルの３５ｋＤタンパク 質を検出する方法を提供する。抗癌剤としてのインターフェロンの使用は現在集 中的に研究されている。γインターフェロンは、感作されたリンパ球が特異的抗 原で刺激された時に産生される。インターフェロンは、注射により被検者に投与 され得る。γインターフェロンは、いくつかの遺伝子の発現を、誘導、増強、ま たは抑制することが示された。

これら誘導された遺伝子のうちには、Ａ、Ｂ、およびＣを含むＨＬＡ遺伝子があ る。ＨＬＡ遺伝子の発現は、特定の細胞が免疫システムにより、より容易に認識 され明らかにされることを可能にする。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものでは ない。

実施例Ｉ ネズミモノクローナルｒ　の　： 抗原画分は化学組成の明確な無血清培地での増殖に適合するように改変されたメ ラノーマ細胞系ＵＣＬＡ−３ｏ−Ｍ１４（Ｍ１４）の使用済培地から、部分的に 精製した。使用済培地の回収および調製の詳細はすでに記載されている（Ｇｕｐ ｔａ、　Ｒ，に、およびＭａｒｔｏｎ　Ｄ、Ｌ、、Ｊ！Ｉｃ１７０：９９３−１ ００３　（１９８３））　Ｏ簡単に述べれば、使用済培地を濃縮し、１００ｋＤ の排他制限を有する膜を通して限外濾過を行った。膜上に残留した物質をセファ ロース６Ｂカラムでクロマトグラフィーにかけて、抗原画分をクロロホルム：メ タノール（２：１）の比率で抽出した。水相の物質は胎児抗原（ＦＡ）および他 のタンパク質成分を含有していた。

６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｅマウスを、１日目、８８目および２ＯＥＩ目に、前述の ように単離して部分的に精製した抗原画分（６μｇ／ｍ１）を１００μｍ用いて 腹膜内に免疫した。最終免疫処置から７日目にマウスの膵臓を摘出した。感作さ れた肺細胞を５Ｐ２１０ネズミ骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）と７：１ （リンパ球：骨髄腫）の比率で混合して、ＯｌおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　（ Ｏ４および■ｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、Ｉｎ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｍａｔｔｅｒｓ 　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｄ、Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌおよび Ｓ、Ｍ、　Ｓｈｉｊｉｌｇ、　ｐ、　３５１−３７２．　（１９８０））の記載 のように、４０％のポリエチレングリコールＬ５０Ｑで融合した。融合した細胞 を、５Ｘ　１０’ＪＢ胞／ウエルの濃度で９６ウエルミクロ培養プレートに移し て、２週間■ＡＴ（ヒポ牛サンチン、アミノプテリン、チミジン）培地で培養し て、リンパ球−骨髄腫ハイブリッド細胞を選択した。

コンフルーエンドになったらハイブリドーマを部分的に精製された抗原調製物に 対する抗体の存在についてスクリーニングした。部分的に精製された抗原調製物 に対する抗体の存在がスクリーンにかけた結果陽性とでたハイブリドーマを少な くとも４回限界希釈法によりクローン化して、プリスチンでプライムしたマウス で大量に産生させた。抗体のサブタイプを市販のプレート（にａｌｌｅｓｔａｄ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｈａｓｋａ、　ＭＮ）上で免疫拡散法により 決定した。

実施例Ｉ＋ ３５ｋＤ　ンバク　る　Ａ ることへのＪＳＩモノクロ−ル　の１　：Ｅｎｇｖａｌ　ｌおよびＰｅｒｌｍａ ｎｎにより開発された技術（ＩＩ！ｎｇｖａｌｌおよびＰｅｒｌｍａｎｎ、　Ｊ 、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　ｆ０９：１２９−１３５．（１９７２））を、ヒト血清 中に抗原特異的循環血中免疫複合体を検出するように適合させた。ＭＡｂ　ＪＳ Ｉ　（５−１０ｍｇ／ｍｌ）をプリンチンでプライムしたマウスの腹水から得て 、６０％の（Ｍｎ２）２　ＳＯ４で沈澱させることにより部分的に精製した。９ ６ウ工ル１ｍ１ｕ　Ｉｏｎマイクロタイタープレート　（Ｄｙｎａｔｅｃｂ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ、　Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ）を、使用前に０． ０１の炭酸塩緩衝液（＋）Ｈ９，６）で１００倍に希釈した１００μｌ　（５０ −１００μｇ／ｍｌ）の部分精製ＭＡｂ　ＪＳＩ腹水液で、４℃で１６時間イン キュベートして感作した。ウェルを空にし、０．ＩＳＭのＮａＣｌおよび０．０ ５％のＴｗｅｅｎ　２０　（ＰＢＳ／Ｔ）を補った０、　２５Ｍのリン酸ナトリ ウム緩衝液で３回洗浄して、ＰＢＳ／Ｔ中の１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｏｒｐ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）の１００μＩで１０分間２６ ℃でブロックした。血清（１：２００の希釈度で１００μｌ）をウェルに分配し て、３７℃で１時間インキュベートした。全ての試料は３試行で行った。固定化 したマウスＩｇとの交叉反応の可能性を最小限にするため、血清をマウス血清の １％溶液で希釈した。ヒｌ−１ｇを含有する免疫複合体と固定化したモノクロナ ール抗体との結合を、基質としての１０％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９， ８）中のｐ−ニトロフェニルフォスフェート（１ｍｇ／ｍｌ）と共にアルカリ性 ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏｒｐ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ　ＭＯ）に結 合させた１：４００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出した。室温でイ ンキュベーションした後、各ウェルにおける発色をマルチスキャン（Ｆｌｏｗ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　［ｎｇｌｅｗｏｏｄ、　ＣＡ）で４０５　ａｍで 読み取り、ＯＤ読み取りが約１゜０に発色した陽性対照血清と比較した。結果を 最大結合に対するパーセントで表し、これは以下のように計算した：最大結合に 対するパーセント”　（ＯＤｓｓｍｏｌｅ−ＯＤｓｓ９／　ＯＤａｏｎｔｒ。ｌ −０ＤＮＳＩＩ）　Ｘ１００．ここでＮＳＢは非特異的バックグラウンド結合の ことである。ロジスティック回帰分析を行い、カットオフとなる最大結合に対す るパーセントをめて、メラノーマ患者から得た血清と他の個体集団から得た血清 とを分別した。正常血清とメラノーマ患者の血清を調べた結果、最大結合に対す るパーセントが１５．５％を越えれば抗原特異的ＩＣの存在は陽性であると決定 した。

ア、セイ　の アッセイ間の変動およびサントイフチアッセイの再現性を、様々なレベルでモノ クローナル抗体と結合する、メラノーマ患者からの９個の血清試料を試験して決 定した。これらの試料を等分して冷凍し、３つの異なる機会に実験した。加えて 、９個の血清試料を冷凍および解凍した後に調べた。選択された血清試料はＳつ の異なるポリスチレンプレートで、３つの異なる機会に試験した。ゆがんだ分布 であるため、最大結合に対するパーセントの自然対数変換を使用して分散分析（ ＡＮＯＶＡ）を行った。表１はこれらのアッセイの結果をまとめたものである。

値は最大結合に対するパーセントの自然対数変換の平均値を表す。ＡＮＯＶＡ分 析により、得た結果の付加的効果は、用いたプレートもしくはアッセイが行われ た時間（ｐ＝０．９９）からも、または用いたプレー）　（ｐ＝０．９７）もし くはアッセイが行われた時間（ｐ・０．３４）のみからも認められなかった。い （らかの変動が結果より、特に時間に関して認められたが、結合率が１５．５％ であるなら抗原特異的免疫複合体の存在を陽性であるとみなすと、最大結合に対 するパーセントの平均の１つの標準偏差内でのこれらの反応の一致は８９％であ った（９中８の血清試料）。

（以下余白） 表」− サンドイッチアッセイで用いたＥＬＩＳＡプレート、およびアッセイが行われた 時間の結果に与える影響をめるための、アブセイ間の変動に対するＡＮＯＶＡア ッセイ。値は、所定の日、および所定のプレートで試験された全試料についての 最大結合に対するパーセントの自然対数の平均値を表す。用いたプレートまたは アッセイが行われた時間の、いずれによっても結果に大きな影響はない。

！　２．４４　２．５１　２．９６　２．５５２　２．６８　２．３４　２．８ ７　２．６３プレート３　２，５６　２．７０　２．８７　２．７１４　２．６ ３　２．５８　２．７７　２．６６５　２．４３　２．５２　２．７６　２．５ ８合計　２．５５　２．５３　２．７９　２．６２日およびプレートの付加的影 響（ｐ＝０．９９９１）日の影響を考慮しないプレートの影響（ｐ−０，９７２ ７）プレートの影響を考慮しない日の影響（ｐｒｏ、　３４０９）実施例Ｉ目 メラノーマ中　の　゛かパの ３５ｋＤ　ンバク　の　１および　′　・け：免疫アフィニティーカラム（１， ５ｘ　１５ｃｍ）を部分的に精製した硫酸アンモニウム沈澱させたＭＡｂ　ＪＳ Ｉを用いて調製した。ＭＡｂ　ＪＳＩ　（５０ｍｇ）を１時間、室温でｍ−過ヨ ウ素ナトリウム（ＮａＩＯ３）で酸化させた。１時間酸化させた直後に、Ｅｃｏ ｎｏ−Ｐａｃ　１０　ＤＧの脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ 、　ＣＡ）を通すことにより、過ヨウ素ナトリウムをＩｇＧ溶液から取り除いた 。脱塩後、酸化させたＭＡｂをＡｆｆｉ−ゲルＨｚヒドラジドゲル（２５ｍ１） 　（Ｂｔｏ＝Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）に添加して、結合用緩衝液 （１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ５，５）中で２４時 間室温で上下回転振盪させながら結合させた。結合後、ゲルを梱包して、０゜Ｉ Ｍのリン酸緩衝液（ＰＢＳ、　０．５Ｍ　ＮａＣ＋）で洗浄した。サンドイッチ ＥＬＩＳＡにおいて抗原特異的循環血中免疫複合体に対して陽性と出た患者血清 の３ｍｌを室温でカラムに供した。溶出液が２８０ｒｖで０．０５未満に減少す るまで、カラムをＰＢＳ　（ｐｉｌｌ　７．２）で洗浄した。抗原特異的免疫複 合体を酸性緩衝液（０，２Ｍグリシン−ＩＴｃＩ　ｐ［Ｉ　２．５．　Ｏ，Ｌ　 Ｍ酢酸、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３，０，０，５Ｍギ酸）で溶出さ せた。画分をｐＨ３，０で、次いでＩＭのＴｒｉｓ、■Ｃ１，ｐＩＩＩ　９．０ で中和させて調べた。各画分をＩ）Ｅ１３．０およびｐＨ８，ｏの両方でサンド イッチＥＬＩＳＡにて抗原特異的免疫複合体の存在を分析した。抗原活性は溶出 画分に限定されていた。この物質をさらに抗原の生化学的特徴を決定するために 使用した。

パか゛のアフィニティー　ｒ　の　および執による皿 アガロースベッドの上に固定化されたトリプシンおよびプロテアーゼを入手して （Ｓｉｇｍａ　Ｃａｒｐ、、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）　、プロトコール に従い調製した。アフィニティー単離抗原のうち５００μ１（ｔｓｏμｇのタン パク質）を酵素（１単位）にさらして、１時間４°Ｃで上下回転振盪させながら 混合した。ジェタノールアミンでブロックした臭化シアンアガロースビーズを対 照として用いて、これにアフィニティー単離抗原の当量を混合した。混合物を７ ０００ｘ　ｇで１０分間遠心分離して、トリプシンおよびプロテアーゼ処理され た抗原を含有する上清を、標準的な酵素リンク免疫吸着アッセイのための、９６ ウ工ルＩｍｍｕｌｏｎポリスチレンプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　’ＩＡ）を感作するのに使用した。モノ クローナル抗体との反応性を、アルカリ性ホスファターゼに結合させたヤギ抗マ ウス■ｇＧを用いて測定した。

実施例ＩＶ メラノーマ　か゛の３５ｋＤ　ンバク の　−イゼート　： 前述のようにメラノーマ細胞（Ｍ１４）を、１０％のウシ胎児血清を補ったＲＰ ＭＩ　１６４０中で増殖させた。細胞を攪拌して採取し、使用するまで栓をして 一４０℃で保存した。冷凍細胞を解凍して、水冷のＴｒｉｓ／生理食塩水／アジ 化物（ＴＳＡ）緩衝液（０，００２Ｍ　Ｔｒｉｓ、ＨＣｌ、ｐＨ８，０，０，１ ４Ｍ　ＮａＣ１，０，０２５％ＮａＮ３　０．５％Ｔｒｉｔ。

ｎ　Ｘ−１００，０，５％デオキシコール酸ナトリウム）中に１：５容積の保存 細胞対ＴＳＡで懸濁した。等量の冷たいリシス用緩衝液（ＴＳＡ中、２％　Ｔｒ ｉｔｏｎ　Ｘ−１００，５ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭフェニルメチルスル ホニルフルオライド）を細胞に１：１の容積比率で添加した。混合物を１時間４ ℃で上下回転振盪した。

混合物を４０００　Ｘ　ｇで１０分間遠心分離して上清をデカンテーションした 。膜抗原を５％のデオキシコール酸ナトリウムを添加して精製し、２時間１５０ ．ＯＯＯｘｇで遠心分離した。上清を実収して、研究に用いるまで４℃で保存し た。

ライゼートか゛の　のアフ　ニティー アフィニティー力ラムを前述のように調製して、１０カラム容量の洗浄用緩衝液 （０，１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ＣＩ、　０．１４　Ｍ　ＭａＣｌ、　Ｑ、０２５ＸＮａ Ｎ３．　ｐＨ８，０）で洗浄し、引き続いて５カラム容量の各ｐＨ８、（３オヨ びｐＨ，ＱのＴｒｆ　ｓ緩衝液並びにトリエタノールアミン溶液（５０ｉＭ）リ エタノール７ミン、０．１％　丁ｒｆｔｏｎ　Ｘ−１００，０，５Ｍ　ＭａＣｌ ンで洗浄した。膜ライゼートをカラムに供して、順次１０カラム容量の洗浄用緩 衝液、各５カラム容量のＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８，０）および５カラム容量のＴ ｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９，０）を用いて溶出させた。抗原をトリエタノールアミン 溶液で溶出させて、画分の中和のためにＩＭのｔｒｉｓ、Ｉ（Ｃ１，ｐＨ６，７ を含有する画分に実収した。

ポリアクリルアミドゲル　′ Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５　（１ ９７０）の方法を使用して、抗原を単離し、ＭＡｂ　ＪＳ［のモノクローナル性 を決定した。

簡単に述べれば、タンパク質を１％の硫酸ドデシルナトリウＡ　（ＳＤＳ）の存 在下で溶解し、２−メルカプトエタノールの存在下で１分間１００℃で加熱して 、Ｐｒｏｔｅａｎ　ｌ　Ｉ　ミニゲル電気泳動装置（旧ｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｅｈ ｍｏｎｄ、　ＣＡ）の１２％のポリアクリルアミドゲルに供した。トラッキング 染料がゲルを渡りきるまで２００ボルトでゲルを流した。タンパク質の存在をク ーマシーブルー染色することにより決定した。帯を摘出し、細かく切り刻んだ。

これらをリン酸緩衝生理食塩水（０，５Ｍ　ＮａＣｌ　ＰＢＳ）中に再懸濁する ことにより抗原をゲル画分から抽出した。混合物を１（１、ＯＯＯＸｇで１０分 間遠心分離してゲル断片を取り除き、上清を９６ウエル【Ｉ１ｍｕｌｏｎマイク ａタイタープレートを感作するのに用いた。ＭＡｂ　ＪＳ＋との反応性を、アル カリ性ホスファターゼに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧを用いて、上述のように 標準的ＥＬＩＳＡで決定した。反応性は３５ｋＤ領域の帯に限られていた。

実施例■ メラノーマ　の　・な　°　の　： 大量の血清バンクを利用することにより、多数の患者について抗原特異的ＩＣの 存在をサンドイッチアッセイで決定する連続的な研究が可能となった。図１はそ の結果をまとめたものである。病気を再発した患者における抗原特異的ＩＣには 明らかな上昇がある。対照的に再発性メラ／−マを有する抗原特異的１ｃの存在 が陰性であった患者には、決して抗原特異的Ｉｃが現れなかった。このアッセイ はＩＣを検出するため、これらのレベルは単に抗原の存在に影響されるだけでな く、抗体の存在および循環血中からＩＣのクリアランスにも影響される。

よって、頻繁な間隔で抗原レベルを定量することにより、改良されたマーカが提 供される。興味深いのは、患者の焼入かは明らかに臨床的に腫瘍はないと診断さ れたが、抗原特異的ＩＣレベルは彼らの操作コース終了後を通じて上昇を続けた という事実である。研究の結果は、メラ／−マが再発した患者のうち約７５％が 臨床的再発時点または以前に抗原特異的ＩＣの存在に対して陽性であることを示 している。

本発明を現在の好適な実施態様で説明してきたが、本発明は本発明の精神を逸脱 しない範囲内で様々に改変し得ると理解すべきである。従って、本発明は特許請 求の範囲によってのみ限定される。

ＦＩＧ、　１ 追跡、月鍛 要約書 本発明は、ヒト癌の免疫診断、免疫予後判定、および治療に用いら得る腫瘍関連 抗原の単離および特徴付けを提供するものである。本抗原はＳＤＳポリアクリル アミドゲル電気泳動による還元および分離後の分子量が約３５ｋＤのタンパク質 分子である。本細胞膜関連抗原はメラノーマ細胞の使用済培地から精製される。

本抗原は癌患者の血清中に検出されている。

、−、−、、−＝、、　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０２６３８、−　＝−ｍ＋＋＋＋ ＋＋＋ｉ＋ＩＩ＋　ＰＣｒ／ＪＳ　９１１０２６３ｇ１ｍｍｍ１＠、ｌＡｅ＋１ １１ｔｈｋＰＣｒＡＪＳ　９１１０２６３８国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０２６３８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による還元および分離後の分子量が 約３５ｋＤであり、ＪＳＩと命名されたモノクローナル抗体と特異的に結合する 、実質的に精製された腫瘍関連抗原タンパク質。 ２．請求項１に記載のタンパク質と特異的に結合する、試薬。 ３．前記試薬が抗体である、請求項２に記載の試薬。 ４．前記抗体がＪＳＩと命名されたモノクローナル抗体である、請求項３に記載 の抗体。 ５．被検者に癌を検出する方法であって、該被検者の体液中からのモノクローナ ル抗体と特異的に結合する３５ｋＤタンパク質抗原を試薬と接触させる工程、お よび癌の存在を示す該結合の存在を検出する工程、を包含する方法。 ６．前記癌が無症状である、請求項５に記載の方法。 ７．ＪＳＩと命名された３５ｋＤタンパク質と反応する抗体と特異的に反応する 、試薬。 ８．前記試薬が抗イデオタイプ抗体である、請求項７に記載の試薬。 ９．請求項８に記載の抗イデオタイプ抗体の治療量を被検者に注入する工程を包 含する、免疫治療の方法。 １０．悪性腫瘍をモニターする方法であって、罹病被検者の体液からの請求項１ に記載の３５ｋＤタンパク質抗原を試薬と接触させる工程、所定の体液量当りの 該タンパク質抗原量を測定する工程、該量を同等試料における予め測定した量と 比較する工程、を包含し、該抗原の変量が該悪性腫瘍の状態の変化を示す、方法 。 １１．生検の腫瘍細胞上の請求項１に記載の３５ｋＤタンパク質抗原を検出する 方法であって、該腫瘍細胞を試薬と接触させる工程、および該結合試薬の存在を 検出する工程、を包含する方法。 １２．請求項４に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイプリドーマ細胞系 。 １３．腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するワクチンであって、ＪＳＩと命名さ れたモノクローナル抗体と特異的に結合する３５ｋＤタンパク質抗原、および製 薬的に容認し得るキャリアを包含する、ワクチン。 １４．被検者において約３５ｋＤの分子量を有するタンパク質抗原に対する免疫 応答を誘導または増強する方法であって、請求項１３に記載のワクチンの有効量 を該被検者に投与することを包含する、方法。 １５．前記被検者が癌に罹病しており、前記ワクチン投与後、個体内に産生され た抗体が癌を抑制する、請求項１４に記載の方法。 １６．前記癌がメラノーマ、肉腫、および癌腫のうちの１つである、請求項１４ に記載の方法。 １７．前記癌腫が胸部癌腫である、請求項１４に記載の方法。 １８．被検者の腫瘍をインビボで検出する方法であって、ＪＳＩと命名されたモ ノクローナル抗体と特異的に結合する腫瘍細胞表面上の３５ｋＤタンパク質抗原 と反応する試薬を被検者に注入する工程、および該３５ｋＤタンパク質抗原と反 応した試薬の存在を検出することにより該腫瘍を検出する工程、を包含する方法 。 １９．前記試薬が抗体である、請求項１８に記載の右方法。 ２０．前記抗体がモノクローナルである、請求項１８に記載の方法。 ２１．被検者の腫瘍細胞表面上に３５ｋＤタンパク質抗原を発現する腫瘍を抑制 する方法であって、ＪＳＩと命名されたモノクローナル抗体と特異的に結合する 腫瘍細胞表面上の３５ｋＤタンパク質抗原と反応する、腫瘍抑制試薬を被検者に 注入する工程、を包含する方法。 ２２．前記試薬が抗体である、請求項２１に記載の方法。 ２３．前記抗体が細胞障害性または細胞増殖抑制性の薬剤に付けられている、請 求項２１に記載の方法。 ２４．前記細胞障害性または細胞増殖抑制性の薬剤が、トキシン、放射性標識さ れた成分、および化学療法用薬剤からなる群から選択される、請求項２３に記載 の方法。 ２５．請求項１に記載のタンパク質をコードする、核酸。 ２６．請求項２５に記載の核酸と選択的にハイブリダイズし得る、核酸。 ２７．低レベルの３５ｋＤタンパク質抗原を検出する方法であって、γインター フェロンを用いて癌細胞の３５ｋＤタンパク質抗原の発現を増強する工程、該３ ５ｋＤタンパク質抗原を試薬と接触させる工程、および該試薬の存在を検出する 工程、を包含する方法。 ２８．試料中の、ＪＳＩと命名されたモノクローナル抗体と特異的に結合する３ ５ｋＤタンパク質抗原を含有する免疫複合体を検出する方法であって、 （１）該免疫榎合体を該３５ｋＤタンパク質抗原上のエピトープに結合する第１ 試薬と接触させる工程； （２）該免疫複合体を該３５ｋＤタンパク質抗原上の第２エピトープ、または該 免疫複合体の残りの上のエピトープに結合する第２試薬と接触させる工程； （３）該試薬の１つを固相支持体に結合させる工程；および（４）該結合試薬の 存在を検出することにより該３５ｋＤタンパク質抗原の存在を検出する工程； を包含する方法。 ２９．前記試薬が２つとも抗体である、請求項２８に記載の方法。 ３０．前記第１試薬が第２エピトープに結合する前に固相支持体に結合される、 請求項２８に記載の方法。 ３１．前記免疫複合体上の第２エピトープが３５ｋＤタンパク質と反応する抗体 である、請求項２８に記載の方法。