JPH06169791A - ヒト腫瘍に関する新しい抗原に対する新しいモノクローナル 抗体 - Google Patents

ヒト腫瘍に関する新しい抗原に対する新しいモノクローナル 抗体

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JPH06169791A
JPH06169791A JP3235340A JP23534091A JPH06169791A JP H06169791 A JPH06169791 A JP H06169791A JP 3235340 A JP3235340 A JP 3235340A JP 23534091 A JP23534091 A JP 23534091A JP H06169791 A JPH06169791 A JP H06169791A
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antibody
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Karl E Hellstrom
エリック ヘルストローム カルル
Hans Marquardt
マルカルト ハンス
Janet Johnston
ジョンストン ジャネット
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Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明はヒトのがん細胞に結合する新しいモノ
クローナル抗体および該抗体が結合する新しい抗原を提
供し、かつこれらの抗体および抗原の製造法および使用
法を提供することを目的とする。 【構成】本発明はヒトの結腸がん，乳がんおよび肺がん
腫ならびに黒色腫を含むヒト腫瘍に関連するたんぱく質
抗原に強く、結合する新しいモノクローナル抗体に関す
る。この抗体は腫瘍細胞への結合に比べ正常細胞にはほ
とんど結合しないもので腫瘍関連の悪性細胞の検出など
の診断法や腫瘍をもつヒトの治療法に利用し得る。また
ヒト腫瘍細胞の細胞表面に存在する分子量約７０，００
０乃至７５０００ダルトンで、以下の式： （式中Ｘは未同定のアミノ酸）で表わされるアミノ末端
アミノ酸配列を有する糖たんぱく質抗原も提供してい
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連分野】本発明は新しいモノクローナル抗体および
新しい抗原、並びにヒトのがん細胞と反応する該モノク
ローナル抗体の製造方法および利用方法に関するもので
ある。特に本発明のモノクローナル抗体は乳がん、結腸
がんおよび黒色腫を含む多くのヒトのがんに関連する新
しい細胞表面抗原と反応する。Ｌ５３と命名した本発明
のモノクローナル抗体は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）
細胞ならびに乳がんおよび結腸がんを含むがん腫、およ
び黒色腫に関連する糖たんぱく質抗原の決定基と反応す
る。Ｌ５３モノクローナル抗体は悪性がん腫の検出のよ
うなインビボおよびインビトロでの臨床診断に適してい
る。さらに本発明の抗体は、たとえばこれらに限定する
わけではないが化学療法剤、トキシン、免疫応答変更因
子、酵素および放射性同位元素を含む抗腫瘍効果を有す
る種々の試剤の標的選択的キャリヤーとして結合体の形
で腫瘍細胞と反応させるなどの治療に適している。また
本発明の抗原も治療および診断に有用である。
【０００２】
【関連技術】毎年何百人もの人ががんで死亡する。たと
えば男性のがんによる死亡の大多数は肺がんによるもの
で、これは女性のがんによる死亡で高い割合いを示す乳
がんを追い越している。早期の外科切除を行う以外、ほ
とんどのがんは化学療法や放射線治療によっては完治し
ない。したがって乳がん、結腸がん、子宮がん、肺がん
や黒色腫などの悪性腫瘍の診断方法や治療方法への需要
は大きい。
【０００３】がん関連抗原と反応するモノクローナル抗
体が知られている（たとえば、パプシデロ（Papsider
o)、Semin .Surg. Oncol.,１（４）、１７１−１８１
（１９８５）；シュロム（Schlom) 等、Important Ad
v．Oncol ．, １７０−１９２（１９８５）；アラム（A
llum)等、Surg. Ann., １８：４１−６４（１９８
６）；ヒュートン（Houghton) 等、Sumin. Oncol.,１３
（２）；１６５−１７９（１９８６）；「がんにおける
モノクローナル抗体、診断と治療の進歩」、ロス（Rot
h)編、フツラパブリッシング版、マウントキスコ、ニュ
ーヨーク（１９８６）；および「モノクローナル抗体を
用いたインビトロがん診断」、クプチク（Kupchik)編、
マーセルディッカー版、ニューヨーク、（１９８８）参
照）。
【０００４】ほとんどの既知モノクローナル抗体は数タ
イプのヒトのがん腫と反応するが、一方人体の特定の器
官、たとえば肺、胸部、子宮、結腸、胃または膵臓由来
のがん腫と反応する抗体は少ない。その標的抗原は一般
に糖たんぱく質または糖脂質である（たとえば、ヘルス
トロム（Hellstrom)等、Cancer Research ４６：３９１
７−２３（１９８６）；およびフィンク（Fink) 等、Pr
og. Clin. Pathol.,９：１２１−３３（１９８４）参
照）。たとえば特定のタイプのがん腫の糖たんぱく質抗
原と反応するモノクローナル抗体には米国特許 4,737,5
79（非小細胞肺がん腫に対するモノクローナル抗体）、
米国特許 4,753,894（ヒト乳がんに対するモノクローナ
ル抗体）、米国特許 4,579,827（ヒト胃がんに対するモ
ノクローナル抗体）および米国特許 4,713,352（ヒト腎
臓がんに対するモノクローナル抗体）で報告されている
ものが含まれる。モノクローナル抗体のいくつかはムチ
ンと考えられている高分子量の抗原と反応する。たとえ
ばモノクローナル抗体Ｂ７２．３は種々のがん腫で選択
的に発現される分子量1,０００kd以上の腫瘍関連オンコ
フェタル糖たんぱく質抗原を認識すると考えられてい
る。Ｂ７２．３は乳がんの８４％、結腸がんの９４％、
子宮がんの１００％および非小細胞肺がんの９６％と反
応することが示された（ジョンストン（Johnston) 、Ac
ta Cytol., １（５）：５３７−５６（１９８７）およ
び米国特許 4,612,282、シュロム（Schlom) 等参照) 。
同様にモノクローナル抗体ＫＣ−４は結腸、前立腺、肺
および乳がんなど多くのがん腫で発現される約４００〜
５００kdのたんぱく質抗原を認識する（米国特許 4,70
8,930参照) 。
【０００５】特定の腫瘍と関連すると考えられている糖
脂質抗原と反応するモノクローナル抗体も報告されてい
る。たとえばヤング（Young)等（J. Exp. Med., １５
０：１００８−１９（１９７９））はカーステンマウス
ザルコーマウイルスでトランスホームした細胞表面スフ
ィンゴ糖脂質アシアロＧＭ2 に特異的な２種のモノクロ
ーナル抗体の生産について報告している。またニープ
（Kniep)等、J. Immunol.,１３１（３）：１５９１−９
４（１９８３）および米国特許 4,507,391（ヒト黒色腫
に対するモノクローナル抗体）参照。
【０００６】さらに特定のタイプのがん細胞上に見られ
る糖脂質抗原と反応するモノクローナル抗体にはローゼ
ン（Rosen)等、Cancer Research 、４４：２０５２−６
１（１９８４）（ヒト小細胞肺がんに対するモノクロー
ナル抗体）；バルキ（Varki)等、Cancer Research ４
４：６８１−８７（１９８４）（肺、胃および結腸のヒ
トアデノカルシノーマおよび黒色種に対するモノクロー
ナル抗体）および米国特許 4,579,827（ヒト結腸アデノ
カルシノーマに対するモノクローナル抗体）に報告され
ているものが含まれる。またヒト非小細胞肺がん腫、乳
がん腫および結腸腫の表面上に発現される炭水化物抗原
を認識するＬ６モノクローナル抗体について報告してい
るヘルストロム（Hellstrom)等、Proc. Nat′l. Acad.
Sci. USA、８３：７０５９−６３（１９８６）参照。
【０００７】多種の腫瘍細胞に存在する抗原に対する反
応性を示す別のモノクローナル抗体も非常に必要とされ
ている。これは診断または治療において同じ腫瘍に対す
る別のモノクローナル抗体の使用を必要とするほとんど
の腫瘍の抗原異質性によるものである。さらに、広範囲
の腫瘍に対し高度の反応性を示すが正常な組織に対して
は反応しないか、または反応性の低いモノクローナル抗
体は一般的なものではない。このような抗体が有効なこ
とは明白である。
【０００８】したがって種々の腫瘍により高レベルに発
現される抗原と反応するモノクローナル抗体はがんの早
期診断、がん転移の有効な測定、がん患者の免疫学的モ
ニター、並びにがん治療を目的とする改良法の開発に有
効であることは明白である。また新しい細胞表面分子に
対するモノクローナル抗体ががんワクチンの形で免疫原
を調製するのに有効であり、かつたとえばホルモンレセ
プターまたは成長ホルモンとして、または細胞内および
細胞外コミュニケーションに関するその他の分子として
重要な細胞機能を果たす分子の定義にも用い得ることも
明らかである。この抗原はそれ自身酵素活性または成長
因子活性を有することさえ可能である。
【０００９】
【発明の概要】本発明は肺がん、乳がんおよび結腸がん
および黒色腫を含む種々のヒト腫瘍細胞と関連する細胞
表面糖たんぱく質抗原、Ｌ５３抗原上の決定基に特異的
なモノクローナル抗体Ｌ５３を提供する。したがって本
発明の抗体は抗体Ｌ５３によって同定されるＬ５３抗原
を発現する腫瘍の診断および治療に有効である。本発明
のＬ５３抗体はIgＧクラスおよびIgＧ１サブクラスに属
し、正常なヒト細胞とは有意に反応しない。
【００１０】また本発明には抗体Ｌ５３が結合する、ま
たは該抗体に免疫特異性のある、または該抗体と免疫反
応し、該抗体により同定される新しいＬ５３抗原が含ま
れる。さらに特定のがん腫に対するワクチンとして精製
した、またはクローン化したＬ５３抗原を用いる方法も
含む。本発明の抗体はヒト肺組織およびその他の組織に
おいて悪性状態を測定するインビトロ診断方法で使用し
得る。この方法は抗体Ｌ５３と反応する７0,０００〜７
5,０００ダルトンのＬ５３糖たんぱく質を有する抗原の
有無について組織を試験することに関する。たとえばこ
の組織をＬ５３抗原の特性を有する細胞関連抗原上の決
定基を限定するＬ５３モノクローナル抗体、または該抗
体の機能等価物またはフラグメントと接触させ、ついで
該抗体と抗原決定基との相互作用を検出し得る。このよ
うな方法にはがん細胞を含む疑いのある検体のがん細胞
の存在を検定するものも含まれる。検体をがん細胞とそ
の検体中に存在する別のタイプの細胞を区別し得るモノ
クローナル抗体と接触させる。この接触はこのような細
胞への抗体の結合を促進させる条件下で行なわれる。接
触につづいて検体中の細胞に結合する抗体の存否を測定
する。一般に検体をこのモノクローナル抗体の標識化特
異的結合パートナーと接触させる。この標識は検出可能
なシグナルを発し得るものである。一方、このモノクロ
ーナル抗体自体を標識化することもできる。
【００１１】別の診断法には検出可能なシグナルを与え
る試剤で標識化した本発明の精製した抗体または抗体フ
ラグメントを患者に投与することによりインビボで腫瘍
の位置を決定するものもある。この位置はエクスターナ
ルシンチノグラフィー、放射型断層擦影法または放射性
核種スキャンニングで検出する。この方法は病状の程度
についてがん患者を段階付けたり、また治療の効果をモ
ニターしたりする方法を提供する。
【００１２】また本発明はＬ５３抗体およびこれと同様
の抗体が腫瘍細胞表面に高レベルに発現されるＬ５３抗
原と反応することから治療に応用される。本発明のモノ
クローナルを用いて腫瘍を治療する医薬組成物を調合で
きる。この組成物には医薬的に許容可能な非経口ベヒク
ルとともに治療有効量の抗体が含まれる。また本発明の
抗体はこれらに限定される訳ではないが抗腫瘍効果を有
する化学療法剤、トキシン、免疫応答モディファイヤ
ー、酵素および放射性核種を含む種々の試剤のキャリヤ
ーとして免疫結合体の形で使用し得る。
【００１３】さらにＬ５３抗体は抗体依存細胞性細胞毒
性（ＡＤＣＣ）を調節し得るよう修正できる。すなわち
この抗体はヒトのリンパ球またはマクロファージの存在
下がん細胞を殺すか、またはヒト補体の存在下腫瘍細胞
を分解し得るようになる。このような修正はたとえばオ
ィ（Ｏｉ）等（Biotechnologies ４（３）：２１４−２
２１（１９８６））およびフェル（Fell) 等(Proc. Nat
l. Acad. Sci. ＵＳＡ８６：８５０７−８５１１（１９
８９））で報告されているキメラ抗体の生産に関し最近
開発された技術で行うことができる。したがって、Ｌ５
３抗体分子の可変領域をコードする遺伝子を適当な生物
学的活性（ヒトの補体を活性化しＡＤＣＣを調節する能
力など）をもつ抗体のＦｃ領域をコードするヒトの遺伝
子と一緒になるようスプライシングする。適当な生物学
的機能を有するＬ５３抗原に対するマウスまたはヒト起
源の新しい抗体も作製し得る。
【００１４】また本発明には分子量約７００００乃至７
５０００で、以下の式： 1 5 10 15 20 25 30 D-V-V-V-Q-A-P-T-Q-V-P-G-F-L-G-D-S-V-T-L-P-X-Y-L-Q-V-P-N-M-X （式中、Ｘは未同定のアミノ酸を示す）で表わされるこ
とを特徴とする新しいＬ５３抗原およびこの抗原に結合
する抗体Ｌ５３およびこのクラスの抗体によって同定さ
れる等価物が含まれる。
【００１５】本発明は特定の腫瘍に対して免疫化するワ
クチンとして精製またはクローン化したＬ５３抗原を使
用する方法も含む。
【００１６】本明書に記載する発明が十分理解されるよ
うに以下で詳細な説明を行う。本発明は肺、結腸および
胸部のがん腫および黒色腫細胞を含むヒト腫瘍細胞上の
膜に局在する抗原（Ｌ５３抗原）と特異的に反応するＬ
５３と命名される新しいモノクローナル抗体、Ｌ５３モ
ノクローナル抗体の生産法および本抗体を用いた診断法
および治療法に関する。Ｌ５３抗体は特定の腫瘍とは反
応するがヒトの正常組織またはリンパ腫など別のタイプ
の腫瘍とは基本的に反応性を示さない。
【００１７】さらに本発明はヒトの肺、胸および結腸の
腫瘍および黒色腫に関するＬ５３抗原と命名した新しい
細胞表面糖たんぱく質抗原およびＬ５３抗原を用いる方
法に関する。モノクローナル抗体Ｌ５３はハイブリドー
マ融合技術またはＥＢＶ不朽化技術を用いた方法により
調製し得る。
【００１８】ハイブリドーマ融合技術はコラー（Kohle
r) およびミルスタイン(Milstein)によって開発された
（コラー（Kohler) およびミルスタイン(Milstein)、Na
ture、２５６：４９５−９７（１９７５）；ブラウン
（Brown)等、J. Immunol.,１２７（２）：５３９−４６
（１９８１）；ブラウン（Brown)等、J. Biol. Chem .,
２５５：４９８０−８３（１９８０）；イエ（Yeh)等、
Proc. Nat′l. Acad. Sci.(ＵＳＡ）、７６（６）：２
９２７−３１（１９７６）；およびイエ（Yeh)等、Int.
J. Cancer、２９：２６９−７５（１９８２）参照）。
【００１９】これらの方法には動物（たとえばマウス）
に免疫原（たとえば精製した抗原、細胞または抗原を含
む細胞抽出物）を注入することによりその動物に望まし
い免疫応答を誘導する（抗体の生産）ことが含まれる。
たとえば免疫原として肋膜流出物由来のヒトの肺がん細
胞、移植したヒトの非小細胞肺がん腫（ＮＳＣＬＣ）由
来の培養細胞、または正常な胎児の肺由来の細胞または
その溶解物が使用される。ここでは説明のため免疫原と
してＮＳＣＬＣ（ヒト肺のアデノカルシノーマ）由来の
移植細胞、細胞系列ＣＨ３、２９８１、２７０７および
２９６４を使用する。たとえばこれらの細胞をマウスに
反復して注入し、十分時間を置いてそのマウスを殺し、
体内から抗体産生リンパ球を回収する。この抗体産生細
胞は感作動物のリンパ節、脾臓および末梢血液から得ら
れる。脾細胞が望ましい。マウスのリンパ球は以下に述
べるようにマウスミエローマとの安定融合体を高い効率
で与える。ラット、ウサギおよびカエルの体細胞の使用
も可能である。望ましい免疫グロブリンをコードする脾
細胞染色体は一般にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
などの融合剤の存在下ミエローマ細胞とその脾細胞とを
融合させることにより不朽化される。標準法に従がい融
合パートナーとしては多くのミエローマ細胞系列、たと
えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３またはＳｐ２／０−Ａｇ１４ミエローマ系
列が使用できる。これらのミエローマ系列はアメリカン
タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（ロックビ
ル、メリーランド）から入手できる。
【００２０】望ましいハイブリドーマを含む細胞をＨＡ
Ｔ培地などの選択培地で生育させる。そこでは未融合の
ミエローマ細胞またはリンパ球は死んでしまう。ハイブ
リドーマだけが生存するので限界希釈条件で生育させ、
単離クローンを得る。このハイブリドーマの上清を免疫
に用いた抗原を用いた免疫検定技術などにより目的の特
異性を持つ抗体の存在についてスクリーニングする。ポ
ジティブクローンを限界希釈条件下でサブクローン化す
ることによりモノクローナル抗体産生細胞を単離し得
る。モノクローナル抗体を他のたんぱく質または混入物
から取り除く単離精製については多くの従来法がある。
モノクローナル抗体を精製するのに一般に使用される方
法には硫安沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、お
よびアフィニティークロマトグラフィー（たとえば、ゾ
ラ（Zola) 等、モノクローナルハイブリドーマ抗体：技
術と応用、フレル（Hurell)(編)pp.５１−５２（ＣＲＣ
プレス１９８２）参照）。これらの方法に従って生産さ
れたハイブリドーマは当分野でよく知られている方法
（一般にはフィンク（Fink) 等、上述１２３ページ、第
６−１図）インビトロまたはインビボ（腹水液中）で増
殖させることが出来る。
【００２１】一般に個々の細胞系列はインビトロ、たと
えば実験培養容器で増殖し、単一の特異的モノクローナ
ル抗体を高濃度で含む培養培地はデカンテーション、濾
過または遠心で収穫できる。別にモノクローナル抗体の
収量はそのハイブリドーマのサンプルを使用したタイプ
の組織適合的動物に注入し、その融合に使用したミエロ
ーマ体細胞を提供することで増加させることができる。
融合した細胞ハイブリッドから産生される特異的モノク
ローナル抗体を分泌している腫瘍が注入した動物の中で
発達する。この動物の腹水または血清などの体液は高濃
度のモノクローナル抗体を含む。コール（Cole) 等によ
り議論されているように（上述）、ヒトのハイブリドー
マまたはＥＢＶ−ハイブリドーマを用いたとき、マウス
などの動物に注入された異所移植の拒否反応を回避する
ことが必要である。免疫不全またはヌードマウスを用い
るか、そのハイブリドーマをまず固体皮下腫瘍として照
射ヌードマウスに入れ、インビトロで培養した後大量の
特異的ヒトモノクローナル抗体を分泌する腹水腫瘍を発
達させたプリスタン感作照射ヌードマウスに腹腔内注射
する（コール（Cole) 等、上述参照) 。
【００２２】治療への応用でマウス抗体で処理した患者
はヒトの抗マウス抗体を生成することからキメラ（マウ
ス−ヒト）またはヒトモノクローナル抗体がマウス抗体
より好ましい（ショーラー（Shawler)等、J. Immunol.
１３５：１５３０−３５（１９８５））。Ｌ５３抗原と
反応するマウス−ヒトキメラモノクローナル抗体はたと
えばキメラ抗体の生成について最近開発された方法によ
って産生することができる（オィ（Ｏｉ）等、Biotechn
ologies ４（３）：２１４−２２１（１９８６）、リュ
ー（Liu)等、Proc. Nat′l . Acad. Sci.（ＵＳＡ) ８
４：３４３９−４３（１９８７））。従ってマウスＬ５
３抗体分子の定常領域をコードする遺伝子を適用な生物
学的活性（ヒトの補体を活性させＡＤＣＣを調節する能
力など）を有する抗体の定常領域をコードするヒトの遺
伝子と置換する。また適当な生物学的機能を有するＬ５
３抗原に対するマウスまたはヒト起源の新しい抗体も作
ることができる。たとえば、インビトロで抗原、たとえ
ば本発明のＬ５３抗原でヒトのリンパ球を感作し、この
抗原感作リンパ球のマウスまたはヒトリンパ球によるＥ
ＢＶ−形質転換またはハイブリダイゼーションによりヒ
トのモノクローナル抗体が得られる（ボレベック（Borr
ebaeck) 等、Proc. Nat′l . Acad. Sci.（ＵＳＡ）８
５：３９９５−９９（１９８８））。
【００２３】好ましい態様にしたがい例で述べるように
免疫原として４つの肺アデノカルシノーマ細胞系列：Ｃ
Ｈ３、２９８１、２７０７および２９６４を用いたハイ
ブリドーマ技術によりＬ５３と命名した本発明の抗体を
生産した。Ｌ５３抗体を産生するＬ５３ハイブリドーマ
はＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド）にＬ５３、受
理番号No. ：ＨＢ１０３４８として登録した。
【００２４】Ｌ５３はIgＧ１サブクラスに属する。この
抗体はたとえば胸、肺および結腸のがん腫および悪性黒
色腫など多種の腫瘍細胞に非常に強い反応性を示す。こ
のＬ５３抗体はＴリンパ腫細胞系列、ＣＥＭおよびＢ細
胞リンパ腫系列Ｐ３ＨＲ−１には検出可能な結合を示さ
ないし、また正常細胞（上皮細胞、繊維芽細胞、内皮細
胞など）への結合は弱いかまったく無い。
【００２５】したがって本抗体は特定の腫瘍細胞への特
異性および正常細胞に比べて腫瘍細胞への高度の特異性
に関しほとんどの既知抗腫瘍抗体よりも優れている（た
とえば、ヘルストロム（Hellstrom)等、“診断および治
療における修正した抗原および抗体”、クァッシュ（Qu
ash)／ロッドウェル（Rodwell)（編）、pp. ２４−２８
（マーセルデッカー（Marcel Dekker)社、（１９８
９）；およびバッグショー（Bag shawe)、Br. J. Cance
r 、４８：１６７−７５（１９８３）参照）。
【００２６】本発明は上述のＬ５３抗体およびＦab、Ｆ
（ab′）2 およびＦｒフラグメントなどの抗体の活性結
合領域を含むそのフラグメントを含むと理解すべきであ
る。これらのフラグメントは当分野で確立されている技
術を用いＬ５３抗体から作ることができる（たとえばロ
ーシュークス（Rousseanx)等、Methods Enzymol.; １２
１：６６３−６９、アカデミックプレス、（１９８６）
参照）。
【００２７】さらに本発明はＬ５３抗体と同じ抗原決定
基に結合し、その部位における結合に関しＬ５３抗体と
競合し得る抗体を含む。これらにはＬ５３抗体と同じ抗
原特異性を有するがその種起源、アイソタイプ、結合ア
フィニティーまたは生物学的機能（たとえば細胞毒性）
などが異なる抗体も含まれる。たとえば本発明の抗体の
クラス、アイソタイプおよびその他の変異体は当分野で
知られている組換えクラススイッチングおよび融合技術
を用いて構築できる（たとえばサマナ（Thammana) 等、
Eur. J. Immunol., １３：６１４（１９８３）；スピラ
（Spira)等、J.Immunol 、Meth.,７４：３０７−１５
（１９８４）；ニューバーガー（Neuberger)等、Natur
e、３１２：６０４−６８（１９８４）；およびオイ
（Ｏｉ）等、上述参照）。したがってＬ５３抗体と同じ
結合特異性を有するキメラ抗体または他の組換え抗体
（たとえばリンフォカインなどの第２たんぱく質に融合
した抗体）も本発明の範囲に属する。さらに本発明の抗
体が結合するＬ５３抗原は新しい全腫瘍抗原であるので
本発明の抗体にはＬ５３抗体が反応するもの以外の決定
基を含むＬ５３抗原上のあらゆる抗原決定基に結合する
抗体が含まれる。
【００２８】また本発明のＬ５３抗体の抗イディオタイ
プ抗体も本発明の範囲に入る。これらの抗イディオタイ
プ抗体は免疫原としてＬ５３抗体を用いて作製すること
が出来、腫瘍に対する体液性応答を検出する診断や、た
とえばワクチンとして患者に抗腫瘍応答を誘導するなど
治療に有用である（たとえば、ネポン（Nepom)等、Canc
er and Metastasis Reviews、６：４８７−５０１（１
９８７）；およびリー(Lee) 等、Proc. Nat′l . Aca
d. Sci.（ＵＳＡ）、８２：６２８６−９０（１９８
５）参照）。
【００２９】Ｌ５３抗体を用いそれに結合するＬ５３抗
原を単離し、特徴づけることができる。したがって、Ｌ
５３をプローブとして用いその抗体によって認識される
エピトープを同定しかつ特徴づけることが出来、さらに
がん腫細胞の表面上のＬ５３抗原を規定することができ
る（たとえばハコモリ(Hakomori)、Ann. Rev. Immuno
l., ２：１０３−２６（１９８４）；ブラウン（Brown)
等、J. Immunol.,１２７：５３９−５４６（１９８
１）；ブラウン（Brown)等、Nature、２９６：１７１−
１７３（１９８２）；およびローズ（Rose) 等、Proc.
Nat′l . Acad. Sci.（ＵＳＡ）、８３：１２６１−１
２６５（１９８６）参照）。
【００３０】本発明のモノクローナル抗体により認識さ
れるＬ５３抗原には胸、結腸、および肺のがん腫および
黒色腫を含む腫瘍細胞に特徴的な新しい細胞表面糖たん
ぱく質抗原が含まれる。Ｌ５３抗原は免疫沈降およびポ
リアクリルアミドゲル電気泳動での測定で約７００００
乃至７5,０００の分子量を有する一本鎖たんぱく質であ
る。
【００３１】新しいＬ５３糖たんぱく質抗原のアミノ末
端アミノ酸配列を以下に示す。 1 5 10 15 20 25 30 D-V-V-V-Q-A-P-T-Q-V-P-G-F-L-G-D-S-V-T-L-P-X-Y-L-Q-V-P-N-M-X （式中Ｘはまた同定されていないアミノ酸を示し、他の
文字は従来の一文字略記法でアミノ酸を表わしてい
る。）３０残基のＬ５３アミノ末端配列を現在のたんぱ
く質データベース（ＬＳＰＲＯ、１９８９年５月；SWIS
SPRO、１９８９年５月、およびＤＩＦ、１９８９年５
月）に保存されている配列と比較したところ他の既知配
列との有意な配列ホモロジーは見つからなかった。ＮＢ
ＲＦ−ＰＩＲのデータベース（１９９０年５月２４日）
での同様の比較ではヒトのポリオウイルスレセプターＨ
２０Ａ前駆体との２８残基の一致が示された。 （Ｌ５３の診断への応用）本発明のＬ５３モノクローナ
ル抗体はＬ５３抗体が特異的に反応するＬ５３抗原を有
するヒトの腫瘍を検出するインビトロならびにインビボ
の診断に有用である。当分野ではインビトロの診断法は
よく知られており（たとえばロス（Roth)、上述および
クプチク(Kupchik) 、上述) 、腫瘍細胞の免疫組織学的
検出（たとえばヒト組織、細胞または切除した腫瘍検体
など）または腫瘍関連抗原の血清学的検出（たとえば血
液試料または他の生物学的液体試料）が含まれる。
【００３２】免疫組織学的方法では、本発明の抗体を腫
瘍組織検体などの生物学的検体と接触させ、ついでその
抗原と複合体を形成した抗体の存在を検出する。このよ
うな検体に関する抗原−抗体複合体の形成はその組織に
おける腫瘍細胞の存在を示している。検体上の抗体の検
出はイムノパーオキシダーゼ染色法、アビジン−ビオチ
ン（ＡＢＣ）法または免疫蛍光法など当分野でよく知ら
れている方法を用いて行い得る（たとえばシオカ（Cioc
ca) 等、Meth. Enzymol.１２１：５６２−７９（１９８
６）；ヘルストロム（Hellstrom)等、Cancer Research
、４６：３９１７−２３（１９８６）；およびキンボ
ール（Kimball)編、Introduction To Immunology（第２
編）、pp１１３−１１７、マクミラン出版（１９８６）
参照）。たとえば例２で述べるイムノパーオキシダーゼ
染色を用いて肺がん、乳がんおよび結腸がん腫ならびに
黒色腫とＬ５３との反応性およびこの抗体と正常なヒト
組織検体との反応性の欠除が示された。
【００３３】血清学的診断法にはがん腫の疑いのある患
者の血清または他の生物学的液体に分泌または放出され
た腫瘍関連抗原の検出および定量が含まれる。このよう
な抗原は体液中ラジオイム／アッセィ（ＲＩＡ）または
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など当分野でよ
く知られている方法を用いて検出されるが、このような
方法では“放出された”抗原と反応する抗体を用いて液
体試料中の抗原の存在を検出する（たとえばウオチラ
（Uotila) 等、J. Immunol. Methods 、４２：１１（１
９８１）およびアラム（Allum)等、上述、pp. ４８−５
１）。ここで述べているＬ５３抗体を用いたこれらの検
定法はＬ５３抗体が反応する生物学的液体中のＬ５３抗
原の検出、つまりヒト患者の種々のがん腫および黒色腫
の検出に用い得る。したがって、本発明のＬ５３抗体を
抗原−抗体反応を含むほとんど検定に使用し得ることは
上述のことから明白である。これらの検定法には、液相
および固相の標準的ＲＩＡ法およびＥＬＩＳＡ検定法、
免疫蛍光法および他の免疫細胞化学検定法などが含まれ
る（たとえばシコラ（Sikora) 等（編）、モノクローナ
ル抗体、pp３２−５２、ブラックウェルサイエンティフ
ィックパブリケーションス版（１９８４）参照）。
【００３４】また本発明のＬ５３抗体はヒト腫瘍検出に
関するインビボ診断に有用である。このような方法には
検出可能なシグナルを生ずる適当なイメージング試剤で
標識化した抗体を用いた腫瘍イメージング法によりイン
ビボで腫瘍を検出するインビボ診断法に有効である。イ
メージング試剤およびこのような試剤による抗体の標識
する方法はよく知られている（たとえばウエンセル（We
nsel) およびミアース(Meares)、ラジオイムノイメージ
ングおよびラジオイムノセラピー、エルセビア版、ニュ
ーヨーク（１９８３）；コルチャー（Colcher)等、Met
h. Enzymol.１２１：８０２−１６（１９８６）参
照）。標識化抗体は放射性核種スキャンニングなどの方
法で検出し得る（たとえばブラッドウェル（Bradwell)
等、“がん検定および治療用のモノクローナル抗体”、
ボールドウィン（Baldwin)等、編、pp.６５−８５、ア
カデミックプレス（１９８５）参照）。
【００３５】またＬ５３抗体はＬ６抗体などがん腫と反
応する他の抗体と結合してラージ細胞未分化肺がん腫、
アデノカルシノーマおよび鱗状がん腫などの非小細胞肺
がん腫のインビボ検出が可能となる。 （治療への応用）本発明のＬ５３抗体には多くのインビ
ボ治療法がある。標的腫瘍細胞に単独で用いる他、この
抗体は適用な治療剤と合せてヒトのがんの治療に用いる
ことができる。たとえばこの抗体を治療薬またはトキシ
ンと結合させてがん患部にこれらの治療薬を運ぶのに使
用する。これらの治療薬を抗体に結合させる方法はよく
知られている（たとえばアーノン（Arnon)等“、モノク
ローナル抗体とがん治療”、リースフェルド（Reisfel
d) 等（編）、pp. ２４３−５６、アラン（Alan) R.リ
ス（Liss) 社版、（１９８５）；ヘルストロム（Hellst
rom)等（編）、“コントロールドドラックデリバリー”
（第２編）、ロビンソン（Robinson) 等（編）、pp. ６
２３−５３、マーセルデッカー社版（１９８７）；ソー
プ（Thorpe) 、モノクローナル抗体′８４：生物学的お
よび臨床的応用、ピンチェラ（Pinchera) 等編、pp４７
５−５０６（１９８５）；およびソープ（Thorpe) 等、
Immunol.Rev., ６２：１１９−５８（１９８２））。Ｌ
５３抗体はインビトロで細胞と合せたとき容易に内部に
入らないので、たとえば組換えＤＮＡ技術を用い抗体に
酵素を結合させることにより腫瘍細胞に化学療法剤を運
ぶのに適している。このような結合体が腫瘍に局在する
ときその酵素は結合体が腫瘍細胞に結合した後に投与さ
れる不活性（非毒性）プロドラッグを活性抗がん剤に転
換し得る（たとえば、センター（Senter) 等、Proc. N
at′l. Acad. Sci. （ＵＳＡ）、８５：４８４２−４６
（１９８８）参照）。
【００３６】それとは別にこの抗体を 131Ｉなどの放射
性同位元素のような高エネルギー照射源に結合させ得
る。これが腫瘍部位に局在化するときそのまわりの数細
胞を死滅させる（たとえばオーダー（Order)、“がん検
出および治療用のモノクローナル抗体" 、ボールドウィ
ン(Baldwin) 編、pp３０３−１６、アカデミックプレス
版（１９８５）参照）。また別の態様に従がい、Ｌ５３
を第２の抗体に結合し、米国特許 4,676,980でシーガル
(Segal) が報告している腫瘍細胞治療用の抗体ヘテロ結
合体を作ることができる。
【００３７】本発明のＬ５３抗体の治療的使用には補体
の存在下、または抗体−薬剤または抗体−トキシン結合
体の一部としてこれを用い、がん患者の骨髄から腫瘍細
胞を除くことが含まれる。この方法に従がい生体外で骨
髄を抗体で洗い再びこの骨髄を患者に戻される（たとえ
ばラムゼー（Ramsay) 等、J. Clin. Immunol. ８
（２）：８１−８８（１９８８）参照）。
【００３８】さらに先に述べたように本発明のキメラま
たは他の組換えＬ５３抗体は単独または種々の免疫結合
体として治療に用いられる。たとえば、リンホカインま
たは腫瘍細胞インヒビターなど抗腫瘍活性を有する第２
たんぱく質の少なくとも機能活性部分に結合するＬ５３
抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合たんぱく質は
インビボでのヒト腫瘍の治療に使用し得る。さらにＬ５
３の抗原結合領域がIgＧ１などのヒトＦｃ領域に結合す
るキメラＬ５３抗体を用いて抗体依存細胞性細胞毒性ま
たは補体仲介細胞毒性を促進し得る。さらに抗体の結合
特異性の１つがＬ５３のものである二特異的抗体の構築
に当分野でよく知られている組換え技術を使用し得る
（たどえば米国特許 4,474,893参照) 。
【００３９】最後に、Ｌ５３抗体の抗イディオタイプ抗
体は活性腫瘍免疫化および腫瘍治療に使用し得る（たと
えばヘルストロム（Hellstrom)等、“腫瘍治療のための
免疫学的アプローチ、モノクローナル抗体、腫瘍ワクチ
ンおよび抗イディオタイプ”“診断および治療における
修正抗原および抗体”、上述、pp３５−４１参照）。そ
れゆえ本発明がヒトの腫瘍を治療するための医薬組成
物、組合せ治療法も含むことは明らかである。たとえば
本発明には医薬的効果量のＬ５３抗体および医薬的に許
容可能なキャリヤーを含むヒト腫瘍治療に使用する組成
物が含まれる。この組成物には非修正のもの、治療剤
（たとえば薬剤、トキシン、酵素または第２の抗体）と
の結合型、または組換え型（たとえばキメラまたは二特
異的Ｌ５３）のものが含まれる。さらにこの組成物には
がん腫治療のための他の抗体または結合体（たとえば抗
体カクテル）を含ませることもできる。
【００４０】本発明の抗体組成物は静脈、腹腔内、経
口、リンパ内投与または腫瘍への直接投与などを含む従
来の投与法を用いて投与し得る。静脈注射が好ましい。
本発明の抗体組成物には溶液またはサスペンジョン、錠
剤、丸薬、粉末、座薬、高分子マイクロカプセルまたは
マイクロヘシクル、リポソームおよび注入可能または不
溶性溶液などを含む種々の投与型のものが使用できる。
投与型は投与方法および治療方法に依存する。
【００４１】またこの抗体組成物にはヒト血清アルブミ
ン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、リン酸塩、グ
リシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物
質および硫酸プロタミンなどの塩または電解質など当分
野でよく知られている医薬的に許容可能なキャリヤーお
よびアジュバントを含めることが好ましい。本発明の組
成物の投与方法や投与量は病気の重度や経過、患者の健
康および治療に対する応答および担当医の判断に依存す
る。したがって、本組成物の投与量は各患者に対して滴
定すべきであるが、本発明の抗体組成物の効果的投与量
は約１〜約５０００mg／m2の範囲である。
【００４２】またＬ５３抗原と呼ばれる本発明の新しい
抗原も治療に使用できる。この抗原は腫瘍から精製する
かまたは組換えＤＮＡ技術でも生産し得る（ブラウン
（Brown)等、米国特許出願中、アトーニードケットNo.
５６２４−１２３、１９９０年３月２２日登録、本明細
書には参考として引用した）。Ｌ５３抗原をコードする
遺伝子はまずＬ５３抗原のｍＲＮＡを濃縮する方法を用
いてクローン化できる。このような方法により発生期の
鎖上のＬ５３抗原決定基を認識する抗体を用いた免疫ア
フィニティークロマトグラフィーでポリソーム（ｍＲＮ
Ａリボゾームと発生期のポリペプチド鎖を含む）を精製
し得る。このｍＲＮＡをたとえばＬ５３抗体などを用い
た免疫沈殿法で単離し、またｃＤＮＡを適当な発現ベク
ターにクローン化する。それとは別にＬ５３抗体または
Ｌ５３抗原に対する抗血清を用い、発現ベクターを使用
したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングできる。こ
の精製した、またはクローン化したＬ５３抗原は免疫原
として単独で、または適当な免疫学的アジュバントと一
緒に投与し得る。
【００４３】本発明の方法でワクチンとして精製もしく
はクローン化したＬ５３抗原を用いて特定の腫瘍を免疫
化できる。このようなワクチンの調製法は当分野でよく
知られている（たとえばエスチン（Estin)等、Proc. N
at′l. Acad. Sci. （ＵＳＡ）、８５、１０５２（１９
８８））。簡単に云うと、クローン化した腫瘍関連抗
原、たとえばＬ５３抗原の発現のために組換えウイルス
を構築する。この組換えウイルスで感染させた細胞は宿
主の非適合性抗原や免疫原性ウイルスたんぱく質と一緒
に細胞表面に腫瘍抗原を発現する。これは腫瘍拒否反応
に重要な役割を果たす細胞性免疫の誘導に好ましい。適
当なウイルス、たとえばウェイススモールポックスワク
チンのプラーク精製ウイルス由来のワクシニアウイルス
（ニューヨーク・シティーボードオブヘルス株）を用い
て、ワクシニアウイルス“7.５Ｋ”プロモーターのコン
トロール下のＬ５３抗原のコード配列を含む組換えウイ
ルスを構築する（フ（Hu）等、J. Virol. ６２：１７６
−１８０（１９８８））。この組換えウイルスをワクチ
ンとして静脈注射しがんを予防する。 （診断キット）本発明は上述の方法を行う診断キットを
含む。１つの態様では、この診断キットには（ａ）モノ
クローナル抗体Ｌ５３および（ｂ）Ｌ５３抗体の特異的
結合パートナーおよび結合抗体を検出するためのラベル
の結合体が含まれる。またこの試薬には緩衝剤およびポ
リ多糖などのたんぱく質安定化剤などの補助試薬が含ま
れる。さらに必要な場合はこの診断キットにはバックグ
ランドを減少させる試薬、コントロール試薬、このテス
トを行なう装置などを含むシグナル生成システムの要素
が含まれる。別の態様では、この診断キットには本発明
のモノクローナル抗体および検出可能なシグナルを生成
し得るラベルとの結合体が含まれる。上述の補助剤も含
ませることができる。
【００４４】本明細書に示す本発明が十分に理解される
ように以下に例を示す。これらの例は説明を目的とする
もので本発明の範囲を制限するものではない。
【００４５】
【実施例】
（例１） Ｌ５３モノクローナル抗体の調製 本発明のＬ５３モノクローナル抗体をイエ（Yeh)等（Pr
oc. Nat′l. Acad. Sci.,（ＵＳＡ）（１９７９）、上
述）により先に報告されたハイブリドーマ融合技術を用
いて作製した。簡単に云うと月令３才のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスを免疫原としてＣＨ３、２９８１、２７０７および
２９６４と命名されている４種のヒトの肺のアデノカル
シノーマの移植培養細胞を用いて免疫化した。マウスは
４回の腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で各免疫化につき約１０
7 個の細胞を受けた。最後の免疫から３日後、その脾臓
を取り出し、その脾細胞を培養培地に懸濁した。ついで
この脾細胞はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用い
てＰ３−Ｘ６３−Ａｇ8.６５３マウスミエローマ細胞
（ＡＴＣＣ No. ＣＲＬ１５８０）と融合させた。この
細胞懸濁液はイエ（Yeh)等（Proc. Nat′l. Acad. Sc
i. （ＵＳＡ）上述）により報告されている選択的ＨＡ
Ｔ培地を入れたマイクロプレートのウェル中で培養し
た。この混合物を接種し、単一の融合細胞またはクロー
ンから生じる低密度培養物を作る。
【００４６】これらのハイブリドーマ培養物由来の上清
を肺がん細胞系列ＣＨ３および２９８１に関する直接的
結合活性およびドーラード（Douillard)等（Meth. Enzy
mol., ９２：１６８−７４（１９８３））により報告さ
れているものと同様のＥＬＩＳＡ検定法を用いたヒトの
繊維芽細胞の短期培養物についてスクリーニングした。
この検定法に従がい、抗原（その反応性で抗体をスクリ
ーニングする）をマイクロプレートに固定化し、ハイブ
リドーマ上清とインキュベートする。もしこの上清が目
的の抗体を含むならその抗体は固定化抗原に結合し、抗
免疫グロブリン抗体−酵素結合体と光学密度の測定可能
な変化を起こすその酵素の基質を添加することにより検
出される。
【００４７】たとえば肺がん細胞またはコントロール繊
維芽細胞または末梢血液白血球（ＰＢＬ）を９６穴組織
培養プレートに分注し（コースター製、ケンブリッジ．
ＭＡ）；加湿３７℃インキュベーター１５％ＣＯ2 ）中
で一晩インキュベートした。ついで１００μｌの新しく
調製した1.０％グルタルアルデヒドを加えて最後ウェル
濃度を0.５％にすることで細胞を固定し、室温で１５分
間インキュベートする。ついで１×ＰＢＳで３回ウェル
を洗浄する。この細胞をＰＢＳ中５％ＢＳＡと３０分間
インキュベーションしてブロックして、再度ＰＢＳで３
回洗浄した。このハイブリドーマ培養物の上清をウェル
当り１００μｌ分注し、そのウェルを室温で１時間イン
キュベートした後細胞をＰＢＳで３回洗浄した。ついで
ＰＢＳ中0.１％ＢＳＡ溶液で希釈したヤギ抗マウスホー
スラディッシュパーオキウダーゼ（ザイムド社、ＣＡ）
をウェル当り１００μｌ加えた。この反応混合物を室温
で１時間もしくは３７℃で３０分間インキュベートし、
ついで細胞をＰＢＳで３回洗浄した。さらにオルトフェ
ニレンジアミン（ＯＰＤ）をウェル当り１００μｌ加
え、そのプレートを室温、暗所で５〜４５分間インキュ
ベートした。細胞に結合している抗体を１０〜２０分以
内に起こるウェル中の色の変化で検出する。反応はウェ
ル当り１００μｌのＨ2 ＳＯ4 を加えることにより停止
させ、ダイナテク（アレクサンドリア、ＶＡ）のマイク
ロイライザ自動読取器で４９２nmでの吸光度を測定し
た。
【００４８】免疫化細胞系列のポジティブのウェルおよ
びＰＢＬのネガティブのウェルを免疫化した細胞系列ペ
レットおよび正常な腎臓、肝臓および脾臓組織断片に関
する免疫組織学的方法によりテストした。この検定法は
免疫化した抗原として本来の細胞または精製可溶性抗原
または細胞抽出物を用いて行うことができる。可溶性抗
原または細胞抽出物を抗原として使用した場合、抗原は
ＰＢＳ中ウェル当り５０μｌでプレーティングし検定前
このプレートを室温で一晩インキュベートした。抗原と
して本来の細胞を用いる場合、それらはそのまま、もし
くは固定後使用する。各々の場合、この細胞はまず培養
培地中ウェル当り１００μｌ、１０4 個をプレーティン
グし、３７℃インキュベーター（５％ＣＯ2 ）で一晩イ
ンキュベートした。肺がん細胞系列には結合するが、正
常な組織には結合しない抗体を生産するハイブリドーマ
を選択し、クローン化し、インビトロで増殖させた後抗
体特異性についてテストした。ヒトの肺がんと反応する
抗体を生産するハイブリドーマを再クローン化し、増殖
した後、プリスタン感作した月令３才のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスに注入した。それらは腹水腫瘍を発達させた。
【００４９】これらの操作により、ハイブリドーマ細胞
系列Ｌ５３が得られ、再クローン化してからマウスに注
射して腹水腫瘍を発達させた。先に公表したようにＬ５
３ハイブリドーマはＡＴＣＣに登録した。腹水に分泌し
た抗体はプロテインＡ−セファロース（たとえば、イー
（Ey) 等、Immunochemistry 、１５：４２９−４３６
（１９７８））またはセファクリルＳ−３００によるゲ
ル濾過で精製した。さらに特性を調べるためにこの精製
Ｌ５３抗体を用いた。 （例２） Ｌ５３モノクローナル抗体の特性−アイソタ
イプの決定 Ｌ５３ハイブリドーマによって産生される免疫グロブリ
ンのクラスを決定するため以下の方法を用いた。 ａ）オクテルローニー免疫拡散法 Ｌ５３ハイブリドーマ細胞の上清の部分標本を2.５％寒
天プレートの中央のウェルに入れた。単一特異性ウサギ
抗マウスIgアイソタイプ抗体（ザウザンバイオテクノロ
ジー、バーミンガム、ＡＬ）を外側のウェルに入れ、こ
のプレートを室温で２４時間インキュベートした。その
後沈殿曲線を読んだ。 ｂ）ＥＬＩＳＡアイソタイピング ダイナテクイムロン９６穴プレートに各ウェル当り５０
μｌの１μｇ／ｍｌヤギ抗マウスIg抗体ＰＢＳ溶液を入
れ４℃で一晩放置することによりこれをコーティングし
た。このプレートをＰＢＳ／トゥィーン２０、0.０５％
溶液で洗浄した後、ウェル当り１００μｌの培地を用い
て室温１時間処理してブロックした。プレートの洗浄
後、Ｌ５３ハイブリドーマ由来の上清を加え、室温で１
時間インキュベートした。ウシ血清アルブミンを含むＰ
ＢＳで洗浄後プレートをパーオキシダーゼ（ザイムド
製）に結合した単一特異性ウサギ抗マウスIgアイソタイ
プ抗体と３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後プ
レートを0.１Ｍクエン酸バッファ（pH4.５）中１mg／ml
のｏ−フェニレンジアミンおよび0.０３％Ｈ2 Ｏ2 溶液
とインキュベートした。ダイナテクＥＬＩＳＡプレート
リーダーを用い６３０nmの光学密度を測定した。これら
の操作に基づきＬ５３モノクローナル抗体がIgＧ１アイ
ソタイプに属することが決定された。 （Ｌ５３モノクローナル抗体の結合特性）非イオン性界
面活性剤による透過処理の前後での抗体の細胞への結合
を測定することで抗原の細胞内での位置を決定した。元
の培養細胞の細胞表面への抗体結合はヘルストロム（He
llstrom)等（Cancer Research ４６：３８１７−３９２
３（１９８６））により報告されている方法に従がい、
蛍光活性化細胞分別装置（ＦＡＣＳ）IIを用い直接蛍光
により同定した。簡単に云うとＦＡＣＳセルソーターを
用いた結合分析のため、１×１０6 個の培養細胞を総容
積チューブ当り５００μｌとなるようにＩＭＤＭ培地
（ギブコ、グランドアイランド、ＮＹ）中１５％のウシ
胎児血清（ＦＢＳ）に分け取った。この細胞をセロフュ
ージで1.５分間遠心し、その上清を除去した。１μｇ／
mlのＬ５３モノクローナル抗体１００μｌを各チューブ
に加え、その内容物を混合した後氷中で３０分間インキ
ュベートした。この反応物をセロフュージによる1.５分
間の遠心により５００μｌの１５％ＦＢＳ／ＩＭＤＭで
３回洗浄した（３回の洗浄後チューブをブロッティング
した）。その後１５％ＦＢＳ／ＩＭＤＭ中１：２５に希
釈した至適化ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスIgＧ抗体５０μ
ｌを各チューブに加え、その反応物を混合後３０分間イ
ンキュベートした。この洗浄ステップを繰り返し、その
チューブのブロッティング後各ペレットを２００〜５０
０μｌのＰＢＳに懸濁した。各サンプルをコールターエ
ピックＣ ＦＡＣＳで分析し、その平均蛍光強度（ＭＦ
Ｉ）を測定した。ＭＦＩから線蛍光当量（ＬＦＥ）を決
定した。各テストサンプルのＬＦＥをネガティブコント
ロールのＬＦＥで割ると特異的抗体およびコントロール
抗体で染色した細胞の蛍光強度の比が得られる（1.０は
蛍光強度の差なし、2.０は蛍光強度２倍など）。非特異
的結合を測定するため、競合者として非標識化抗体との
インキュベーションを平行して行った。結合のデータを
以下の第１表に示す。
【００５０】 第 １ 表 種々の細胞系列に対するＬ５３抗体の結合 細胞系列 Ｌ５３抗体結合比 肺がん腫 ２７０７ １３ ＣＨ３ １３ ２９６４ １３ ２９８１ １３ 結腸がん腫 ３３４７ ９ ＲＣＡ １４ ＨＣＴ１１６ １５ “ｃ”系列 ６ 乳がん腫 ３４７７ ４ ３４６４ ５ ３３９６ ６ ＣＥＭ−Ｔ リンパ球 １ Ｐ３４Ｒ−１ Ｂリンパ球 １ 第１表に示されているようにＬ５３モノクローナル抗体
は肺がん、乳がんおよび結腸がん腫細胞系列とは反応す
るがＴまたはＢリンパ腫系列および正常な末梢血液白血
球とは反応しない。 （免疫組織学）L. A. スターンバーガー（Sternberger)
によって報告され（免疫化学、pp１０４−６９ジョンウ
ィリー・アンドサンス社版、ニューヨーク（１９７
９））、ガリゲス（Garrigues)等（Int. J. Cancer、２
９：５１１−１５（１９８２））により修正されたＰＡ
Ｐ法を用いて凍結組織断片を免疫組織学的に研究した。
このテスト用の組織は手術により入手し、液体窒素で予
備冷却したイソペンタンを用いて切除から４時間以内に
凍結した。それから組織は使用するまで液体窒素内また
は−７０℃で保存した。凍結断片を調製し、空気乾燥し
た後アセトンで処理して再び乾燥させた（ガリゲス（Ga
rrigues)等、上述参照）。組織学的評価に使用する断片
はヘマトキシリンで染色した。非特異的バックグランド
を減らすため、断片をＰＢＳで１／５に希釈した正常な
ヒト血清とプレインキュベーションした（ガリゲス（Ga
rrigues)等、上述参照）。マウス抗体、ウサギ抗マウス
IgＧおよびマウスＰＡＰを１０％正常ヒト血清および３
％ウサギ血清の溶液で希釈した。ウサギ抗マウスIgＧ
（スターンバーガー−メイヤー イムノケミカルス製、
ジャレッツビル、ＭＤ）は１／５０希釈物を用いた。特
別に精製したＰＡＰ（２mg／ml）を含むマウスパーオキ
シダーゼー抗パーオキシダーゼ複合体は１／８０希釈の
ものを使用した。
【００５１】染色操作は、一連の断片の特定の抗体、す
なわちＬ５３またはコントロール抗体による2.５時間の
処理、その断片のウサギ抗マウスIgＧ１／５０希釈物と
の室温、３０分間のインキュベーションおよびその断片
のマウスＰＡＰ複合体１／８０希釈物との室温、３０分
間のインキュベーションを含む。抗体による各処理後そ
のスライドをＰＢＳで２回洗浄した。
【００５２】免疫組織化学的反応物は新しく調製した0.
５％３，３′−ジアミノベンジジンテトラハイドロクロ
ライド（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ）および
0.０１％Ｈ2 Ｏ2 の0.０５Ｍトリスバッファ（pH7.６）
溶液を加え８分間発色させた（ヘルストロム（Hellstro
m)等、J. Immunol. ，１２７：５７−６０（１９８１）
参照）。蒸留水の１％Ｏs Ｏ4 溶液で２０分間インキュ
ベートすることにより染色が促進される。この断片を水
で洗い、アルコールで脱水し、キシレンで透明化した後
にスライドに乗せた。平行して断片をヘマトキシリンで
染色した。
【００５３】各スライドはコードで評価し、コード化し
たサンプルは別の研究者がチェックした。典型的スライ
ドは差干渉コントラスト光学系（ツァイスーノマルスキ
ー製）を用いて写真を操った。抗体染色度は０（反応な
し）、＋（少数の弱いポジティブ細胞）、＋＋（少なく
とも細胞の３分の１がポジティブ）、＋＋＋（ほとんど
の細胞がポジティブ）、＋＋＋＋（全ての細胞が強いポ
ジティブ）で評価した。＋と０染色度の差は＋と＋＋ほ
ど明確ではないので＋＋以上の染色度のものは“ポジテ
ィブ”と考えた。腫瘍サンプルの中には悪性細胞および
ストローマ細胞の両方が見られた。ストローマ細胞はま
ったく染色されないか、または腫瘍細胞よりも著しく染
色が弱いことから記録された染色は腫瘍細胞のものであ
る。以下の第２表はＬ５３モノクローナル抗体を用いた
種々の腫瘍および正常組織検体の免疫組織学的染色を示
している。この表に示されているように、Ｌ５３抗体は
広範囲のヒト腫瘍検体と反応するが、テストした多くの
正常なヒト組織とは全く反応しないか、反応は非常に弱
い。
【００５４】 第 ２ 表 腫瘍および正常組織検体のＬ５３モノクローナル抗体による イムノパーオシキダーゼ染色 組織タイプ 抗体結合 （ポジティブ腫瘍の数／テストした腫瘍の総数） ＣＡ．結腸 １８／１８ ＣＡ．肺 １５／２６ ＣＡ．胸部 ７／１４ ＣＡ．卵巣 ０／２ ＣＡ．胃 ０／２ 黒色腫 ５／５ ザルコーマ １／５ 正常組織：脾臓 ０／６ 腎臓 ２／１０1 肝臓 １／１０ 心臓 ０／１ 卵巣 ０／１ 副腎 ０／１ 睾丸 ０／２ 胸部 ９／９2 扁桃腺 ０／２ 皮膚 ０／８ 肺 ０／９ 結腸 ０／７ 脳 ０／６ 胸腺 ０／７ リンパ節 ０／４ 膵臓 ０／２ 食道 ０／２ 胃 ０／２ 1. ポジティブ細胞は上皮細胞に分散している。
【００５５】2. ポジティブ細胞は胸腺中の上皮細胞に
分散している。 （例３） Ｌ５３抗体により認識されるＬ５３抗原 （精製）Ｌ５３モノクローナル抗体と反応する抗原を特
徴づけるため、２９８１細胞（オンコゲン、シアトル、
ＷＡ）およびＲＣＡ細胞（Ｍ．ブラテイン（Brattain)
博士から入手、ベイラー大学、ヒューストン、ＴＸ）か
らＬ５３抗原を単離し、イムノアフィニティークロマト
グラフィーで部分的に精製した。Ｌ５３抗原をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで均一になるまで精製しメンブレンへの電気溶
出またはエレクトロブロッティングによりＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルから回収した。
【００５６】電気泳動につづいて、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル（１２％アクリルアミド）をコマージブリ
リアントブルー（１０％酢酸および３０％イソプロパノ
ール中0.０５％（重量））で染色し、ついで酢酸（５
％、v/v)およびメタノール（１７％、v/v)溶液で脱色し
た。染色したＬ５３抗原バンド（Ｍｒ＝７０〜７5,００
０ダルトン）をかみそりの刃で切り出し、先に報告され
ているように（ハンカピラー（Hunkapiller)等、Method
s in Enzymology 、９１：２２７−２３６（１９８
３））ＥＣＵ−０４０・エレクトロエリューター／コン
セントレータ（C. B.S.サイエンティフィック社、サン
ディエゴ、ＣＡ）による電気溶出を行った。
【００５７】またＬ５３抗原は先に報告されている方法
で（マツダイラ（Matsudaira) J. Biol Chem. ２６１：
10035 −1003（１９８７））ミニ・トランスブロット・
エレクトロホレティック・トランスファー・セル（バイ
オラドラボラトリー製．リッチモンド、ＣＡ）を用い、
イムノブロットメンブレン（ミリポア社、ベッドフォー
ド、ＭＡ）にエレクトロブロッティングすることにより
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２％アクリルアミ
ド）から回収した。このメンブレンをコマージブリリア
ントブルーで染色し、脱染色後染色したＬ５３抗原バン
ド（Ｍｒ＝７０−７5,０００ダルトン）をかみそりの刃
で切り出し、次のアミノ末端配列分析に用いた。 （配列分析）パルス液体たんぱく質シークエンサー（モ
デル４７５Ａ、アプライドバイオシステムズ．フォスタ
ーシティ、ＣＡ）を用いＬ５３抗原１１pmol（２９８１
細胞）、１６pmol（ＲＣＡ細胞）、２１pmol（２９８１
細胞）および２５pmol（２９８１細胞）の４つの調製物
について自動エドマン分解を行った。フェニルチオハイ
タントインアミノ酸誘導体はＰＴＨＣ１８カラム（2.１
×２２０mm、アブライドバイオシステムズ社）と酢酸ナ
トリウム／テトラハイドロフラン／アセトニトリル勾配
溶出液を用いたモデル１２０ＡオンラインＨＰＬＣユニ
ット（アプライドバイオシステムズ社）の逆相高速液体
クロマトグラフィーで分析した。
【００５８】Ｌ５３抗原のアミノ末端配列を以下に示
す。 1 5 10 15 20 25 30 D V V V Q A P T Q V P G F L G D S V T L P X Y L Q V P N M X （式中Ｘは同定されていないアミノ酸を示す）。LOSPRO
（１９８９、５月）、SWISSPROT （１９８９、５月）お
よびＤＩＦ（１９８９、５月）データベースと３０残基
のＬ５３アミノ末端配列の比較では他の既知配列との有
意な配列ホモロジーは見つからなかった。ＮＢＲＦ−Ｐ
ＩＲデータベース（１９９０年５月２日）との同様の比
較でヒトポリオウイルスレセプターＨ２０Ａ前駆体との
２８残基の一致を示した。
【００５９】Ｌ５３抗体により認識される抗原は分子量
約７００００〜７５０００ダルトンの新しいたんぱく質
である。 （免疫学的特性−放射能免疫沈殿法） ａ．２６６９および２９８１細胞（２０×１０6 細胞）
を先に報告されている方法に従がい（ビテタ（Vitett
a)、E. S. 等、１９７１、J. Exp. Med.１３４：２４２
−２６４） 125Ｉ−ＮａＩ（ニューイングランドニュー
クリア、ボストン、ＭＡ）を用いたラクトパーオキシダ
ーゼ法により表面ヨウ素化した。放射能標識した膜たん
ぱく質を１mlの溶解バッファ（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％
トリトン×−１００、0.１％ＳＤＳ、１％デオキシコー
ル酸ナトリウム、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニル
フルオライド、１０μｇ／ml）を含むリン酸緩衝液pH7.
２）とＴＬＣＫ（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンク
ロロメチルケトン；2.０μｇ／ml）を用い４℃で３０分
間かけて抽出した。この界面活性剤抽出物をプロテイン
Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（シグマケミカル社、セン
トルイス、ＭＯ）の５０％懸濁液５０μｌおよびウサギ
抗マウスIgＧ（ザイムドラボラトリーズ社、サンフラン
シスコ、ＣＡ）と４℃で３０分間インキュベーションす
ることで清澄化した。Ｌ５３抗原は清澄化細胞溶解物を
５μｌの精製Ｌ５３抗体（２mg／ml）および予めウサギ
抗マウスIgＧを結合したプロテインＡ−セファロースＣ
Ｌ−４Ｂの５０％懸濁液３０μｌと４℃で２時間インキ
ュベートすることにより免疫沈殿させた。この免疫沈殿
を0.５Ｍ NaClおよび１％ＮＰ−４０を含む１０ｍＭト
リス−ＨＣｌバッファで４回洗浄し、還元および非還元
条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ライトニングプ
ラス増感スクリーンを用いてＸ−ＯＭＡＴ−Ｘ線フィル
ム（コダック）に感光させた。 ｂ．５％の透析ウシ胎児血清を補ったＲＰＭＩ １６４
０培地（メチオニンフリー、ＲＰＭＩ １６４０セレク
ト−アミンキット、ギブコ、グランドアイランド、Ｎ
Ｙ）中35Ｓ−メチオニン（0.２５ｍＣｉメチオニン／m
l、アマーシャム、アーリントンハイツ、ＩＬ）を用
い、３７℃、１８時間かけて２６６９、ＲＣＡ、および
２９６４細胞（１×１０6 細胞／ml）を代謝的に標識化
した。この細胞ペレットをリン酸緩衝液(pH7.2) で３回
洗浄し、ついで１ml溶解バッファで抽出した。上述のよ
うにＬ５３抗原を免疫沈殿化し、還元および非還元条件
でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったのち、そのゲルをアンプリ
ファイ（アマーシャム製）で飽和させて蛍光で観察し
た。
【００６０】Ｌ５３抗体は、 125Ｉ−NaＩおよび35Ｓ−
メチオニン標識化細胞の両方でＭｒ＝７０〜７5,０００
のＬ５３抗原を特異的に沈殿させた。このデータはＬ５
３モノクローナル抗体により認識される抗原決定基はＭ
ｒ＝７０−７5,０００ダルトンの単一の一本鎖たんぱく
質上に存在することを示している。
【００６１】先に示した本発明はその精神および範囲を
逸脱することなしに修正し得ることは明白である。ここ
に示した特定の態様は例として示したもので本発明は請
求の範囲のみにより規定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 カルル エリック ヘルストローム アメリカ合衆国 ワシントン州 98105 シアトル ノースイースト サーバー ド ライヴ 3925 (72)発明者 ハンス マルカルト アメリカ合衆国 ワシントン州 98040 マーサー アイランド サウスイースト フォーティシックスス ストリート 9222 (72)発明者 ジャネット ジョンストン アメリカ合衆国 ワシントン州 98103 シアトル パラタイン アベニュー ノー ス 9037

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト腫瘍細胞の細胞表面糖たんぱく質抗
    原上の決定基に結合するハイブリドーマ細胞系列 No.
    ＨＢ１０３４８により生産されるモノクローナル抗体、
    該抗体の機能等価物、結合フラグメントおよび免疫複合
    体。
  2. 【請求項２】 前記腫瘍細胞ががん細胞である請求の範
    囲１記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】 前記がん細胞が肺、結腸および乳がん細
    胞からなる群から選ばれる請求の範囲２記載のモノクロ
    ーナル抗体。
  4. 【請求項４】 前記腫瘍細胞が黒色腫細胞である請求の
    範囲１記載のモノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】 検出可能なシグナルを発生し得る標識を
    結合した請求の範囲１記載のモノクローナル抗体。
  6. 【請求項６】 前記標識が放射性核種、酵素、蛍光剤お
    よび発色剤からなる群から選ばれる請求の範囲５記載の
    モノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】 ヒト腫瘍細胞の細胞表面糖たんぱく質抗
    原でポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定で分子
    量が約７0,０００乃至約７5,０００であり、かつ以下に
    示す式 1 5 10 15 20 25 30 D-V-V-V-Q-A-P-T-Q-V-P-G-F-L-G-D-S-V-T-L-P-X-Y-L-Q-V-P-N-M-X （式中Ｘは未同定のアミノ酸を示している）で表わされ
    るアミノ末端アミノ酸配列を有することを特徴とする抗
    原上の決定基に結合するハイブリドーマ細胞系列 No.
    ＨＢ１０３４８により生産されるモノクローナル抗体、
    該抗体の機能等価物、結合フラグメントおよび免疫複合
    体。
  8. 【請求項８】 医薬的に許容可能な非経口ベヒクルと共
    に治療有効量の請求の範囲７記載の抗体を含む腫瘍の治
    療を目的とする組成物。
  9. 【請求項９】 ミエローマ細胞とヒト腫瘍細胞の細胞表
    面糖たんぱく質抗原で、ポリアクリルアミドゲル電気泳
    動による測定で分子量が約７0,０００乃至約７5,０００
    であり、かつ以下に示す式： 1 5 10 15 20 25 30 D-V-V-V-Q-A-P-T-Q-V-P-G-F-L-G-D-S-V-T-L-P-X-Y-L-Q-V-P-N-M-X （式中、Ｘは未同定のアミノ酸を示す）で表わされるア
    ミノ末端アミノ酸配列を有する抗原上の決定基に結合す
    る抗体を生産し得る細胞との融合により生成するハイブ
    リドーマ細胞系列により生産されるモノクローナル抗
    体、該抗体の機能等価物、結合フラグメントおよび免疫
    複合体。
  10. 【請求項１０】 IgＧクラスに属する請求の範囲９記載
    のモノクローナル抗体。
  11. 【請求項１１】 IgＧ１サブクラスに属する請求の範囲
    ９記載のモノクローナル抗体。
  12. 【請求項１２】 マウスの抗体である請求の範囲９記載
    のモノクローナル抗体。
  13. 【請求項１３】 ヒト腫瘍細胞の細胞表面糖たんぱく質
    抗原で、アクリルアミドゲル電気泳動による測定で分子
    量が約７0,０００乃至約７5,０００であり、かつ以下の
    式： 1 5 10 15 20 25 30 D-V-V-V-Q-A-P-T-Q-V-P-G-F-L-G-D-S-V-T-L-P-X-Y-L-Q-V-P-N-M-X （式中、Ｘは未同定のアミノ酸を示す）で表わされるア
    ミノ末端アミノ酸配列を有することを特徴とする抗原上
    の決定基と反応するモノクローナル抗体、該抗体の機能
    等価物、結合フラグメントおよび免疫複合体。
  14. 【請求項１４】 ハイブリドーマ細胞系列ＡＴＣＣ N
    o. ＨＢ１０３４８により生産されるＬ５３モノクロー
    ナル抗体を含む請求の範囲１３記載のモノクローナル抗
    体。
  15. 【請求項１５】 ヒト抗体である請求の範囲１３記載の
    モノクローナル抗体。
  16. 【請求項１６】 マウス−ヒト抗体である請求の範囲１
    ３記載のモノクローナル抗体。
  17. 【請求項１７】 医薬的に許容可能な非経口ベヒクルと
    共に治療有効量の請求の範囲１３記載の抗体を含む腫瘍
    の治療を目的とした組成物。
  18. 【請求項１８】 ヒトの腫瘍の検出を目的とする免疫検
    定法で、 ａ）ヒト腫瘍細胞に関する細胞表面糖たんぱく質抗原
    で、アクリルアミドゲル電気泳動による測定で分子量が
    約７0,０００乃至約７5,０００であり、かつ以下の式： 1 5 10 15 20 25 30 D-V-V-V-Q-A-P-T-Q-V-P-G-F-L-G-D-S-V-T-L-P-X-Y-L-Q-V-P-N-M-X （式中、Ｘは未同定のアミノ酸を示す）で表わされるア
    ミノ末端アミノ酸配列を有することを特徴とする抗原に
    反応するモノクローナル抗体で、検出可能となるように
    標識した抗体を腫瘍細胞試料と合せる、および ｂ）該抗原を有する腫瘍細胞への該標識モノクローナル
    抗体の結合を検定する、以上ａ）およびｂ）のステップ
    を含む方法。
  19. 【請求項１９】 前記モノクローナル抗体がハイブリド
    ーマ細胞系列ＡＴＣＣ No. ＨＢ１０３４８により生産
    されるＬ５３抗体である請求の範囲１８記載の免疫検定
    法。
  20. 【請求項２０】 前記抗体を放射性核種、酵素、蛍光剤
    および発色剤からなる群から選ばれる標識物で標識する
    請求の範囲１８記載の免疫検定法。
  21. 【請求項２１】 腫瘍の検出方法で、請求の範囲１、
    ７、９または１３のいずれか１項記載のモノクローナル
    抗体をヒトの組織または液体試料と接触させ、ついで該
    抗体と該試料中の抗原的に対応する腫瘍細胞または抗原
    決定基との相互作用を検出することを含む方法。
  22. 【請求項２２】 前記腫瘍細胞が肺がん細胞であり、か
    つヒト組織が肺組織である請求の範囲２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記腫瘍細胞が乳がん細胞であり、か
    つヒト組織が胸部組織である請求の範囲２１記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】 前記腫瘍細胞が結腸がん細胞であり、
    かつヒト組織が結腸組織である請求の範囲２１記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】 前記腫瘍細胞が黒色腫細胞である請求
    の範囲２１記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記モノクローナル抗体と前記腫瘍細
    胞との相互作用が免疫組織学的染色により検出される請
    求の範囲２１記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ヒトの体内の腫瘍の位置を検出する方
    法で、 ａ）請求の範囲１、７、９または１３のいずれか１項記
    載のモノクローナル抗体を精製する、 ｂ）該抗体を放射性標識する、 ｃ）適当なキャリヤー中の該抗体をヒトの患者に投与す
    る、および ｄ）イクスターナルシンチグラフィー、放射型断層擦影
    法または放射性核種スキャンニングにより該モノクロー
    ナル抗体の位置を決定する、 以上ａ）〜ｄ）のステップを含む方法。
  28. 【請求項２８】 腫瘍の治療を目的とした免疫治療法
    で、 ａ）請求の範囲１、７、９または１３のいずれか１項記
    載のモノクローナル抗体を精製する、 ｂ）該モノクローナル抗体を細胞毒性物質、トキシンま
    たは放射性医薬と結合する、および ｃ）適当なキャリヤー中の該モノクローナル抗体結合体
    をヒトの患者に投与する、 以上ａ）〜ｃ）のステップを含む方法。
  29. 【請求項２９】 該モノクローナル抗体が抗イディオタ
    イプ抗体である請求の範囲２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ヒトのがん細胞の細胞表面糖たんぱく
    質抗原上の決定基と結合する能力を有するモノクローナ
    ル抗体を生産する継続性細胞系列で、がん細胞またはそ
    の免疫原決定基で免疫化したマウス由来のリンパ球とマ
    ウスミエローマ細胞のハイブリドーマを含む細胞系列。
  31. 【請求項３１】 ヒトのがん細胞の細胞表面糖たんぱく
    質抗原上の決定基に結合する能力を有するモノクローナ
    ル抗体を生産する継続性細胞系列でがんを有するヒト由
    来のリンパ球とミエローマ細胞のハイブリドーマを含む
    細胞系列。
  32. 【請求項３２】 ヒトの腫瘍細胞の細胞表面糖たんぱく
    質抗原上の決定基に結合し得るハイブリドーマ細胞系列
    ＡＴＣＣ No. ＨＢ１０３４８のモノクローナル抗体。
  33. 【請求項３３】 マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−
    Ａｇ8.６５３を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
    る測定で分子量が約７0,０００乃至約７5,０００であ
    り、かつ以下の式： 1 5 10 15 20 25 30 D-V-V-V-Q-A-P-T-Q-V-P-G-F-L-G-D-S-V-T-L-P-X-Y-L-Q-V-P-N-M-X （式中、Ｘは未同定のアミノ酸を示す）で表わされるア
    ミノ末端アミノ酸配列を有するヒト腫瘍細胞の細胞表面
    糖たんぱく質抗原の決定基に結合するモノクローナル抗
    体を生産する肺アデノカルシノーマＣＨ３、２９８１、
    ２９０７および２９６４細胞で免疫化したＢＡＬＢ／Ｃ
    マウス由来の脾細胞を融合することにより生成するハイ
    ブリドーマ細胞系列ＡＴＣＣ No. ＨＢ１０３４８。
  34. 【請求項３４】 腫瘍細胞に関連する分子量約７0,００
    ０乃至約７5,０００で、かつ以下の式： 1 5 10 15 20 25 30 D-V-V-V-Q-A-P-T-Q-V-P-G-F-L-G-D-S-V-T-L-P-X-Y-L-Q-V-P-N-M-X （式中、Ｘは未同定のアミノ酸を示す）で表わされるア
    ミノ末端アミノ酸配列を有する細胞表面糖たんぱく質抗
    原上の決定基と結合する能力を特徴とするモノクローナ
    ル抗体を生産する継続的細胞系列で該抗原に対する抗体
    を生産し得るリンパ球とミエローマ細胞とのハイブリド
    ーマを含む細胞系列。
  35. 【請求項３５】 ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
    る測定で分子量が約７0,０００乃至約７5,０００であ
    り、かつ以下の式： 1 5 10 15 20 25 30 D-V-V-V-Q-A-P-T-Q-V-P-G-F-L-G-D-S-V-T-L-P-X-Y-L-Q-V-P-N-M-X （式中、Ｘは未同定のアミノ酸を示す）で表わされるヒ
    ト腫瘍由来の実質的に精製された糖たんぱく質抗原およ
    び該抗原の免疫複合体。
  36. 【請求項３６】 請求の範囲３５記載の抗原をコードす
    るＤＮＡを含む組換えウイルスを含む腫瘍に対する免疫
    を目的とするワクチン。
  37. 【請求項３７】 該ウイルスがワクシニアウイルスであ
    る請求の範囲３６記載のワクチン。
  38. 【請求項３８】 治療有効量の請求の範囲３６記載のワ
    クチンを投与することを含む腫瘍に対する免疫方法。
  39. 【請求項３９】 診断キットで、 ａ）請求の範囲１、７、９または１３のいずれか１項記
    載のモノクローナル抗体、および ｂ）検出可能標識とａ）のモノクローナル抗体の特異的
    結合パートナーの結合物 以上ａ）およびｂ）を含むキット。
  40. 【請求項４０】 前記標識が酵素、放射性核種、発色剤
    および蛍光剤からなる群から選ばれる請求の範囲３９記
    載の診断キット。
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