JPH03504436A - Ｔａｇ‐７２及びヒト癌腫に対して結合特異性を有する第二世代モノクローナル抗体及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＡＧ−７２及びヒト癌腫に対して結合特異性を有する第二世代モノクローナル 抗体及びその使用方法 発明の分野 本発明は約＞１０’ｄの分子量を有する腫瘍付随糖タンパク質（以後ｒＴＡＧ− ７２Ｊと称する）及びヒト癌腫に対して結合特異性を有する第二世代モノクロー ナル抗体、及びその使用方法に関する。

発明の背景 各種ヒト癌腫に対して結合特異性を有する数多くのモノクローナル抗体が開発さ れてきた（Ｓｃｈｌｏａ　ｅｔ　ａｌ、、「腫瘍学における重要な進歩（Ｉｓｐ ｏｒｔａｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ）　Ｊ　、Ｐｈ１ｌａ ｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ、　Ｊ、Ｂ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、、Ｖｏｌ、 １、Ｉ）Ｉ）、１７Ｇ−１９２（１９Ｂ４）及び５ｃｈｌｏｓ、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、、４８；　３２２５−３２１８　（１９１１８）＃照〕。８７２．３と 称されるこれらのモノクローナル抗体の一つ（Ｃｏｌｅｈｅｒ　ａｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　）Ｊａｉｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８：　８１９９− ３２０３（１９８１）及び米国特許４，５２２，９１８号及び４，６１２，２８ ２でヒト乳癌抽出物を用いて開発された。モノクローナルＮＩＬＨＢ−８１０８ ）により生産され、広範に研究されてきた。モノクローナル抗体８７２．３は下 記の点に基づいてその他の公知のモノクローナル抗体と区別されることが示され てきた二　（１）ＴＡＧ−７２に対するその結合特異性（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６：　８５７−８５９（１９８Ｂ） 参照）；　　（２）乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌及び膵臓癌組 織などの各種タイプのヒト癌腫組織に対するその結合特異性Ｄｌｕｔｌ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ、　２９：　６８９−５４５　（１９ｇ２）；　Ｓｔｒａｍｉｇｎ ｏｎｉ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　８１：　５４Ｂ−５５２（１９８２）；　 Ｔｈｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　７６：　９９５−１００６（１ ９８６）　；及びＴｈｏｒｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６： 　３１１８−１１２４（１９８６）参照〕、（３）その正常ヒト大人組織に対す る結合特異性の欠乏［Ｎｕｔｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎ ｃｅｒ、　２９：５３９−５４５（１９８２）：Ｓｔｒａｓｉｇｎｏｎｌ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｌ、’Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３１：５４３−５５２（１ ９８３）；　Ｔｈｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｉｎ５ｔ、、　７６：９９５−１００８（１９Ｊ１８）　；及びＴｈｏｒ、　ｅ ｔ　ａＪ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４８：　　’３１１ｇ−：１１２４ 　（１９８Ｂ）参照）；　（４）その血清におけるＴＡＧ−７２の検出能力（Ｐ ａｔｅｒｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ、　３７：　６５９−６６８　（１９８６）及びＫｌｕｇ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｉｎｔｌ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　８８：　６６１−６６９（１９８Ｂ）参照）；　　（５ ）そのヒト滲出液中の及び微細針吸引生検中の癌腫細胞の検出能力［５ｚｐａｋ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｃｔａ、　Ｃｙｔｏｌｏｇｌｅａ、　２８：　３５６− ３８７（１９８４）；”　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅｓ、、４５：１８９４−１９００（１９８Ｂ）；　５ｚｐａｋ、　ｅｔ　 ａｔ、、　　Ａｆｆｉ、　　Ｊ、　　Ｐａｔｈ、、　　１２２：　　２５２−２ ８０（１９１１６）；　　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｕｍａｎ　 Ｐａｔｈ、、　　１７：５（ＩＩ−５１３（１９８Ｂ）；　Ｍａｒｔｉｎ、　ｅ ｔ　ａｔ、、　Ａａ、　　Ｊ、　Ｃｌ１ｍ、　Ｐａｔｈｌ、　　８８：　　ｉ。

−１８（１９８Ｂ）：　　Ｎｕｔｌ、　　ｅｔ　ａｌ、＋　　Ｉｎｔｌ、　　Ｊ 、　　Ｃａｎｃｅｒ、　　３７：　　４９１−４９１１１（１９８Ｂ）；　　及 びＪｏｈｎｓｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６：８ ４Ｂ２−６４７０（１９８Ｂ）参照〕　；及び（６）その実験動物系（Ｋｅｎｎ ａｎ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ、　Ｎｕｅｌ、　Ｍｅｄ、、　２５：　１１９７− １２０３（１９８４）及びＣｏ１ｃｈｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、　４４：　５７４４−５７５１（１９８４）参照〕及び臨床試験（Ｃｏ ｌｃｈｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４７：　１１８５−１１８９（１！１Ｊ８７）及び Ｅｓｔｅｂａｎ、　ｅｔａｌ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３９： 　５Ｏ−５８（１９１＋７）参照〕の両者におけるヒト癌腫に対する結合特異性 及び長期結合。

しかしながら、モノクローナル抗体８７２．３は次の点において不利である。即 ち、（１）８７２．３は特別のタイプ例えば卵巣、結腸癌腫などの各組織などの いずれのヒト癌腫組織に対しても結合特異性を有する訳ではない（Ｎｕｔｉ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９：　５３９−５４５ （１９１１１２）；　　Ｓｔｒａｔｉｌｇｎｏｎｌ、　　ａｔ　　ａｌ、、　　 Ｉｎｔｌ、　　ノ、　　Ｃａｎｃｅｒ、　　３１：５４３−５５２（１９８３） ；　Ｔｈｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔ 、。

７８：　９９５−１００６（１９８Ｂ）；　Ｔｈｏｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６：３１１ｆｌ−３１２４（１９１１６）　：　　及 びＨａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

４３：　７２１１−７３５（１９８３）参照）；　　（２）８７２．３は所定の ヒト癌腫集合体中の全ての癌腫細胞に対して結合特異性を有する訳ではない（Ｎ ｕｔｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ。

２９：　　５３９−５４５（１９８２）；　ＳｔｒａＩＩＡｉｇｎｏｎｉ、　　 ｅｔ　ａｌ、、　　Ｉｎｔｌ、　　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ、　　３１：　　５４Ｂ−５５２（１９ｇ３）；　　丁ｈｏｒ、　 　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　　７６：　　９９５−１００８（１９８Ｂ）；　 Ｔｈｏｒ、　　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４８：　３１１８−３１２４（１９ｇＢ）；及びＨ ａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４３：　７２ｇ−７３５（１９８３）参照〕　；（ ３）８７２．３は培養液中の殆んどのヒト癌腫細胞系に対して結合特異性を有さ ない（Ｈａｎｄ、　ｅｔ　ａｔ、、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、　４３：　７２Ｂ −７３５（１９１１ｇ）；　Ｈａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ、。

４５：　８３３−８４０（１９８５）；　　及びＰｒｌｅｄｍａｎ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、　４５：　５Ｂ４ｇ−５６５５（１９８５）参 照）；　　（４）効率的な１ｎｖｉｖｏの免疫診断及び治療応用に必要である高 度に免疫反応性の８７２．３からのＦ　（ａ　ｂ’　）　２、Ｆ　（ａｂ’　） 及びＦ（ａｂ）断片を得ることが困難である；そして（５）８７２．３はＩｇＧ １アイソタイプのものであるので８７２．３を用いてモノクローナル抗体エフェ クター細胞媒介細胞毒性或いは補体媒介細胞毒性研究を行うことが困難である（ 　’Ｉ　ｇ　Ｇ　　　Ｉ　ｇ　Ｇ　２ｂ或いはＩｇＭア２ａゝ イソタイプはこれらの応用に対してはより効率的である）。

発明の概要 従って、本発明の目的は８７２．３が本質的に結合特異性を有さない所定のタイ プのヒト癌腫を含む各種ヒト癌腫に対して結合特異性を有するモノクローナル抗 体を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、ＴＡＧ−７２及びヒト癌腫に対して高い結合親和性 を有するモノクローナル抗体を提供することである。

更に本発明の目的は、ヒト癌腫のｉｎ　ｖｉｖｏの免疫診断及び治療用の高度に 免疫反応性のＦ　（ａ　ｂ’　）　２、Ｆ　（ａｂ’　）及びＦ（ａｂ）断片を 容易に得ることができるモノクローナル抗体を提供することである。

更に本発明の目的は、ヒト癌腫のｉｎ　ｖｉｖｏの免疫診断及び治療用の組換え 抗体を得ることのできるモノクローナル抗体を提供することである。

更に本発明の目的は、モノクローナル抗体エフェクター細胞媒介細胞毒性或いは 補体媒介細胞毒性研究を行う用途のためのヒト癌腫に対して結合特異性を有する Ｉ　ｇ　Ｇ　２ａ’　　Ｉ　ｇ　Ｇ　２ｂ及び１ｇＭアイソタイプのモノクロー ナル抗体を提供することである。

更に本発明の目的は、これらのモノクローナル抗体を用いてＩｎ　ｖｉｔｒｏ及 びｉｎ　ｖｌｖｏでヒト癌腫を診断する方法及びヒト癌腫を治療する方法を提供 することである。

本発明のその他の目的及び利点は、以下に示す発明の詳細な説明から明らかとな るであろう。

本発明の上記及び各種その他の目的及び利点はＴＡＧ−７２及びＬＳ−１７４７ 抗原の両者に対して結合親和性を有する本発明の第二世代モノクローナル抗体に より達成される。

特に断りのない限り、萩で用いられる全ての技術的及び化学的用語は、本発明が 属する技術分野の当業者に共通的に理解されている同一の意味を有する。萩で説 明されるものと同様或いは同等の任意の方法及び材料を本発明の実施或いは試験 において用いることができるが、好ましい方法及び材料は以下に説明される。以 下に述べられる全ての刊行物は益に準用する。

在に用いられる「第二世代モノクローナル抗体」という表現は、免疫原として第 一世代モノクローナル抗体でアフィニティ精製された抗原を用いて産生されたモ ノクローナル抗体を意味する。在に用いられる「第一世代モノクローナル抗体」 という用語は、免疫原として粗製細胞抽出物を用いて産生されたモノクローナル 抗体を意味する。

萩において用いられる「実質的」という用語は、殆んど全部或いは大部分を意味 するが、しかし全くを意味するものではない。

Ｌｓ−１７４７（ＡＴＣＣＦｈＣＲＬ−１８８）はＬＳ１８０　（ＡＴＣＣＮ［ ＬＣＲＬ−１８７）結腸腺癌系の一変種である。それは親株よりもより容易に二 次培養する三とができる。それはヌードマウスにおいて、発癌性である。核型は 大部分の細胞にＸ染色体を失ったＬＳ１８０のそれと同様である。電子顕微鏡研 究は多量の細絨毛及び細胞室内ムチン空胞を示す（Ｔｏ■、　ｅｔ　ａｌ、、　 ＩｎＶｉｔｒｏ、　１２：　１８０−１９１（１９７ｆｔ）参照〕。

ＴＡＧ−７２はＬＳ−１７４Ｔ！ｌｉ瘍細胞系にみられる抗原である。モノクロ ーナル抗体Ｂ７２．３はＴＡＧ−７２として同定される高分子量腫瘍付随糖タン パク質に結合する。Ｊｏｈｎｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ 、、４６：　８５０−８５７（１９１１１ｉ）に記載されるようなデータが示さ れるこのＴＡＧ−７２分子をムチンと特性付けた。この結論は次の観察に基づく ものである：　　（ａ）ＴＡＧ−７２はその５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ カラムからの排除により示されるように高分子量（＞ｌＸｌ０Ｂ）を有する；（ ｂ）ＣｓＣ１中において平衡遠心分離により求められたＴＡＧ−７２の密度は１ ．４５ｇｍ／ｍｌであり、ひどくグリコジル化された糖タンパク質を示した；（ ｃ）ＴＡＧ−７２はノイラミニダーゼ消化後に移動における変化を示し、それが ムチン類に特徴的な多量の０−グリコシド的に結合したオリゴ糖類を有するひど くシアリル化された分子であることを示す；　（ｄ）ムチン類上に普通見られる 血液基抗原がアフィニティー精製ＴＡＧ−７２に見られる；及び（ｅ）コンドロ イチナーゼＡＢＣ消化はＴＡＧ−７２に何等の効果も有さず、従ってＴＡＧ−７ ２エピトープはコンドロイチンサルフェートタンパク質グリカン上に発現されな いことを示す。

即ち、本発明の目的は、ＴＡＧ−７２及び抗体８７２．３がそれに対して最少の 結合特異性を有するヒト癌腫を含むヒト癌腫に対して結合特異性を有し、又正常 ヒト大人組織に対しては最少の結合特異性を有する本発明の第二世代モノクロー ナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体により達成された。

もう一つの実施態様に対しては、本発明の上記目的は下記工程を含んでなるヒト 癌腫或いは転移の診断方法により達成された： （、ａ）患者から体液、組織或いは生検などの体試料を得る工程； （ｂ）この体試料材料を本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性 断片或いは組換え体と接触させる工程； （ｃ）第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体の体試 料材料への結合レベルを決定する工程；及び （ｄ）体試料内に存在する物、質に結合した第二世代モノクローナル抗体、その 免疫反応性断片或いは組換え体の量を、対照試料或いは所定規定レベルと比較し て、その結果対照レベルより大きい結合がヒト癌腫或いはその転移の存在を示す 工程。

更に別の実施態様においては、本発明の上記目的は下記工程を含んでなるヒト癌 腫或いはその転移の存在の診断方法により達成された： （ａ）患者に像形成マーカーに接合した本発明の第二世代モノクローナル抗体、 その免疫反応性断片或いは組換え体を投与する工程；及び （ｂ）患者を該像形成マーカーを検出する手段に曝して該患者におけるヒト癌腫 或いはその転移部位に対応する像形成マーカーの領域を同定する工程。

更に別の実施態様においては、本発明の上記目的はヒト癌腫或いはその転移に罹 患した患者の治療方法であって、癌腫或いはその転移に罹患した患者に薬学的に 有効量の治療剤に接合した本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫活性 断片或いは組換え体を投与することを特徴とする方法により達成された。

図面の簡単な説明 第１図は次のものの概略図である：　　（１）８７２．３との競争ラジオイムノ アッセイ（以下「ＲＩ　ＡＪ　）における本発明のＣＣ及びＭＡＴＡＧモノクロ ーナル抗体のＬＳ−１７４７結腸癌腫細胞（ＡＴＣＣ嵐ＣＲＬ−１８８）に対す る示差結合特異性；　（２）本発明のＣＣ及びＭＡＴＡＧモノクローナル抗体の アイソタイプ；及び（３）本発明のＣＣ及びＭＡＴＡＧモノクローナル抗体の固 相ＲＩＡ　（以下ｒｓＰＲＩＡＪ）中の各種結腸癌腫に対する結合特異性。

第２図は８７２．３との競争ＲＩＡにおけるモノクローナル抗体ＣＣ４１のＬＳ −１７４Ｔ結腸癌腫細胞抽出物に対する結合特異性の分析である。第２Ｂ図は５ ＰＩＲＡにおけるモノクローナル抗体Ｂ７２．３及びＣＣ４１のＬＳ−１７４Ｔ 結腸癌腫細胞系抽出物（ＬＳ）及び乳癌腫生検抽出物（Ｂｒ、　Ｃａ、　）に対 する結合特異性の定量分析である。

第２Ｃ図は、８７２．３との競争ＲＩＡにおけるモノクローナル抗体ＣＣ６０の ＬＳ−１７４Ｔ結腸癌腫細胞抽出物に対する結合特異性の分析である。第２Ｄ図 は５ＰＩＲＡにおけるモノクローナル抗体Ｂ７２．３及びＣＣ６０のＬＳ−１７ ４７結腸癌腫細胞系抽出物（Ｌ　Ｓ）及び乳癌生検抽出物（Ｂｒ、　Ｃａ、　） に対する結合特異性の定量分析である。

第２Ｅ図は、８７２．３との競争ＲＩＡにおけるモノクローナル抗体ＣＣ８３の ＬＳ−１７４７結腸癌腫細胞抽出物に対する結合特異性の分析である。第２Ｆ図 は５ＰＩＲＡにおけるモノクローナル抗体Ｂ７２．３及びＣＣ８３のＬＳ−１７ ４７結腸癌腫細胞系抽出物（Ｌ　Ｓ）及び乳癌腫生検抽出物（Ｂｒ、　Ｃａ、　 ）に対する結合特異性の定量分析である。

第２Ｇ図は、８７２．３との競争ＲＩＡにおけるモノクローナル抗体ＣＣ４９の ＬＳ−１７４Ｔ結腸癌腫細胞抽出物に対する結合特異性の分析である。第２Ｈ図 は５ＰＩＲＡにおけるモノクローナル抗体Ｂ７２．３及びＣＣ４９のＬＳ−１７ ４Ｔ結腸癌腫細胞系抽出物（ＬＳ）及び乳癌腫生検抽出物（Ｂｒ、　Ｃａ、　） に対する結合特異性の定量分析である。

第３図は、ＣＣ４９との競争ＲＩＡの分析であり、同分析において１２５Ｉ−標 識化ＣＣ４９モノクローナル抗体をＬＳ−１７４７結腸癌腫細胞抽出物と反応さ せ、精製ＣＣ５０、ＣＣ４６、ＣＣ８３及び８７２．３を競争抗体として用いた 。

第４Ａ図は、ＬＳ−１４７７結腸癌腫異種移植片のモノクローナル抗体ＣＣ１１ によるｉｎ　ｖｌｖｏのねらい打ちの分析である。

第４Ｂ図は、ＬＳ−１４７７結腸癌腫異種移植片のモノクローナル抗体ＣＣ４６ によるＩｎ　ｖｉｖｏのねらい打ちの分析である。

発明の詳細な説明 １、モノクローナル抗体の特性 本発明において特に開発されたＣＣ１〜ＣＣＣＣ９２（Ｉモノクローナル抗体） 及びＭＡＴＡＧＩ〜ＭＡＴＡＧ１ｇ　（ＩｇＭモノクローナル抗体）（第１図参 照）と命名されたモノクローナル抗体は、全てＴＡＧ−７２及び数多くのタイプ のヒト癌腫（乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌及び膵臓癌を含む） に対して結合特異性を有し、８７２．３とは次の点において異る： （１）それらが正常ヒト大人組織に対する特異性を本質的に有さないことを維持 しながら８７２．３よりもより多くのヒト癌腫に対して結合特異性を有すること ；（２）それらがＴＡＧ−７２に対してＢ７２．３よりより高い結合親和性、即 ち３Ｘ１０”Ｍ、好ましくは８Ｘ１０９Ｍより大きいオーダーで有し、従ってｉ ｆｉ　ＶｉＶＯでヒト癌腫をより高い効率で結合すること；（３）それらがヒト 癌腫をｌｎ　５ｉｔｕでねらい打ちするに際し８７２．３より５０％以上の効率 を示すこと（即ち、８７２．３よりも５０％多量の注射投与量／グラム腫瘍及び 好ましくはＢ７２．３よりも１００％多量注射投与量／グラム腫瘍）； （４）それらがペプシンによって容易に断片化されて高度に免疫反応性であるＦ 　（ａ　ｂ’　）　２、Ｆ　（ａｂ’　）及びＦ（ａｂ）断片を得ることができ ること；及び（５）それらがＩｇＧ　　　ＩｇＧ２．、及び１ｇＭアイ２ａゝ ツタイブのモノクローナル抗体を包合するため、それらをより効率的にモノクロ ーナル抗体目標エフェクター細胞媒介細胞毒或いは補体媒介細胞毒研究に用いる ことができること。

本発明のＣＣ及びＭＡＴＡＧモノクローナル抗体の開発は只今や二重決定基ＲＩ Ａ（以下ｒＤＤＲＩＡＪ　）の癌患者の体液及び生検におけるヒト癌腫抗原のよ り効率的検出への使用を実現可能にする。

■、モノクローナル抗体の産生 本発明のＣＣ及びＭＡＴＡｇモノクローナル抗体はマウス（或いはラット、ウサ ギ、ヤギ及びヒトなどのその他の動物）を各種異種移植片例えばＬＳ−１７４７ 癌腫細胞（ＡＴＣＣ魔ＣＲＬ　−１８８）を用いて調製されたＬＳ−１７４Ｔヒ ト結腸癌腫異種移植片及び０ＶＣＡＲ−３癌腫細胞ＣＩａｍｌｌｔｏｎ　ｅｔ　 ａｌ、、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、　４３：　５３７９−５３８９（１９８３） 参照〕を用いて調製された０ＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌異種移植片から得られる精 製ＴＡＧ−７２で免疫化することにより産生される。

ＴＡＧ−７２は周知の方法により異種移植片から精製される。即ち次の工程によ り精製される：（１）細胞を破壊する工程；　（２）細胞破片を除去するために 遠心分離及び／又は濾過する工程；（３）＞１０６ｄの分子量、即ちＴＡＧ−７ ２の分子量を有するタンパク質を得るためにサイジングカラムクロマトグラフィ ーを行う工程；　及び次いで（４）目的ＴＡＧ−７２を得るために８７２．３ア フイニテイカラムクロマトグラフイを行う工程［Ｐａｔｅｒｓｏｎ、　ｅｔ　ａ ｌ、＋Ｉｎｔ１．　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　８７二６５９−６８６（１９８Ｂ） 参照〕。

動物例えばマウスの精製ＴＡＧ−７２による免疫化、免疫化細胞の単離、免疫化 細胞とマウス骨髄腫細胞（或いはラット、ウサギ、ヤギ及びヒトなどのその他の 種の骨髄腫）との融合は全て周知であり、容易に利用可能であり、又得られる融 合細胞のハイブリドーマの生育を可能にする条件下での培養は全て周知の或いは 容易に決定される方法により行われる［Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ、 、　　ｒ実験免疫学便覧（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ 　Ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ）Ｊ　％０ｘｆｏｒｄ、　Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ、　ｐ ｐ、２５．１〜２５．７；　Ｃａｔｃｈｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８：　３１９９ −３２０３（１９８１）；及びＭｕｒａｎｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｌ、　 Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３９：　３４−４４（１９８７）参照〕。

得られたハイブリドーマを次いで試験してＴＡＧ−７２及びヒト癌腫に結合特異 性を有するが、しかし正常ヒト大人組織に対しては有さないモノクローナル抗体 を産生ずるものを単離する。このスクリーニングはより詳細に以下の具体例にお いて説明される５ＰＲＩＡを用いて行われる。

ＴＡＧ−７２に対するモノクローナル抗体の結合親和性は周知の手段により［Ｈ ｅｙｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　８８：　１９１−２０４（１９８４）参照〕、又以下の具体 例において詳細に説明されるようにして決定される。

これらのモノクローナル抗体のアイソタイプ（ＩｇＧ１、Ｉ　ｇ　Ｇ２ａ１１　 ｇ　Ｇ２ｂ−１ｇ　Ｇ　３或いはＩｇＭ）は周知の手段により（Ｃｏｌｃｈｅｒ 、　ｅｔ　ａｌ、、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、　４１：　１４５１−１４５９（１９ ８１）参照〕、又以下の具体例において詳細に説明されるようにして決定される 。

以下に与えられる非−限定的具体例においては、日干を越えるハイブリドーマが （ｊ）ＬＳ−１７４７ヒト結腸癌腫異種移植片から得られた精製ＴＡＧ−７２で 免疫されたマウスの膵臓細胞、及び（１１）周知の容易に利用可能なＮ５−１ｖ ウス骨髄腫系（ＡＴＣＣＮＩＩＬＴＩＢ−１８）を融合させることにより産生じ た。これらのハイブリドーマから４４個の二重クローン化ハイブリドーマ（２９ 個のＣＣ第二世代モノクローナル抗体及び１５ＭＡＴＡＧ第二世代モノクローナ ル抗体）を選択し、以下に与えられる具体例に説明されるようにして特性化した 。

本発明のＣＣモノクローナル抗体を周知の方法により酵素ペプシンを用いて（Ｃ ｏｌｃｈｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

４３：　７３８−７４２（１９８３）参照〕、又以下に与えられる具体例により 詳細に説明されるようにして断片化して高度に免疫活性のＦ　（ａ　ｂ’　）　 ２及びＦ（ａｂ）断片を得る。得られるＦ　（ａ　ｂ’　）　２、Ｆ　（ａｂ’ 　）及びＦ（ａｂ）断片の免疫反応性は完全モノクローナル抗体分子について上 記した如く競争ＲＩＡ或いは５ＰＲＩＡにおいて決定する。

本発明の第二世代抗体は又周知の分子生物学技術により組換え形態にも作成され る（Ｒｌｃｅ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｒｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ１．　ＵＳＡ、７９：　７８６２−７８６５（１ ９ｇ２）；’Ｋｕｒｏｋａｖａ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１１：　３０７７ −３０８５（１９８３）；ＯＬ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１１１：　８２５−１１２９（１９８３）；　 Ｂｏｘｘ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２ ：３７９１−３８０６（１９８４）；　Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）。

３１２：　　６４３−６４６（１９ｇ４）；　Ｃａｂｉｌｙ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　８１：　３２７３−３２７７（１９８４） ；　Ｋｅｎｔｅｎ、　ｅｔａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　　８１：　　２９５５−２９５９（１９８４）：　Ｌｌ ｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．ＵＳＡ 。

８１：　５３８９−５１７３（１９８４）：　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　８１：　　６８５１−８８５５（１９ ８番）；　　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　　ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ ｎ）、８１２：８０４　−６０８（１９８４）；Ｐｏｔｔｅｒ、ｅｔａｌ、、　 　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　８１：　 　７１８１−７１８６（１９８４）；　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ＋　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、　：１１４：２Ｈ−２７０（１９８５）；　 Ｊｏｎｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、　３２１：５ ２２−５２３（１９８６）；　Ｏ３，ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｉｑｕ ｅｓ、　４：　２１４−２２１（１９８６）：　Ｓａｈａｇａｎ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ、　　Ｉａｍｕｎｏｌ、、　　１８７：　　１０６Ｂ−１０７４（１９ ８Ｂ）；　Ｓｕｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｙｂｒｌｄｏｍａ　５　（Ｓｕｐｐｌ 、　ｌ）：Ｓ−１７−８２０（１９８Ｂ）；及びＳｕｎ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｅ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　８４：　２１４−２１８（１９８７）参照〕、これらの全 ては特に益において準用する。

上記文献に記載されるような公知の組換えＤＮＡ技術により、マウス不変部の代 りに例えばヒト不変部（Ｆｃ領域）を置換することによりキメラ形態に変更され る。

これらのＦｃ領域は各種ヒトアイソタイプ、即ち１ｇＧ　　１ｇＧ２、Ｉ　ｇＧ ３．１　ｇ　Ｇ　４或いは１ｇＭ１ゝ のちのであり得る。

加えて、本発明の第二世代のモノクローナル抗体は、アフィニティ変成形態、ア ビジチイ変成形態、或いは両者に上記文献に記載される周知の組換えＤＮＡ技術 を用いて結合部位を変更することにより或いはヒンジ領域を変更することにより 変更される。

組換え抗体形態は又本発明の第二世代モノクローナル抗体が断片化された上記同 一方法により断片化して免疫活性断片Ｆ　（ａｂ’　）２、Ｆ（ａｂ’）或いは Ｆ（ａｂ）が生成される。

従って、虱において用いられる「組換え抗体」という表現は集合的にＦｃ領域が 別の種或いはアイソタイプのＦｃ領域で置換された本発明の第二世代モノクロー ナル抗体のキメラ／組換え形態、結合部位が変更された本発明の第二世代モノク ローナル抗体のアフィニティ変成形態、ヒンジ領域が変更された本発明の第二世 代モノクローナル抗体のアビジチイ変成形態、それらの免疫反応性断片及びそれ らの組合わせを包合するものである。

本発明の第二世代モノクローナル抗体は、本発明の第二世代モノクローナル抗体 を産生ずるハイブリドーマをブリスタン−下塗りマウスの腹腔内に注射し、適当 な時間（約１〜２週ｆｆ、’Ｊ）後、極めて高力価の均質モノクローナル抗体を 与える腹水をマウスから採取し、及びそれからモノクローナル抗体を周知の方法 （Ｓｔｒａｓｌｇｎｏｎｉ　ｅｔａｌ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、 　３１：　５４３−５５２（１９８３）参照〕により単離することにより大量に 製造される。或いは又、第二世代モノクローナル抗体は、本発明の第二世代上ツ クローナル抗体を産生ずるパイブリドーマをｉｎ　ｖｌｔｒｏで培養し、細胞培 養培地から分泌したモノクローナル抗体を周知の方法（Ｃｏｌｃｈｅｒ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１゜ＵＳＡ、　７８： 　８１９９−１２０３（１９８１）参照〕により単離することにより製造される 。

本発明のＣＣ及びＭＡＴＡＧモノクローナル抗体は上記方法により、このように して製造される。これらのモノクローナル抗体の結合特異性及び結合親和性及び ギれらとＢ７２．３との比較は以下に与えられる具体例においてより詳細に説明 される。

■、モノクローナル抗体の用途 本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫活性断片或いは組換え体は単独 、相互の組合わせ、或いは他の抗体、例えば８７２．３或いはその免疫反応性断 片と組合わせて次のような用途に用いることができる＝（１）患者の体液中のＴ ＡＧ−７２の検出のための標識化モノクローナル抗体を用いる１ｎ　ＶｌｔｒＯ の診断アッセイ；（２）癌腫病巣の１ｎ　５ｉｔｕ検出のための像形成マーカー に接合された本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは その組換え体を用いるｉｎ　ｖｌｖ。

診断アッセイ（診断像形成）；　（３）本発明の第二世代モノクローナル抗体、 その免疫反応性断片或いは組換え体を単独或いは放射線核種、薬品、毒素、エフ ェクター細胞、その他の抗体に接合したもの、或いは補体機構を介して用いるｊ ｎ　ｖｉｖｏ癌治療；　（４）癌腫細胞の検出或いは表現形決定のための免疫刊 織病理学或いは免疫細胞化学；及び（５）癌腫に対する活性免疫治療のための抗 −イディオタイプ網状組織を活性化する免疫原。

Ａ、　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断アッセイ本発明の第二世代モノクローナル抗体、 その免疫反応性断片或いは組換え体を用いる患者の体液中においてＴＡＧ−７２ を検出することによるヒト癌腫或いはその転移のｉｎ　ｖ１ｔｒｏ診断アッセイ を以下により詳細に説明する。

患者から得られた体液を本発明のモノクローナル抗体、その免疫反応性断片或い は組換え体と接触させる。診断は次いで体液中に存在する物質（ＴＡＧ−７２） に結合するモノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を決定し、 体液物質に結合したモノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体の 量を以下に規定される所定の基底レベルと対比することにより行う。

基底レベルを越える結合モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え 体の量はヒト癌腫或いはその転移の存在を示す。

このｉｎ　ｖｉｔｒｏ法に用いることのできる体液の具体例としては、ＴＡＧ− ７２を含有することが疑われた任意の体液である。その好ましい具体例としては 、血液（血清或いは血漿）、唾液、乳頭排出物、嚢胞液、腹水、胸膜滲出液、精 漿、精液、尿及び前立腺液及び／又は生検標本などが挙げられる。血清或いは血 漿が本発明で用いられるより好ましい体液である。体液は当業者に容易に公知で あるか決定される方法により得ることができる。

体液は本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え 体と接触され、及び体液中の物質に結合したモノクローナル抗体、その免疫反応 性断片或いは組換え体の量は例えば下記の文献に記載される当業者に周知の免疫 化学アッセイによって決定される（Ｋｌｕｇ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅｓ、　４４：　１０４ｇ−１０５３（１９８４）；Ｋｌｕｇ、　ｅｔ　ａ ｔ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３８：　６８１−［９（１９８Ｂ ）；Ｈｅｒｌｙｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　ＣｌＩｎ、　１ｍｍｕｎｏ１．． ２：　１３５−１４０（１９８２）　；Ｍｅｔｚｇａｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８１：５２４２− ５２４８（１９８４）；　ＰａｐｓＩｄｅｒｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、、４４　：４６５３−４６５７（１９８４）；　１ａｙｅｓ、　ｅ ｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７５：１８７１−１６７８（ １９８５）：　ＫＩＩｌｌａｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、 　４５：８８Ｂ−８９１（１９８５）；　Ｈｅｄｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８０：　３４７０−３４７４（１９８３）；　Ｐｅｋａｒ ｙ、　ｅｔ　ａｔ、。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　３０：　１２１３−１２１５（１９ｇ４）；　Ｂａ５ ｔ、ｅｔ　ａｌ、、　ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３０９：　８ ８３−８８７（Ｌ９８３＞：　　及びＢｅ１ｌｅｔ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ、　ＵＳＡ、　 ８１：　３１１８９−３８７３（１９８４）　（これらの開示内容は全て五に特 に準用する）〕。

本発明においてａ用である一つのタイプの免疫化学アッセイの一例はサンドイッ チ放射測定アッセイ（以下「ＩＲＭＡＪ　）である。このタイプのアッセイにお いて、抗原（ＴＡＧ−７２）の存在はそれを過剰の標識化モノクローナル抗体と 反応させることにより直接測定される。

そのようなアッセイにおいては、抗原が標識化モノクローナル抗体と反応させら れる前に、抗原が抗原に特異的に結合する免疫吸着剤上に不溶化される。この免 疫吸着剤は、第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体 を免疫ビーズなどの基材上に添付することにより形成される。単量体である抗原 のサンドイッチアッセイにおいては抗原上に別々のエピトープを認識する二つの 抗体が必要とされる、即ち所謂「二重決定基」アッセイが必要とされ、その結果 、抗原に対する結合の競争がない。サンドイッチアッセイにおいては、一つの抗 体は免疫吸着剤に結合され、他方の抗体は標識化トレーサーとして用いられる。

二量体或いは重合体抗原のアッセイにおいては、同一抗体が標識化トレーサーと して免疫吸着剤に結合され得る。

サンドイッチＩＲＭＡは前進、逆進或いは同時モードで行われてよい。

ＴＡＧ−７２に対する前進サンドイッチアッセイにおいては、モノクローナル抗 体は免疫ビーズなどの固相に添付されてＴＡＧ−７２に特異的な免疫吸着剤番形 成する。ＴＡＧ−７２を含有する体液試料を次いでこの免疫吸着剤とインキュベ ートする。インキュベーションは体液中のＴＡＧ−７２を免疫吸着剤上の固定化 モノクローナル抗体に結合させるのに十分な時間維持される。この最初のインキ ュベーション後、固相免疫吸着剤をインキュベーション混合物から分離する。こ の免疫吸着剤を洗浄して体液中にも存在するかもしれない非−特異的結合タンパ ク質などの未結合妨害物質を除去する。固定化モノクローナル抗体に結合された ＴＡＧ−７２を含有する免疫吸着剤を引続き標識化されたモノクローナル抗体、 その免疫反応性断片或いは組換え体と共にインキュベートする。ここでも又イン キュベーションは標識化モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え 体のＴＡＧ−７２への結合を確実に行うのに十分な時間及び条件下において行わ れる。この第二のインキュベーション後、もう−回の洗浄を行って固相免疫吸着 剤から未結合標識化モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を 除去する。次いで固相免疫吸着剤に結合した標識化モノクローナル抗体、その免 疫反応性断片或いは組換え体を測定し、検出された標識化モノクローナル抗体、 その免疫反応性断片或いは組換え体の量が大気中に存在するＴＡＧ−７２の量の 直接の目安として役立つ。

サンドイッチＩＲＭＡは又逆進及び同時モードで行われてもよい。逆進モードに おいては、インキュベーション混合物が被試験体液及びＴＡＧ−７２に向けられ た可溶性標識化モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体により 形成される。この混合物をインキュベートし、次いで又ＴＡＧ−７２に向けられ たモノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を含有する固相免疫 吸着剤と接触させる。もう−回のインキュベーション後、免疫吸着剤を混合物か ら分離し、免疫吸着剤に結合した標識を体液中のＴＡＧ−７２の表示として採用 する。

同時モードにおいては、インキュベージジン混合物を体液、標識化モノクローナ ル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体及び固相免疫吸着剤から形成する。

十分な時間のインキュベーション後、固相免疫吸着剤を混合物から分離し、免疫 吸着剤に伴う標識を測定して体液中のＴＡＧ−７２の量の表示を与える。

上記各種アッセイモードにおける各インキュベーション工程に対して、インキュ ベージジン時間及び条件はＴＡＧ−７２の固定化モノクローナル抗体、その免疫 反応性断片或いは組換え体及び標識化モノクローナル抗体、その免疫反応性断片 或いは組換え体に対する最大の結合を保障するように選択されるが、しかし通常 室温（２２”〜２７℃）において約６〜１６時間である。

上記ＩＲＭＡに加えて、本発明において有用なその他のイムノアッセイとしては 、ＲＩＡ及び蛍光或いは酵素結合イムノアッセイ（以下ｒＥＬ　Ｉ　ＳＡＪ　） などが挙げられる。ＲＩＡの中で適したタイプのものは５ＰＲＩＡである。

５ＰＲＩＡに対しては、固相免疫吸着剤はＩＲＭＡについて説明した如く調製さ れる。

この免疫吸着剤を次いで体液及び公知量の標識化ＴＡＧ−７２とＴＡＧ−７２の 免疫吸着剤への結合を可能にする時間及び条件下においてインキュベートする、 この免疫吸着剤を体液から分離し、それに伴う標識の量を評価する。免疫吸着剤 に伴う標識化ＴＡＧ−７２との間の関係を規定する予備確立された抑制曲線を参 照することにより体液中の未標識ヒトＴＡＧ−７２の量が求められる。

各ＩＪｓＰＲＩＡにおいて、免疫吸着剤は体液、標識化抗体或いは両者を含有す るインキュベーション混合物から分離される。分離は沈降或いは遠心分離などの 任意の通常の分離技術により達成することができる。必須ではないが、好ましく は免疫吸着剤を必要に応じてそれを第二インキュベーション培地と接触するに先 立ち且つ免疫吸着剤に伴う標識の量を測定するのに先立ち洗浄するのがよい。こ の洗浄はアッセイの精度及び感度に影響を及ぼすことのある非−特異的妨害物質 或いは過剰め標識化抗体を除去する。

上記アッセイにおいて本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断 片或いは組換え体或いはＴＡＧ−７２を標識化するために用いられる特別の標識 は、本発明に対しては重要ではな（、ＩＲＭＡ及びＲＩＡに対しては　Ｐ、　　 Ｃ，ＨＳ　　　Ｉ、　　　　Ｉ。

或いは３５８などの放射性同位元素或いはフルオレラセン或いはローダミンなど の蛍光性分子或いは適当な基質の存在下において基質をＥＬ　Ｉ　ＳＡのための 着色生成物に転換する酵素であり得る。そのような酵素の具体例としては、アル カリホスファターゼ及びワサビダイコンペルオキシダーゼが挙げられる。

本発明に従うｉｎ　ｖｌｔｒｏの診断方法における最終工程として、体液中に存 在する物質（ＴＡＧ−７２）に結合する第二世代モノクローナル抗体、その免疫 反応性断片或いは組換え体の量を所定の基底レベルと対比する。

予想されるモノクローナル抗体アッセイ結合の基底レベルの決定はこの種の診断 試験の読取りに対して必要なパラメータを規定するに際して当業者により日常的 に行われる決定である。これらの決定は、ここに示される教示に照らして不当な 実験を行うことなくなされる。

一般的に「基底レベル」は、（１）正常個体数の平均を越える二つの標準偏差、 或いは（２）正常個体数の９９％該当するレベルと規定される。

Ｂ、　１ｎ　ｖ１ｖｏ診断アッセイ 本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を用 いるヒト癌腫或いはその転移のｉｎ　ｖｉｖｏの診断アッセイを以下により詳細 に説明する。

像形成マーカーに接合した本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応 性断片或いは組換え体を患者に投与（或いは引続き第二世代モノクローナル抗体 の投与後マーカー或いはリンカ−接合体マーカーを投与）、次いで患者中の像形 成マーカーの存在を、患者をマーカーを検出するための適当な手段に曝すことに より検出する。

抗体−像形成マーカー接合体の投与及び検出並びに抗体の像形成マーカーへの接 合方法は、例えば以下に示す当業者に容易に公知であり或いは容易に決定される 方法により達成される（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　Ｊ。

Ｗｅｄ、、　２９８：　１Ｂ８４−１８８８（１９７ｇ）；　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ａ。

Ｍ、Ａ、、　２５０：　８３０−６３５（１９８８）；　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　 ｅｔ　ａｌ、、（ｉａｓｔｒｏ−ｅｎｔｅｒｏｌ、、　８４：　５２４−５８２ （１９８８）；　５ｉｃｃａｒｄｌ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４５：　４８１７−４８２２（１９８Ｂ）；　Ｅｐ ｅｎｅｔｏｓ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ、　　５５：　　９ｇ４−９８７（１９８５）；　Ｐｈ１１ｂｅｎ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ。

５７：　５７１−５７６（１９８６）；　Ｃｈｉｏｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４５：６１４０−６１４６（１９８５）；　Ｈｖａｎｇ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎａ１１．　ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ、、　７６：　 ８４９−８５５（１９８Ｇ）；　Ｃｏ１ｃｈｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅ ｒＲｅｓ、、　４３ニア３Ｂ−７４２（１９８３）；　Ｃｏ１ｃｈｅｒ、　ｅｔ 　ａｌ、、　ｒ生物学及び医学゛免疫診断における実験室研究方法（Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ 　Ｍｅｄｌｃｌｎｅ　Ｉｍｍｕｎｏｄｉａ−ｇｎｏｓｔｉｃｓ）Ｊ　、Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｌｓｓ、　ｐｐ、２１５−２５８（１９８８）： 　Ｋｅｅｎａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、、　２５：　１ １９７−１２０３（１９８４）；　Ｃｏ１ｃｈｅｒ、　　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　　４３：　　１１８５−ＩＩＨ（１９８７）；　　Ｅｓ ｔｅｂａｎ、　　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｉｎｔｌ、　　Ｊ、　　Ｃａｎｃｅｒ、　 　３９：５Ｏ−５９（１９８７）；　　Ｍａｒｔｊｎ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　 Ｃｕｒｒ、　　Ｓｕｒｇ、、　　４１；　　１９３ｌ９３−１９４（１９；　　 Ｍａｒｔｉｎ、　　ｅｔ　ａｔ、、　　ＨｙｂｒｉｄｏｒＡａ、　　５：　　８ ９７−８１０Ｂ（１９８Ｂ）　；及びＭａｒｔｉｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ａａ、 　Ｊ、　Ｓｕｒｇ、、　１５０：　［１７２−６７５（１９８５）　（これら全 ての開示内容は在に特に準用する）〕。

投与量は患者の年令及び体重に応じて異るが、しかし、患者当り約０．１〜２０ Ｉｌ１ｇの抗体−マーカー接合体の一回の投与量が十分である。より好ましい投 与量は患者当り約１．０〜２．Ｏａ＋ｇの抗体−マーカー接合体である。

抗体に接合することのできる像形成マーカーの具体例は当業者に周知であり、上 記文献により説明されているようなガンマスキャナー或いは手持ちガンマプロー ブ或いはポジトロン・エミッション・トモグラフィー（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ　ＥＩ Ｉｉｓｓｌｏｎ　Ｔｏｍｏｇｒｐｈｙ　）などの診断像形成により検出されるこ とのできる物質及び上記引用文献に記載されるような核磁気共鳴分光光度計を用 いる核磁気共鳴像形成により検出されることのできる物質などが挙げられる。

ガンマスキャナーなどを用いて検出されることのでき１２５　　１３す る物質の適当な具体例としては、　　　■、　　　■、１２３！、１１１．ｎ、 及び９９ａＴＣなどが挙げられる。

１１１Ｔｎ及び９９１１ＴＣがそれらの低エネルギー及び長範囲検出用の適性に より好ましい。

核磁気共鳴分光光度計などを用いて検出されることのできる物質の一例は、核磁 気スピン−共鳴同位体ガドリニウム（Ｇｄ）である。

Ｃ，ｉｎ　ｖｉｖｏ治療 本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を用 いるヒト癌腫或いはその転移のＩｎ　ｖｌｖｏ治療を以下により詳細に説明する 。

薬学的に有効量の治療剤に未接合或いは接合した本発明の第二世代モノクローナ ル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を患者に投与する。

モノクローナル抗体−治療剤接合体の調製及び投与方法並びに適当な投与量は、 患者の年令及び体重及び用いられる治療剤に応じて異り、当業者に周知であるか 或いは容易に決定される。代表的な実験方法は以下に引用する文献に記載されて いる。

治療に用いることのできるモノクローナル抗体−治療剤の具体例としては、１３ １．９°Ｙ、１０５Ｒｈ、′７ＳＣ１Ｃｕ、　　　Ｂｉ、及び２１１Ａｔなどの 放射線核種にカップリングした抗体［Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｔ、、 　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、　４１：　４３５４−４３８０（１９１ｉ１）；　Ｃ ａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ、　　Ｒｅｐ、、　　８８：　　３１７−３２８（１ ９８４）；　Ｚａｌｃｂｅｒｇ。

ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　　７２ ：　　８９７−７０４（１９８４）；Ｊｏｎｅｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｉｎｔ 、　　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　　３５：　　７１５−７２０（１９８５）；Ｌａ ｎｇｅ、　　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　　９Ｂ：　　１４３−１５（ ｔ（１９８５）；　　Ｋａｌｔｏ−ｖｌｃｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｎ ｕｃｌ、　Ｍｅｄ、、　　２７：　　８９７（１９８Ｂ）；　０ｒｄｅｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　　Ｉｎｔｌ、　　Ｊ、　　Ｒａｄｊｏｔｈｅｒ、　　０ｎｃ１ ．　　Ｂｉｏｌ、　　Ｐｈｙｓ、、　　８：２５９−２８１（１９１ｉ２）；　 Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　　１：１ ４４１−１４４３（１９８３）　　；及びＥｔｔｉｎｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、 　ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔ、　Ｒｅｐ、、　８Ｂ：　２８９−２９７（１９８２ ）に記載されており、それらの全開示内容は鼓に特に準用する〕　；メトトレキ セート、アドリアマイシン及びインターフェロンなどのその他の薬品或いは生物 学的応答変成剤にカップリングした抗体〔例えば、Ｃｈａｂｎｅｒ、　ｅｔ　ａ ｔ、、　ｒ癌、腫瘍学の原理及び実践（Ｃａｎｃｅｒ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ 　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ）　Ｊ　Ｐｈ１ｌａｄｅｌ ｐｈｉａ、　ＰＡ、　Ｊ、Ｂ、　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、。

Ｖｏｌ、　１．　ｐｐ、２９０−３２８（１９８５）：　０Ｉｄｈａａ、　ｅｔ 　ａｌ、　ｒ癌、腫瘍学の原理及び実践（Ｃａｎｃｅｒ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅ ｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅｏｒ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）Ｊ　、Ｐｈ１ｌａｄｅ ｌｐｈｉａ、　ＰＡ、　Ｊ、Ｂ、　ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＧｏ、、　Ｖｏｌ、２ ．　ｐｐ、２２２３−２２４５（１９８５）；　Ｄｅｇｕｃｈｉ、　ｅｔ　ａｔ 、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６：　３７５１−３７５５（１９８Ｂ）；　Ｄｅ ｇｕｃｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、、　４４：　Ｉｎ４（１９ｇ５）；　Ｅｍｂｌｅｔｏｎ、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　４９：　５５９−５１３５（１９ｇ４）；及びＰｉｍｌ 、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｓｗｕｎｏｌ、　！ｓｍｕｎｏｔｈｅｒ、、　１２：　１２５ −１３４（１９１ｉ２）に記載され、それらの開示内容は全て特に在に準用する 〕　；毒素にカップリングした抗体〔例えば、Ｕｈｒ、　ｅｔ　ａｌ、。

［モノクローナル抗体及び癌（Ｍｏｎｏｃ　Ｉ　ｏｎａ　Ｉ＾ｎｔｌｂｏｄＩｅ ｓａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ）　Ｊ　、　Ａｃａｄｅｔｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ 、、　ｐｐ、Ｂ５−９８（１９８３）；　Ｖｉｔｅｔｔａ、　ｅｔ　ａｌ、、　 ｒバイオ技術及びバイオ新領域（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ 、　Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ）　Ｊ　、Ｐ、Ｈ。

Ａｂｅｌｓｏｎ編、ｐｐ、７３−８５（１９８４）　；及びＶｉｔｅｔｔａ、　 ｅｔ　ａｌ、。

Ｓｃｉ、、　２１９：　６４４−６５４０（１９８３）に記載され、その開示内 容は全て特に在に準用する〕　：へテロ三官能性抗体、例えば複合体が癌腫及び エフェクター細胞、例えばＴ細胞などのキラー細胞の両者に結合するようにもう 一つの抗体とカップリング或いは組合わされた抗体〔例えば、Ｐｅｒｅｚ、　ｅ ｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｅｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ、、　ＩＨ：　ＩＨ−１７８（１９ ８Ｂ）；及びＬａｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、 　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８２：８１１４Ｂ−８６５２（１９８５）に記載されて おり、その開示内容は共に在に特に準用する〕　；及び自生の、即ち非−接合或 いは非−複合化抗体〔例えば、Ｈｅｒｌｙｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　７９：　４７６１−４７６５（ １９ｇ２）；　５ｃｈｕｌｚ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８ ０：　５４０７−５４１１（１９８３）；　Ｃａｐｏｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ。

８０：　７３２Ｂ−７３３２（１９８３）；　５ｅａｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

４５：　５９１０−５９１３（１９１ｉ５）；　Ｎｅｐｏｔａ、　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　８１：　２ｇ６４−２８８７（１９８４）： 　Ｋｏｐｒｏｖｓｋｉ、ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１：　２１Ｂ−２１９（１９８４）　；及びＨｏｕｇｈ ｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　 ＵＳＡ。

８２：　１２４２−１２４８（１９８５）に記載されており、その全ては在に特 に準用する〕などが挙げられる。

この方法においては、モノクローナル抗体−治療剤接合体を癌腫部位に投与して 、癌腫組織を直接に治療剤に曝すことができる。

Ｄ、免疫組織化学及び免疫細胞化学アッセイ本発明の第二世代モノクローナル抗 体を用いるヒト癌腫或いは転移の診断のための或いは示差診断を行うための免疫 組織化学（以下「１ＨｃＪ）及び免疫細胞化学（以下ｒｌｃｃＪ）アッセイは以 下に詳細に説明するようにして行われる。

本発明の第二世代モノクローナル抗体を生検標本（ＩＨＣについて）或いは体液 （例えば胸膜滲出物、腹水、唾液或いは膣液）からの細胞（Ｉ　ＯＣについて） の５μ部分を含有するスライドに添加する。一連のリンカ−（ビオチニル化つマ 抗−マウスＩｇＧ後アビジンＤＨ：ビオチニル化ワサビダイコンペルオキシダー ゼ複合体）及び染料（例、ジアミノベンジジン）を次いでスライドに添加して色 反応により第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体と 生検或いは体液中の癌腫細胞との結合を検出する。即ち、癌腫細胞は常態のまま では赤褐色に見えるのに対し、良性細胞は青色（バックグラウンド染色）に見え る。萩に準用される文献（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ、　ｒ免疫細胞化学Ｊ　　（ Ｉｍｓｕｎｏｃｙｔｏｃｈｃｍｌ−ｓｔｒｙ）　Ｊ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｊｏ ｈｎ　Ｖｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、第二版、　ｐｐ、８２−１６９（１９７９） 参照〕に記載されているようなその他のリンカ−１染料及び引続く色反応を勿論 適用してよい。この方法により、（ａ）癌腫細胞が癌の診断を行う補助として生 検標本及び体液内に検出することができ、及び（ｂ）示差診断を行うことができ る、例えばＴＡＧ−７２は肺の腺癌及び肺の腺鱗状癌腫に存在するがしかし小細 胞癌腫には存在しないことが示されている。即ち、本発明の第二世代モノクロー ナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体の肺生検に対する結合の検出は小 細胞肺癌を除外する。更にＴＡＧ−７２は悪性の中皮腫には発現されないことが 示されているので、本発明の第二世代モノクローナル抗体は、従って肺の腺癌を 悪性の中皮腫から区別することに用いることができる。

癌の診断のための或いは示差診断を行うためのＩＨＣ及びＩＣＣアッセイの使用 は例えば次の文献に記載されているようにして、当業者に公知であるか容易に決 定される方法により達成される〔例えば、）Ｊｕｔｉ−ｅｔ　ａｌ、＊Ｉｎｔ１ ．　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９：　５８９−５４５（１９８２）；　Ｓｔｒａ ｓｌｇｎｏｎｌ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　８１：　５４３−５５２ （１９ｇ：ｌ）；　５ｚｐａｋ。

ｅｔ　ａｌ、、＾ｅｔａ　Ｃｙｔｏｌｏｇｌｃａ、　２８：　３５Ｂ−３８７（ １９８４）：ＪｏｈｎｓＬｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、 　４５：　１８９４−１９００（１９８５）　；５ｚｐａｋ、　　ａｔ　　ａｌ 、、　　Ａｓ、　　Ｊ、　　Ｐａｔｈ、、　　１２２：　　２５２−２６０（１ ９８Ｂ）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　 ４Ｂ：　８５０−８５７（１９１１６）　；Ｔｈｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、＋　４６：３１１Ｂ−８１２４（１９８Ｂ）：０ｈｕｃｈ１ ．　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｉｎｔｌ、　　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　　３８：　　６ ４３−６５０（１９８Ｇ）　：Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、、　　４５：　　６４８２−８４７０（１９８６）　；及びＴｈ ｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４７：　５０５−５１２ （１９ｇ？）（これらの開示内容は全て蕊に特に準用する）〕。

スライド当り用いられる本発明の第二世代モノクローナル抗体の量及びインキュ ベーション時間及び温度は変えられてよいが、しかし通常ＩＨＣ及びＩＣＣアッ セイは約４０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を用いて約４℃で約１８時間行わ れる。

Ｅ、抗−イディオタイプ網目の活性化 本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を用 いる癌治療のための抗−イディオタイプ網目の活性化は以下に詳細に説明される ように行われる。

本発明の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体（Ａ ｂｌと命名される）を長間隔で患者に投与する。患者の免疫系はＡｂｌの結合部 位に結合特異性を有する抗体（Ａｂ２と命名される）の発生により応答する。こ れらの抗−イディオタイプ抗体（Ａｂ２）は次いでＡｂ２の結合部位に結合特異 性を有する抗体（Ａｂ３と命名される）の形成を顕在下する。

Ａｂ２抗体は元のＴＡＧ−７２の内部像であり、従ってＡｂ３抗体は結合特異性 を有し、且つ潜在的に癌腫産生イディオタイプ網目を活性化するモノクローナル 抗体の使用及びこれを達成するために用いられる操作は、例えば次の文献に記載 されるように当業者に容易に公知であるか容易に決定される（Ｎ１ｓｏｎｏｆＴ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ。

Ｌｓｓｕｎｏｌ、　ａｎｄ　Ｐａｔｈ、、　２１；　３９７−４０６（１９８１ ）；　Ｐｏｒｓｔｒｏｓ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　８０３：　６２７−６２９（１９８３）；　 ＫａｕｆＴｍａｎ、　ａｔａｌ、、　Ｊ、　１ｗｍｕｎｏ１．　ｉｌｌ：　２５ １９−２５４１（１９８３）：　Ｒｅａｇｅｎ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒ ｏｌ、、　４８：　６６０−６６６（１９８３）；　Ｋｏｐｒｏｖｓｋｌ、　ｅ ｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１ ：　２１６−２１９（ｌＨ４）　；Ｈｅｒｌｙｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉ ＊ｍｕｎｏ１．、１４３：　１３０Ｇ−１８０４（１９８５）；Ｋｏｐｒｏｖｓ ｋｉ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　１ｍ５ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏ、、　１１５： 　２７−８８（１９８５）：　Ｋｏｐｒｏｖｓｋｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉ ｅｎｃｅ、　２３２：　１００−１０２（１９８５）；　　Ｇｒｅｅｎｅ、　　 ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｉ＊ｍｕｎｏ１．、　１８７：２９８０−２９１ ６（１９１１６）：　　Ｋｏｈｌｅｒ、　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｊ、　　Ｉ− ＊ｕｎｏ１．．　１：１７：１７４３−１７４９（１９８Ｂ）；　Ｎｏｔｋｉｎ ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６８：　１８５５−１ １６０（１９ＢＢ）　（これらの開示内容は全て荘に特に準用する）〕。

抗−イディオタイプ網目の活性化を用いて患者が癌腫産生ＴＡＧ−７２に対して 活性免疫応答を装備できるように患者の免疫系を刺戟することができる。

以下の具体例は例示を目的としてのみ提供されるものであり、本発明の範囲を制 限する趣旨のものではない。

例　　　Ｉ ＬＳ−１７４Ｔ結腸癌腫細胞（ＡＴＣＣＮＱ、ＣＲＬ　−１８８）を、１０％（ ｖ／ｖ　）熱−不活性化ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００ μｇ　／　ｍｌストレプトマイシンを補給した非−必須アミノ酸を有するＥａｇ 　Ｉ　ｅの最少必須培地中において生育した。これらのＬＳ−１７４Ｔ細胞をマ イコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種の存在について試験を行ったところ陰 性であることが判明した。

４週令のメス無胸腺マウスに０．１ｍｌの培養培地中の１×１０６個のＬＳ−１ ７４Ｔ細胞を皮下接種した。癌腫異種移植片をそれらが約１．０ｃｍ直径に到達 した時点（細胞移植後１５〜２０日後）で採取して、液体窒素中に迅速凍結し、 −７０℃に貯蔵した。大きな癌腫異種移植片は壊死のために用いられなかった。

その後、約３ｇの凍結ＬＳ−１７４７ヒト癌腫異種移植片をを２０ｍＭ　　Ｔｒ ｉｓ　（ｐＨ７，２）及び１５０ｍＭＮａｃｌを含んでなる緩衝液（以下ｒＴＢ ＳＪ）中においてＯｍｎ　ｉ　”、キサ−で４５秒ホモジナイズした。

ホモジナイズされた異種移植片を次いでガラスウールを通して濾過し、予めＴＢ Ｓ中において平衡化した５ｅｐｈａ−ｒｏｓｅ　　ＣＬ　−４Ｂカラムサイジン グカラム（Ｐｈａｒｉａｃｉａ。

ｔｌｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）　　（５，５Ｘ２５ｃｍ）にかけた。このカ ラムをＴＢＳ　（ｐＨ７，２）を用いて溶出した。

７．０ｍｌの両分を集め、直接結合アッセイ１／１０容稀釈液中で調べた。即ち 、５０μｇの稀釈液を９６−ウェルのポリ塩化ビニルマイクロタイタープレート （Ｄｙｎａ−ｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、＋　Ａｌｅｘａ ｎｄｒｉｖａ　ＶＡ　）のウェルに添加した。非特異的タンパク質吸着を最少に するために、これらのマイクロタイターウェルを８．０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，２ ，５ｍＭ　　ＫＣＩ、１４０ｍＭＮａＣ１，０，５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１．　 ＯｍＭＣａ　Ｃｌ　２を含んでなるリン酸緩衝化塩水（ｐＨ７，２）（以下「Ｐ ＢｓＪ）中の、１００μｇの５．０％ウシ血清アルブミン（以下ｒＢｓＡＪ）で 処理し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＢＳＡを除去し、Ｃｏ１ ｃｈｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４４：５７４４−５ ７５１（１９８４）に記載されるようにして、ウェル当り５０，０００ｃｐ■／ ２５μｇで調製された１２５Ｉ−Ｂ　　７２．　３を各ウェルに添加した。４℃ における一晩のインキュベーション後、未結合１２５Ｉ−Ｂ７２．　３をＰＢＳ 中１．０％ＢＳＡＣｖ／ｖ　）で洗浄することにより除去した。結合１２５Ｉ− Ｂ７２．３は個々のウェルをプレートから切取り、放射能をガンマカウンター（ ＲＩＡｇａｗＩｌａ、　ＬＫＢ、　Ｂｒｏ＋ｎａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）中において測定することにより検出した。

その後、ピーク画分をプールしく１３０ｍ１の材料）、ＴＢＳで洗浄されたＢ７ ２．３アフイニテイ力ラムにかけた。この８７２．３アフイニテイ力ラムはＪｏ ｈｎｓｏｎ。

ｅｔ　ａｌ、、ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６：　８５（１−８５７（１９８ Ｂ）に記載されるようにして調製され、２００ｍｇ０Ｂ　７２．　３とカップリ ングされた１００ｍ１の１．１′　　−カルボニルジイミダゾール活性化アフィ ニティマトリックスＲｅａｃｔａ−Ｇｅｔ　Ｈシロ５Ｆ　（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒ ｏｅｋｆ’ｏｒｄ、　ＩＬ）をを含んでなるものであった。

このカラムをＴＢＳで洗浄し、結合タンパク質をＴＢＳ中３．０ＭＮａＩで溶出 した。このカラムを最終的にＴＢＳで洗浄した。

５．０ｍｌの両分を集め、上記の如く行われた第二の直接結合アッセイにおいて 調べた。ピーク画分をプールしく９２ｍ１のタンパク質）、４℃で一晩４．０ｇ の２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　（ｐＨ７，２）に対して透析した。このようにして 得られた精製ＴＡＧ−７２をカルボキシメチルセルロースのナトリウム塩である Ａｑｕａｃｉｄｅ　ＩＩ　（Ｃａｌ−ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、 　ＣＡ）中で濃縮して免疫原として用いた。

以下にＣＣと命名される群として、３匹の４週令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウ スを、等容量の完全フロイントのアジュバントと予備混合された上記の如く精製 された１０μｇのＴＡＧ−７２を腹腔内接種することにより免疫化した。８０日 後、これらのマウスは等容の不完全フロイントのアジュバントと予備混合された 上記の如く精製された５０どのＴＡＧ−７２のブースター投与量を腹腔内に受取 った。７日後、これらのマウスは静脈内接種により塩水中１０μｇのＴＡＧ−７ ２を受取った。膵臓を３日後細胞注入のために採取した。

２、ＭＡＴＡＧ群 以下にＭＡＴＡＧと命名される群として、２匹の４週令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　 ｃマウスを、等容量の完全フロイントのアジュバントで予備混合された上記の如 く精製された５０μｇのＴＡＧ−７２を腹腔内接種することにより免疫化した。

７日後、これらのマウスは等容量の不完全フロイントのアジュバントで予備混合 された上記の如く精製された５０μｇのＴＡＧ−７２のブースター投与量を腹腔 内に受取った。７日後、これらのマウスは静脈内接種により塩水中１０μｇのＴ ＡＧ−７２を受取った。膵臓を３日後細胞融合のために採取した。

Ｃ，ハイブリドーマの調製 体細胞のハイブリッド（バイプリドーマ）をＨｅｒｚｅｎ−ｂｅｒｇ、等の［実 験免疫学便覧（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｒＥｘｐｅｒｌｍｅｎ−ｔａｌ　Ｉｇｎｅ ｕｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ　（Ｏｘｆｏｒｄ、　Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ、　ｐｐ、２５ ．１−２５．７（１９７ｇ））の方法の修正法を用いて調製した。即ち、免疫化 マウスからの膵臓細胞の単細胞浮遊液をマウスの膵臓組織をＮ（Ｌ３メツシュス テンレススクリーン（Ｂ、　Ｆｅｎｅｎｅ。

Ｇｏ、、　Ｉｎ’ｃ、、　Ｎｏｒｃｅｓｔｅｒ、　Ｍ＾）を通すことにより作製 した。

これらの肺臓細胞及びＮ５−１マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ込ＴＩＢ−１８）を ２．０ｍＭグルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０単位／ｍｌのペ ニシリン、５０μｇ　／　ｍｌのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍｌの 抗真菌混合物であるＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｃｏａ＋ｐａｎｙ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ。

ＮＹ）を含有するＲＰＭ　Ｉ　−１６４０培地中で洗浄した。

次いで肺臓細胞及びＮ５−１マウス骨髄腫細胞を４：１の比率で混合し、５０％ （Ｖ／Ｖ　）ポリエチレングリコール（分子量１５００）　　（ＢＤＨＣｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｌｔｄ、、　Ｐｏｏｌｅ。

Ｅｎｇｌａｎｄ　）を用いて融合した。融合後、９６−ウェルのマイクロタイタ ープレート（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＨＡ　）の個々のウェル にＩ　Ｘ　１０６個の全細胞数（０，１ｍ１）の細胞浮ａ液を播種した。融合細 胞を次いで）ＩＡＴ培地を用いる生育のために選択した。

ハイブリドーマ細胞系のクローニングは限界稀釈法により行った。即ち、９６− ウェルマイクロタイタープレート（ＣｏｓＬａｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｈ Ａ　）の２４個のウェルに次の濃度のハイブリドーマ細胞の一つを播種した：１ ０細胞／ウェル、５細胞／ウエル、１．０細胞／ウエル、或いは０．５細胞／ウ エル。４週令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの胸腺から得られたマウス胸腺細 胞を１０６■胞／ウエルの濃度でフィーダー細胞として各ウェルに添加した。

ウェルは最終的に単細胞培養液の生育を生ずる濃度で播種された。

ＣＣ群については合計２．５６７の初期ハイブリドーマ培養物が得られ、Ｍ　Ａ 　Ｔ　Ａ　Ｇ群については合計２０００の初期ハイブリドーマ培養物が得られた 。更にスクリーニングのために選ばれた全ての７１イブリドーマ細胞系を２回ク ローニングした。

ＣＣ群を転移乳癌及び正常肝臓及び肝臓からの細胞抽出物を用いて５ＰＲＩＡに おいてアッセイした。

即ち、５０μｇの細胞抽出物（５μｇ）をＣｏｏｋｅ丸底ポリ塩化ビニルマイク ロタイター（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌｏｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ、　Ａｌｅｘａｎ ｄｒｉａ、　ＶＡ）の各ウェルに添加し、乾燥させた。非−特異的タンパク質吸 着を最少にするために、マイクロタイターウェルをＰＢＳ中１００ｇの５．０９ ６（ｖ／ｖ）ＢＳＡで処理し、試料を被覆して１時間インキュベートした。この インキュベーション及び全ての引続くインキュベーションは３７℃で行われた。

ＢＳＡを次イテ除去し、ウェルを１回ＰＢＳ中１．０％（Ｖ／Ｖ　）ＢＳＡで洗 浄した。次いで、５０μｇのノ＼イブリドーマ上澄液をウェル当り添加した。１ 時間インキュベーション後、未結合イムノグロブリンをプレートをＰＢＳＢｉ１ ２％（Ｖ／Ｖ）ＢＳＡで１００μｇ／ウェル／洗浄で３回洗浄することにより除 去した。

抗体結合を決定するために、ウェルを次いで２５μｇの１２５Ｉ−ヤギー抗−マ ウスＩｇＧ（γ鎖特異性）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆Ｐｅｒｒｙ、　Ｇａｉｔ ｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）てウェル当り７５，０００ｃｐｍ／２５μｇにて３ ７℃で１時間インキュベートした。上澄液を吸引し、プレートをＰＢＳＢｉ１２ ％（ｖ／ｖ　）で１００μＮ／ウエル／洗浄にて４回洗浄した。

これらのプレートを次いでＫｏｄａｋ　ＸＡＲフィルム及びＤｕｐｏｎｔ　ｌＪ ｇｈｔｎｉｎｇ−Ｐｌｕｓ補カスタカスクリーンるオートラジオグラフィに付し た。これらのフィルムを１６時間後、−７０℃で現像した。結合ｃｐａ＋は又プ レートから個々のウェルを切取りｃｐｓをガンマカウンター中で測定することに より検出した。

結果は５ＰＲＩＡにおいて癌腫抽出物に特異性を有するが、しかし正常抽出物に は有さない４３３個のＣＣ培養物をもたらした。

これらの４３３個のＣＣ培養物を次いで下記表１に示される細胞抽出物を用いて 上記の如＜５ＰＲＩＡにてアッセイした。

表　　　１ 一次直腸癌腫 転移孔癌腫 正常腎臓 正　　常　　肝　　臓 正　　常　　直　　腸 正　　　常　　　胃 正常骨髄 正　　　常　　　肺 正常甲状腺 多形核白血球 赤　　　血　　　球 これらの結果、５ＰＲＩＡにおいて癌腫抽出物に対して特異性を有するが、しか し上記表１に掲げた正常抽出物に対しては有さない９９個のＣＣ培養物をもたら した。

次いで、全ての９９個の培養物を９５０４個のウェル中にクローニングし、各ウ ェルについて単一コロニーの生育をチェックした。単一コロニーを有するウェル を更にアッセイのために選択した。選択されたウェルをヒト乳癌及び−次結腸癌 腫並びに正常肝臓の抽出物を用いて上記の如＜５ＰＲＩＡでアッセイした。５Ｐ ＲＩＡにおいて、癌腫抽出物に対して特異性を有するが、しかし、正常肝臓抽出 物に対しては有さないコロニーを再クローニングし、再び５ＰＲＩＡにおいて結 腸癌腫抽出物に対して結合特異性を何するがしか１２正常肝臓抽出物に対しては 有しないことについてアッセイした。この結果、結腸癌腫に対しては結合特異性 を有するがしかし正常肝臓抽出物については有しない２９個のＣＣモノクローナ ル抗体が得られた（第１図参照）。

第１図に示される２９個のＣＣモノクローナル抗体の全ては、直腸腺癌腫の抽出 物に対して結合特異性を示すが、しかし次の正常及び／又は良性組織の抽出物に 対しては結合特異性に欠ける：結腸（表面杯状細胞に対して最少結合特異性）、 卵巣、胃（腸変質形成の杯状細胞に対して最少の結合特異性）、内子宮頚（腺表 皮に対する最少結合特異性）、脳、腎臓、膵臓、肺（表皮に対する最少結合特異 性）、皮膚（皮脂１腺上皮にする最少結合特異性）、肝臓、前立腺、子宮（分泌 用子宮内膜のみに対する結合特異性）、副腎、膵臓、心臓、リンパ節、骨髄、乳 房及び小腸（表面粘膜細胞に対する最少結合特異性）。

そのように産生された２９個のＣＣモノクローナル抗体のうち、好ましいモノク ローナル抗体を産生ずるハイブリドーマをＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｃｃＬｉｏｎにＣＣ４９（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ−９４５９） ；ＣＣ８３（ＡＴＣＣＮＣＬＨＢ−９４５４）；ＣＣ５０（ＡＴＣＣＮａＨＢ− ９４５７）；ＣＣＩＩ　（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ−９４５５）；及びＣＣ１５（Ａ ＴＣＣＮｏ、ＨＢ−９４６０）の下に寄託した。

２、ＭＡ　Ｔ　Ａ　０群 ＭＡＴＡＧ群を抗体の結合を検出するために、５０μｇのウサギ−抗−マウスＩ 　ｇ　Ｍ　（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ。

Ｍａｌｖｅｒｎ、　ＰＡ　）を各ウェルに添加した以外は、ウェル当り１／８０ 稀釈率のＰＢＳ中のＴＡＧ−７２を用いてＣＣ群について本質的に上記したと同 様にして５ＰＲＩＡにおいてアッセイした。これらのプレートを３７℃で１時間 インキュベート後、　　　■−標識化タンパク質Ａ　（Ｓ　ＰＡ）　　（Ｐｈａ ｒｍａｃｊａ、　Ｕｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ　）を５０．０ＯＯｃｐｒａ／ ２５μｊ７にてウェル当り添加し、再び３７℃で１時間インキュベートさせた。

未結合ＳＰＡをＰＢＳ中１，０％（ｖ／ｖ）ＢＳＡで十分に洗浄して除去した。

ＴＡＧ−７２及びＰＢＳを用いてアッセイした２０００個のＭＡＴＡＧ培養物の うち、１１０個はＴＡＴ−７２に対する結合特異性を有することが判明した。Ｔ ＡＧ−７２を用いる、上記の如＜５ＰＲＩＡにお胆癌抽出物及びＴＡＧ−７２に 対して結合特異性を有するが、しかし、正常肝臓抽出物については有さない３４ 個の培養物を得た。これらを３２６４個のウェルにクローニングし、元の３４個 の培養物の各々の２０ウエルのアッセイを上記と同様にして５ＰＲＩＡにおいて ＴＡＧ−７２及びＰＢＳを用いてアッセイした。これによりＴＡＧ−７２に結合 特異性を有する２３個の培養物が得られた。これらの２３個の培養物を引続き生 育させ、更に正常膵臓及び正常肝臓に対する結合特異性の欠乏、及び転移乳癌抽 出物に対する結合特異性について、上記の如＜５ＰＲＩＡにおいて更にアッセイ し、又ＴＡＧ−７２及びＰＢＳを用いて上記の如＜５ＰＲＩＡにおいてアッセイ した。これらの結果は、癌腫病抽出物及びＴＡＧ−７２に結合特異性を示すがし かし正常抽出物には示さない１５個の培養物をもたらした。これらの培養物を次 いで上記の如＜５ＰＲＩＡ中において再クローニング及び再アッセイして１５個 のＭＡＴＡＧモノクローナル抗体を生成した（第１図参照）。

第１図に示される全てのＭＡＴＡＧモノクローナル抗体は卵巣癌腫、結腸腺癌腫 、乳房の浸潤脈管癌腫瘍、非−小細胞排癌腫に対しては結合特異性を示すが、し かし、次の正常及び／又は良性組織の抽出物に対しては結合特異性を欠く：結腸 （粘膜杯状細胞に対する最少結合特異性）、卵巣、良性滲出液（リンパ球及び中 皮細胞に対する最少結合特異性）、肺（気管上皮に対する最少結合特異性）、膵 臓、肝臓、乳房、腎臓、骨髄、胃（（表面上皮に対する最少結合特異性）、皮膚 、神経、上皮小体、心臓、膵臓、リンパ節、副腎、甲状線、小腸（表面粘膜に対 する最少結合特異性）、脳、胆嚢、子宮頚、子宮（子宮内膜の分泌相のみに対す る結合特異性）、子宮内膜（子宮内脱線上皮に対する最少結合特異性）、膀胱、 虫垂、ラッパ管、筋肉、唾液腺、胸腺、精巣及び食道。

そのように産生された１５個のＭＡＴＡＧモノクローナル抗体のうち、ハイブリ ドーマ産生ＭＡＴＡＧ１２が好ましく　、Ａｌｌ１ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＭＡＴＡＧ　　１２　（ＡＴＣＣＮａＨ Ｂ−９４５６）の下に寄託された。

ＣＣ群として、５０μｇのポリクローナル抗−マウスＩ　ｇ　Ｇ　（Ｊａｃｋｓ ｏｎ　１ａｕｎｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｕｊｅｓ、　Ｉｎｃ −Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　ＰＡ）を９６−ウェルのポリ塩化ビニル（Ｄｙｎａ ｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ａｌｅｘａｎｄｒ！ａ、　ＶＡ　）マ イクロタイタープレートに吸着させた。ＩｇＧをＰＢＳで稀釈した。これらのプ レートを３７℃で一晩インキユベートした。翌日、１００μＮのＰＢＳ中の５． ０％（ｖ／ｖ　）ＢＳＡを各ウェルに添加し、１時間インキュベートさせて非− 特異的吸着を最少にした。これらのウェルを次いでＰＢＳ中１．０％（ｖ／ｖ） ＢＳＡで洗浄した。５ｕｌの未稀釈ＣＣ培養上澄液を二つのウェルの各々に添加 した。これらのプレートを再び３７℃で１時間インキュベた。ウサギ−抗−マウ ス１ｇＧ　　ＩｇＧ２ｂ１１ｇＧ３．１ゝ Ｉ　ｇＭＳＩ　ｇＡ　　（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　　Ｍａｌｖ ｅｒｎ、　　ＰＡ）ＤＣ−１２（ＮＩＨＳＮＣＩ、ＬＴＩＢ）及びＰＢＳ中対照 １．　０　（ｗ／ｖ　）　ＢＳＡをウェル当り５０μＮで添加した。１時間のイ ンキュベーション後、プレートを上記の如く３回洗浄した。次いで、５０，００ ０ｅｐ１１の１２５■−標識化タンパク質Ａ（ＳＰＡ）を各ウェルに添加し、１ 時間インキュベートし、ＰＢＳ中１．０％（ｖ／ｖ）ＢＳＡで４回洗浄し、ウェ ル当りのｃｐｓをガンマカウンター中で計数した。結果を第１図に示す。

２、ＭＡＴＡＧ群 ＭＡＴＡＧ群として、アイソタイプを、ＣＣ群について上記したのと本質的に同 様にして、平行アッセイにより決定した。しかしながら、検出のために、　　　 Ｉ−標識化タンパク質Ａ　（ＳＰＡ）に代えて、一方のアッセイは１２５Ｉ−標 識化ヤギー抗−マウスＪ　ｇＧ　（Ｋｊｒｋｅｇａａｒｄ＆　Ｐｅｒｒｙ、　Ｇ ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ　）を用い、他方のアッセイは１２５Ｉ−標識 化ヤギー抗−マウスＩ　ｇＭ　（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ、　Ｇａｉ ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ　）を用いた。

このＭＡＴＡＧ群は、更に高速液体クロマトグラフィ（以下ｒＨＰＬｃＪ）分析 によりそれらの五二体構造を特性化した。ＨＰＬＣ分析は０．２Ｍリン酸ナトリ ウム（ｐＨ６，８）中で平衡化したＺｏｒｂａｘ　　Ｇ　Ｆ　−４５０カラム、 ０．９４　Ｘ　２５ｃｍ　（Ｄｕｐｏｎｔ、讐ｉ１ｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ）を 用いて行った。１００μｇのＭ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｇ培養上澄液をカラムにかけ、カ ラムを０．５ｍｌ／分の流速で運転し、０．５ｍ１画分を１分間隔で集めた。こ れらの画分について上記の如くアイソタイプを分析した。結果を第１図に競争Ｒ ＩＡはＢ７２．３及び本発明のＣＣモノクローナル抗体が異つた抗原決定基を認 識するか否かを決定するために行われた。即ち、８７２．３及びＣＣモノクロー ナル抗体についてそれらのＬＳ−１７４Ｔ結腸癌腫細胞の抽出物に対する１２５ ■−標識化Ｂ７２．３の結合に対して競争する能力を次のようにしてアッセイし た。

５．０μｇのＬＳ−１７４Ｔ結腸癌腫細胞抽出物をポリ塩化ビニルマイクロタイ タブレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｊｅｓ、　Ａｌｅｘａｎ ｄｒｌａ、　ｖＡ）の各ウェルに吸着させ、各種量の競争ＣＣモノクローナル抗 体（１０μｇ／μｇ〜０．００４μｇ／μＩ）を添加して結合部位を飽和した。

４℃で６時間インキュベーション後、５０，０００ｃｐａ／２５μｇの１２５１ −８７２．３を各ウェルに添加し、４℃で１２時間インキュベートした。結合１ ２５１−Ｂ７２．３を個々のウェルを切取りウェル内のｅｐｆｉｌをガンマカウ ンターで測定することにより求めた。競争体としての飽和量の８７２．３で予備 インキュベートしたウェル内のｃｐＩＩを１００％競争率と考えた。結果を第２ Ａ。

２Ｃ，２Ｅ及び２Ｇ図に示す。第２Ａ図において、ＣＣ４１を競争抗体として用 いた。第２Ｃ図においてはＣＣ６０を競争抗体として用いた。第２Ｅ図において はＣＣ８３を競争抗体として用いた。第２Ｇにおいては、ＣＣ４９を競争抗体と して用いた。

第２Ａ及び２０図に示される如く、ＣＣ４１及びＣＣ６０はＢ７２．３とは全く 競争しなかった。これはＣＣ４１及びＣＣ６０がＢ７２．３に対するよりもＴＡ Ｇ−７２上の異ったエピトープに対して特異性を有することを示す。第２Ｅ及び ２Ｇ図に示される如く、ＣＣ８３及びＣＣ４９はＢ７２．３と部分的に競争する 。これは、ＣＣ８３及びＣＣ４９により認識されるエピトープがＴＡＧ−７２分 子上の８７２．３エピトープと部分的（しかし完全ではない）相同性を共有する か、或いは、ＣＣ８３及びＣＣ４９エピトープが８７２．３エピトープと区別さ れるが、しかし、近くにあって立体的障害を生ずることを示す。

その後、ＣＣ４９がＢ７２．３、ＣＣ５０、ＣＣ４６、及びＣＣ８３と同−或い は異った抗原決定基を認識するか否かを決定するために競争ＲＩＡを行った。即 ち、これらの抗体について上記の如きＬＳ−１７４Ｔ結腸癌腫細胞の抽出物に対 する１２５Ｉ−標識化ＣＣ４９の結合に対するそれらの競争能力をアッセイした 。得られた結果を第３図に示す。第３図は、（１）モノクローナル抗体ＣＣ４６ 及びＢ７２．３により認識されるＴＡＧ−７２上のエピトープは、モノクローナ ル抗体ＣＣ４９により認識されるエピトープと殆んど全く相同性を共有しない； （２）ＣＣ８３により認識されるエピトープはＣＣ４９により認識されるそれと 相当な相同性を有するが、しかしＣＣ８３曲線の変位により示されるように同一 ではない；及び（３）モノクローナル抗体ＣＣ５０により認識されるエピトープ はＣＣ４９により認識されるそれと部分的相同性を共有するか或いはＣＣ４９の それと区別されるが、しかし近い位置にあって立体障害を生ずることを示してい る。

ＴＡＧ−７２に対する本発明の第二世代モノクローナル抗体の結合親和性（親和 性定数）をＨｅｙｍａｎ等のＪ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　０ ８：　１９３−２０４（１９８４）の操作の修正方法を用いる５ＰＲＩＡにより 決定した。即ち、ＰＢＳ中２８０単位／ｍｌの濃度に稀釈した（単位数はＰａｔ ｅｒＳＯｎｅｔ　ａｔ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３７：　６５ ９−８６６（１９８Ｂ）に記載される如く決定した）３０μｐの精製ＴＡＧ−７ ２を９６ウエルのポリ塩化ビニルマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ａｌｅｘａｎｄｒｆａ、　ＶＡ　）で乾燥した 。残存非−特異的活性基をＰＢＳ中５．０％（ｖ／ｖ）ＢＳＡで保護した。次い で下記表２に示される精製モノクローナル抗体（Ｃｏｌｃｈｃｒ、　ａｔ　ａｌ 、、　Ｃａｎｃｃｒ　Ｒｃｓ、、　４４：５７４４−５７５１　（１９＋ｉ４） に記載されるようにして精製）の１：１．５逐次稀釈液２０ｔｉｆ）を１−Ｏｕ ｒ／ｍｌから出発してウェルに添加した。４℃で一晩インキュベート後、プレー トをＰＢＳ中１．０％（ｖ／ｖ）ＢＳＡで３回洗浄した。次いで１２５　Ｉ−標 識ヤギー抗−マウスＩｇＧ（Ｋｌｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ、　Ｇａｉ ｔｈｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）をウェル当り７５．０００ｃｐ纒／２５μｇで添加 し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ中１．０９ｃｉ　（ｖ／ｖ　）　ＢＳＡ で３回洗浄後、個々のウェル中のｃｐｓを上記の如く二［数した。

ｃｐ−値を結合モノクローナル抗体のｉＱ度に変換するために、ＴＡＧ−７２と 共にインキュベートされたが、しかし、それに結合されなかった上澄液中の残存 遊離モノクローナル抗体を４．０ｇ／ｍｌのヒツジ抗−マウスｌ　　ｇ　　Ｇ　 　（Ｊａｃｋｓｏｎ　　ｌｍ５ｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅ５．　　Ｉｎｃ−Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　Ｐ＾）で予ｆ；１ｈｌＥ　Ｔｉ ｐされたもう一つの９６ウエルポリ塩化ビニルマイクロタイタープレート上でイ ンキユベートし、　　　ｌ−標ぷ化ヤギ抗−マウスＩｇＧＣＫｌｒｋｃｃａａｒ ｄ　＆　ＰＣｒｒｙ、　Ｇａｌｔｈｃｒｓｂｕｒｇ、　ＨＤ）を用いて検出した 。このようにして、上ｒｆｆ　？＆中に遊離モノクローナル抗体が存在しない濃 度を、各モノクローナル抗体について決定した。これらのデータからコンピュー タ曲線から得られ、各モノクローナル抗体の結合親和性定数を決定した。これら の結果を下記表２に示す。

表　　　２ ＴＡＧ−７２を用いて、ＩＦ１定した結合親和性定数親和性定数 精製抗体　　　（Ｘ１０９Ｎｌ） Ｂ７２．３　　　　２．５４ ＣＣ４６３，６４ ＣＣ２９９，４９ ＣＣ９２１４，２６ ＣＣ４９２０，５８ ＣＣ８３２７，７２ 表２は、第二世代モノクローナル抗体ＣＣ４６、ＣＣ５０、ＣＣｌ３、ＣＣ２９ 、ＣＣ９２、ＣＣ４９及びＣＣ８３は全て第一世代モノクローナル抗体８７２． ３よりも高い結合親和性定数を育することを示している。

このＣＣ群をＬＳ−１７４Ｔ細胞系及び転移孔癌腫からの細胞抽出物を用いた５ ＰＲＩＡにおいてアッセイした。５０μｇの細胞抽出物（５μｇ）をＣｏｏｋ丸 底ポリ塩化ビニルマイクロタイタープレー）　（Ｄｙｎａｔｃｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａ−ｔｏｒｌｃｓ、　Ａｌｃｘａｎｄｒｌａ、　ＶＡ）の各ウェルに添加し乾燥 させた。非−特異的タンパク質吸着を最少にするために、マイクロタイターウェ ルを１００ｕＮのＰＢＳ中５．０％（ｖ／ｖ）ＢＳＡで処理し、１時間インキュ ベーション被覆した。これ及び全ての引続くインキュベーションは３７℃で行っ た。ＢＳＡを次いで除去し、ウェルをＰＢＳ中１．０％（ｖ／ｖ）ＢＳＡで１回 洗浄した。次いで５０μｇのハイブリドーマ上澄液及び１：５Ｆｇ釈率の上ａ液 をウェル当り添加した。１時間のインキュページジン後、未結合イムノグロブリ ンをプレートをＰＢＳ中１．０％（ｖ／ｖ）ＢＳＡで１００ｕｌ／ウエル／洗浄 で３回洗浄することにより除去した。

抗体結合を決定するために、ウェルを次いで２５μｇの１２５Ｉ−ヤギー抗−マ ウスＩｇＧＣガンマ鎖特異性）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ、　Ｇ ａＩｔｈｅｒｓｂｕｒに、　ＭＤ）でウェル当り７５．０ＯＯｃｐ＊／２５μｐ で３７℃で１時間インキュベートした。上澄液を吸引し、プレートをＰＢＳ中１ ．０％（ｖ／ｖ）ＢＳＡで１００μｆＩ／ウエル／洗浄にて４回洗浄した。結合 ｃｐ■を個々のウェルをプレートから切取り、ＣＰＭをガンマカウンターで測定 することにより検出した。

第２Ｂ図に示される如く、ＣＣ４１はＬＳ抽出物と反応するが、８７２．３は反 応しない。第２Ｂ図及び表２は、ＣＣ４１がＢ７２．３よりもＢｒ、　　Ｃａ、 に対してより高い結合親和性（曲線の傾斜）を有することを示していることに注 意。ｍ２Ｄ図は、ＣＣ６０がＢ７２．３と同様にＬＳ抽出物に対して結合特異性 を有しないが、ＣＣ６０は８７２．３よりもＢｒ、Ｃａ、に対してより高い結合 親和性（曲線の傾斜）を有することを示している。第２Ｆ図は、ＣＣ８３及びＢ ７２．３がＢｒ、Ｃａ。

抽出物に対して同様な結合特性を有するが、しかし、ＣＣ８３がＬＳ抽出物に対 して高い結合親和性を有するのに対し、８７２．３が有さないことを示す、第２ Ｈ図は、ＣＣ４９がＬＳ及びＢｒ、　Ｃａ、抽出物の両者に対して高い結合親和 性を有するのに対して、８７２．３はＬＳ抽出物に対して本質的に結合親和性を 有さないこと０．１２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ　（ｐＨ６，８）４．０％（ｗ ／ｖ）ＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ　）グリセロール及び１０％（ｖ／ｖ　）　２− メルカプトエタノールよりなる５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で稀釈された４０ μｇのＬＳ−１７４Ｔ細胞抽出物或いはヒト乳癌抽出物を、３〜１２％（ｖ／ｖ 　）線形勾配５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。

９℃で５ミリアンプ／ゲルにて８時間電気泳動を行フた後、ゲルを２５ｍＭ　　 Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，３）、１９２ｍＭグリシン、２０％（ｖ／ｖ　 ）メタノールを４Ｍ尿素及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００と共に含んでな る転移緩衝液で室温で１時間処理した。ゲルを次いで転移緩衝液で平衡化させ、 タンパク質をニトロセルロ−ス紙（０，４５μｍ孔径）に３０Ｖにおいて４℃で １６時間転移させた。次いで、ニトロセルロース紙をＰＢＳ中０．０５％（ｖ／ ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を有する５、Ｏ（ｖ／ｖ　）　ＢＳＡと共に室温で３時間 インキュベートし、ＰＢＳ中０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した 。次いで、１０ｍ１の全てのＣＣ及びＭＡＴＡＧモノクローナル抗体のハイブリ ドーマ組織培養上澄液を添加し、インキュベーションを静かに攪拌しながら室温 で２時間継続した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで 洗浄後、ニトロセルロース紙を室温で１２５　Ｉ−標識化ヤギー抗−マウスＩ　 ｇ　Ｇ　（Ｋｉｒｋｅ−ｇａａｒｄ　＆Ｐｅｒｒｙ、　Ｃａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ、　ＭＤ　）と共に１時間インキュベートした。このニトロセルロース紙を次 いで一晩十分に洗浄し、ＤｕＰｏｎｔ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｐｌｕｓ補カスタ カスクリーンて一７０℃で２時間ＫｏｄａｋＸＡＲ−５Ｘ−線フィルムに曝露し た。全ての実験についてＮ５−１組織培養上澄液を陰性対照例として用いた。

このウェスタンブロッティングアナリシスはＣＣ及びＭＡＴＡＧ抗体の５〜１２ ％の分解ゲルを有する積層ゲルの分解ゲルに約１■侵入した界面において始まる 拡散バンドに対する反応性を示した。この拡散バンドは高分子ｆｉＴＡＧ−７２ ムチン一様分子と一致する。この高分子量バンドは試験された全てのＣＣ及びＭ ＡＴＡＧ抗体に観察され、ＬＳ−１７４Ｔ細胞系抽出物及びヒト乳癌転移抽出物 の両者に検出された。

例　　　６ 免疫ペルオキシダーゼ研究 スライド上のホルマリン−固定或いは凍結組織断片の５、　０μ断片を用いた。

固定組織をキシレン中で脱パラフィンさせ、等級化Ｈ，Ｏ／エタノール濯ぎ液中 で水和させた。メタノール中０，３％（ｖ／ｖ　）　Ｈ２０２による１５分間の インキュベーションを用いて内因性ベルオキ＋２ シダーゼ活性をブロックした。Ｃａ　　及びＭｇ＋２なしにＰＢＳ中で濯いだ後 スライドをＭＡＴＡＧと命名した抗体について１：１０（ｖ／ｖ）の正常ヤギ血 清の稀釈液と１５分間インキュベートした。このインキュベーション及び全ての 引続くインキュベーションは室温で行われたが、但し、−次ＭＡＴＡＧ抗体は４ ℃で１６時間のインキュベーションが行われた。正常なブロッキング血清を除去 し、モノクローナル抗体の未稀釈組織培養上澄液を組織断片上に置き、スライド を一晩インキユベートした。

上澄液のＩｇＭを除去し、スライドをＣａ”’及びＭｇ＋２のないＰＢＳ中で１ ５分間濯いだ。ＭＡＴＡＧと命名された抗体について、１　：１６７　（ｖ／ｖ 　）の稀釈のビオチニル化ヤギ抗−ネズミＩ　ｇ　Ｇ　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、）の稀釈率で組織断片の各々に添加し、３０分間インキュベートさせた 。これらのスライドを再びＣａ＋２及びＭｇ＋２なしにＰＢＳ中で濯ぎ、次いで 室温でＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）ペル オキシダーゼと３０分間インキュベートした。もう−回ＰＢＳ濯ぎ後、０．０６ ％（ｖ／ｖ　）　３．　３′　　−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｎｏ　）を０．０１％（ｖ／ｖ　 ）　Ｈ２０２と共に５分間添加した。これらの断片を水中で簡単に濯ぎ、ヘマト 牛シリンで対比染色し、等級化エタノール／Ｈ２０濯ぎ液中で脱水させ、キシレ ン中で透明化しく残存Ｈ２０の除去）、カバースリップ下１；ｌ：　Ｐｅｒｍｏ ｕｎｔ　（Ｈ識字搭載培地、Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、　） を用いて搭載し、光学顕微鏡を用いて検査した。各断片のモノクローナル抗体結 合を示す赤褐色ジアミノベンジジン沈澱の存在を評価した。陽性癌腫細胞の概略 パーセントは各モノクローナル抗体で陽性の癌腫細胞の数を全癌腫細胞数で除し 、１００をかけて与えられた。結果を下記表３に示す。

表　　　３ 組織断片の免疫ペルオキシダーゼアッセイにおける卵巣癌１　　　　　　６　　 　　８０ 卵巣癌２　　　　　　５　　　　２５ 卵巣癌３　　　　　　１０　　　　　５５結腸直腸癌１　　　　１０　　　　　 ６０結腸直腸癌２　　　　４０　　　　　９５表３に示される如く、８７２．３ と反応性の腫瘍細胞パーセントはＭＡＹＡＧ−１２に対するよりも相当低い。

これはＭＡＴＡＧが上記癌腫に対してより高い結合特異性従って免疫組織化学的 或いは免疫細胞化学的アッセイ並びに癌のｉｎ　ｖｌｖｏ診断及び治療において より有用であることを示す。

下記表４に示すモノクローナル抗体をＩＯｄＯｇｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）を用いてＮａ１２５１で標識化した。

即ち、４０μｇの表４に示したモノクローナル抗体を０．１ｍｌの０．１Ｍリン 酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）で調整し、次いで１２ｃｍＸ７５ａｏの２０ μｇのＩＯｄＯｇｅｎで被覆されたガラス管に添加した後、０、５ｎＣｉのＮ　 ａ　１２”　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ 。

Ｈ＾）を添加した。室温で２分間インキュベーンヨン後タンパク質を不溶性１ｏ ｄｏｇｅｎから除去し、未導入１２５ＩをｌＱｍＭリン酸ナトリウム、ｆ）Ｈ７ ，２を含んでなる緩衝液を用いる１０ｍ１カラム５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５ を通すゲル濾過により抗体から分離した。空隙中のこの標識化モノクローナル抗 体をプールし、５．０ｍＭ　　Ｎａｌを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝 液（ｐＨ７，２）に対して透析した。このヨード化実験方法は、５．　０〜１５ μｃｌ／μｇ（約８．　０〜２５　Ｘ　１０６ｃｐｍ　／ｕ　ｇ）の比活性を有 する標識化１ｇＧモノクローナル抗体を与えた。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃバックグラウンド上のメス無胸腺マウス（ｎｕ／ｎｕ） を、約４退会にてＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｌｖｅｒ、　Ｉｎｃ、或いはＦｒｅｄｅｒ ｊｃｋ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｊｔｙから得た。１週間 後、マウスにＬＳ−１７４７ヒト結腸癌腫細胞（ＩＸ１０６細胞／動物）を皮下 接種した（０．　１ｍｌ／マウス）。

０．３〜１．　５ｃｍ直径の癌腫をＨする無胸腺マウスに、細胞の接種後２〜３ ；ＪＡ間後に上記の如くヨード化した下記表４に示すモノクローナル抗体のＰＢ Ｓ中の１．５μＣＩ（０，１μｇ）の注射を腹腔内に与えた。５匹の群のマウス を各種時間において放血により殺し、癌腫及び正常組織を切除及び秤量し、ｃｐ ＋ｎをガンマカウンターで測定した。各組織のｃｐｍ／ｍｇを次いで求め、癌腫 に見られたそれと比較した。結果を表４及び第４Ａ及び４Ｂ図１２５１−標識化 抗体のダラム当りの 癌腫　　６．６　　２Ｇ、６　　１３．２　　２３．１　　１２．４　　２２． ９　　２３．４肝臓　　０．８　　１．２　　０．５　　０４！　　　０．８　 　０．７　　１．２牌臓　　０．５　　１．１　　０．５　　１．０　　１．０ 　　０．７　　１．２腎臓　　０．６　　１．１　　０．４　　１．０　　１． ０　　０．７　　０．４肺　　　１．４　　２．４　　１．１　　２．１　　２ ．０　　１．８　　０．６血液　　２．９　　６．２　　２．１　　４．１　　 ３．８　　４．８　　１．１＊モノクロ一ナル抗体投与後１６８時間後第４図に 示される如く、８７２．３に対する腫瘍への注入投与量パーセントは、本発明の ＣＣ抗体に対するそれよりも相当低い。モノクローナル抗体ＣＣ４６はＢ７２． ３よりも僅かに高い親和性定数を有するに過ぎないが、表４はＣＣ４６がＢ７２ ．３よりもｉｎ　５ｉｔｕでヒト腫瘍をねらい打ちするに際し、明らかにより効 率的であることを示している。これは本発明の第二世代モノクローナル抗体がモ ノクローナル抗体８７２．３よりもＩｎ　ｖｉｖｏの癌腫のねらい打ちに対して より効率的であり、従って、癌のｉｎ　ｖｉｖｏ診断及び治療においてより有用 であることを示している。第４Ａ及び４Ｂ図は、それぞれＣＣＩＩ及びＣＣ４６ に対する各種時点における異った結合速度論及び疵種／正常組織比を示す。第４ Ａ及び４Ｂ図は、これらのモノクローナル抗体が癌腫を効率的に結合する能力を 有し長時間（！！ｐち、少なくとも７日間）癌腫に結合されていることを示して いる。

動物モデル及び臨床試験の両者におけるバイオ分布研究は、そのままのＩｇＧが 正常器官において最少のバックグラウンドを有する最適の腫瘍局在化を得るため の抗体分子の最良形態でないことを示した。その結果、本発明の第二世代モノク ローナル抗体及び８７２．３をペプシンで断片化する研究がＣｏ１ｃｈｅｒ等、 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４３ニア３Ｂ−７４２（１９８３）に記載されたの と同様にして行われた。

得られた断片を上記の如＜　　１２５Ｉで放射線標識化し、ＬＳ−１７４Ｔ結腸 癌腫細胞抽出物を用いて上記の如く５ＰＲＩＡにて結合特異性を試験した。結果 を表５に示す。

表　　　５ ＬＳ−１７４７結腸癌腫細胞 Ｆ　（ａｂ’　）２断片　抽出物に対する結合特異性８７２．３　　　　　　　 　　　　　　　　＜２％ＣＣ４９５０％ ＣＣ４６７０％ 表５に示される如く、ＣＣ４９のＦ　（ａｂ’　）２断片は限られた量の抗原を 用いて５ＰＲＩＡにおいて５０％より大きい入力カウント数を結合することがで き、又ＣＣ４６断片は７０％を越える入力活性を結合したのに対し、８７２．３ から得られた断片は本質的に全ての免疫反応性に欠けた、即ち２％未満の結合特 異性を維持したに過ぎなかった。

本発明の第二世代抗体を生理食塩水、非−毒性緩衝液などの薬学的に許容可能な 非−毒性無菌担体中に含んでなる医薬組成物も今や可能となった。この医薬組成 物中の該抗体の量は該抗体が特異性親和性或いは中和反応性を有する抗原との有 効な結合を達成するのに十分であるべきである。この医薬組成物は、必要に応じ てアジュバント或いは添加剤と共に単−或いは多投毎で該抗体を必要とする宿主 に任意の適当な方法で投与される。

本発明を詳細にその特別の実施態様に関して説明したが、当業者には各種変更及 び修正が本発明の趣旨及びその範囲から離れることなくなされ得ることが明らか であろう。

Ｆｉｇ、　２Ａ　　　　　　　　　　　Ｆｉｇ、　２ＢＦｉｇ、　２Ｅ　　　　 　　　　　　Ｆｉｇ、　２Ｆ１／Ａｂ　ＤＩＬＬＪＴＩＯＮ　　　　　　　　　 　１／Ａｂ　ＤＩＬＵＴＩＯＮ１／Ａｂ　ＤＩＬＬＪＴＩＯＮ　　　　　　　　 　１／Ａｂ　ＤＩ山Ｔｌ０ＮＡｂ　ＤＩＬＵＴＩＯＮ　（１：　５）用鍋１に１ −χ制 ｊｒｒｔり手パーをント 特表平３−５０４４３６　（２０） Ｆｉｇ、　４Ａ 補正書の翻訳文提出Ｎ（特許法第１８４条の８）平成　２　年　１　月　１６０ 慣か 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、　国際出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　　８８１０１９４１ 、発明の名称 ＴＡＧ−７２及びヒト癌腫に対して結合特異性を有する第二世代モノクローナル 抗体及びその使用方法３、特許出願人 住　所　　アメリカ合衆国バージニア用、スジ１ルグフイールド、ボート、ロイ ヤル、ロード、５２８５ 名　称　　　アメリカ合衆国 ４、代理人 （郵便番号１００） 浄書（内容に変更なし） しかしながら、モノクローナル抗体８７２．３は次の点において不利である。即 ち、（１）８７２．３は特別のタイプ例えば卵巣、結腸癌腫などの各組織などの いずれのヒト癌腫組織に対しても結合特異性を有する訳ではない［Ｎｕｔｉ、　 ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９：　５３９−５４５ （１９８２）；　Ｓｔｒａｍｉｇｎｏｎｉ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｎｔｌ、　Ｊ 、　Ｃａｎｃｅｒ、　３１：５４３−５５２（１９８３）；　Ｔｈｏｒ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎｓｔ、。

７６：　９９５−１００６（１９８６）；　Ｔｈｏｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４８：３１１８−３１２４（１９８Ｂ）；　　及びＨａ ｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

４３：　７２ｇ−７３５（１９８３）参照）；　（２）８７２．３は所定のヒト 癌腫集合体中の全ての癌腫細胞に対して結合特異性を有する訳ではない（Ｎｕｔ ｌ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｉｎｔｌ、　　（上記）；Ｓｔｒａｍｊｇｎｏｎｉ、　 ｅｔ　ａｌ、、　（上記）　　；　Ｔｈｏｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ｎａｔｌ 。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　７８：　９９５−１００６（１９８Ｂ）；　Ｔｈ ｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６：　３１Ｈｌ−３１２４（１９８Ｂ）；及びＨ ａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、＋（上記）参照）；　　（３）８７２．３は培養液中の 殆んどのヒト癌腫細胞系に対して結合特異性を有さない（Ｈａｎｄ。

ｅｔａｌ、、　　（上記）　　；　Ｈａｎｄ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅｓ、　、　４５：８３３−８４０（１９８５）　；及びＦｒｉｅｄｍａｎ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

４５二５６４８−５６５５　（１９８５）参照）；　　（４）効率的なｉｎ　ｖ ｉｖ。

の免疫診断及び治療応用に必要である高度に免疫反応性の８７２．３からのＦ　 （ａ　ｂ’　）　２、Ｆ　（ａｂ’　）及びＦ（ａｂ）断片を得ることが困難で ある；そして（５）Ｂ７２．−３はＩｇＧ１アイソタイプのものであるので８７ ２．３を用いてモノクローナル抗体エフェクター細胞媒介細胞毒性或いは補体媒 介細胞毒性研究を行うことが困難である＜１ｇｃ　　　ＩｇＧ２ｂ或いはＩｇＭ アイソ２ａゝ タイプはこれらの応用に対してはより効率的である）。

本発明の生物学的材料の寄託 ハイブリドーマ細胞系ＣＣ８３，ＣＣ９２，ＣＣ１１。

ＭＡＴＡＧ１２；ＣＣ５０；ＣＣ４６；ＣＣ４９；及びＣＣｌ３の生育可能な試 料は、アメリカン・タイプ・カルチャー０コレクシヨン（Ａｍｅｒｌｃａｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗ ｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＨＤ。

２０８５２）に１９８７年６月２６日に寄託され、それぞれ次のＡＴＣＣ名称を 有する：ＨＢ９４５３、ＨＢ９４５４、ＨＢ９４５５、ＨＢ９４５６、ＨＢ９４ ５７、ＨＢ９４５８、ＨＢ９４５９、及びＨＢ９４６０゜請求の範囲 １、　　ＴＡＧ−７２抗原及びＬＳ−１７４Ｔ細胞系の両者に対して結合親和性 を有するが、しかし正常ヒト大人組織に対して実質的結合親和性を有さず、ＴＡ Ｇ−７２に対する結合親和性が、Ｂ７２．３のＴＡＧ−７２に対する結合親和性 より大きいことを特徴とする第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片 或いは組換え体。

２、　該抗体が３Ｘ１０９Ｍより大きい結合親和性を有する請求項１記載の第二 世代モノクローナル抗体。

３、　該抗体がヒト癌腫をｉｎ　５ｉｔｕでねらい打ちするに際し、８７２．３ 抗体より約５０％多い効率を有する請求項１記載の第二世代モノクローナル抗体 。

４、　該抗体が、ＬＳ−１７４細胞系抗原に対する結合について８７２．３と０ 〜３０％の競争率を示す請求項１記載の第二世代モノクローナル抗体。

５、　該抗体がＩｇＧ２ａＳＩｇＧ２６．１ｇＧ３、及びＩｇＭよりなる群から 選ばれるアイソタイプを有する請求項１記載の第二世代モノクローナル抗体。

６、　該抗体が標識、腫瘍検出マーカー或いは治療剤に接合している請求項１記 載の第二世代抗体。

７、　該標識が放射性同位元素、螢光性分子及び酵素よりなる群から選ばれる請 求項６記載の第二世代抗体。

４２、　　該抗体が、ＡＴＣＣｋＨＢ−９４５９、ＡＴＣＣ嵐ＨＢ−９４５３、 ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ−９４５８、ＡＴＣＣＮａＨＢ−９４５４、ＡＴＣＣＮａＨ Ｂ−９４５７、ＡＴＣＣＮＣＬＨＢ−９４５５、ＡＴＣＣ磁ＨＢ−９４６０、及 びＡＴＣＣＮＱ、ＨＢ　−９４５６の同定特性の全てを有するハイブリドーマよ りなる群から選ばれるハイブリドーマから得られる請求項３２記載の方法。

４３、　　ＴＡＧ−７２及びＬＳ−１７４Ｔの両者に対して特異的結合親和性を 有し、正常ヒト大人組織に対して実質的結合親和性のないことを特徴とする第二 世代モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ。

４４、　　ＡＴＣＣ漱ＨＢ−９４５９、ＡＴＣＣＮａＨＢ−９４５３、ＡＴＣＣ ｋＨＢ−９４５８、ＡＴＣＣＮｃＬＨＢ−９４５４、ＡＴＣＣｌｌｉ［ＬＨＢ− ９４５７、ＡＴＣＣｌ１ｋＬＨＢ−９４５５、ＡＴＣＣＮＩＩＬＨＢ−９４６０ 、及びＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ−９４５６の同定特性の全てを有するハイブリドーマ よりなる群から選ばれる請求項４３記載の方法。

４５、　　請求項１記載の抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を該抗体或 いはその免疫反応性断片或いは組換え体が親和性を有する抗原を結合するに十分 な量で含み、及び薬学的に許容可能な非−毒性、無菌担体を含んでなることを特 徴とする医薬組成物。

４６６　請求項１記載の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或い は組換え体を含んでなる組成物。

４７、　　抗−イディオタイプ抗体の製造方法において、動物に該抗−イディオ タイプ抗体の産生を誘発するのに有効量の請求項４６記載の組成物を投与するこ とを特徴とする特許 ＰＣＴ／ＵＳ　　８８１０１９４１ ３　補正をする者　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３事件との 関係　　　　特許出願人 アメリカ合衆国 ５　補正命令の日付　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５手続補 正書（方式） ％式％ 事件の表示 ＰＣＴ／ｌｌｓ　８８１０１９４１ 補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 アメリカ合衆国 発送日　　平成　２年　１１月　６日 補正の対象 ・、Ｎ際調査報告 １″′−ｌ＠０°ｌ　Ａ＠＠ｌｌｃ″１″”ｐ（’：’１”／ｌ’Ｔｓ８８１０ １９４１ｌＭｌ＃１ＭｌＩＩＭａｌＡｗｌｌｃａｌ１６Ｍｍｐ、〒、、、、、、 、、、ｑ、。

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．ＴＡＧ−７２及びＬＳ−１７４Ｔ細胞系抗原に対して結合親和性を有し、正 常ヒト大人組織に対して実質的結合親和性のないことを特徴とする第二世代モノ クローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体。
2. ２．該抗体が３×１０９Ｍより大きい結合親和性を有する請求項１記載の第二世 代モノクローナル抗体。
3. ３．該抗体がヒト癌腫をｉｎ　ｓｉｔｕでねらい打ちするに際し、Ｂ７２．３抗 体より約５０％多い効率を有する請求項１記載の第二世代モノクローナル抗体。
4. ４．該抗体がＢ７２．３と０〜３０％の競争率を示す請求項１記載の第二世代モ ノクローナル抗体。
5. ５．該抗体がＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＭよりなる群から選 はれるアイソタイブのものである請求項１記載の第二世代モノクローナル抗体。
6. ６．該抗体が標識、腫瘍検出マーカー或いは治療剤に接合している請求項１記載 の第二世代抗体。
7. ７．該標識が放射性同位元素、螢光性分子及び酵素よりなる群から選はれる請求 項６記載の第二世代抗体。
8. ８．該放射性同位元衆が３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、及び３５Ｓよりなる 群から選はれる請求項７記載の第二世代抗体。
9. ９．該螢光性分子がフルオレシン及びローダミンよりなる群から選ばれる請求項 ７記載の第二世代抗体。
10. １０．該酵素がアルカリホスファターゼ及びワサビダイコンペルオキシダーゼよ りなる群から選はれる請求項７記載の第二世代抗体。
11. １１．該腫瘍検出マーカーが１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、９９ ｎＴｃ及びＧｄよりなる群から選はれる請求項６記載の第二世代抗体。
12. １２．該治療剤が放射線核種、薬品、毒素及び第二抗体より選はれる請求項６記 載の第二世代抗体。
13. １３．該放射線核種が１３１Ｉ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、２ １２Ｂｉ及び２１１Ａｔよりなる群から選はれる請求項１２記載の第二世代抗体 。
14. １４．該薬品がメトトレキセート及びアドレアマイシンよりなる群から選はれる 請求項１２記載の第二世代抗体。
15. １５．該第二抗体がキラ−Ｔ−細胞に対して特異的結合親和性を有する請求項２ ３記載の第二世代抗体。
16. １６．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ−９４５４、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ−９４５３、ＡＴＣ Ｃ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５８、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５４、ＡＴＣＣ　Ｎｏ ．ＨＢ−９４５７、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５５、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ− ９４６０、及びＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５６の同定特性を有するハイブリド ーマよりなる群から選はれるハイブリドーマから得られる請求項１記載の第二世 代抗体。
17. １７．（ａ）患者から体液或いは生検の試料を得、（ｂ）その体液或いは生検を 請求項１記載の第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え 体と接触させ、 （ｃ）第二世代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体の体液 或いは生検材料に対する結合量を決定し、及び （ｄ）工程（ｃ）における結合量を対照試料或いは所定の基底レベルと対比する 、 ことよりなり、基底レベルより大きい結合が癌腫或いはその転移の存在を示すこ とを特徴とするヒト癌腫或いはその転移の検出方法。
18. １８．該体液が血液、血漿、血清、乳頭排出物、嚢胞流体、腹水、胸膜滲出液、 精漿、精液、尿及び前立腺液よりなる群から得らばれた請求項１７記載の方法。
19. １９．体液或いは生検中に存在する材料へのモノクローナル抗体の結合量がラジ オイムノアッセイにより決定される請求項１７記載の方法。
20. ２０．体液或いは生検中に存在する物質に対するモノクローナル抗体の結合量が 酵素イムノアッセイにより決定される請求項１７記載の方法。
21. ２１．該抗体が３×１０９Ｍより大きい結合親和性を有する請求項１７記載の方 法。
22. ２２．該抗体がＢ７２．３抗体と０〜３０％の競争率を示す請求項１７記載の方 法。
23. ２３．該抗体がＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＭよりなる群から選 ばれるアイソタイブのものである請求項１７記載の方法。
24. ２４．該抗体が、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５９、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９ ４５３、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５８、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５４、 ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５７、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５５、ＡＴＣＣ 　Ｎｏ．ＨＢ−９４６０、及びＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５６の同定特性を有 するハイブリドーマよりなる群がら選ばれるハイブリドーマから得られる請求項 １７記載の方法。
25. ２５．（ａ）患者に像形成或いは検出マーカーに接合した請求項１記載の第二世 代モノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を投与し、及び（ｂ ）患者を該腫瘍検出マーカーを検出するための手段に曝すことよりなり、腫瘍検 出マーカーの局在化領域が該患者における癌腫或いは転移の部位を示すことを特 徴とする癌腫或いはその転移の局在化方法。
26. ２６．該腫瘍検出マーカーが１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１１ ３Ｉｎ、６７Ｇａ、８８Ｇａ、９９ｍＴｃ及びＧｄよりなる群から選ばれる請求 項２５記載の方法。
27. ２７．該抗体が３×１０９Ｍより大きい結合親和性を有する請求項２５記載の方 法。
28. ２８．該抗体がヒト癌腫をｉｎ　ｓｉｔｕでねらい打ちするに際し、Ｂ７２．３ より５０％より多い効率を示す請求項２５記載の方法。
29. ２９．該抗体がＢ７２．３抗体と０〜３０％の競争率を示す請求項２５記載の方 法。
30. ３０．該抗体が、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＭよりなる群か ら選はれるアイソタイブのものである請求項２５記載の方法。
31. ３１．該抗体が、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５９、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９ ４５３、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５８、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５４、 ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５７、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５５、ＡＴＣＣ 　Ｎｏ．ＨＢ−９４６０、及びＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５６の同定特性を有 するハイブリドーマよりなる群がら選はれるハイブリドーマから得られる請求項 ２５記載の方法。
32. ３２．癌腫或いはその転移に罹患した患者に有効量の請求項１記載の第二世代モ ノクローナル抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を適用して、該癌腫或い はその転移を破壊或いはその生育及び増殖を抑制することを特徴とする癌腫或い はその転移の治療方法。
33. ３３．該抗体が治療剤に接合している請求項３２記載の方法。
34. ３４．該治療剤が、放射線核種、薬品、毒素、生物学的応答変成剤、及び第二抗 体よりなる群から選ばれる請求項３３記載の方法。
35. ３５．該放射線核種が、１３１Ｉ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、 ２１２Ｂｉ、及び２１１Ａｔよりなる群がら選はれる請求項３４記載の方法。
36. ３６．該薬品が、メトトレキセート及びアドリアマイシンよりなる群から選ばれ る請求項３４記載の方法。
37. ３７．該第二抗体がキラ−Ｔ−細胞に特異的結合親和性を有する請求項３４記載 の方法。
38. ３８．該抗体が３×１０９Ｍより大きい結合親和性を有する請求項３２記載の方 法。
39. ３９．該抗体が、ｉｎｓ　ｉｔｕでヒト癌腫をねらい打ちするに際し、Ｂ７２． ３より５０％多い効率を示す請求項３２記載の方法。
40. ４０．該抗体がＢ７２．３抗体と０〜３０％の競争率を示す請求項３２記載の方 法。
41. ４１．該抗体が、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＭよりなる群か ら選はれるアイソタイブのものである請求項３２記載の方法。
42. ４２．該抗体が、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５９、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９ ４５３、ＡＴＣＣ　ＮＯ．ＨＢ−９４５８、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５４、 ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５７、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５５、ＡＴＣＣ 　Ｎｏ．ＨＢ−９４６０、及びＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５６の同定特性を有 するハイブリドーマよりなる群がら選はれるハイブリドーマから得られる請求項 ３２記載の方法。
43. ４３．ＴＡＧ−７２及びＬＳ−１７４Ｔの両者に対して特異的結合親和性を有し 、正常ヒト大人組織に対して実質的結合親和性のないことを特徴とする第二世代 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
44. ４４．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５９、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５３、Ａ ＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５８、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５４、ＡＴＣＣ　 Ｎｏ．ＨＢ−９４５７、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５５、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．Ｈ Ｂ−９４６０、及びＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ−９４５６の同定特性を有するハイブ リドーマよりなる群から選はれる請求項４３記載のハイブリドーマ。
45. ４５．請求項１記載の抗体、その免疫反応性断片或いは組換え体を該抗体或いは その一部が親和性を有する抗原を結合するに十分な量で、及び薬学的に許容可能 な非−毒性、無菌担体を含んでなることを特徴とする医薬組成物。
46. ４６．請求項１記載の抗体である免疫原を含んでなることを特徴とする組成物。
47. ４７．免疫原的に有効量の請求項４６記載の組成物を哺乳動物に投与することに より抗−イデイオタイプ抗体を製造する方法。
48. ４８．癌患者に請求項４６の組成物を投与することにより腫瘍に対する抗体を顕 在化させる方法。