JPH05504330A - ヒトのがん腫と反応する新しい抗体 - Google Patents

ヒトのがん腫と反応する新しい抗体

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JPH05504330A
JPH05504330A JP2511844A JP51184490A JPH05504330A JP H05504330 A JPH05504330 A JP H05504330A JP 2511844 A JP2511844 A JP 2511844A JP 51184490 A JP51184490 A JP 51184490A JP H05504330 A JPH05504330 A JP H05504330A
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antibodies
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ヘルストローム　カーク　エリック
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オンコーゲン　リミテッド　パートナーシップ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトのガン腫と反応する新しい抗体 （関連分野） 本発明はヒトのかん腫細胞と反応する新しい抗体に関する。特に本発明は結腸、 胸、子宮および肺のかん腫を含む多種多様のヒトのかん腫に関連する細胞膜抗原 と反応するマウスモノクローナル抗体およびキメラモノクローナル抗体に関する 。
このマウスモノクローナル抗体はかん腫に非常に特異的で、正常な組織なリンパ 腫またはサルコーマなとの他の腫瘍に対しては反応性を全くまたはほとんど示さ ない。本発明の抗体にはいくつかの利屯かある。第１に、これらは結合したがん ＠細胞の中に入る。それゆえ、本発明の抗体ＢＲ９６は、その結合体の内向か望 まれる抗体−薬剤または抗体−毒物結合体の抗体成分なとのように治療への応用 に有用である。第２に、この抗体は抗体依存細胞性細胞毒性“ＡＤＣＣ”、およ び補体依存細胞毒性“ＣＤＣ“を担う。第３に、この抗体は十分な濃度で抗原陽 性腫瘍細胞を殺生し得る。また本抗体はインビトロまたはインビボにおけるがん 腫の検出なと診断にも有用である。
（関連技術） ヒトの腫瘍関連分化抗原に対するモノクローナル抗体はラジオアイソトープ、化 学療法剤および毒物なと種々の抗ｉ瘍薬剤の”ターゲツティングの可能性を提供 する。〔パルトウイン（Ｂａｌｄｗｉｎ）およびバイヤーズ（Ｂｙｅｒｓ）　（ 編）、“がんの検出および治療に関するモノクローナル抗体”、ロンドン、アカ デミツクプレス（＋９８５））。さらに、いくつかのモノクローナル抗体はヒト のエフェクター細胞または血清の存在下ＡＤＣＣまたはＣＤＣにより腫瘍細胞を 殺すという利点を存する〔ヘルストロム（）ｔｅｌ　１ｓｔｒｏｍ）等、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｏｃ、　［ＪＳＡ、８３；７０５９−７０６ ３　（１９８６））。またとの宿主成分にも依存しない直接的な抗腫瘍活性を有 するモノクローナル抗体らいくつかある〔トンビン（Ｄｒｅｂｉ口）等、Ｏｎｃ ｏｇｅｒｅ　２　：　３８７−３９４　（１９８８）　）。
かん腫関連抗原と反応するモノクローナル抗体も多く知られてる〔たとえば、パ プシデロ（Ｐａｐｓｉｄｅｒｏ）、“モノクローナル抗体を用いたかん腫の免疫 学的モニターにおける最近の進歩”　、　Ｓｅｍ１ｎ、　Ｓｕｒｇ、　０ｎｃｏ １．、　Ｉ　（４）　；　Ｉ　７１−８　［１９８５）ニジロム（Ｓｃｈｌｏｍ ）等“ヒトかん腫の管理におけるモノクローナル抗体の臨床的応用＋、Ｉｍｐｏ ｒｔａｎｔＡｄｖ、　０ｎｃｏ１．．１７０−９２　（＋９８５）　；アラム（ Ａｌｌｕ＋ｎ’）等、“恕性腫瘍の診断および治療におけるモノクローナル抗体 “、Ｓｕｒｇ、　Ａｌ、、Ｉ８：４１−６４　（＋９８６）；およびヒユートン （Ｈｏｕｇｈｔｏｒ、：１等、“モノクローナル抗体　か／シ治療への応用”　 、Ｓｅｍ１ｎ、　０ｎｃｏ１．、　Ｉ　３（２）：１６５−７９　（１９８６） 　）これらの既知モノクローナル抗体は糖たんばく質、糖脂質およびムチンを含 む種々のかん腫関連抗原に結合し得る〔たとえば、フィンク（Ｆｉｎｋ）等、“ ヒト腫瘍抗原の同定および特性化に関する診断試薬としてのモノクローナル抗体 ”、Ｐｒｏｇ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、、９　：Ｉ２１−３３　（１９８ ４））、たとえば、特定のタイプのかん腫に関する糖たんばく質抗原に結合する モノクローナル抗体には米国特許４．７３７．５７９　（非スモール細胞肺がん 腫に対するモノクローナル抗体）、米国特許４．７５３．８９４　（ヒト胸部か んに対するモノクローナル抗体）、米国特許４．５７９．８２７（ヒト胃腸かん に対するモノクローナル抗体）および米国特許４．７１３．３５２　（ヒト腎臓 かん腫に対するモノクローナル抗体）に述へられているものかある。最も研究さ れている抗体の１っである８７２．３は種々のかん腫に選択的に発現される分子 Ｍ１．０００ｋｃ１以上の腫瘍関連ムチン抗原を確認する。
８７２．３は胸部かんの８４％、結腸かんの９４％、非スモール細胞肺がんの９ ６％と反応することか示された（ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）、“モノク ローナル抗体８７２．３の研究される臨床細胞学におけるモノクローナル抗体の 応用”、ＡＣｔａ。
Ｃｙｔｏｌ、、Ｉ　（５）　；　５３７−５６　（１９８７）およびシロム（Ｓ ｃｈｌａｍ）等、米国特許４．６１２．２８２　）。特許を受けた別のモノクロ ーナル抗体ＫＣ−４（米国特許４、７０８．９３０　）は結腸、前立腺、肺およ び胸部かんなと多くのかん腫で発現される約４００−５００ｋｄのたんばく質抗 原を認識する。Ｉ７２．３およびＫＣ−４抗体のいずれもこれらか反応したかん 細胞の中には入らないよってある。腫瘍細胞に関連する糖脂質抗原と反応するモ ノクローナル抗体か公開されてきている。たとえば、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）等、 “糖脂質ガングリオ−Ｎ−トリオシルセラミド（アンアロＧＭ２）の２つの異な る立体部分に特異的なモノクローナル抗体の生産“、Ｊ。
ＥＸｐ、Ｍｅｄ、、１５０　；　１００８−１０１９　（１９７９）はカーステ ンマウスザルコーマウィルスでトランスホームしたＢＡＬＢ／ＣＶ３Ｔ３Ｔ細胞 に対するマーカーとして確立された細胞表面クリコスフィンゴ脂質抗原、アンア ロＧＭ２に特異的な２つのモノクローナル抗体の生産を公開している。また、ニ ープ（Ｋｎｉｅｐ）等、“ホトキン病患者由来の細胞系列に対するガングリオト リアオンルセラミト（アンアロＧＭ、）Ａグリコスフィンゴ脂質マーカー”、Ｊ 、Ｉ厘ｕｎｏ１．、　］　３１（３）；　１５９１−９４　（１９８３）および 米国特許４．５０７．３９１　Ｃヒト悪性腫に対するモノクローナル抗体）径孔 かん細胞に関する糖脂質抗原と反応する別のモノクローナル抗体には、ローゼン （Ｒｏｓｅｒ）等、“ラットモノクローナル抗体群を用いたヒトスモール細胞腫 がん分化抗原の分析＋、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、４４　；２０５２−６ １　（１９８４）　（ヒトスモール細胞腫がんに対するモノクローナル抗体）、 バルキ（Ｖａｒｋｉ）等、“モノクローナル抗体で規定されるヒト肺アデノカル ンノーマに関する抗原”、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、　４４．６８１−８ ７　（＋　９８４）、（肺、胃および結腸のヒトアデノカルシノーマおよびメラ ノールに対するモノクローナル抗体）および米国特許４、５７９．８２７（ヒト 結腸アデノカルンノーマに対するモノクローナル抗体）に述へられているものか 含まれている。また、ヘルストロム（Ｈｅｌ　Ｉｓｔｒｏｍ）等、“はとんとの ヒトかん腫と反応するＩａＧ２ａ抗体、Ｉ６の抗腫瘍効果”　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８３；７０５９−６３　（１９８６）参照、この文献はヒト 非スモール細胞肺かん腫、胸部かん腫および結腸かん腫の表面に発現される炭水 化物抗原を認識するＬ６モノクローナル抗体について述へている。巾広いがん腫 の大部分の細胞に高い反応特異性を示す別のモノクローナル抗体か非常に必要と されている。
このことは診断や治療において同し腫瘍に多くの異なるモノクローナル抗体を必 要とする多くのかん腫の抗原異種性によるものである。特に治療に関し、いわゆ る“内向性“抗体、すなわち結合した腫瘍細胞に容易に取り込まれる抗体の必要 かある。このタイプの抗体は腫瘍関連抗原と結合し、その腫瘍細胞内に抗腫瘍薬 剤を運ぶもので、腫瘍に運ぶ治療用抗腫瘍剤と結合した抗体−薬剤または抗体− 毒物結合体を用いた治療法に利用できるものである〔エンブルドン（Ｅｍｂｌｅ ｔｏｎ）等、“抗がん剤の抗体ターゲツティング、“かん検出および治療を目的 としたモノクローナル抗体”、３１７−４４（アルデミツクプレス＋９８５）） 。結合した腫瘍細胞内に入れない腫瘍関連抗原に対する抗体は一般に細胞内に抗 腫瘍薬剤や毒物の作用を到達させ得ないことから結合体の調製には有用てはない 。治療にこれらの抗体を使用するには別の方法が必要となる。
リンパ球抗原と反応する内向性抗体がいくつか知られている。これに対して腫瘍 を扱ったこれらの抗体は稀れである。がん腫と反応する内向性抗体の数少ない例 の１つにドミンゴ（００制ｎｇｏ）等、“抗体−薬剤結合体のターゲットとして のトランスフェリンレセプター”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１１２ 　；　２３８−４７　（１９８５）に述べられている抗体がある。この抗体は腫 瘍細胞に発現するヒトトランスフェリン−レセプター糖たんばく質と反応する。
しかし、このトランスフェリン−レセプターは多くの正常組織にも、しばしば高 レベルで発現するため、抗体−薬剤または抗体−毒物結合体に抗トランスフェリ ンーレセプター抗体を用いると正常細胞へも重大な毒性を与えることになる。腫 瘍細胞の選択的殺生や阻害にこの抗体を用いることは問題である。別の内向性抗 体としては巾広いがん種と結合するＢＲ６４（１９８８年１２月２２日登録の米 国特許出願Ｎα２ｇ９．６３５および１９８９年１１月２９日登録のＮｎ４４３ ．６９６に公開されている、参考として引用）がある。
モノクローナル抗体生産を目的とした細胞融合技術（コラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）お よびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、Ｎａｔｕｒｅ　（ｏンドン＞、２５ ６：４９５　（１９７５）　］で、未知の抗原を含む抗原と反応する多くのマウ スモノクローナル抗体の開発が可能となった。しかし、マウスのモノクローナル 抗体はヒトの免疫系にとって異物と認識され、ヒトの治療に威力を発揮する前に 中和されてしまう。それゆえ、最近は免疫グロブリン遺伝子を発現させるため哺 乳類細胞にＤＮＡを導入することによる、いわゆる“キメラ“抗体の生産に研究 が集中してきている〔オイ　（ｏｌ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８０；８２５　（１９８３）；ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ） 等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｉｔｓ＾　８１；７１６ １　（）、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　；６５８１　（１９８４）　；サバガン（Ｓａ ｈａｇａｎ）等、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７；１０６６　（１９８６）；サン （Ｓｕｎ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８４　：２１４ 　（１９８７）　）。
キメラ抗体とはヒトと非ヒト部分からなる免疫グロブリン分子である。特にキメ ラ抗体の抗原結合部分く可変部）は非ヒトを起源とし、免疫グロブリンに生物学 的エフェクター機能を与えるキメラ抗体の定常部はヒトに由来する。キメラ抗体 は非ヒト抗体分子の抗原結合特異性とヒト抗体分子によって与えられるエフェク ター機能を兼ね備えている。一般にキメラ抗体を生産するのに使用する操作には 以下のステップか含まれる。ａ）抗体分子の抗原結合部をコートする正しい遺伝 子セグメントの同定およびクローニング、この遺伝子セグメント（ＶＤＪ、重鎮 の可変、多様性および結合部または、ＶＪ、軽鎖の可変、結合部または単にＶ、 可変部として知られている）はｃＤＮＡの形てもゲノムの形てもよい。ｂ）定常 部またはその一部をコードする遺伝子セグメントのクローニング：ｃ）完全なキ メラ抗体か転写可能でかつ翻訳可能な形でコードされるような可変部と定常部の ライゲーション＋ｄ）選択マーカーやプロモーター、エンハンサ−およびポリ（ Ａ）付加シグナルなとの遺伝子コントロール領域を含むベクターへの該構築物の ライゲーション、ｅ）バクテリアにおける該横築物の増巾：ｆ）本ＤＮＡの真核 細胞、一般的には哺乳層１ルバ球への導入（トランスフェクション）：ｇ）選択 マーカーを発現する細胞の選択：ｈ）所望するキメラ抗体を発現する細胞のスク リーニング、およびｋ）適当な結合特異性およびエフェクター機能に関する抗体 のテスト。
いくつかの異なる抗原結合特異性をもつ抗体がキメラたんばく質を生産するこれ らの操作を用いて調製されている〔抗ＴＮＰ、ポーリアン（Ｂｏｕｌ　１ａｎｎ ｅ）等、Ｎａｔｕｒｅ３１２＋６４３　（１９８４）：抗腫瘍抗原：サバガン（ Ｓａｂａｇａｎ）等、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７＋１０６６　（＋９８６））、同様に抗原結合部をコー トする配列に新しい配列を結合させることによりいくつかのエフェクター機能を 与えることができる。これらには酵素〔ニューバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ） 等、Ｎａｔｕｒｅ　３１２　；６０４　（１９８４））、異種由来の免疫グロブ リン定常部および異種免疫グロブリン鎖の定常部（シャロン（Ｓｈａｒｏｎ）等 、Ｎａｔｕｒｅ、３０９　：３６４　（＋　９８４）；タン（Ｔａｎ）等、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５；３５６５−３５６７　（１９８５））、哺乳類細胞に おける相同組換えの発見は特異的染色体塵への新しい配列のターゲツティングを 可能にする。培養した嘩乳類細胞かプラスミドに相当的配列を含む染色体部位で 染色体ＤＮＡに外来ＤＮＡを取り込む時に相同組換えが起こる〔フォルガ−（Ｆ ｏｌｇｅｒ）等、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、２；　１３７２−１３８７ 　（１９８２Ｌ）オルガ−（Ｆｏｌｇｅｒ）等、Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂ ｉｏｌ、４９　：１２３−１３８　（＋９８４）；クチャラバティ（Ｋｕｃｈｅ ｒｌａｐａｔｉ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８１　；　３１５３−３１５７　（＋９８４）；リン（い口）等、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　：１３９１−１３９５　 （＋９８５）；デセイントビンセント（ｄｅ　５ａｉｎｔ　Ｖｉｎｃｅｎｔ）等 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　；　２００ ２−２００６　（１９８３）　；：／ヤウル（Ｓｈａｕｌ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　；　３７８１−３７８４（＋ ９８５））。細胞内での相同組換えはインサイチュ−での内在性遺伝子の修正を 可能にする。標的部位と相同的なりＮＡ上セグメント所望する修正を含んだ新し い配列のセグメントの両方を含むプラスミドＤＮＡを細胞に導入することにより 染色体配列を修正し得る条件か見つかっている〔トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）等、 Ｃｅ１１４４；４１９−４２８　（＋９８６）：スミシーズ（Ｓｍｉ　ｔｈｉｅ ｓ）等、Ｎａｔｕｒｅ３１７；２３０−２３４　（１９８５）ニスミス（Ｓｍｉ 　ｊｈ）等Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ。
４９：ｌ７ｌ−１８１（１９８４））。哺乳類細胞染色体ＤＮＡおよび外来プラ スミドＤＮＡの間の相同組換えてそのプラスミドの組込みまたは相同的プラスミ ド配列といくらかの染色体配列との置換か起こり得る。相同組換えプロセスはい くらかの細胞梨に対してＮＥＯおよびＨＰＲＴなとの選択性を提供する遺伝子を 用いて評価されてきた（ソング（Ｓｏｎｇ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４　：６８２０−６８２４　（＋９８７）：ルビニ ラ（Ｒｕｂｉｎｉ　ｔｚ）およびサブラマニ（Ｓｕｂｒａａｎｉ　）、Ｍｏ１． 　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、６　；　］　］６０８−１６１４　（１９８６）　； およびリスケイ（Ｌｉｓｋａい、Ｃｅ１ｌ　３５：１５７−１６４（＋９８３） ）、最近、遺伝子修正を目的とする相同組換えを用いた抗体分子の修正およびキ メラ抗体分子の生産に関する操作か報告された〔フェル（Ｆｅｌｌ）等、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
ＵＳ、Ａ　８６；８５０７−８５１１　（１９８９）；および１９８８年９月１ ４日登録の米国特許出願Ｎｃ２４３．８７３および１９９０年１月２２日登録の Ｎα４６８．０３５　（いずれも本発明者による）、参考として引用する〕。
臨床的に抗腫瘍モノクローナル抗体を応用する直接的方法はインビトロおよび動 物体内て抗腫瘍活性を示すモノクローナル抗体を未修正の形で投与することであ る。腫瘍抗原に対するほとんとの抗腫瘍抗体はそれら自身では抗腫瘍活性を有し ているとは思わないか、あるモノクローナル抗体は補体依存細胞毒性（ＣＤＣ） を有する、すなわち、補体源としてのヒト血清の存在下、ヒトの腫瘍細胞を殺す ことか知られており〔ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
ＵＳＡ　８２；　１４９９−１５０２　（＋９８５））、またヒトＮＫ細胞また はマクロファージなとのエフェクター細胞と共に抗体依存細胞性細胞毒性（ＡＤ ＣＣ）を有していることか知られている。ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を検出する ため、４時間インキュベーションでＳ　Ｉ　Ｃｒラベル化腫瘍標的培養細胞を溶 解する能力についてモノクローナル抗体をテストする。
ターゲット細胞を５１　Ｃｒラベルし、４時間エフェクター細胞（リンパ球分離 培地を用いて精製したヒトリンパ球の形のもの）および抗体の組合せ物（０，１ μｇ／ｍｌからＩＯμｇ／ｍｌの濃度で添加する）に露す。ターゲット細胞から 放出される５１Ｃｒを腫瘍細胞の分解（細胞毒性）の証拠として測定する。ター ゲット細胞のみのインキュベーションまたはリンパ球またはモノクローナル抗体 とのインキュベーションをコントロールとする。放出され得る全”Ｃｒ量を測定 し、単独でインキュベーションしたターゲット細胞に対するターゲット細胞の死 亡率としてＡＤＣＣを計算する。ＣＤＣに関する操作は補体源としてヒト血清（ １：３〜１６希釈物）をエフェクター細胞の代りに添加すること以外ＡＤＣＣの 検出に使用したものと同しである。
ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を有するモノクローナル抗体はしばしばインビボでの 抗腫瘍活性を育するので治療に使用できると考えられる。一方インビトロてのＡ ＤＣＣおよびＣＤＣ活性を欠く抗体は抗腫瘍薬剤のキャリヤーとして使用されな い限り一般にインビボでは効果かない。宿主の補体を活性化するモノクローナル 抗体の能力は、腫瘍細胞か殺されるためばかりてなく、腫瘍への血液供給か増加 するため薬剤の取り込みか容易となることから治療に有利であることか分った〔 ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）等、“腫瘍治療の免疫学的方法：モノクロ ーナル抗体、腫瘍ワクチンおよび抗イデイオタイプ、“診断および治療における 修正抗原および抗体”、クウオソシュ（Ｑｕａｓｈ）およびロッドウェル（Ｒｏ ｄｗｅｌｌ）編、マーセルデツカ−（ｍｒｃｅｌｌ　Ｄｅｋｋｅｒ）　、ｐｐ、 Ｉ　５−１８　（＋９８９）　）、　マウスモノクローナル抗体の中で、ＩｇＧ ２ａおよびＩｇＧ　３アイソタイプは一般にＡＤＣＣおよびＣＤＣと関連してい る。ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両活性を有する抗体はそれらか結合した腫瘍細胞の みを殺す高い選択性を有し、もしそれらが肺、肝臓または他の器官にトラップさ れても毒性効果を示すことはない。このことは放射性ラベルした抗体または特定 タイプの免疫結合体よりも秀れた長所をこれらの抗体に与えている。
それ自体、すなわちＡＤＣＣまたはＣＤＣにおけるエフェクター細胞または補体 の非存在下、腫瘍を殺し得る抗体はほとんとない。約１０８ｇ７ｍ１以上の抗体 濃度で単独で細胞を殺し得ることからＢＲ９６はそのような抗体の１っである。
これらの抗体は、悪性細胞の生存のためのいくつかの重要な事象を阻害し得るこ とから特に興味深い。
このように広範囲のかん腫に高い選択性を示し、それ自体て抗腫瘍活性を有し、 かつ、容易に腫瘍細胞に内向し得る抗体は腫瘍治療に非常に育利であることは明 らかである。
（発明の概要） 本発明はある範囲のヒトかん腫に高い選択性を示す内向性抗体を提供する。特に 、ＢＲ９６と命名した本発明の新しい抗体はヒトかん細胞に存在する細胞膜抗原 に結合するマウスモノクローナル抗体であるキメラ抗体である。この抗体は胸、 肺、結腸および子宮かん由来のかん細胞と非常による反応するか正常ヒト細胞や リンパ腫またはサルコーマなと他のタイプの腫瘍には全くまたはわずかじか反応 性を示さない。さらに、本発明の抗体は結合したかん細胞内に侵入しそれら自身 で、すなわち結合体としててはなく、かつエフェクター細胞または補体なしに腫 瘍細胞を殺し得る。このようにＢＲ９６抗体は腫瘍細胞と反応して、または化学 療法剤、毒物、免疫応答モディファイヤー、酵素およびラジオアイソトープを含 む抗腫瘍効果を存する種々の薬剤のターゲット選択的キャリヤーとして結合体の 形で治療に用いるのに特に有用である。この抗体は結合体の侵入を容易にする抗 体−薬剤および抗体−毒物結合体を含む種々の免疫結合体の成分として、または 腫瘍にラジオアイソトープを運ぶためにラジオラヘルした後に使用し得る。また ＢＲ９６抗体は未修飾型でも治療に使用し得る。さらに、この抗体はがんを検出 するためのインビトロまたはインビボ診断法にも有用である。
図面の簡単な説明 第１図は実施例３に示されているように測定した種々の濃度のＢＲ９６−ＲＡイ ムノドキノンで処理した３　３９６Ｍ部かん細胞のＤＮＡへのチミジン取込み阻 止率を示している。ＢＲ６−ＲＡは３３９６細胞には結合しないことからネガデ ィプコントロールとして使用されている内向性抗体である。
第２図は実施例３に示されているように測定した種々の濃度のＢＲ９６−ＲＡイ ムノトキシンで処理した２７０７肺がん細胞のＤＮＡへのチミジン取込み阻止率 を示している。ＢＲ６−ＲＡは２７０７細胞にも結合する内向性抗体である。
第３図は実施例３に示されているように測定した種々の濃度のＢＲ９６−ＲＡイ ムノトキシンて処理したＨＣＴ１１６結腸かん細胞のＤＮＡへのチミジン阻止率 を示している。ＢＲ９６はＨＣＴｌ　１６細胞には結合しない。
第４図は実施例３に示されているように測定した種々の濃度のＢＲ９６−ＲＡイ ムノトキシンで処理したＣ結腸かん細胞のＤＮＡへのチミジン取込みの阻止率を 示している。ＢＲ６−ＲＡはＣ細胞には結合しない。Ｌ　６−ＲＡはＣ細胞に結 合するか内向しない。
第５図は実施例３に示されているように測定した種々の濃度のＢＲ９６−ＲＡイ ムノトキシンで処理した３３４７結腸かん細胞のＤＮＡへのチミジン取込み阻止 率を示している。ＢＲ９６はこれらの細胞に結合しないかＢＲ６は結合する。
第６図は実施例４に示されているようにＪｑ定したプロピジウムヨーダイト染色 した３３９６胸部かん細胞、２９８７肺かん細胞および３６１９結腸かん細胞の 細胞毒性のＦΔＣ８分析の結果を示している。
第７図は実施例４に示されているように測定した種々の細胞系列の細胞増殖に関 するＢＲ９６の効果を示している。
第８図は実施例４に示されているように染色法で測定した種々の細胞系列の細胞 増殖に関するＢＲ９６の効果を示している。
第９図は実施例５に示されているように行ったＢＲ９６のＡＤＣＣ活性を測定す るテストの結果を示している。
第１Ｏ図は実施例６に示されているように行ったＢＲ９６のＣＤＣ活性を測定す るテストの結果を示している。
第１１図は実施例７に示されているように行ったＢＲ９６の糖脂質に対する反応 性のテスト結果の捧グラフである。
第１２図は実施例７に示されているように行ったＢＲ９６のネオグリコプロティ ンに対する反応性のテスト結果の棒グラフである。
第１３図は実施例８に示されているように行ったヤギ抗−に軽鎖検出試薬を用い たＥＬＴＳＡにおける全ＢＲ９６モノクローナル抗体に対するＢＲ９６Ｆ（ａｈ ’　）２フラグメントの結合活性のグラフである。
第１４図は実施例８に示されているように行ったパーオキシダーセ結合プロティ ンＡ検出試薬を用いたＥＬＩＳＡにおける全ＢＲ９６モノクローナル抗体に対す るＢＲ９６Ｆ＜ａｂ’　）２フラグメントの結合活性のグラフである。
第１５図は実施例９に示されているエレクトロポレーションに用いたベクター１ ）ｈｇ綿配、ＨＣ−Ｄの図である。
第１６図は実施例９に示されているエレクトロポレーシヨンに用いたベクターｐ ＳＶｚｇｐｊ　／ＣＫの図である。
第」７図は実施例９に示されているように行った本発明のキメラＢＲ９６抗体の 結合と本発明のマウスＢＲ９６モノクローナル抗体の結合を比較する競争結合検 定の結果を示すグラフである。
第１８図は実施例１０に示されている３３９６胸部かん細胞に関する本発明の抗 体の細胞毒性のＦＡＣ３分析の結果を示している。
第１９図は実施例１０に示されているように２９８７ヒト肺アデノカルソノ−ま 細胞に関する本発明の抗体の細胞毒性のＦＡＣ３分析の結果を示している。
第２１図は実施例１０に示されているように測定した種々の濃度のマウスＢＲ９ ６−ＲＡイムノトキシンおよびキメラ（Ｃｈｉ）ＢＲ９６−ＲＡて処理した３３ ９６胸部かん細胞のＤＮＡへのチミジン取込み阻止率を示している。
第２２図は実施例ＩＯに示されているように測定した種々の濃度のマウスＢＲ９ ６−ＲＡイムノトキンンおよびＣｈｉＢＲ９６−ＲＡて処理した３６３０胸部か ん細胞のＤＮＡへのチミン〉取込み阻止率を示している。
第２３図は実施例１１に示されているように測定した腫瘍細胞系列８２９８７に 関する未修飾ＢＲ９６の抗腫瘍効果を示すグラフである。
第２４図は実施例１１に示されているように測定したＢＲ９６で処理した動物治 療の終りにおける腫瘍の不在を示す棒グラフである。
第２５図は実施例１１に示されているようにｉｌｌ、ｌｌ定した腫瘍容積で示さ れるＨ２７０７細胞移植後のＢＲ９６抗体の投与効果を示している。
第２６図は、実施例１１に示されているように測定した腫瘍容積て示される２７ ０７細胞の移植後のＦ（ａｂ’　）２フラグメントおよびキメラＢＲ９６による 治療効果を示している。
第２７図は実施例１１に示されているように測定したＦ（ａｂ’　）２フラグメ ントおよびキメラＢＲ９６の効果に対する種々の投与量のＢＲ９６抗体治療後の 腫瘍の不在を示している。
（発明の詳細な説明） 本発明か十分理解されるよう以下に詳細に説明する。
本発明はかん細胞に高い特異性を有する抗体に関する。特に本抗体は胸部、肺、 子宮および結腸かんなと広い範囲のかん腫と反応するか、正常なヒトの組織やサ ルコーマやリンパ腫なとその池のかん腫とは全くまたはほとんど反応しない。
抗体ＢＲ９６を用いてこれか結合する抗原を単離および特徴付けることかできる 。したがって、ＢＲ９６をプローブとして用い認識されるエピトープを同定およ び特徴付けることかできるし、さらにそれらか反応する細胞膜抗原を規定するこ とかできる〔たとえば、ヌデルマン（Ｎｕｄｅ１ｍａｎ’）等“モノクローナル 抗体４．２で規定されるヒトメラノーマ関連ガングリオシド抗原の特性”、Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。
２５７　（１）１２７５２−５６　（１９８２）およびハコモリ（Ｈａｋｏｍｏ ｒｉ）、“腫瘍関連炭水化物抗原”Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　［ｍｍｕｎｏｌ、、２ 　；　１０３−２６　（１９８４））。
モノクローナル抗体ＢＲ９６て行ったエピトープの予備的スクリーニングの結果 からＢＲＱ６か結合するかん細胞上の抗原はルイスＹ抗原のフユシル化変異体の １っであることか示された。ルイスＹ　（Ｌｅ’　）抗原についてはアベ（Ａｂ ｅ）等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５８　：　８９３４　（１９８３） 　：ロイド化１ｏｙｄ）等、１ｍｍｕｎｏ−ｇｅｎｅｔｉｃｓ１７：５３７　（ １９８３）；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）等、Ｂｉｏｓｃｉ、　Ｒｅｐ、　３　；１ ６３　（１９８３）；ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）等、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、　４６　；　３９１７（１９８６）に述へられている。フコモル化ルイ スＹ抗原についたはアベ（Ａｂｅ）等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、４６　；２６３９ −２６４４　（１９８６）に説明されている。
本発明の抗体は、コラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉ ｎ）　（コラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（ｌｊｉ　ｌ５ｔｅｉｎ） 、”予め規定された特異性を育する抗体を分泌する融合細胞の連続培養−１Ｎａ ｔｕｒｅ、２５６　：４９５−９７　（＋９７５））によって初めて導入された ハイブリトーマ技術により生産することかできる。また、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ ）等、“モノクローナル抗体によるヒトメラノーマ関連抗原ｐ９７の特性化″、 Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、、＋２７　（２）　；５３９−４６　（１９８１）、ブ ラウン（Ｂｒｏｗｎ）等、“モノクローナル抗体による免疫沈殿で同定される正 常および悪性ヒ１−細胞のたんばく質抗原＋、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、 ２５５　；４９８０−８３（１９８０）、イエ−（Ｙｅｈ）等、“モノクローナ ル抗体によって同定されるヒトメラノーマの細胞表面抗原”　、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７６　（６）　；２９７−３１　 （１９７９）：およびイエ−（Ｙｅｈ）等、“ガングリオノド画分に存在し、か つヒトのメラノーマにも存在する細胞表面抗原”Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ 、２９　；２６９−７５　（＋　９８２）参照。これらの技術は望ましい免疫応 答を起こさせるための動物（たとえばマウス）への免疫原（たとえば、抗原や精 製した抗原を含む細胞または細胞抽出物）の注入を含む。十分な時間の経過後、 その動物の膵臓、リンパまたは抹消血液なとから抗体産生リンパ球を得る。この リンパ球はＩＩ！Ｉ！臓から取ることか望ましい。この界域由来のリンパ球を通 常ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）なとの融合剤の存在下ミエローマ細胞と融 合する。標準的方法では融合パートナ−として例えば、Ｐ３−ＮＳＩ／ｌＡｇ４ −１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３または５ｐ２１０・Ａｇ１４ミ工ローマ系 列なと多くのミニローマ細胞系列を用いることかできる。これらのミエローマ系 列はメリーラント、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクシ３ン（Ａ ＴＣＣ）から入手できる。
望ましいハイブリドーマを含む細胞を親のミエローマやリンパ球細胞は実質的に 死滅するＨＡＴ培地なとの選択培地中で生育させる。ハイブリトーマのみか生存 し、制限条件で生育てきることからクローンか単離される。望ましい特異性をも つ抗体の存在について、たとえは免疫化に用いた抗原による免疫検定法なとによ りハイブリトーマの−Ｌ清をスクリーニングする。制限希釈条件下でポジティブ クローンをサブクローニングし、生産されるモノクローナル抗体を収穫する。こ の方法によって得られるハイブリトーマは当分野でよく知られている方法（一般 的にはフィンク（Ｆｉｎｋ’ｉ等、上述、ページ１２３、図６−１１参照２を用 いインビトロまたはインビボ（ＩＩ！水中）で増殖することかできる。モノクロ ーナル抗体ＯｌＷ製に一般に用いられる方法には硫酸アンモニウム沈殿、イオン 交換クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィーかある〔たとえ ば、シラ（Ｚｏｒａ）等、“モノクローナルハイブリドーマ抗体の生産および特 性化の方法”、モノクローナルハイブリトーマ抗体、技術と応用、フレル（Ｈｕ ｒｅｌｌＸＪｉＮ）　、ｌ１ｌ）。
５ｌ−５２（ＣＲＣブレス、１９８２））好ましい態様に従かい、ＢＲ９６と命 名された本発明のモノクローナル抗体は、免疫原として胸部かん細胞系列３３９ ６を用い以下に説明するようなハイブリドーマ技術を用いて生産した。以下のよ うに調製し、ＢＲ９６抗体を生産するＢＲ９６ハイブリトーマは１９８９年２月 ２２日ＡＴＣＣに登録し、ＢＲ９６ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ　：　１００３６で同 定される。
抗体ＢＲ９６はＩｇＧ　３サブクラスに属する。この抗体は、例えば胸部、肺、 結腸および子宮の腫瘍など多くの器官のかん細胞や、種々の胸部、肺および結腸 かん腫に由来する培養細胞系列に高い特異性を育する。さらに抗体ＢＲ９６はＴ 細胞リンパ腫細胞系列し、ＣＥＭおよびＩ’、１０ＬＴ−４、Ｂ−細胞リンパ腫 細胞系列Ｐ３ＨＲ−１またはメラノーマ細胞系列なと他のタイプの腫瘍細胞には 結合しない。また抗体ＢＲ９６は抗原ポジティブ腫瘍細胞内に侵入でき、抗原ポ ジティブ腫瘍細胞に毒性を示し、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を仲介し、かつ、驚 くべきことに単独て、すなわち未修正の形で細胞毒性を有する。抗体ＢＲ９６は Ｌｅ’抗原を認識すると思われる。
別の態様に従かい精製ＢＲ９６のペブソン消化によりＢＲ９６モノクローナル抗 体のＦ（ａｂ’　）！フラグメントか得られた〔ニソノフ（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ） 等、“抗体分子“、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９７５））。腫瘍（ ３３９６）およびＮ・ＩＣＦＴ細胞−一のｌ”（ａｂ’　）２フラグメントの結 合はＢＲ９６モノクローナル抗体自体の結合と同等であることか示された。
また別のｆｆｉ様において本発明のキメラ（マウス／ヒト）抗体かフェル（Ｆｅ ｌｌ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６；８ ５０７−８５１１　（１９８６）および本発明による１９８８年９月１４日登録 の米国特許出願２４３．８７３および１９９０年６月２２日登録の４６８．０３ ５　（いずれも参考として引用している）に示されている２段階相同組換え法で 生産された。この２段階法ではヒトのＩｇＧガンマ重鎖を含むＢＲ９６キメラ抗 体を発現するハイブリトーマを生産するためにマウスＢＲ９６モノクローナル抗 体を発現するマウスハイブリドーマ細胞系列（ハイブリトーマＡＴＣＣＮａＨＢ Ｉ　０Ｏ３６）を使用する。ついてこのハイブリドーマにヒトカッパ（■＜）軽 鎖をコートするＤＮＡを含むターゲットベクターをトランスフェクトし、ヒトＩ ｇＧガンマ重鎖およびヒトＫｌ！鎖を含むＢＲ９６キメラ抗体を発現するマウス ハイブリドーマを生成する。ハイブリトーマのトランスフェクションに使用する ターゲットベクターはＸｂａ　Ｉて消化したｐＨガンマＩＨＣ−ＤＤ、ベクター （オンコジーン、シアトル、ＷＡ）およびＨｉｎｄＩＩ［て消化したｐｓＶ２ｇ ｐｔ／　Ｃ＊ベクター（オンコジーン、シアトル、ＷＡ）である。
ここてＣｈｉＢＲ９６として同定され、以下に調製法を示したキメラヒト／マウ スＢＲ９６抗体を生産するキメラＢＲ９６ハイブリトーマはｌ９９０年５月２２ 日ＡＴＣＣに登録され、ＣｈｉＢＲ９６ＡＴＣＣ受理番号ＨＢ　Ｉ　０４６０で 同定される。
このキメラ抗体を発現するハイブリトーマを一度同定すれば、このハイブリドー マを培養し、モノクローナル抗体を単離するための従来法を用いてこの細胞の培 養上清から目的のキメラ分子を単離てきる。
本明細書で用いている“抗体ＢＲ９６”という言葉には、ハイブリトーマＡＴＣ ＣＮｃＬＨＢ＋００３６によって生産されるマウスＢＲ９６モノクローナル抗体 なとポリクローナルおよびモノクローナル抗体やハイブリドーマＡＴＣＣＮＱＩ 　Ｏ４６０によって生産されるキメラＢＲ９６抗体なとのキメラ抗体か含まれる 。上述の抗体ＢＲ９６にはＦａｂ　、　Ｆ（ａｂ’　）２およびＦｖフラグメン トなど抗体の抗原結合活性部位を含む抗体フラグメントか含まれる（たとえば、 ローセークス（Ｒｏｕ　５ｅａｕｘ＞等、“種々のラットｌ１ＢＧサブクラスの モノクローナルＩｇＧからのたんばく質分解フラグメントの調製”、λ１ｅｔｈ ｏｄ　Ｅｎｔｙｍｏｌ、Ｉ　２１：　６６３−６９　（アカデミツクプレス１９ ８６））。また、本発明のＢＲ９６抗体には融合たんばく質も含まれる。
さらに、本発明の抗体ＢＲ９６は腎臓、膵臓、肝臓、皮膚、柿、胸、結腸、脳、 甲状腺、心臓、リンパ節または子宮なと主要器官由来の正常なヒト組織には免疫 組織学的に検出可能な結合は示さない。抗体ＢＲ９６は末端血液の白血球にも反 応しない。またこの抗体は扁桃や精巣内のいくつかの細胞には限定された結合を 示すし、胸腺のアシナー細胞や胃および食道の上皮細胞には結合する。したかり て、抗体ＢＲ９６は正常細胞に比へて腫瘍細胞に高い特異性を存する最もよく知 られた抗腫瘍抗体よりも秀れている〔たとえば、ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒ ｏｍ）等、“腫瘍治療の免疫学的治療　モノクローナル抗体、腫瘍ワクチンおよ び抗イデイオタイプ、“診断および治療における修正抗原および抗体”クアッン ユ（Ｑｕａｓｈ）／ロッドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）　（編）　、ｐｐｌ　−３ ９（７−セルゾツカー（Ｍａｒｃｅｌ　ＩＤｅｋｋｅｒ）、Ｉ　９８９）および バグン−ａ　−（Ｂａｇｓｈａｗｅ）　”腫瘍マーカー−我々はとこへ行くのか ”Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、４８　：１６７−７５　（１９８３））。
さらに、本発明にはＢＲ９６抗体と同し抗原決定基と結合し、その結合部位での 結合を該抗体と競争し得る抗体も含まれる。これらにはＢＲ９６と同し抗原特異 性ををするか、種起源、アイソタイプ、結合アフィニティーまたは生物学的機能 （たとえば、細胞毒性）などが異なる抗体も含まれる。たとえば、ＢＲ９６の抗 原結合領域を存する本発明の抗体のクラ人アイソタイプおよびその他の変異体は 、当分野でよく知られている組換えクラススイッチングおよび融合技術を用いて 構築することかてきる〔たとえば、サマナ（Ｔｈａｍｍａｎａ’）等、“ハイブ リドーマにおけるＩｇＭからＩｇＧへの免疫グロブリン重鎮クラススイッチ”Ｅ ｕｒ、　Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋３；６１４　（＋９８３）　；スビラ（Ｓｐｉｒａ）等、“ サブセレク’／ａンおよびＥＩｊＳＡ検定によるモノクローナルクラススイッチ 変異体の同定１、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、７４　；　３０７−１５　（１９８４）　：ニ 二一バーガー（Ｎｅ＊ｂｅｒｇｅｒ）等、“新しいエフェクター機能を存する組 換え抗体”、Ｎａｔｕｒｅ、３１２　；　６０４−６０８　（＋９８４）：およ び才イ（Ｏｉ）等、“キメラ抗体−、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。
４　（３）：２１４−２１　（＋９８６））。このように、ＢＲ９６と同じ結合 特異性を有する他のキメラ抗体または池の組換え抗体（たとえば、その抗体がリ ンフ才力インや腫瘍増殖阻害因子なとの第２のたんばく質と結合するような融合 たんばく質）も本発明の範囲に含まれる。
また、本発明の抗体ＢＲ９６に対する抗イデイオタイプ抗体も本発明の範囲に含 まれる。これらの抗イデイオタイプ抗体は免疫原として抗体ＢＲ９６およびその フラグメントを用いて生産でき、腫瘍に対する体液性応答を検出するＸＱａや、 患者に抗腫瘍的応答を誘導するワクチンなとの治療に有用である〔たとえば、ネ ポン（Ｎｅｐｏｎ）等、“抗イデイオタイプ抗体および特異的腫瘍免疫の誘導” 、Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｐｅｖｉｅｗｓ、６　：　４ 　８　７−５　０　１　（１９８７）　）　。
また、本発明の抗体ＢＲ９６は、特異的な抗原を有するヒトのかん腫の検出にイ ンビトロおよびインビボで使用する診断にも有用である。インビトロの診断法に は腫瘍細胞の免疫組織学的検出（たとえば、ヒトの組織、細胞または切り出した 腫瘍検体なと）または腫瘍関連抗原（たとえば、血液や他の体液中の）の血清学 的検出を含まれる。
免疫組織学的方法には組織検体なとの生物検体の本発明の抗体ＢＲ９６による染 色およびその抗原と複合体を作った抗体を含む検体の検出か含まれる。
検体におけるそのような抗体−抗原複合体の生成はその組織におけるかん細胞の 存在を示す。検体上の抗体の検出は、免疫パーオキソダーゼ染色法なとの免疫酵 素法やアビジン−ジオチン（ＡＢＣ）法、または免疫蛍光法なと当分野でよく知 られている方法で行なわれる〔たとえば、シオカ（Ｃｉｏｃｃａ）等、“モノク ローナル抗体を用いた免疫組織学的技術”　、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　 Ｉ　２１　；　５６２−７９（１９８６）；ヘルストロム（Ｈｅｌ　ｌｓｔｒｏ ｍ）等、“ヒト肺がん腫に関するマウスモノクローナル抗体”、ＣａｎｃｅｒＲ ｅｓｅａｒｃｈ、４６　；３９１７−２３　（＋９８６）　；およびキンポール （Ｋｉｍｂａｌｌ）　（編）“免疫常人ｒ丁　（第２編）　、ｐｐ、１１３−１ １７（マクミランパブリケーンヨン社、１９８６））。たとえば、実施例２に示 されているようにノムノバーオキシダーセ染色は肺、胸部、結腸および子宮かん 腫と抗体ＢＲ９６との反応性の高さと正常なヒト組織検体と本抗体との反応性の 低さを示している。
血清学的診断法にはがんにかかっていると思われる患者の血清や他の生体液に分 ｉ、されている腫瘍関連抗原の検出および定量か含まれる。これらの抗原はラン オイムノアソセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫吸着法（ＥＬＴＳＡ）なと当分野で よく知られている方法を用いて体液中のものか検出てきる。これらの方法では” 分泌“された抗原と反応する抗体を用いて体液サンプル中の抗原の存在を検出す る〔たとえば、つオチラ（Ｌｌｏｔｉｌａ）等、“ヒトのＡＦＰに対するモノク ローナル抗体を用いた二部位すントイソチＥ　Ｌ　Ｔ　ＳＡ”　、Ｊ、１ｎｖｎ ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、４２　；１１（＋９８１）およびアラン（Ａｌｌｕｍ） 等、−Ｌ述、ｐｐ、４８−５１）。
本発明の抗体ＢＲ９６を用いたこれらの方法は、抗体ＢＲ９６か反応する糖脂質 抗原の生体液における検出、したかって患者のかん腫の検出に使用できる。本発 明の抗体ＢＲ９６が抗原−抗体反応を含むほとんどの検出法に利用できることは 明白である。これらに限定される訳ではないが、これらの検定法には液相または 固相の標準的ＲＩＡ法、ＥＬＴＳＡ法、免疫蛍光法やその他の免疫細胞化学的検 定法か含まれる〔たとえば、シコラ（Ｓｉｋｏｒａ）等（編）、“モノクローナ ル抗体”、ｐｐ、３２−５２　（ブラックウェルサイエンティフィック出版、１ ９８４）　）。
また、本発明には、上述の検定法を実施するための診断キットか含まれる。ある 態様では、この診断キットにはモノクローナル抗体ＢＲ９６、そのフラグメント 、本発明の融合たんばく質またはキメラ抗体および抗体ＢＲ９６の特異的結合パ ートナ−および検出可能シグナルを生成し得るラベルを含む結合体を含む。また これらの試薬には緩衝剤やたんばく質安定化剤（たとえば多糖類）なとの補助剤 が含まれる。さらに必要ならばこれらの診断キットにはバックグランド減少剤、 コントロールなとの試薬や、テストを行うための装置や容器か含まれる。別の態 様では、この診断キットには本発明の抗体ＢＲ９６と検出可能なシグナルを生成 し得るラベルの結合物か含まれる。上述の補助剤も含められる。また、本発明の 抗体ＢＲ９６はヒトのかんの検出を目的としたインビボ診断にも有用である。１ つの方法に腫瘍イメージング技術によるインビボでの腫瘍の検出かある。本方法 に従かい、抗体ＢＲ９６を検出可能なシグナルを生成する適当なイメージング剤 てラベルする。使用し得るイメージング剤にはＤＩ　Ｉ、ｌｌｌ［，１、＋１２ （、８６ｍ　ＴＣ１２２ｐ、１２５　Ｔ、）Ｈおよび１４ｃなとの放射性ラベル 、フルオレセインやローダミンなとの蛍光ラベルおよびルシフェリンなどの化学 発光物質なとかある。これらの試薬の抗体へのラベルは従来法により行うことか できる。たとえば、ウェルセル（Ｗｅｎｓｅｌ）およびミアース（Ｍｅａｒｅｓ ）　、ラジオイムノイメージングおよびラジオイムノセラピー、エルセピア版、 ニューヨーク（１９８３）は抗体のラジオラベル法について報告している〔コル チャー（Ｃｏｌｃｈｅｒ）等、“アノミックマウスにおけるヒトかん移植物の検 出を目的とした放射性薬物としてのモノクローナル抗体の使用”、Ｍｅｔｈ、　 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、＋２１　：８０２−１６　（１９８６））、ラジオラベルし た抗体の場合、抗体を患者に投与し、抗体か反応する抗原を有する腫瘍に局在さ せておいてガンマカメラや発光トモグラフィーなと用いた放射性核種スキヤンニ ングなとの従来法を用いてインビボで検出またはイメージングする〔たとえば、 ブランドウェル（Ｂｒａｄｗｅｌｌ）等、“抗体イメージングの発展”、“かん 検出および治療におけるモノクローナル抗体”、ホールトウィン（Ｂａｌｄｗｉ ｎ）等（編）、ｐｐ、６５−８５　（アカデミツクプレス＋９８５））。抗体は 水、食塩水、リンゲル液、バンク液やフィックストオイルなと非水性キャリヤー なと医学的に許容し得るキャリヤーと共に患者に投与される。また、キャリヤー には、ノ＜・ソファや安定剤なと抗体の等張性や化学的安定性を高める物質も含 められる。この抗体成剤は腫瘍部位の観測に十分なガンマ線を提供する量かたと えば静脈注射によって投与される。抗体の投与と検出の間に十分な時間をとって 抗体を腫瘍に局在化させる。一般的な腫瘍イメージングについては、アラン（Ａ ｌｌｕｍ）等、上述、ｐｐ、　５１−５５を参照せよ。
抗体ＢＲ９６の性質、ａ）腫瘍細胞への高い特異性、ｂ）内向性、Ｃ）単独での 、すなわち、適当な濃度では非修飾の形での抗原ポジティブ細胞への毒性、およ びｄ）ＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性、は多くのインビボ治療への可能性を示してい る。第１に、抗体ＢＲ９６はインビボて単独で腫瘍細胞を指向し、これを殺すこ とかできる。またこの抗体は適当な治療剤と組合せてヒトのかん治療に用いるこ とかできる。たとえばこの抗体を化学療法、放射療法など、標準的または従来の 方法と組み合せて使うことかできるし、また、治療剤や毒物、またはリンフ才力 インや腫瘍増殖阻害因子と結合させ、これらの治療剤をがん患部に運ぶのに使用 し得る。抗体にこれらの治療剤を結合する方法はよく知られている〔たとえば、 アーノン（Ａｒｎｏ口）等、“かん治療における薬剤のイムノターゲツティング を目的とするモノクローナル抗体”、“モノクローナル抗体とかん治療“、レイ スフエルド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）等（纒）、ｐｐ２４３−５６（アラン（Ａｒａ ｎ）　Ｒ、リス（Ｌｉｓｓ）出版、＋９８５）：ヘルストロム（Ｈｅ　ｌ　ｌ　 ｓ　ｔｒｏｍ）等、“薬剤運搬用抗体”、“薬剤配給のコントロ−ノじ　（第２ 編）、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）等（ＩＮ）　、ｐｐ、　６２３−５３（ マーセルデツカ−（１１１ａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ’）出版、＋９８７）：ソ ルダ（Ｔｈｏｒｐｅ）、“かん治療における細胞毒性薬剤の抗体キャリャーーレ ヴユー“、「モノクローナル抗体′　８４；生物学的および臨床的応用」ピンチ エラ（Ｐｉｎｃｈｅｒａ）等（！ｉ）、ｐｐ、４７５−５０６　（１９８５）： およびソルフ（Ｔｈｏｒｐｅ）等、“抗体−毒物結合体の調製と細胞毒性＋、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、、６２　；　１１９−５８　（＋　９８２）　）。
特に本発明の抗体ＢＲ９６は、それか結合したかん細胞に容易に侵入し、したか って作用した細胞内部位に治療剤を配給し得ることから治療結合体として用いる のに適している。
それとは別に、抗体ＢＲ９６は高エネルギー放射物、たとえば１３１■なとのラ ジオアイソトープと組合せることかでき、これか腫瘍部位に局在した場合、細胞 数個を殺すことか可能である〔たとえば、オーダー（Ｏｒｄｅｒ）、“かん治療 におけるラジオラベル化抗体の分析、性能および治療における見通し”、「かん 検出および治療を目的としたモノクローナル抗体」ホールドウィン（Ｂａｌｄｗ ｉｎ）等（纒）、ｐｐ、３０３−１６　（アカデミツクプレス＋９８５））。ま た、他の態様では、抗体ＢＲ９６を第２の抗体と結合させ抗体へテロ結合体を生 成して腫瘍細胞の治療に用いている〔米国特許４．６７６、９８０　、七ガル（ Ｓｅｇａｌ））。
また本発明の抗体ＢＲ９６の別の応用としては、たとえば組換えＤＮＡ技術を用 いた薬剤前駆体を薬剤に変換し得る酵素への結合や腫瘍部位において薬剤前駆体 を薬剤に変換するための薬剤前駆体と組合せた抗体−酵素結合体の使用かある〔 たとえば、センター（Ｓｅｎｔｅｒ）等、“抗体−アルカリホスファターゼの抗 腫瘍効果”　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｉｃ、　ＵＳＡ、８５． ４８４２−４６　（１９８８）；　“モノクローナル抗体−アルカリホスファタ ーゼ結合体によるリン酸化マイトマイシンＣおよびエトボシト誘導体のインピロ およびインビボ抗腫瘍活性の増加”、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、４９　； 　５７８９−５７９２　（１９８９）　；およびセンター５ｅｎｔｅｒ）、“抗 体−酵素結合体による薬剤前駆体の活性化、かん治療への新しい方法“、ＦＡＳ ＥＢ、Ｊ、４；１８８−１９３　（１９９０））。抗体ＢＲ９６の別の治療的応 用には、補体の存在下、または抗体−薬物、または抗体−毒物結合体の一部とし て使用してかん患者の骨髄から腫瘍細胞を除去することが挙げられる。この方法 に従かうとこの抗体による治療により本来存在する骨髄は生体外に洗い流され、 その骨髄は再び患者に戻される〔たとえば、ラムゼー（Ｒａｍｓｏｒｙ）等、“ モノクローナル抗体を用いた骨髄パージング”　、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｗｒｎ ｕｎｏｌ、、　８　（２）　；　８１−８８　（１９８８））。
さらに先に述へたキメラまたは池の組換え抗体ＢＲ９６も治療に使用し得る。
たとえば、リンフす力インやオンコスタチンなと抗腫瘍活性を有する第２のたん ばく質の少なくとも機能的に活性な部分に結合した抗体ＢＲ９６の少なくとも抗 原結合領域を含む融合たんばく質もインビボにおけるヒトのかん腫の治療に使用 し得る。さらに、抗体の結合特異性の１つかＢＲ９６のものである二特異的抗体 を横築するために従来の組換え技術を用いることかできる〔たとえば、米国特許 ４、４７４．８９３　）。
最後に抗体ＢＲ９６の抗イデイオタイプ抗体も活性腫瘍免疫化や腫瘍治療に使用 できる〔たとえば、ヘルストロム（Ｈｅｌ　ｌｓｔｒｏｍ）等、“腫瘍治療への 免疫学的方法　千５ツクローナル抗体、腫瘍ワクチンおよび抗イデイオタイプ、 　「診断および治療における修正抗原および抗体」上述、ｐｐ、３５−４１）。
それゆえ、本発明はヒトのかん腫の治療を目的としだ医薬組成物、調合物および 方法を陰むことは明白である。たとえば、本発明には医学的に有効な量の抗体Ｂ Ｒ９６および医薬的に許容し得るキャリヤーを含むヒトのかん腫の治療を目的と した医薬組成物か含まれる。この組成物には未修正型、治療藁との結合体（たき えは、薬剤、毒物、酵素または第２抗体）または組換え体（たとえは、キメラま たは二特異的ＢＲ９６）の形て抗体ＢＲ９６か含まれる。さらにこの組成物には 、かん治療を目的とした池の抗体または結合体（たとえは抗体カクテル）か含ま れる。
本発明の抗体は、静脈注射、腹腔内注射、経口、リンパ内注射または＠瘍への直 接的投与なとを含む従来の投与様式で投与される。静脈注射か特に好ましい。
本発明の抗体組成物の成型物にはいくつかあるか、これには溶液や懸濁液、錠剤 、丸薬、粉末、軟膏マイクロカプセルやマイクロカプセル、リポソームおよび注 射可能または導入可能な溶液なとかある。その様式は投与法や治療法に依存する 。
また、抗体組成物は医薬的に許容し得るキャリヤーやヒト血清アルブミン、イオ ン交換体、アルミナ、レシチ〉、りン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸 カリウムおよび塩や硫酸プロタミンなとの電解質なと当分野でよく知られている アジュバントを含むことか望ましい。
本発明の組成物の最も効果的な投与様式や投与法は病気の重度や経過、患者の健 康や治療に対する応答および担当医の判断に依存する。したかって組成物の投与 量は各弘者について測定するへきである。しかし、本発明の抗体組成物の効果的 投与量は約ｌ〜約２０００ｍｇ／ｍ”の範囲にある。
本発明かよく理解されるように、以下に実施例を示す。これらの実施例は説明を 目的としたものであり、本発明を制限するものではない。
（実施例１） モノクローナル抗体ＢＲ９６の調製 本発明のモノクローナル抗体ＢＲ９６は、先にイエ−（Ｙｅｈ）等、Ｆ’ｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９７９）およびイーＬ＝　（Ｙｅｈ）等、 ［ｕｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　（＋　９８２）によって報告されているバイブ １月〜−マ融合技術を用いて製造した。簡単にいうと、３３９６またはＨ３３９ ６（ワシントシ、シアトル、オンコジーンにて培養された胸部かん患者のアデノ カルンノーマ）と命名されたヒト胸部アデノカル７ノーマ由来の移植培養細胞を 免疫原として用いて月令３才のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスを免疫化した。このマ ウスは５回の注射を受けた。最初の４回は１回の腹腔内注射と異なる４ケ所への 皮下注射１回を受けた。５番目の注射は１回の腹腔内注射のみである。各注射て 注入された細胞の総数は約１０７個である。最後の免疫化後３８目に、界域を採 取し、その牌細胞をＲＰＭＩ培養培地に懸濁した。それからポリエチレングリコ ールの存在下、この牌細胞をＰ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウスミエローマ細 胞と融合させ、この細胞懸濁液をイエ−（Ｙｅｈ’）等によって報告されている 選択ＨＡＴ培地を入れたマイクロプレートのウェル中で増殖させた〔コラ−（Ｋ ｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｉｉｌｉｌｓｔｅｉｎ）　、Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６　：　４９５−９７　（１９７５）およびＥｕｒ、　Ｊ、　［ｎｗｎｕｎ ｏｌ、６　：　５１１−１９　（１９７６）　）。
この混合物を接種して単一の融合細胞もしくはクローンに由来する低密度培養物 を生成した。ついて、これらのハイブリトーマ培養物由来の上溝をトイラード（ Ｄｏｎｉ　１ｌａｒｄ）等“酸素ラベル化第２抗体を用いたモノクローナル抗体 生産のスクリーニングを目的とする酵素結合免疫吸着検定法”、Ｍｅｔｈ、　Ｅ ｎｚｙｍｏｌ、、９２　；１６８−７４　（＋９８３）に報告されている方法と 同様のＥＬＩＳＡ法を用いて、皮膚生検体から得た繊維芽細胞および胸部かん細 胞系列３３９６に関する直接的結合活性についてスクリーニングした。
本検定法に従かい、この抗原（スクリーニングされた抗体か結合するもの）をマ イクロプレートに固定し、ハイブリトーマ上清とインキュベートする。もしこの 上清か望ましい抗体を含むならこの抗体か固定されている抗原と結合し、光学密 度の変化を生しる酵素の基質と抗免疫グロブリン抗体−酵素結合体の添加で検出 される。本実験では胸部かん細胞またはコントロール繊維芽細胞を９６穴組織培 養プレー１−（コスタ−、ケンブリッジ、ＭＡ＞に分配し、３７°Ｃ加温インキ ュヘータ−（５９１０２）中で一晩インキユベーションした。その後この細胞を 最終ウェル濃度０．５％となるよう新鮮な＋、ｏ９＜グルタルアルデヒドを加え て固定化し、室温で１５分間インキコベーシタンした後、１×リン酸緩衝液（Ｐ ＢＳ）で３回洗浄した。次にこの細胞をＯＢＳ中５％８３９５％ランミンで３０ 分間処理してブロンキングし、さらにＰＢＳて３回洗浄した。それから、ノゾブ リトーマの上清を１ｏＯｔｉｌ／ウエルとなるよう添加し、このウェルを室温て １時間インキュベートした後その中の細胞をＰＢＳて３回洗浄した。次に、０． １％ＢＳＡ　ＰＢＳ溶液て希釈したヤギ抗マウスホースラディツシュパーオキシ ダーゼ（ザイムド、ＣＡ）を２００μｌ／ウエルとなるように添加した。この反 応混合物を室温でｌｈ、または３７°Ｃて３０分間インキュベートし、その後こ の細胞をＰＢＳで３回洗浄した。さらに１００μｌ／ウエルとなるようＯ−フェ ニレンジアミン（ＯＰＤ）を添加し、このプレートを暗所、室温て５〜４５分間 インキュベートした。細胞に結合する抗体は１０〜２０分間以内に起こるウェル の色の変化で検出した。この反応を１００μｌ／ウエルのＨ２ＳＯ，を加えるこ とて停止し、４９０ｎｍの吸光度をダイナチク（アレクサントリア、ＶＡ）マイ クロエリサオートリーダーで測定した。
この検定法は固定化した抗原として細胞自体、精製した可溶性抗原または細胞抽 出物を用いて行うことかできる。可溶性抗原または細胞抽出物を抗原として使用 する場合、最初ＰＢＳ中５０μｌ／ウェルとなるよう抗原をプレテイングし、こ のプレートを検定前に室温で一晩インキュベートした。細胞自体を抗原として用 いる場合、それらはそのままか、あるいは固定後使用する。いずれの場合も、培 地１００μｌ／ウエル中１０’個の細胞をブレーティングし、３７℃のインキ二 ベター（５％Ｃ０２）で−晩インキユベートした。
胸部かん細胞系列に結合し、ヒトの繊維芽細胞には結合しない抗体を生産するハ イブリドーマを選択し、実施例２て示されているように末梢血液白血球（ＰＢＬ ）に関し、ＦＡＣＳセルソーターて試験した。ＰＢＬネガティブのハイブリドー マをクローン化し、インビトロで増殖した後、その抗体特異性を調べた。ヒトの 胸部かんと反応する抗体を生産するハイブリトーマを再クローニングし、増殖後 、ブリスタン刺激した月令３才のＢＡＬＢ／Ｃマウスに注射し、それらを腹水腫 瘍として増殖させた。
この操作に従かいハイブリドーマ細胞系列か得られ、クローン化した後マウスに 注射して腹水腫瘍として増殖させた。先に示したようにハイブリドーマＢＲ９６ はＡＴＣＣに登録した。固定化した組換えプロティンへのアフィニティークロマ トグラフィー（レブリゲスケンブリッノ、ＭＡ）で腹水からモノクローナル抗体 ＢＲ９６を精製した。清澄化した腹水を等容量の結合バッファ（１Ｍリン酸カリ ウムｐＨ８）で希釈し、予め結合バッファで平衡化したプロティンＡカラムに通 した。このカラムを結合バッファで十分洗浄した後、抗体を５０鴫リン酸（ｐｉ （３）で溶出した。精製された抗体フラクションをＩＭ）リス（ＰＨ９）で中和 し、リン酸緩衝液に対して透析した。最後に精製したＢＲ９６をフィルターで除 菌し、冷蔵または冷凍保存した。
（実施例２） （モノクローナル抗体ＢＲ９６の特性化）（アイソタイプの決定） ハイブリドーマＢＲ９６によって生産される免疫グロブリンのクラスを決定する ため以下の方法を用いた。
（ａ）　オフタロ二−拡散法 ハイブリドーマ細胞の上清サンプルを２５％観点プレートの中央ウェルに入れた 。−特異的ウサギ抗マウスＩｇアイソタイプ抗体（サザンバイオテクノロジー、 バーミンガム、ＡＬ）を外側ウェルに入れ、このプレートを室温て２４〜２８ｈ インキユベートした。沈殿ラインを読み取る。
（ｂ）　ＥＬＩＳＡアイソタイピング ダイナチクイムロン９６穴プレー上プレートｌ／ウエルのＰＢＳ中ｌμｇ／ｍｌ のヤギ抗マウスＩｇ抗体を入れ、４°Ｃで一晩放置してコーティングした。この プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳて洗浄し、ついて室温でＩｈかけ て１００μｍ／ウェルの培地てブロッキングした。プレート洗浄後、ハイブリト ーマＢＲ９６の上清を添加し、室温でｌｈインキュベートした。２％のウソ血清 アルブミンを含むＰＢＳて洗浄後、このプレートをパーオキシダーゼに結合した ー特異的つサギ抗マウスＩｇアイソタイプ抗体（サイムド、サウスサンフランシ スコ、ＣＡ）で３７°Ｃ１３０分間かけてインキュベートした。さらに洗浄後、 このプレートを１　■／ｍｌｏ　Ｐ　Ｄおよび０．０３％８２Ｇ］２１０．１　 Ｍクエン酸バッフｙ　（ｐＨ４，５）とインキュベートした。タイナテクＥＬＩ ＳＡプレートリーダーを用い６３００ｍにおける光学密度を測定した。
これらの操作に基づき、モノクローナル抗体ＢＲ９６は１ｇＧ　３アイソタイプ に属することか分った。
（モノクローナル抗体の特性化） 抗体ＢＲ９６は巾広いかん腫と高い反応性を示し、正常な細胞には非常に限定さ れた反応性しか示さない。このことは凍結組織断片にかんする免疫組織学的実験 および培養細胞を用いた結合実験を含む実験から示された。
（免疫組織学） “免疫化学”ｐｐ、＋０４−６９　（ジョンウィリーアイトサンズ版、ニューヨ ー人　１９７９）に報告され、また、Ｈ，Ｊ、　ガリゲス（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ ’）等“ヒトメラノーマ関連抗原の検出、ｐ９７、ヒトー次メラノーマの組織学 的断片”、Ｉｎｔ、　Ｊ。
Ｃａｎｃｅｒ、２９　：　５１１−１５　（１９８２）により修正されたり、　 Ａ、スターンバーガー（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ’）のパーオキシダーゼー抗パ ーオキシダーセ（ＰＡＰ）法を免疫組織学的研究に使用した。これらのテストの 標的組織は切除して採取し、液体窒素で冷やしたイノペンタンを用いて切除後４ ｈ以内に凍結した。それから組織は使用するまで液体窒素中または一７０°Ｃて 保存した。
凍結断片を調製し、空気乾燥後、アセトンて処理して再び乾燥した（ガリケス（ Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ）等、上述）。組織学的評価に用いる断片はへマドキノリン で染色した。非特異的バックグランドを減らすため、断片をＰＢＳて５倍に希釈 した正常なヒト血清で前処理した〔ガリゲス（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ）等、上述〕 。マウス抗体、ウサギ抗マウスＩｇＧおよびマウスＰＡＰは１０％正常ヒト血清 および３％ウサギ血清溶液で希釈した。ウサギ抗マウス［ｇＧ　（スターンバー ガーメイヤーイムノケミカルズ、ジャレッツビル、ＭＤ）は５０倍に希釈して使 用した。マウス特別に精製したＰＡＰ２■／ｒｎｌを含むマウスＰＡＰ？！合体 （スターンバーガーメイヤーイム／ケミカルズ社）は８０倍に希釈して使用した 。
染色染料は、一連の断片を特異的抗体、すなわちＢＲ９６、またはコントロール 抗体で、２．５ｈ処理し、その断片を５０分の１に希釈したウサギ抗マウスＩｇ Ｇを用い室温で３０分間インキュヘーション後、８０分の１に希釈したマウスＰ ＡＰ複合体に室温で３０分間処理することを含む。抗体による各処理後、そのス ライスをＰＢＳで２度洗浄した。この免疫組織化学的反応は、０．０５Ｍ１−リ スバッファ、ｐＨ７，６中０．５％３，３′−ジアミノベンジノンテトラハイド ロクロライト（ジクマケミカルズ、セントルイス、ＭＯ）および０．０１％Ｈ２ Ｏ２の新しく調製した溶液を加え、８分間保持することで発色させた〔ヘルスト ロム（Ｈｅｌ　ｌｓｔｒｏｍ）等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、＋２７；　１５７ −６０　（＋９８１））、さらに、蒸留水中１％０ｓ０４溶液て２０分間処理し て染色を強化した。この断片を水ですすぎ、アルコール中て脱水した後、キンレ ンで透明にしてスライドして乗せた。平行して断片はヘマトキノリンで染色した 。
このスライドを各々コードで評価し、コート化したサンプルは各研究者でチェッ クした。典型的スライドは微分干渉顕微鏡（ツアイスーノマルスキー）で写真を 撮った。抗体染色度は０（反応性ない、＋（僅かなポジティブ細胞）、十＋（少 なくとも３分の１のポジティブ細胞）　、＋＋＋　（はとんどかポジティブ細胞 ）、＋＋＋＋　（はとんとすへてか強いポジティブ細胞）で評価した。十と０と の染色の差は十と＋＋の差はと明確ではないので、＋十以上の染色は“ポンチイ ブと考える。悪性細胞およびストローマ細胞の両方とも腫瘍サンプルに観測され た。
ストローマ細胞は全く染色されないか、または腫瘍細胞に比へるとほんの僅かし か染色されないので記録された染色は腫瘍細胞に由来するものである。
第」表はモノクローナル抗体ＢＲ９６を用いた種々の腫瘍および正常組織検体の 免疫組織学的染色の結果を示している。この表に明らかに示されているように、 抗体ＢＲ９６は巾広いヒトかん腫検体と反応するか、サルコーマとは反応せず、 またはメラノーマに対しては非常にまれにしか反応しない。さらに、テストした 正常組織のとれとも非常に限られた反応性しか仔していない。検出された正常組 織との限られた反応は扁桃腺や精巣中の少数の細胞群や胸腺のアノナー細胞およ び胃や食道の上皮細胞に対するものである。
第１表 モノクローナル抗体ＢＲ９６を用いたヒト腫瘍および正常組織検体のイムノパー オキシダーゼ染色肺がん（非スモール細胞）　ｌ　４／＋　７一部かん　１７／ １９ 結腸かん　１５／１８ 子宮かん　４／４ 子宮内膜かん　２／２ 膵臓かん　２／２ 食道かん　２／２ 頚部かん　２／２ 牌［１ｉＯ１５ 胸部　０／２ 結腸　０／７ 腎臓　０／７ 肝［１ｌＯ１５ 脳　０／２ 心臓　０／３ 第３表（つづき） モノクローナル抗体ＢＲ９６を用いたヒト腫瘍および正常組織検体のイムノバー オキシダーセ染色皮膚　０／２ 甲状腺　０／２ 副腎　０／１ 子宮　０／２ リンパ節　０／２ リンパ球ペレット　０／４ 牌Ｉｍ　２／２　（アシナー細胞のみポジティブ）子宮　０／７ 網膜　１／１ 精巣　２／２（少数の細胞群のみポジティブ）扁桃腺　２／２　（少数の細胞群 のみポジティブ）胃　２／２　（上皮細胞ポジティブ） 食道　２／２　（上皮細胞ポジティブ）種々の培養細胞系列に対する抗体ＢＲ９ ６の結合の評価も行った。培養細胞そのものの細胞表面への抗体結合はブラウン （Ｂｒｏｗｎ）等、“正常および悪性組織におけるメラノーマ関連抗原ｐ９７の 定量分析”　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。
７８；５３９−４３（１９８１）に報告されている１２ｓＩラベル化抗体を用い た直接的結合検定またはコールターエビックスＣ蛍光活性化セルソーター（ＦＡ ＣＳ）■を用いた直接的免疫蛍光法〔ヘルストロム（）ｔｅｌ　１ｓｔｒｏ＋ａ ）等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４６　；３９１７−３９２３　（１９８６）） で同定した。
ＦＡＣＳセルソーターを用いた結合分析には、ＩＭＤＭ培地（ギブコ、ＮＹ）中 １５％ウシ胎児血清５００μｌ／チューブに２Ｘ１０’−ＩＸＩＯ’個の培養細 胞を分は取って用いた。この細胞をセロファージで１．５分間遠心し、上溝を除 去した。ｌＯμｌ／ｍｌのモノクローナル抗体ＢＲ９６１００μｌを各チューブ に入れ、その内容物を混合後氷中て３０分間インキュベーションした。この反応 混合物をセロフユージによる１、５分間の遠心より、１５％ＦＢＳ／ＴＭＤＭで ３回洗浄した（３回の洗浄後チューブの水分を吸い取った。）。
それから、１５％ＦＢＳ／ＩＭＤＭて２５分の１に希釈した至滴化ＦＩＴＣ結合 ヤギ抗マウス１ｇＧ抗体（タボ、バーリンガム、ＣＡ）５０μｌを各チューブに 入れ、反応物を混合し、３０分間インキュベートした。その後洗浄ステップを反 復し、各チューブの水分を除去してから各ペレットを２００〜５００μｐのＰＢ Ｓに懸濁した。各サンプルをコールターエビックスＣＦＡＣ３て分析し、蛍光強 度（ＭＦＩ）を測定した。またＭＦＩから線型蛍光当１（ＬＦＥ）を算出した。
各テストサンプルのＬＦＥをネガティブコントロールのＬＦＥて割−っでコント ロール抗体に対する特定抗体染色細胞の輝度の比を算出した。結合データを第２ 表に示す。
第２表 種々の懸濁細胞に対するＢＨ９６の結合のＦＡＣ３分析細胞系列　比（１０μｇ ／ｍの 胸部かん腫　３３９６　５４ ＭＣＦ−７３８ 肺がん腫　２９８７　＋５ 結腸かん＠　ＲＣＡ　３４ ＨＣＴ１１６　１ ＣＢＳ　２７ 第２表（つづき） 種々の懸濁細胞に対するＢＨ９６の結合のＦＡＣ３分析細胞系列　比（１０μｇ ／ｍｌ） 結腸かん腫　Ｃ３０ 子宮かん腫　３６３３−３　１１ メラノーマ　２６６９　１ Ｔ細胞リンパ腫　ＣＥ！Ｊ　Ｉ ＭＯＬＴ−４１ Ｂ細胞リンパ＠　Ｐ３ＨＲ１１ 末哨血液白血球　１ 第２表から分るようにモノクローナル抗体ＢＲ９６は胸部、肺および結腸かん腫 と反応するかメラノーマ、ＴおよびＢ細胞リンパ腫および正常な末梢血液白血球 とは反応しない。ラジオラベルした抗体を使った散乱分析により、ＢＨ９６が結 合する３３９６細胞に対するＢＨ９６のおよその会合定数（Ｋ、）は３．６×１ ０’抗原部位／細胞であると計算された。
これらのデータはモノクローナル抗体ＢＲ９６はヒトのかん腫の大部分て豊富に 発現される（ｌＯ＠分子／細胞まで）細胞表面抗原を認識することを示している 。
（実施例３） モノクローナル抗体ＢＲ９６のかん細胞への内向化モノクローナル抗体ＢＲ９６ の抗原ポジティブかん細胞への内向化を測定する実験を行った。ある方法てＢＨ ９６をリシンＡｌキノンに結合し、イムノドキノンを生成しそのかん細胞への内 向化を測定した。かん細胞によるこの結合体の取り込みはりシンＡ鎖により殺さ れる腫瘍細胞の程度を測定することにより検定した。
抗体のトキシンの結合は以下のように行った。脱グリコノル化したりノン−ＡＨ ４（インランドラプス、オースチン、ＴＸ）（ブレーキ−（Ｂｌａｋｅい等、Ｃ ａｎｃｅｒＲｅｓ、、４７．９４７−９５２　（１９８７））をジチオスレート ール（５ｍＭ）で処理後、ＰＢＳ　（ｐＨ７，２）で溶出するＧ２５によるゲル 濾過を行った。ＰＢＳ中これを２１のモル比となるように抗体に添加した。この 抗体は予めランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ＞等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、 ２６０　＋１２０３５−１２０４１　（１９８５）の方法を用いてＮ−スクシン イミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−１〜（ＳＰＤＰ）＜ピアス 、ロックフォード、ＩＬ）で処理しておいたものである。室温で１２〜２４時間 反応させ、その後この溶液を等容量の水で希釈した。
未結合抗体の除去はブルーセファロースＣＬ−６Ｂを用いて行った〔ノーレス（ Ｋｎｏｗｌｅｓ’）等、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｉ　６０　：　４４０ −４４３　（１９８７）　）。
高温濃度で結合体と過剰のりノンーＡ鎖を溶出しくｌ０ＸＰＢｓ）、さらにＰＢ Ｓを溶出液としたセファクリル−３００（ファルマシア）を用いて精製した。
生成した結合体は未結合のモノクローナル抗体およびリシン−Ａ鎖を含まず、お よそｌ：ｌの付加物であった。
種々のかん細胞によるＢＨ９６−ＲＡの内向化はチミジン取込み阻害検定て測定 した。この検定法によるかん細胞のＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取込みの阻害は（ 細胞増殖の阻害）その細胞へのＢＨ９６−ＲＡの細胞毒性効果、すなわち、細胞 内へのイムノドキノンの内向化の欠席となる。この検定を行うため、かん細胞を １５％ウソ胎児血清（ＦＣ３）を含む＋００μｌのＩＭＤＭ培地を入れた９６穴 マイクロプレートにｌＸｌ０’個／ウェルの割合てブレーティングした。このプ レートを３７°Ｃて１２〜１８時間インキュベートし、細胞を粘着させた。それ から培地を除き、プレートを氷上に置いた。次いてＢＨ９６−ＲＡイムノトキシ ン（Ｉ　ＯＯμｆ）　ｃ７）、ＩＯｔ、ｔｇ／ｍｅから０．０１　ｔｔ　ｇ／ｍ ｌまて１０倍毎の希釈液を添加した。この混合物を水中４時間インキュベートし た。プレートの洗浄後、２００μ！！／−の培地を添加し、３７°Ｃて１８時間 インキュベートした。この時点て１μＣｉ／ウエルとなる３Ｈ−チミジン５０μ ｌを添加し、このプレートを５％ＣＯ□インキュヘーター中、３７°Ｃて６時間 インキュベートした。ついてこの検定プレートを一７０°Ｃで少なくとも１時間 かけて凍結した後、ゲル乾燥器で１５分間かけて融解した。ガラスファイバーフ ィルター（フィルターストリッブス、２４０−１、ケンブリッジチクノロソー） 件のプラスチックシンチレーションバイアル中にＰＨＤ細胞バーヘスターを用い て細胞を収穫した。３ｍｌのシンチレーション計数液をバイアルに添加し、この バイアルをサンプル当り１分間、ベックマンＬＳ３８９１ベータシンチレーショ ンカウンターを用いて計数した。
テストした細胞のイムノドキノン濃度に対するチミジン取込み阻害率のグラフを 作成し、第１〜５図に示した。検定結果は未処理コントロール細胞によって取込 まれる３Ｈ−チミジンに対する割合として表現されている。
第１図はＢＨ９６−ＲＡの内向化によって引き起こされる３３９６胸部かん細胞 のチミジン取込み阻害率を示している。同様の結果か２７０７肺がん細胞（第２ 図）およびＣ結腸かん細胞（第４図）についても得られた。ＢＨ９６−ＲＡはＢ Ｈ９６を結合しないヒト結腸かん細胞系列、ＨＣＴｌ　１６細胞系列へは内向し なかった（第３図）。
ＢＨ９６か結合しない３３４７結腸かん細胞へはＢＨ９６−ＲＡは内向しないこ とか示された（第５図）。一方、３３４７細胞に結合するＢＨ３−ＲＡは内向す る。それゆえ、この実験は抗体ＢＲ９６の内向ばかりてなく、抗原ポジティブか ん細胞に対するＢＲ９６抗体の内向化の選択性も示している。
（実施例４） 未修正モノクローナル抗体ＢＲ９６の細胞毒性３種類の実験でモノクローナル抗 体ＢＲ９６自体か細胞毒性を有するらしいという予期できない観測はＦＡＣＳ検 定で追跡した。血清水の補体の影響を除くため、使用しだすへての血清を熱失活 させた（５６°Ｃ１３０分間）。さらに、無血清培地で増殖させた細胞について ＦＡＣ３検定を行ったり、血清の非存在下で分析を行った。
まず、種々の抗原ポジティブがん腫系列（３３９６，２９８７，３６１９）由来 の懸濁生細胞をモノクローナル抗体ＢＲ９６て処理した。培養培地（ＩＭＤＭ、 １５％ＦＢＳ）中６０．３０．１５．７．７および３．８μｇ／−のＢＨ９６ま たはコントロールモノクローナル抗体を用い細胞（５ＸＩＯ’）を氷水中、３０ 分間処理した。細胞を培養培地で２度洗浄後、５００μ！の培地に懸濁し、つい て死細胞を染色する色素ブクピノウムヨーダイトで染色した〔クリシャン（Ｋｒ ｉｓｈａｎ）、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、６６　；　１８８　（１９７５）　；およ びイーＴ−（Ｙｅｈ）、Ｊ、Ｉｎ１ｎｕｎｏｌ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ、４３；２６９　（１９８＋））。１ｍｇ／ｒｎｌの色素ストッ ク溶液（７０％アルコール）５μｌを細胞サンプルに加え、水中で１５分間イン キュベートした。
その細胞は１度洗浄後最終的に５００μｅの培地に懸濁した。死細胞は赤い蛍光 として同定されるコールターエピクスｃＦＡＣＳて細胞を分析した。この分析は 横軸に前方光散乱対数値、縦軸に赤色蛍光強度対数値を目盛った２パラメ一ター 表示で行った。細胞生存率と細胞サイズの相関はコールターエピクスＣクオード スタントプログラムを用いて行った。ＢＲ９６を結合する腫瘍細胞と結合できな い腫瘍細胞を平行して分析した。その結果を第６図に示す。第６図は３種いずれ の抗原ボッチイブかん腫由来の細胞とＢＲ６９とのインキユベーシヨンは迅速に これらの細胞を死滅させることを示している。未処理または抗原ネガティブ細胞 は死滅しなかった。
第２に、腫瘍細胞（３３９６，３６３０，２９８７，３６１９およびＨＣＴ１１ ６）をＦＢＳ含有含有１Ｍ項地１５０μｍ中、マイクロプレートのウェル当り３ Ｘ１０’個の密度で、３７°ＣＩ８時間ＢＲ９６（またはコントロールモノクロ ーナル抗体）で処理し、ついて５０μｌの３Ｈ−チミジンを１μＣｉ／ウエルと なるよう添加し、プレートをさらに３７°Ｃて６時間インキュベーションた。つ づいて−７０°Ｃて少なくとも１時間かけて凍結させてから、１５分間、ゲルド ライヤーで加熱して融解し、グラスファイバーフィルター上に細胞を収穫した。
その後、細胞と抗体を３７°Ｃてインキュベートする以外は先に示した実施例と 同様にトリチル化チミジン検定を行った。第４図はこの結果を示している。ＢＲ ９６は抗原ポンチイブ細胞系列への〔３Ｈ〕チミンン取込みの阻害を起こした。
この効果は投与ｍ依存であった。抗原ネガティブ細胞ＨＣＴＩＩ６はＢＲ９６の 濃度には影響れなかった。
第３に、リンスレー（いｎ５ｌｅｙ）等〔リンスレー化１ｎｓｌｅｙ’）等、“ 増殖レギュレーター、オンコスタチンＭに対する細胞レセプターの同定および特 性”、Ｊ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４　＋４２８２−４２８９　（１９８９））の方法の ］自圧法を用い増殖阻害検定法を行った。４ｆｉ１の細胞系列（ＨＣＴ１１６． ２９８７．３３９６および３６３０）由来の細胞を９６穴マイクロプレ一ト中１ ５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む０．１−のＩＭＤＭに接種しく３Ｘ１０２） 、３７°Ｃ１３時間かけて付着させた。それから種々の濃度のモノクローナル抗 体ＢＲ９６０，１−を加え、その後３７°Ｃのインキュベーションを７２時間続 けた。つづいて、培養培地を除き、細胞をクリスタルバイオレット（２０％メタ ノール中０．１％）で３０分間染色した。３度ＦＢＳで洗浄後結合した色素を５ ０％エタノール中０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ４，２）溶液０．１ｍｌ添 加して溶出した。サンプルはＥＬ［ＳＡリーダーで未処理サンプルに対するＢＲ ９６存在下での吸光度を測定することにより３回の検定を行った。この操作の結 果は細胞増殖阻害率として表わす。
第８図にこの結果を示す。この検定結果はチミジン取込み検定法の結果と一致し た（第４図）。
（実施例５） 抗体ＢＲ９６のＡＤＣＣ活性 モノクローナル抗体ＢＲ９６のＡＤＣＣ活性の測定は、ヘルストロム（Ｈｅｌ　 ｌｓｔｒｏｍ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ ）　８２　：　１４９９−１５０２（１９８５）の方法で行った。簡単には、セ ロチー１−（Ｃｅｒｒｏｔｊｎｉ）等、Ａｄｖ、　Ｉｎｗｎｕｎｏｌ。
１８；６７−１３２　（１９７４）により報告されているｉｌ（：、の放出を測 定する短期”Ｃｒ放出テストを腫瘍細胞溶解（細胞毒性）の証拠として用いた。
健康人の末梢血液リンパ球をフィコール−ハイバークを用いて分離し〔ヘルスト ロム（Ｈｅｌ　ｌｓｔｒｏｍ）等、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ２７；２８１−２ ８５　（１９８１）Ｌ　ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に対するナチュラルキラー細胞 活性の５％に当るエフェクター細胞か得られた、（１０１個の）細胞をｌ　ＯＯ μｃｉ　（ＩＣ１＝　３７Ｇｂｑ）の５ＩＣｒを用い３７℃で２時間インキュベ ーションすることによりラベル化し、その後細胞を３回洗浄し、培地に懸濁した 。ラベル化した細胞をＶホトムブイクロプレート（ダイナテクラホラトリーズ、 アレキサントリア、ＶＡ）に接種した（つ千ル当り２０ｕｌ中２ｘｌＯ”個）。
ついて精製した抗体ＢＲ９６（ｌ　Ｏｔ、ｔｇ／ｍ１　１Ｈｇ／ｍｅ、　０．１ 　μｇ／＋Ｊ）を添加し、さらにウェル当りＩ００μｊ７中２Ｘ　ｌ　０５個の リンパ球を添加した。この混合物を２〜４時間インキュベートした後、プレー１ −を４００Ｘｇで遠心した。上清を取り出し、１００μ！サンプルの放射能をガ ンマカンウタで計測した。グループ当り２回の測定を行った。その変動は１０％ 以下であった。何回か“クリスークロス′実験を行なった。そこでは肺（または 結腸）かんおよびメラノーマ細胞を平行してモノクローナル抗体ＢＲ９６および 抗メラノーマモノクローナル抗ＩＪ：ＭＧ　−２２（ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓ ｔｒｏｍ’）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８ ２：１４９９−１５０２（１９８５））　（これはほとんどのかん細胞には結合 しない）でテストした。コントロールには標的細胞のみまたはリンパ球またはモ ノクローナル抗体と別々にインキュベーションしたものを使用した。
自然放出とは抗体またはリンパ球のいずれても処理しなかった標的細胞から培地 に放出される１分当りのカウント（ｃｐｍ）数と定義し、また全放出量は検定路 りに浸透圧的に溶解した標的細胞から放出されるカウント数と定義する。細胞毒 性率は以下のように計算する・ エフェクター細胞はへルストロム（Ｈｅｌ　ｌｓｒｔｏｍ）等、（“モノクロー ナル抗体とがん治療“、分子生物学および細胞生物学に関するＵＣＬＡシンポジ ウム、ニューシリーズ、レイスフエルト（Ｒｅｉｓｆｅｌ＋ｊ）およびシュル（ Ｓｈｅｌｌ）編、リス、ニューヨー人２７巻、ｐｐ、１４９−１６４　（１９８ ５Ｌ参考として引用する）の方法に従かいＬｅｕ−１１６表面マーカーおよびモ ルモット補体に対する抗血清とのインキュベーションに対する感受性を検定する ことにより特徴付けた。これはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に特徴的でモノク ローナル抗体ＢＲ９６の存在下ヒトメラノーマ細胞に対するＡＤＣＣを仲介する リンパ球によって発現されるＬｅｕ−１１６マーカーの発現を測定することによ り行った。エフェクター細胞単独の細胞毒性（“ナチュラルキラー効果“）は第 ９図のデータから差し引いた。
ＩＯμｇ１ｍｌａ度の抗体に関する第９図の結果は、もしその標的細胞力廿分な 濃度のエピトープを発現し、かつＢＲ９６か十分存在するならＢＲ９６はＡＤＣ Ｃ活性を仲介することを示している。その以下の濃度でもＡＤＣＣ活性か見られ るがその濃度では抗体自体か細胞毒性を示す（通常約２０μｇ／１ｎｌ）。抗体 ＢＲ９６をフントロールとして単独で使用すると、テストした濃度および５ＩＣ ｒ検定においては死亡は０％であった。ＢＲ９６結合細胞系列でのみＡＤＣＣ活 性か見られた。したかって全てＢＲ９６と結合する５種のかん腫細胞は０．１Ｈ ｇ／ｍｌまでのモノクローナル抗体濃度においてＡＤＣＣ活性により死滅するか 、ＢＲ９６を結合しない６番目の系列２９６４の細胞は死滅しなかった。ＡＤＣ Ｃを得るために抗体の結合か必要であることは別の抗体Ｌ６を結合し得る２つの かん腫（３６１９および２９８７系列）は両方共Ｌ６のＡＤＣＣにより死滅する か他のものは死滅しないという事実によっても示された。この検定条件下、１０ μｇ／−の濃度でテストしたときてさえＢＲ９６単独てはラヘルの放出はねずか １％であった。
（実施例６） ＢＲ９６の補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）誘導能力補体源としてヒト血清存在下腫 瘍細胞を死滅させる（補体依存細胞毒性（ＣＤＣ））モノクローナル抗体ＢＲ９ ６の能力を評価するテストを、エフェクター細胞懸濁液の代りにマイクロプレー トウェル当り補体源として１．３から１．６に希釈した健康人のヒト血清１００ μｌを用いること以外は先の実施例５て述へたＡＤＣＣテストと同様に行った。
第１０図に示したように、ＢＲ９６結合細胞に対するＣＤＣは０．１〜５．０Ｈ ｇ／ｄの抗体濃度てみられたか、ＢＲ９６抗原ネガティブ系列ＨＣＴＩＩ６およ び３３４７に対してはＣＤＣは無かった。しかし、これらの細胞に結合するモノ クローナル抗体Ｌ６を用いると３３４７細胞は死滅させることかてきた。補体非 存在下でＢＲ９６をテストするコントロールは常に行った。
”Ｃｒ放出検定てはＢＲ９６単独による死滅は検出されなかった。これらのデー タはＢＲ９６かそれ自体では細胞毒性を示さない濃度のヒト血清の存在下で細胞 毒性を示すことを表わしている（コントロール抗体はＣＤＣを示さなかった）。
（実施例７） 糖脂質および糖たんばく質に対するＢＲ９６の反応性の測定抗体ＢＲ９６を精製 した糖脂質および糖たんばくおよび抗体を過剰に用いるＥＬＩＳＡ検定を用いて 既知の炭水化物構造を有する固定化糖脂質抗原および合成糖たんばく質（いわゆ る“ネオ糖たんばく質”）への反応性についてテストした（ジョンマグナニ（Ｊ ｏｈｎ　ＩＪａｇｎａｎｉ）博士、Ｂｉｏｃａｒｂ、ゲイサースバーグ、ＭＤ　 ；　ロイド（Ｌｌｏｙｄ）等、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７；５３７− ５４１　（１９８３））ｏマイクロリソトルウエル中各１１００ｎの糖脂質をメ タノールから乾燥した。ウェル当り、糖たんばく質２０００ｇのリン酸Ｕ衝液（ ＰＢＳ）（ｐＨ７，４）溶液をインキュベーションすることで合成糖たんばく質 によるウェル表面のコーティングを行った１、精製したＢＲ９６はＩ％ＢＳＡを 含もｆｆ１．ｏｌＭ）・１．ｌスーＨＣｌ　（ｐＨ７，４）中１０　ｕ　ｇ／ｒ ｎｌの濃度て検定し、また腹水由来の抗体は同バッフＹ中！　：　１００に希釈 して検定した。
、：′のように高い濃度においてはほとんどの結合相互作用か容易に検出てきる 。２ケのウェルの吸光度の平均値を計算（７た。この分析結果を第１１図および 第４２［４に示Ｖ。これらはＢＲ９６か１、ｅ′抗原と反応することを示してい る。
こえ１らの知見はＢＲ９６か種）ＺＯ）型のルイスＹ（Ｆｕｃａｌ　−２Ｇａｌ βｌ　４　（Ｆｕｃａ　２−３　）ＧｌｃＮＡｃ、抗原と結合することおよびＧ ｌｃＮＡｃに結合したフコースα１−３はＢＲ９６によって認識される１、ｅ’ 関連エピトープの一部を形成することを示して−いる。ＢＲ９６の高い腫瘍特異 性および内向醸化ｅ′抗原と反応するモノクローナル抗体についての報告はなか 、た）は二の抗体かその部かｌｅｙ抗原を含む複合したエピトープを認識するこ とを示している。
（実施例８） ＢＲ９６Ｆ（ａｂ”）２″″ラグメントの調製および特性７１゛７ス腹水からプ ロティンＡアフィニティークロマトグラフィーを用いてマウスＢＲ９６（１ｇＧ ３）を精製した。簡単に云うと、脱脂した腹水を先にＩＭリン酸カリウ１、（ｐ Ｈ８，０）で平衡化した固定化プロティンＡ（レブリゲンコーポレーショ〕・、 ケンブリノン、ＭＡ）マトリクスカラムに通した。その後分光学的にたんばく質 か検出されなくなるまでカラｊ、を平衡化バッファで洗浄した。カラムに結合（ −５たＢＲ９６の溶出にはＯ，１Ｍクエン酸バッフ了（ｐＨ３，０）を用いた。
溶出直後、溶出液のｐＨか７０になるまて１．ＯＭトリスハ・・１ア（ｐＨ９， ０）を用いて中和する。二の石、′クローナル抗体溶液はＰＢＳに対して透析し た浚濃縮して使用するまで保持する。
Ｆ（ａｂ’　）２フ→グメンＩ・は−３量イ（Ｌａｍｏｙ）（“種々のザブクラ スのマウス］ｇＧからのＦ（ａｂ’　）、フラグメントの調製−、Ｍｅｔｈ、　 Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１２１　；　６５２−６６３（＋９８６））の方法に従かい 精製したＢＲ９６モノクローナル抗体をペプシンで消化することにより調製した 。反応混合物をプロティンＡアフィニティーカラムに通すことにより残存する抗 体およびＦｃフラグメントを吸着させて除いた。生成したＦ（ａｂ’　）２フラ グメント調製物をＰＢＳｉ：対して十分透析した後濾過して除菌した。
このＢＲ９６Ｆ（ａｂ’　）２７ラグメント調製物はゲル濾過ＨＰＬＣ，５ＤＳ −Ｐ、ＡＧＥおよびヒト胸部腫瘍３３９６によるＥＬ　ＩＳＡ　（オンコゲン、 シアトル、ＷＡ）を用いてその特性を調・＼た。ゲル濾過ＨＰＬＣＩ；！Ｆ（ａ ｂ’　）−調製物を含むたんばく質の分子サイズの検定に用いた。いくつかの調 製物から得られた再現性のあるクロマトグラムはこのたんばく質の７５〜８０％ かＦ（ａｂ’　）２であることを示した。
ＢＲ９６自体やたんばく質凝集物なとに当るより高分子量物質の位置にはたんば く質は検出されなかった。残りの２０〜２５％のたんばく質は失活したペプシン や他のより小さい非プロティンＡ結合消化産物に対応する位置に溶出した。
非還元および還元５ＤＳ−ＰＡＧＥはＦ（ａｂ’　）２調製物内のたんばく質の 変性分子サイズおよび構造的配置を謂へるのに用いた。一般的にＦ（ａｂ’　） ２の位置に単一の主要パンＦ’　（約１００ｋｄａｔ）か観察され、モノクロー ナル抗体自体のバント（１６０ｋｄａｌ）のコンタミは確謔されなかった。失活 したペプシンや小さい消化産物を示す低分子量バント（すなわち、１００ｋｄａ ｌ以下）はわずかであった。還元条件丁ては、軽鎖および重鎮の残存部分を示す 約２５ｋｄａｌのダブレットとして出現する主要バンドか予想どおり観察された 。重鎮そのものは観察されなかった。
Ｂ　Ｒ９６Ｆ（ａｂ”：ｈフラグメントの機能（結合）活性を、抗原ポジティブ ３３９６細胞を用いたＥＬＴＳＡによりＢＲ９６そのものの活性と比較した。第 １３図に示したようにＨＲＰ−結合ヤギ抗−マウスに軽鎖試薬を用いＢＲ９６ま たはそのＦ（’ａｈ’　）、フラグメントの細胞への結合を検出した。２枚のプ レートに関し、抗体そのものには結合するかそのＦ（ａｂ’　）２フラグメント には結合しないＨＲＰ−結合プロチインＡを用いて抗体の結合とＦ（ａｂ′）− フラグメントの結合を区別した（第１４図）。
これらの結果はＢＲ９６Ｆ（ａｂ’　）２（ＯノドＲ０２０＋−１６６３−０３ 、ロット２）は微量の抗体を含むことを示している。抗体のコンタミネーション レベルは存在するＦ（ａｂ’　）２量とは３倍希釈約８回分と等量もしくは約０ ．０１％と見積ることかできる。池のＦ（、ａｂ’　）２調製物（ロットＲ９０ １１−１４８１−４８、ロット１）は検出レベルのＢＲ９６のコンタミが見られ ず、このことはＢＲ９６の効果はＦｃ領域でなく　Ｆａｂ領域に寄することがで きることを示している。
まとめると、ＢＲ９６Ｆ（ａｂ’　）２調製物はＨＰ　Ｌ　Ｃおよび５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥによりＢＲ９６１ｇＧのコンタミが全くないと考えられる。唯一つの場合 に限り、非常に感度の良いＥＬＩＳＡ法を用いたときコンタミしたＢＲ９６が検 出され、この量はＦ　（ａｂ’　）　ｈフラグメント量の約０．０１％程しかな いことが示された。
（実施例９） キメラ抗体ＢＲ９６（ＣｈｉＢＲ９６）の調製および特性本発明の７ウス／ヒト キメラ抗体ＢＲ９６はフェル（Ｆｅｌｌ）等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　８６　；８５０７−８５１１　（１９８９） 　）およびフェル（Ｆｅｌｌ）およびフォルガーブルース（Ｐｏｌｇｅｒ−Ｂｒ ｕｃｅ）　（１９８８年、９月１４日登録、米国特許Ｎｏ、　２４３．８７３　 ）および本発明の出願者（１９９０年１月２日登録米国特許Ｎｏ４６８．０３５ 　）によって報告されている２ステップ相同組換え法を用いて生成した。
（ヒト重ＭＤＮＡ）ランスフェクション）上述の方法で得たマウスハイブリドー マ細胞ＢＲ９６、ＡＴＣＣＮｎＨＢ１００３６をリン酸緩衝等張渡およびベクタ ーｈｇａｍｍａ　Ｉ　ＨＣ−Ｄの６．２ｋｂ　Ｘｂａｌ制限断片精製物を用いた エレクトロポレーション（シーンパルサー：バイオラドラボラトリーズ、リッチ モンド、ｃＡ、２５０Ｖ、　９６　Ｑμｉｄ）によりｈｇａｍｍａｌＨｃ−Ｄ（ アクリ力ルチャルリサーチサーヒ゛スカルチャーコレクション（ＮＲＲＬ）、ペ オリア、イリノイ；ＮＲＲＬ　Ｎｏ、Ｂ１８５９９　（第１５図）でトランスフ ェクトした（８Ｘ１０’個細胞）。４８時間後細胞をウェル当り１０’個の割合 で接種した。１０％（Ｖ／Ｖ）ウソ胎児血清（ＦＢＳ）および２．０ｍｇ／−抗 生物質アミノグリコシドＧ４１８（ギブコ）を含むＩＭＤＭ培地（ギブコ、グラ ンドアイランド、ＮＹ）中Ｎｅｏ”に関する選択を行った。
（ＥＬＩＳＡによる分泌したヒトＩｇＧ　（Ｈｕガンマ）抗体の検出）トランス フェクションから２週間後すンドイッチＥＬＩＳＡを用い培養培地上清のスクリ ーニングを行った。Ｆｃ特異的の抗ヒトＩｇＧ（カルダグ、サンフランシスコ、 ＣＡ）を捕獲抗体として用い、またホースラディッシパーオキシダーゼＨＲＰＯ に結合したＦｃ特異的ヤギαヒ）ＩｇＧを用い結合したヒｌ−１ｇＧを検出した 。Ｈｕ１ｇＧポジティブウェルの細胞を希釈によりサブクローニングし、その希 釈クローンを従来法てヒトＦｇＧｇａｒｒｒｒｋｉ１を検出するＥＬ）ＳＡてス クリーニングした。ヒトＴｇＧｇａｍｌを含むクローンもマウス＋ｇＧ　３重鎖 を検出するＥＬＩＳＡてスクリーニングした。捕獲抗体としてヤギ抗マウスＩｇ Ｇ　３　（サザンバイオテクノロジーアソシエーシ３ン、バーミンガム、ＡＬ） を用い、またＨＲＰＯ（サザンバイオテクノロジーアソシエーノヨン）に結合し たヤギ抗マウスＩｇＧを用いてマウスＩｇＧ　３を検出した。ヒトＩｇＧ　ｇａ ｎｍａｌポジティブマウス［ｇＧ　３ネガテイブ（Ｈｕｇａｍｍａｌ”　。
ＭｏＣ２−）クローンの１つを選択し、ＣｈｉＨＢＲ９６と命名した。この重鎮 キメラハイブリドーマ細胞系列、ＣｈｉＨＢＲ９６をＭＣＦ−７細胞に関する抗 原特異性を調へ、また定１ＥＬＴｓＡを用いＭＣＦ−７細胞におけるヒトＩｇＧ 発現レベルを測定した。ＣｈｉＨＢＲ９６細胞は抗原特異的ヒトＩｇＧ抗体をお よそ２０μｇ／ｍ１発現した。
（軽ｊｌＤＮＡ　トランスフェクション）Ｈｉｎｄｌｌｒて線状化した第１６［ Ｎに示すヒト軽ＭＫ免疫グロブリン配列を含むヒト軽鎖組換えベクターｐＳＶｚ ｇｐｔ／Ｃｋ　（ＮＲＲＬ　ＮｕＢ　１８５０７）　３０　ｕ　ｇ／ｍｌを用い ること以外、上述のエレクトロポレーションによりＣｈｉＨＢＲ９６ハイブリド ーマ（８ＸｌＯ＠個）をトランスフェクトした。４８時間後その細胞をウェル当 り１０’個の割合で９６穴プレートのウェルに接種した。１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ 胎児血清、１５μｇ／ｒｎｌハイポキサンチン、２５０μｇ／ｍｌキサンチンお よび２．２５μｇ／ｍｌマイコフェノール酸（ＭＡ）を含むＩＭＤＭ培地中ｇｐ ｔに関する選択を行った。
（ＥＬＴＳＡによる分疋、したヒトカッパ（ＨｕＫ）抗体の検出）トランスフェ クションから２週間後上述のサンドイッチＥＬＩＳＡ検定法を用いて培養上清の スクリーニングを行った。捕獲抗体にはヤギα−ヒトＫ　（ＣＡＬＴＡＧ）およ び結合ヒとＫの検出にはヤギ抗ヒトＫ　ＨＲＰ　Ｏ（ＣＡＬＴＡＧ）を用いた。
希釈によりヒトに抗体を含むウェルをサブクローニングし、ついてそのクローン をヒトＫまたはマウスに鎖を検出するＥＩｊＳＡてスクリーニングした。捕獲抗 体としてヤギ抗マウスＫ（フィソソヤーサイエンティフィッ入ビノッパーグ、Ｐ Ａ）を用い、またマウスに鎖の検出にはＨＲＰＯに結合したヤギ抗マウスＫ（フ ィッノヤーサイエンティフィック）を用いた。ヒトにポジティブマウスにネガテ ィブクローン（ＨｕＫ”　、ＭｕＫ”　）の１つを選択しＭＣＦ−７細胞の抗原 特異性を検定し、また定量的ＥＬＩＳＡによりＭＣＦ−７細胞でのヒトＩｇＧ発 現レベルを測定した。ＭＣＦ−７細胞に特異的な抗原を持ち、か−）　Ｈｕｌｇ Ｇ”　、Ｍｕ［ｇＧ３−１ＨｕＫ”、ＭｕＫ”である細胞系列を選択しキメラＢ Ｒ９６（Ｃｈｉ−ＢＲ９６）と命名した。
重鎮および軽鎖抗原特異的キメラ抗体ＢＲ９６（Ｃｈｉ−ＢＲ９６）の発現量は 約２５μｇ／ｍｌであった。キメラ抗体の高分記、細胞を検出するためのウサギ αＨｕ１ｇＧ抗体を含む軟寒天を用いた細胞のクローニングを連続４回行なうこ とで（コツイノ（Ｃｏｆｆｎｏ）等、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、７９ 　；　４２９−４４０　（＋９７２）　）、キメラ抗体約１３０μｇ／ｍｌを分 泌するハイブリドーマ細胞系列（ＣｈｉＢＲ９６）をｉ辱だ。このハイブリトー マＣｈｉＢＲ９６は１９９０年５月２３日ＡＴＣＣにＡＴＣＣ階ＨＢＩ０４６０ として登録された。
（ＣｈｉＢＲ９６の結合） ＭＣＦ−７細胞上の腫瘍関連抗原に対する本発明のＣｈｉＢＲ９６抗体およびマ ウスＢＲ９６抗体の相対的アフィニティーをＥＬＩＳＡ競合結合検定で測定した 〔ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、５０　：　 ２４４９−２４５４　（１９９０）　）。
簡単に云うと、粘着抗原保持細胞系列ＭＣＦ−７を３Ｘ１０’細胞／ウエルの割 合て９６穴プレートのウェルにブレーティングし集密化するまで約３〜４日間増 殖させた。増殖培地を捨て細胞をウェル当りｌＯＯμｌの０．５％グルタルアル デヒドＰＢＳ溶液（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）を用い３０分間か けて固定しこ。プルタルアルデヒドを捨て、プレートをＰＢＳて緩やかに３回洗 浄した。ついてプレートを１時間かけてウェル当０２００μ！の結合ノ＼ソファ （ＤＭＥＭ中０．１％ＢＳＡ）てブ０７りするか、または−２０°Ｃて保存した 。結合バッファを捨てた後、ウェルにサンプルおよびコントロールを添加した。
プレートにフタをして４°Ｃて一晩インキュベートした。サンプルおよびコント ロールを捨て、プレートをＰＢＳて３回洗浄した。１％ウマ血清、／ＰＢＳ溶液 で希釈したＨＲＰ結合体をウェル当１）１００μｆ添加し、３７°Ｃて１時間イ ンキュベートした。このＥＬＩＳＡはクエン酸バッファ中の３．　３’、５．　 ５’−テトラメチル−ベンツジン（ＴＭＢ）クロマケン（ノエネテインクシステ ムス、シアトル、ＷＡ）で発色させた。発色は３ＮＨ２ＳＯ，て停止し、ヌイタ ーテクマイクロブーレトリーダーにより４５０ｎｍの吸光度を測定した。この検 定は０．３μｇ／ｍｌ！のビオチン化ＣｈｉＢＲ９６抗体かその抗原に対して非 ラベル化ＣｈｉＢＲ９６または非ラベル化マウスＢＲ９６モノクローナル抗体と どれくらい競争するかを測定する。
結合したビチオン化ＣｈｉＢＲ９６はアビジン−ＨＲＰＯて検出され標準的ＥＬ ［ＳＡ試薬で発色する。第１７図に示したように２つの結合曲線の重なりは２つ の抗体か腫瘍抗原に対し同じ特異性と相対的アフィニティーを有することを示し ている。
（実施例１０） （抗体ＣｈｉＢＲ９６およびＢＲ９６Ｆ（ａｂ’　）２フラグメントの特性）（ 未修飾のＣｈｉＢＲ９６およびＢＲ９６Ｆ（ａｂ’　）２７ラグメントの細胞毒 性）ＢＲ９６抗原ポジティブかん腫３３９６．２９８７およびＭＣＦ−７由来の 懸濁生細胞を先の実施例８および９て述へたように調製したＣｈｉＢＲ９６およ びＢＲ９６Ｆ（ａｂ’　）２フラグメントて処理し、これらの抗体の細胞毒性を 本発明のモノクローナル抗体ＢＲ９Ｂと比較した。この細胞毒性テストは実施例 ４て述へたＦＡＣ３検定法て行った。この実験の結果は抗体濃度（μｇ、ｚＷ） に対する死細胞率として第１８図〜第２０図に示した。
第１８図および第２０図はキメラ抗体ＢＲ９６およびＢＲ９６１ｇＧ３のＦ（ａ ｂ’　）２フラグメントか３３９６およびＭＣＦ−７細胞に対する細胞毒性に関 しモノクローナル抗体ＢＲ９６と同しであることを示している。１１９図は２９ ８７細胞に関する細胞毒性が他の胸部かん細胞よりもはるかに低いことを示して いる（第１８図および第２０図）。これらの結果はこれらの抗体による死滅には より高い結合比が重要であること（第２表）および、または腫瘍細胞の種類によ ってこれらの抗体に対する感受性か異なることを示している。これらの結果はＣ ｈｉＢＲ９６およびそのＦ（ａｂ”Ｉｔフラグメントはとそれ自体、すなわち非 結合型で細胞毒性を有すること、またＢＲ９６の細胞毒性はそのＦｃ領域には依 存しないことを示している。
（ＣｈｉＢＲ９６の内向化） 抗体ＣｈｉＢＲ９６のかん細胞への内向化をモノクローナル抗体ＢＲ９６の内向 化と比較して評価した。この抗体をリシンＡｌキシンと結合してイムノトキシン ＣｈｉＢＲ９６（抗体当り１〜４個のりノンＡ鎖）およびイムノトキシンＢＲ９ ６（抗体分子当り１〜２個のりンンＡ鎖）を生成し、先の実施例３て述へたチミ ジン取込み阻害検定を用いてかん細胞３３９６および３６３０に関する内向化を 測定した。
ナス１−シた各細胞系列に対するイムノトキシン濃度とチミジン阻害率のグラフ を第２１図および第２２図に示す。第２１図はＣｈｉ　ＢＲ９６−ＲＡおよびＢ Ｒ９６−ＲＡの内向化に帰因する３３９６胸部かん細胞のチミジン取込み阻害率 を示している。グラフから分るように、ＣｈｉＢＲ９６はＢＲ９６と同様に内向 し、また腫瘍細胞の死滅化については少なくともＢＲ９６と同し効率を示す。こ れは同様の結果か３６３０胸部かん細胞についても得られた（第２２図）。
（抗体ＣｈｉＢＲ９６のＡＤＣＣ活性）以下の細胞系列を用い実施例５て述へた ようにＣｈｉＢＲ９６のＡＤＣＣ活性を測定した　胸部かん系列３３９６．３６ ３０および３６８０　（オンコゲン、シアトル、ＷＡ）およびＮ１ＣＦ−７（Ａ ＴＣＣＮｃＨＴＢ２２）；子宮かん系列３６３３−３（オンコゲン、シアトル、 ＷＡ）；および肺かん系列２９８７；３６５５−３および２９８１　（オンコゲ ン、ノアトル、ＷＡ）。種々の抗体濃度の結果を第３表に示す。
第３表 ＣｈｉＢＲ９６のＡＤＣＣ活性 抗体濃度（８ｇ　／ｍｌ） 細胞系列　抗体　ＮＫ　１０　１　０．１　０．０１　０．０１胸部かん ３３９６　ＢＲ９６２８８６７４５８２７２５ＣｈｉＢＲ９６８８７９６０３４ ２６ ＭＣＦ−７ＢＲ９６１６８２６９５４１７１５ＣｈｉＢＲ９６９０８２５７２５ １７ 〜１ｃＦ−７ＢＲ９６２２７３６９４８２２２２ＣｈｉＢＲ９６７６７０５７３ ３２６ ３６３０ＢＲ９６３０６９６４４２３０３４ＣｈｉＢＲ９６６９５６４２３６３ ６ 第３表（つつき） ＣｈｉＢＲ９６のＡＤＣＣ活性 抗体濃度（８ｇ　／ｍｌ） 細胞系列　抗体　ＮＫ　１０　１　０．１　０．０１　０．０１胸部かん ３６８０　ＢＲ９６１３７３６７５８’３４　３８ＣｈｉＢＲ９６７０７１６１ ３９３０ 子宮かん ３６３３−３　ＢＲ９６２０９２９０６４２８２３ＣｈｉＢＲ９６８８８８５４ ４３２９ 肺がん ２９８７　ＢＲ９６１１５１５７４１９７ＣｈｉＢＲ９６６９６５５１２８＋５ ３６５５−３　ＢＲ９６４４９３７０００ＣｈｉＢＲ９６３９３５１２６５ ２９８１ＢＲ９６３４３３４５ ＣｈｉＢＲ９６５４３４４ 種々の抗体濃度に関する第３表に示した結果はＣｈｉＢＲ９６かＢＲ９６と同程 度にＡＤＣＣ活性を仲介することを示している。ＣｈｉＢＲ９６かそれ自体で細 胞毒性を示す抗体濃度よりも低い濃度でＡＤＣＣ活性か表れた。抗体ＢＲ９６を コントロールとして単独で使用したとき、ナス１−シた濃度での死滅は０％であ った。
ＡＤＣＣ活性は抗体ＢＲ９６結合細胞系列についてのみ観測された。
（補体依存細胞毒性を仲介するＣｈｉＢＲの能力）補体源としてのヒト血清存在 下、腫瘍細胞を死滅させるＣｈｉＢＲ９６の能力は胸部かん細胞３３９６；ＭＣ Ｆ−７，３６３０および３６８０　；子宮かん細胞３６３３−３；および肺がん 細胞３６５５−３．２９８７および２９８Ｉを用い、実施例６に示した方法で測 定した。その結果を第４表に示す。
第４表 ＣｈｉＢＲ９６のＣＤＣ活性 細胞系列　抗体濃度　（μｇ／ｍｌ＞ ＋０　１　０．１　０．０１ 胸部かん ３３９６　ＢＰＯ４１００９９７８１３ＣｈｉＢＲ９６８６９２１３２ ＭＣＦ−７ＢＰＯ４９４１００６３２ ＣｈｉＢＲ９６９２８３１０ ３６３０ＢＰＯ４９４１００８２９ ＣｈｉＢＲ９６８６８６３３９ ３６８０ＢＰＯ４１００１００＋９　７ＣｈｉＢＲ９６８７１００５９ 子宮かん ３６３３−３　ＢＰＯ４９８９８２１０ＣｈｉＢＲ９６１００＋００　２６　１ 肺がん ３６５５−３　ＢＰＯ４９１２２００ ＣｈｉＢＲ９６４６３００ ２９８７ＢＰＯ４＋００　＋００　１　０ＣｈｉＢＲ９６１００４３００ ２９８１ＢＰＯ４０３３２ ＣｈｉＢＲ９６１１２１０ 第」表に示されているように、ＣｈｉＢＲ９６は補体を含むヒト血清の存在下、 ＢＰＯ４と同様の細胞毒性（ＣＤＣ）を示す。との濃度においてらＢＰＯ４およ びＣｈｉＢＲ９６は細胞毒性を示さず、またヒト血清も細胞毒性を示さなかった 。
上述の結果は本発明の抗体ＢＲ９６およびキメラ抗体はそれらか結合するかん細 胞に内向し、未修飾のままで細胞毒性を示すと同時に高いレベルでエピトープを 発現する細胞に対してＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を有することを示している。
（実施例１１） （インビボにおける抗体ＢＲ９６の評価）腫瘍治療における本発明の未修飾抗体 ＢＲ９６の治療能力をヌードマウスにおけるヒト腫瘍移植を用いた一連の実験で 測定した。さらに、抗腫傷薬としてのＢＰＯ４の効果に影響する特定のパラメー ターも調べた。これらのパラメーターには標的腫瘍細胞における抗原発現レベル 、腫瘍移植から治療開始までの時間および投与量が含まれる。
全てのインビボ実験において必要数のＢａ１ｂ／Ｃｎｕ／ｎｕマウス（バーラン スプラークドーリ−、インディアナポリス、ＩＮ）にヒト肺アデノカルシノーマ 細胞系列８２９８７またはＨ２７０７腫瘍系列を移植した。これらの腫瘍系列由 来の細胞をインビトロで増殖、収穫、洗浄後ＰＢＳに懸濁してから各マウスの後 横腹に１０７個の細胞の皮下＜Ｓ、　Ｃ，）移植を行った。このマウスをランダ ムに各々８または１０匹のより小さいグループに分けた。
ＢＰＯ４の抗腫瘍効果を見い出し、もしくはその効果が起こる腫瘍移植部位に抗 体が局在化する機会を増すため、治療は腫瘍移植から２４時間後に行った。場合 によっては治療開始は前後したけれどもＢＰＯ４およびコントロールＭＡｂの投 与は量や方法とも同じにした。投与はマウスの尾の静脈からの０．２ｍｊ！ＰＳ Ｂ注射で行った。通常、５回の注射を３日に１度というスケジュールを用いた（ Ｑ３ＤＸ５）。しかし、実験開始した８２９８７腫瘍移植から１９日目と２１日 目に２回の余分の注射を行った。（２９８７および２７ｏ７腫瘍における抗体Ｂ Ｒ９６の抗腫瘍効果）移植後８日目から毎週各動物の腫瘍容積を測定した。腫瘍 容積は以下の式を用い腫瘍長さと深さから算出した。
腫瘍容積＝最長の長さＸ（深さ）２／２グループ平均値を計算し腫瘍移植後の時 間に対してプロットした。
第２３図に示した最初の実験ではＢＰＯ４による治療が８２９８７細胞系列に対 して非常に有意な抗腫瘍効果を生んだ。またこれらの細胞に結合し、これらの中 に内向するＢＲ９４をネガティブコントロールとして用いたが、ＰＢＳ処理した コントロールと同様にほとんど効果を示さなかった。
第５表は最初の実験における治療の終了時の各腫瘍に関する効果をまとめたち（ Ｈ２９８７移植後種々の時間に開始した未修飾ＢＲ９６による治療の効果）実験 １．　２８日目 グループ　ＭＡＢ　Ｎ　瘍応答 完全　部分的　安定　進行 １　、ＢＰＯ４２０３５ ２ＢＲ９４００１９ ３ＰＢＳ　０　０　０１０ 抗体ＢＲ９６による治療のみが腫瘍の完全な消失が起きた。このグループの動物 ２匹は腫瘍が無くなりまた、さらに３匹がＢＰＯ４による治療によりその腫瘍の 増殖停止が見られた。腫瘍の徴候がなくなった２匹のマウスは実験を通して腫瘍 は生じなかった。
（確立した腫瘍に関するＢＰＯ４の抗腫瘍効果）腫瘍治療の最終ゴールの１つは 確立し増殖しつづける腫瘍の有効な治療である。
ＢＰＯ４が確立した腫瘍に関する抗腫瘍効果を有するかどうかを試すため、ヌー ドマウスの移植物さしてＨ２９８７またはＨ２７０７肺アデノカルシノーマ腫瘍 系列を用いた。両腫瘍系列とも１０７個細胞の皮下注射後８日目に明白な腫瘍を 生じたことから、治療開始の遅れは確立した腫瘍に関する抗腫瘍効果のテスト法 を提供した。それゆえ、未修飾のＢＰＯ４の有効性を調べるため、皮下腫瘍移植 後５または８日間治療を続けたいくつかの実験を行った。治療開始の遅れは腫瘍 細胞に腫瘍を確立させた。これは治療が困難でより現実的に臨床状況を反映する 動物モデルを提供する。
治療方法は第６表にまとめた。各１０匹の３グループのマウスをこの表に示しで あるような種々の時刻に抗体ＢＲ９６で治療した。コントロールマウスは２日目 からＦＡ６またはＰＢＳによる処理を行った。ＦＡ６は哺乳類には存在しないバ クテリア抗原に対するマウスＩｇＧ＋であり、アイソタイプが一致する非結合ネ ガティブコントロールモノクローナル抗体として作用した。
第６表 Ｈ２９８７またはＨ２７０７移植後種々の時刻に開始した未修飾ＢＲ９６による 治療効果 治療法 グループ　ＭＡｂ　スケノコル／ルート　投与量　注射口Ｉ　ＢＰＯ４Ｑ３Ｄｘ ５ｉ、ｖ、　１■　２．５．８．１１．１４２　ＢＲ９６Ｑ３Ｄｘ５　ｉ、ｖ、 １■５．８、比Ｉ４．１７３　ＢＰＯ４Ｑ３Ｄｘ５ｉ、ｖ、　１■　８．１１． １４．１７．２０４　ＦＡ６　Ｑ３ＤＸ５　ｉ、ｖ、　１■２．５．８．１１． １４５　ＰＢＳ　Ｑ３ＤＸ５　ｉ、ｖ、　０．２　ｍｌ　２．５．８．１１．１ ４Ｈ２９８７およびＨ２７０７の両腫瘍細胞に対する治療効果を第２４図に示す 。
ここには腫瘍移植後の治療開始時刻と腫瘍のない動物数かプロットしである。明 白な腫瘍か無いことによって定義される腫瘍の不在は各グループに関して治療の 終りに検定した。腫瘍移植浸種々の時間に治療を開始したことから腫瘍不在の決 定までに費やされた日数は一定ではない。治療の早期開始は明らかに効果的であ り、治療か遅ければ効果は減少する。治療開始の遅れは腫瘍の増殖および確立を 許すので治療開始の遅れによる効果の減少は治療をより困難なものにする。
これらの結果はＢＰＯ４が２つの異なる腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を育するこ とを示している。抗腫瘍効果はＢＰＯ４て治療した３グループにのみ観測され、 一方コントロールのＦＡ６またはＰＢＳて処理した動物には抗腫瘍効果は表れな かった。
より確立した腫瘍に関する効果の差はより高レベルの抗原発現腫瘍系列、Ｈ２７ ０７に顕著であることは重要である。Ｈ２９８７と比へてＢＲ９６治療に対して Ｈ２７０７の方かより大きく応答したことは腫瘍細胞によって発現される抗原量 かＢＲ９６治療効果に影響するという仮定と一致している。先のデータからＢＰ Ｏ４か明確な腫瘍に対する抗腫瘍効果を有することは明らかである。
（抗体ＢＲ９６の投与量の効果） 別の実験てＨ２７０７腫瘍系列に村するＢＲ９６の投与ｌ効果を調へた。この実 験では１■／投与から０．０３２■／投与まで半減的に減少させる様式でＢＲ９ ６を投与し、た。各グループについて移植後の時間と平均腫瘍容積の関係を第２ ５図に示した。コントロール処理動物には最も高いモノクローナル抗体、１■／ 投与のＦＡ６のみか与えられた。これらのコントロール動物は抗腫瘍効果を示さ ず、一方抗体ＢＲ９６を選択した投与量範囲で投与した場合に投与依存的応答が あった。
（Ｆ（ａｂ’　）、フラグメントおよびキメラＢＲ９６の抗腫瘍効果）さらに、 Ｆ（ａｂ’　）２ＢＲ９６フラグメントの抗腫瘍効果を調へて、インビボで見ら れる抗腫瘍効果かＦｅ領域に１よるものかとうか、または腫瘍への結合とぞれに 続く内向化かインビトロ検定と同様に細胞の死滅に十分なものがどうかを決定し た。
Ｆ（ａｂ’　）２フラグメントの投与量はＢＲ９６と同しスケジュールにより０ ．６６■／投与量を用いた。この投与量はＩｇＧｘＢＲ９６の１．０■／投与量 と結合領域がほぼ等価となるものである。フラグメントて処理したグループの平 均腫瘍容量ｍと移植後の時間の関係は第２６図に示した。その効果は抗体自体は と強くはなかったか明らかにいくらかの抗腫瘍かあった。これらの効果は治療の 間および直後の早い時点で釦著てあった。
またこの実験てキメラＢＲ９６の抗腫瘍効果も調べた。キメラｋｉａｂには０． ３２■／投与量の中間曲設！Ｅｉｉを選んだ。このグループのマウスの平均腫瘍 容積値も第２６図に示した。キメラ抗体ＢＲ９６による治療は匹敵する投与量の マウスＢＲ９６１ｇＣ＋ｓよりも有効であった。このことはキメラＢＲ９６て処 理した８匹のマウスのうちの６匹か治療の終りに明確な腫瘍か無かったことを示 す第２７図からも分かる。
第２７図に示した各腫瘍の試験で治療の完了時の１．０から０．１■／投与量へ 抗体＋ｇＧ、ＢＲ９６量を変えて治療した後の腫瘍のない動物数により明らかな 投与量効果か証明された。驚くへきことに、０．０３２■／投与量の治療は０． ３２■／投与量と同し抗腫瘍効果を生した。このことは治療により腫瘍内で死滅 した細胞レベルか腫瘍か増殖しつつけるのに必要な最小量に非常に近いことを反 映している。
Ｆ（ａｂ”）２フラグメントで治療した８匹の動物のうちの３匹は治療後明確な 腫瘍を含まなかった。したかってＦｃ領域は特にイムノコンピテント動物におい てＢＲ９６の腫瘍殺生効果を促進するかインビボにおいてその抗体か抗腫瘍効果 を示すのには全く必要ない。
これまて述へてきたことは未修飾ＢＲ９６抗体はインビボにおいて腫瘍に対して 有効な抗腫瘍剤となることを示している。さらに、ＢＲ９６は明確なまたは確立 した増殖腫瘍に関し２て効果かある。＠瘍上の抗原密度か高けれはＢＲ９６かこ れらの細胞を殺しやすい、ことを示すデータかある。キメラ、マウスＩｇＧ＊そ のもの、またはＦ（ａｂ’　）、フラグメントなととのタイプのモノクローナル 抗体でも抗腫瘍剤として有効であることか示されていた。より早く治療しより多 く投与することか望ましい。
（実施例１２） （抗体ＢＲ９６の局在化および生体分布）上述の実施例１１て述へた治療実験で 用いた放射性ヨウ未標識モノクローナル抗体ＢＲ９６を用い生体分布特性を測定 した。特に、適当なコントロール（モノクローナル抗体ＦＡ６、キメラ９６．５ および９６．５　Ｆ（ａｈ’　）２とともに、ＩｇＧ、、ＢＲ９６、キメラまた はＦ（ａｂ’　）２フラグメントを用いて腫瘍や種々の器官に局在化させた。
局在化実験の前、治療実験として実施例１１て述へたように動物に腫瘍細胞を注 射した。腫瘍を２週間かけて増殖させた。この時点て１００μｇの抗体ＢＲ９６ またはそのフラグメントをＩＯμｇヨートゲンと室温、１０分間処理することて 放射能標識した。コントロール抗体またはフラグメントも同様の方法を用いＢｌ ｌて標識した。これらの放射性ヨウ素化抗体を適当な非標識抗体で希釈し治療実 験で使用する投与量とした。特異的および非特異的抗体を混合し、マウスの尾の 静脈に注射した。所定の時刻にランダムにマウスをそのグループから選び、麻酔 をかけ、眼窩叢を通して血を抜いて殺した。種々の組織を取り出し、重さを測り 、２つの放射性ヨウ素を区別し得るガンマカウンタで計数した。このデータから 注射投与物の割合及びグラム当りの注射投与物の割合を計算した。
局在化実験における２４の投与時刻のデーターを第７表にまとめた。
第７表 生体分布実験のまとめ 投与後２４時間の注射投与物の割合／グラム投与量　腫瘍 抗体　（■）　細胞系列　血液　腫瘍　肝臓　膵臓　腎臓　肺１）　ＢＲ９６− Ｇ、　１．ＯＨ２９８７１０，２６，８２，２＋、９　３．４　４．７ＦＡ６　 １．０　６．３　２．１　２．１　＋、６　２．４　３．２２）ＢＲ９６−Ｇ２ ０．３　Ｈ２７０７９，０７，０１，８＋、６　２．７　３．７ＦＡ６　０．３ 　５．９　２．７　２．０　＋、８　２．２　２．８３＞　ＣｈｉＢＲ９６０， ３２Ｈ２７０７７，２８，２１，４＋、６　２．０　３．５Ｃｈｉ９６．５　０ ．３２　７．５　２．３　１．８　１．６　１．９　３．５４）Ｆ（ａｂ”）２ ＢＲ９６０，６５Ｈ２７０７＜０．３　＜０．３　＜０．３　＜０．３　＜０． ３　＜０．３９６．５　０．６５　＜０．３　＜０．３　＜０．３　＜０．３　 ＜０．３　＜０．３特異的および非特異的抗体間に育意な差を示す組織のみか腫 瘍である。試験した他の全ての組織は特異的および非特異的抗体のほぼ等しい取 込みを示した。１つの例外は非特異的抗体ＦＡ６に対するより低い血液レベルで ある。このことはこの抗体か血液清澄化を促進することを示している。しかし、 腫瘍における特異的および非特異的抗体の差はＦＡ６およびＢＲ９６に対する血 液レベルの差よりも大きい。また第７表のデータは特定器官に存在する投与物の 割合は投与量とは無関係に一定であることを示している。それゆえ、このことは 投与量かより多いとき１瘍部位に存在する抗体も定量的により多いことを示して いる。さらに、特異的および非特異的取り込みに関し２つの腫瘍系列に明白な差 はない。
また、第７表はＦ（ａｂ′）２かＩｇＧ、またはキメラＢＲ９６よりも速い速度 で動物体内から消失することを示している。このことは抗体治療実験と比較して このフラグメントの効率か低いことを説明し得る。それゆえこのフラグメントの との抗腫瘍効果も迅速て、消失する前の短時間に効かなければならない。Ｃｈｉ ＢＲ９６はＩｇＧ、ＢＲ９６と同レベルに局在化していた。コントロールキメラ 抗体に比へ腫瘍内にのみ多量に存在した。このことはマウスＢＲ９６［ｇＧ、に 比へたキメラ抗体の効果の増加はヒトの定常部置換によるものであることを示し ている。同様に重要なこととしてヒト定常部置換か腫瘍に局在化するキメラ抗体 の能力に影響するがまたはその生体分布に非常に影響するとは考え難い。
まとめると、ＢＲ９６のＩｇＧａおよびキメラ抗体は腫瘍に特異的に局在化し得 る。
さらに、同等の投与ｌを用いた予備実験で局在化および治療効果か示された。
Ｆ（ａｂ’　）！フラグメントの局在化の間接的証拠は治療実験におけるそのフ ラグメントの抗腫瘍活性でも示された。この活性は２４時間以内に発生しなけれ ばならない。
我々は本発明の特定の態様を示してきたか本発明の範囲内で変化や修正か可能で あることは明白である。それゆえ、本発明の範囲は本明細書に実施例として示さ れている特定の態様よりもむしろ特許請求の範囲で定義されていると考えるべき である。
浄書（内容に変更なし） イムノトキシン濃度（μｇ／ウェル） 浄書（内容に変更なし） イムノトキシン濃度 浄書（内容に変更なし） イムノトキシン濃度（μｇ／ウェル） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） イムノトキンン濃度（μｇ／ウェル） 浄＠（内容に変更なし） 濃度（、ｕｇ／ｍｌ） 浄書（内容に変更なし） 日Ｒ９６，ｐｇ／ｍｌ 標的細胞 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 標的細胞 浄書（内容に変更な１−） 標的細胞 浄書（内容に変更ない 吸光度（４５０ｎｍ） 浄書（内容に変更なし） 吸光度（４５０ｎｍ） 吸光度、４５０　ｎｍ　（ｘｌｏｏｏ）Ｆ’１ＧＵＲＥ　１５ Ｆ工ＧＵＲＥ　ＩＧ 浄書（内容に変更なし） 競合結合検定 ０．３　ｐｇ／ｍｌ　ビオチン化キメラ　ＢＲ９６戸９／ｍ１ 死細胞率（％） 死細胞ｉｔ　（％） 死細胞率（％） 浄書（内容に変更なし） Ｈ３３９６の直接的内向検定 抗体ａ度　（ｍｃｇ／ｍｌ） 浄書（内容に変更なし） Ｈ３６３０の直接的内向検定 抗体１度　（ｍｃｇ／ｍｌ） 腫瘍容積　（ｍｍ３） 浄書（内容に変更なし） 治療終了時の腫瘍の有無 １０　ＡＮＩＭＡＬＳ　ＰＥＲＧＲＯｔＪＰ治療、（開始日） ヒ） Ｃ工 浄書（内容に変更なし） 治療終了後の腫瘍の有無 平成　年　月　日

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （請求項１）ヒトのがん細胞と特異的な免疫反応を起こす抗体またはそのフラグ メントで、それが反応したがん細胞への内向、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの仲介、お よび宿主エフェクター細胞または補体の非存在下での該ヒトがん細胞の死滅化を 特徴とする抗体またはそのフラグメント。 （請求項２）前記抗体がマウスのモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体 。 （請求項３）ＡＴＣＣに登録されているＨＢ１００３６と同定し得る特徴を有す るハイブリドーマにより産生されるマウスモノクローナル抗体ＢＲ９６。 （請求項４）ＡＴＣＣに登録されているハイブリドーマＨＢ１００３６。 （請求項５）請求項２記載のモノクローナル抗体の抗原結合部を含む組換えたん ばく質。 （請求項６）前記たんぱく質がヒト／マウスキメラ抗体である請求項５記載の組 換えたんばく質。 （請求項７）ＡＴＣＣに登録されているＨＢ１０４６０と同定し得る特徴を有す るハイブリドーマにより産生されるキメラ抗体ＣｈｉＢＲ９６。 （請求項８）ＡＴＣＣに登録されているハイブリドーマＨＢ１０４６０。 （請求項９）前記抗原結合部が少なくとも抗腫瘍活性を有する第２のたんばく質 の機能活性部に結合している請求項５記載の組換えたんばく質。 （請求項１０）前記第２のたんばく質が酵素、リンフォカイン、オンコスタチン またはトキシンである請求項９記載の組換えたんばく質。 （請求項１１）前記抗原結合部がフコースα１−３を含有するエピトープを含む Ｌｅｙ抗原変異体である抗原と反応るす請求項５記載の組換えたんばく質。 （請求項１２）請求項２記載の抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２またはＦｒフラグ メント。 （請求項１３）２種の抗原に対する結合特異性を有する二特異的抗体で、その抗 原の１つは請求項２記載のモノクローナル抗体が結合するものであるもの。 （請求項１４）前記抗原の１つがフコースα１−３を含有するエピトープを含む Ｌｅｙ抗原変異体である請求項１３記載の二特異的抗体。 （請求項１５）抗原結合部がハイブリドーマＨＢ１００３６により産生されるモ ノクローナル抗体ＢＲ９６の標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害するモ ノクローナル抗体。 （請求項１６）前記抗原がフコースα１−３を含有するエピトープを含むＬｅｙ 抗原変異体である請求項１５記載の抗体。 （請求項１７）抗原結合部がハイブリドーマＨＢ１００３６により産生されるモ ノクローナル抗体ＢＲ９６の標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害するヒ ト／マウス組換え抗体。 （請求項１８）前記抗体が治療薬と結合し抗体結合体を形成する請求項３または ７のいずれか１項記載の抗体。 （請求項１９）前記治療薬が抗腫瘍剤、トキシン、放射性試薬、第２抗体または 酵素である請求項１８記載の抗体。 （請求項２０）薬剤前駆体を細胞毒性試薬に変換し得る酵素に結合した請求項３ または７のいずれか１項記載の抗体を含む免疫結合体と該薬剤前駆体の組合せ。 （請求項２１）医薬的有効量の請求項３または７のいずれか１項記載の抗体を含 むヒトのがん治療に有用な医薬組成物。 （請求項２２）医薬的有効量の請求項１８記載の少なくとも１つの抗体結合体を 含むヒトのがん治療に有用な医薬組成物。 （請求項２３）医薬的有効量の請求項９記載の少なくとも１つの組換えたんばく 質を含むヒトのがん治療に有用な医薬組成物。 （請求項２４）患者に医薬的有効量の請求項３または７のいずれか１項記載の抗 体を含む組成物を投与することを含むインビボにおけるヒトのがんの治療方法。 （請求項２５）ヒトの組織におけるガン腫の検定方法で、該組織検体に請求項３ または７のいずれか１項記載の抗体を接触させ、ついで該組織への該抗体の結合 を検出することを含む方法。 （請求項２６）前記抗体を放射能ラベル、酵素、発色団および蛍光団からなる群 から選ばれるラベルを用い検出可能なシグナルを生成するよう標識する請求項２ ５記載の方法。 （請求項２７）抗体検出に有効な量の請求項３または７のいずれか１項記載の抗 体を患者に静脈注射し、該抗体をがん細胞に局在化させた後該抗体を検出するこ とを含むヒトがん腫のイメージング法。 （請求項２８）前記抗体を放射能ラベル、酵素、発色団および蛍光団からなる群 から選ばれるラベルを用い検出可能なシグナルを生成するよう標識する請求項２ ７記載の方法。 （請求項２９）請求項３記載の抗体のイディタイプを反応する抗イディオタイプ モノクローナル抗体。 （請求項３０）ａ）請求項３または７のいずれか１項記載の抗体、およびｂ）検 出可能なラベルおよび上記ａ）の抗体の特異的結合パートナーの結合体、以上ａ ）およびｂ）を含む診断キット。 （請求項３１）前記ラベルが酵素、放射能ラベル、発色団および蛍光団からなる 群から選はれる請求項３０記載の診断キット。
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