JP3415840B2 - 外来蛋白質の産生方法 - Google Patents

外来蛋白質の産生方法

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和彦 来海
浩明 前田
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、遺伝子組換え等により調製される外来遺伝
子を効率よく発現させ、回収することからなる外来蛋白
質の産生方法に関する。詳細には、マウスミエローマと
リンパ系細胞とを融合して得られる融合細胞を発現宿主
細胞として用い、無血清培養により目的の外来蛋白質、
特に組換え抗体を産生させる優れた外来蛋白質の産生方
法に関する。
発明の背景 近年の細胞融合技術の発展によってモノクローナル抗
体の産業上の利用が期待されている。しかしマウス型の
抗体以外の異種の抗体はマウス、ラット等のげっ歯類の
ミエローマ細胞株と異種細胞を用いた融合では、雑種細
胞（ハイブリドーマ）において該当する異種の抗体の染
色体が急速に消失する現象がみられ、安定な抗体産生細
胞を得ることは極めて困難であった。さらに、げっ歯類
以外の同種のミエローマ細胞株やＢ細胞株を用いた細胞
融合も試みられているが満足する結果は得られていな
い。
一方、近年遺伝子組換え技術の発展に伴い、遺伝子の
クローニングが容易となってきた。抗体に関しても、遺
伝子レベルでの解析が進み、抗体遺伝子を単離すること
により染色体レベルでの脱落を起こさずに適当な宿主細
胞でこれを発現させることが可能となった。しかし抗体
遺伝子の導入により発現させる抗体の産生量は一般に細
胞融合法で得られる雑種細胞のそれよりも低く実用的で
はなかった。この問題を解決するためにDHFR遺伝子等を
用いた遺伝子の増幅系等が用いられるが一般にマウス由
来の細胞系ではDM（Double Minutes）として宿主染色
体に組み込まれず外来性遺伝子は不安定であると言われ
ている。またマウス細胞を用いたDHFR遺伝子増幅系に関
するいくつかの報告はあるがその安定性については触れ
られていない。
遺伝子組換えによる抗体産生技術に関しては、工業的
レベルにおいても実用可能な発現系という観点から満足
するものがなく、組換え抗体遺伝子の発現および精製の
両面から組換え抗体の優れた産生方法の開発が望まれて
いる。
発明の開示 このような状況の中で、本発明者らは、無血清培養を
用いた組換え抗体の産生方法という観点から、鋭意研究
を重ねた結果、マウスミエローマとリンパ系細胞とから
調製される無血清培地で培養可能な融合細胞（一般には
雑種細胞とも呼べるが、本発明の特徴となる外来蛋白質
の発現用宿主細胞として用いられる雑種細胞を本明細書
では融合細胞と呼ぶ）を宿主細胞として用い、該融合細
胞内で抗体遺伝子を発現させることにより、目的の組換
え抗体が極めて効率よく調製されることを見いだし本発
明を完成するに至った。
マウスミエローマ細胞を利用した遺伝子組換えによる
抗体の製造方法は、これまでにも一部報告されている
が、これまでに知られている方法は、ハイブリドーマ作
製用の親株（ミエローマ）をそのまま宿主細胞として用
い、これに外来遺伝子を組み込み、抗体を発現させたに
過ぎない。しかし、このようなマウスミエローマ自体を
外来遺伝子の発現させるための宿主細胞に用いた場合に
は、特に無血清培地での培養に適した細胞を調製するこ
とが困難であり、血清添加培地と同等に増殖可能で、か
つ安定な遺伝子発現効率を兼ね備えた宿主細胞を調製す
ることは極めて困難と考えられた。
マウスミエローマ細胞の代表的なものとして、P3X63A
g8.653株が挙げられるが、この細胞株は、外来遺伝子導
入のしやすかと発現効率の高さから優れた遺伝子発現の
宿主である。ところが上述した通り、P3X63Ag8.653株の
無血清培地への順化は容易ではなく形質転換体によって
増殖性が様々であり、無血清培地では増殖せず血清添加
培地中でしか生育できなかった。これまで発明者らが調
べた結果によれば、この細胞自体はコレステロール依存
性栄養要求を示しLDL、YLP（卵黄リポプロテイン）、リ
ポソーム等の培地への添加が長期継代には必要である
が、この様にして培地中のコレステロール含量を高めた
培地でも増殖は完全に血清添加培地と同等ではなく、そ
れ以外の未知の因子が必要である。これまでのところ該
細胞の血清中の増殖因子については不明である。
そこで本発明者らは、このようなマウスミエローマと
リンパ系細胞とを融合させ無血清培地で培養可能な細胞
に順化した融合細胞を調製し、これを外来遺伝子の発現
宿主細胞として用いたところ、外来遺伝子も効率よく発
現し、しかも無血清培地においても培養可能な、目的の
外来遺伝子を安定に発現する形質導入細胞を調製できる
ことを見いだした。本発明において、このような融合細
胞を調製する際に用いられるリンパ系細胞は、融合した
後に無血清培養に順応可能な性状を有した細胞であるこ
とが必要であり、例えば、ミエローマ細胞とリンパ系細
胞とから一般にモノクローナル抗体産生用に調製される
雑種細胞（ハイブリドーマ）のうち、無血清培養に順化
した細胞または順化可能な細胞が効果的に用いられる。
このような雑種細胞のうち、本発明の中でマウスミエロ
ーマと融合される細胞に適した細胞としては、雑種細胞
Sp2/0細胞（ATCC番号CRL1581）が挙げられる。
また、本発明における融合細胞の調製に用いられる上
記マウスミエローマの最も好ましいものとして、マウス
ミエローマP3X63Ag8.653株（ATCC番号CRL1580）が挙げ
られる。本発明者らが、組換え抗体遺伝子を効率よく発
現できる融合細胞の調製に用いられる細胞株について種
々検討を行った結果、種々のマウスミエローマの中でも
上記マウスミエローマP3X63Ag8.653株が外来遺伝子の導
入という観点から最も優れていることが確認された。
さらに工業レベルでの外来蛋白質、例えば組換え抗体
の大量調製を実現するためには、 （１）低コストで目的産物の精製が容易な無血清培地で
増殖可能であること。
（２）目的産物を高産生できること。
（３）浮遊培養系でスケールアップが容易であること。
等の条件を満足しなければならない。
本発明のマウスミエローマとリンパ系細胞とを融合し
て得られる無血清培地で培養可能な融合細胞を外来遺伝
子の発現宿主として用いる外来遺伝子の産生方法は、マ
ウスミエローマと（例えば、P3X63Ag8.653株）のリンパ
系細胞とを混合し、ポリエチレングリコール等の融合剤
を加えて細胞融合して得られた融合細胞を無血清培地中
での選択と一連のクローニングを行うことによって無血
清培地中で生育可能かつ外来性の抗体遺伝子を安定して
発現させることのできる融合細胞を作出し、該細胞を宿
主細胞として用いることを特徴とし、この融合細胞を用
いて目的の外来遺伝子を発現せしめることにより、所望
の外来蛋白質を無血清培地中から回収することが可能な
優れた外来蛋白質の産生方法である。このような本発明
の産生方法は、上記のいずれの条件をも克服することが
可能な産生方法である。
本発明の産生方法により、調製される外来蛋白質とし
ては、種々の有用蛋白質、例えば抗原蛋白質、生理活性
蛋白質および酵素等特に限定されるものではないが、特
に遺伝子組換えにより抗体を産生させる場合に於て極め
て有用である。このような抗体は、キメラ抗体、Ｖ領域
改変抗体［CDR改変抗体（reshaping抗体）］等の種々の
遺伝子組換え抗体の発現に極めて適しており、目的の組
換え抗体を効率よく産生することが可能である。
図面の簡単な説明 図１は遺伝子導入試験に用いられる外来遺伝子の一例
としてのIgG−Ｌ鎖発現ベクターの構造を示す。
図２は実施例４で形質転換に用いられたIgG−Ｈ鎖発
現ベクターの構造を示す。
図３は実施例４で形質転換に用いられたIgG−Ｌ鎖発
現ベクターの構造を示す。
図４は融合細胞を用いて確立された形質転換体の無血
清培養での増殖性と発現量を示す。
発明を実施するための最良の形態 以下、組換え抗体の産生を例にとって、さらに詳細に
説明する。
一般に、ほ乳類動物細胞の浮遊培養に用いられる培地
の基本組成は10％の牛胎児血清を含むRPMI−1640培地等
が常用される。本発明で作製される融合細胞は以下に示
すような総蛋白含量の低い無血清培地にて血清添加培地
と同等の細胞増殖性と組換え抗体産生能を有している。
無血清培地の組成 基礎培地としてハムF12培地：ダルベッコ改変MEM培
地:RPMI1640培地を1:1:2または2:1:1の比率で混合した
ものを用い、これに添加物として次の表１のものを加え
る。
さらにDHFR遺伝子増幅系を用いる場合にはメトトレキ
サート（MTX）を10-7M程度、G418耐性遺伝子を組み込ん
で用いる場合にはG418を0.5mg/ml程度加えることが可能
である。
本発明に用いられるリンパ系細胞は末梢血リンパ球、
リンパ節、脾臓などから得られる正常リンパ系細胞も利
用可能であるが、Sp2/0に代表されるようなリンパ系雑
種細胞が効果的に用いられる。細胞融合はこのようなリ
ンパ系細胞とマウスミエローマ（好ましくは、P3X63Ag
8.653）を細胞融合剤（ポリエチレングリコール等）の
存在下、常温で混合して行われる。細胞融合法は一般的
な方法で行われる。例えば、１ないし10X107個のP3X63A
g8.653に対し正常リンパ系細胞なら１ないし5X108個、S
p2/0ならば１ないし10X107個の細胞を混合し1500rpm5分
間遠心して細胞を沈澱させ、さらに血清を含まないRPMI
1640培地の40mlを加え、1500rpm10分間遠心して細胞を
洗浄する。細胞ペレットをよく解したのち、45％ポリエ
チレングリコール（1500から4000の重合度）を１分間に
1mlの速度で滴下し、ゆっくりと１分間混合する。さら
に1mlのRPMI1640培地を１分間かけて滴下し、再度1mlの
培地を１分間かけて滴下したのち、8mlのRPMI1640培地
でPEG（ポリエチレングリコール）を希釈し、1200rpm10
分間遠心して細胞を回収する。細胞融合後、１％牛胎児
血清を含む無血清培地にて１週間程培養したのち、上記
の完全無血清培地中で培養すると、融合しなかったP3.6
53株は徐々に死滅してゆき、融合細胞は死滅しないで増
殖を続ける。この様にして無血清培地中で増殖可能な融
合細胞は容易に獲得され、更に培養上清中の抗体を、放
射性同位体で標識した抗体もしくは酵素標識抗体を利用
したEIA等の適当なアッセイ法を用いて、スクリーニン
グすることができる。
本発明は、外来性の遺伝子、特に組換え抗体遺伝子を
発現せしめることを目的としているので、この無血清培
地で増殖可能な該融合細胞の中から宿主由来の抗体を分
泌していない融合細胞を上記の様なスクリーニング法で
選別することができるが、組換え体の宿主として適切で
あるか否かは以下の様な遺伝子導入試験を実施すること
によって確かめることが可能である。
遺伝子導入試験 通常の方法で細胞融合し、無血清培地に浮遊させて24
穴培養プレートに接種したのち、３日おきに新鮮な無血
清培地で培地交換し約２ヶ月ほど培養を続ける。その間
に融合後３日め、14日め、21日めに培養上清を一部採取
してEIA等で抗体産生を調べる。約10日後、無血清培地
で増殖可能な融合細胞のプールが得られたら、増殖のよ
いウェルを選んで10％の牛胎児血清を含むRPMI1640培地
にて限界希釈法によるクローニングを行う。96穴プレー
トより単一クローンのウェルを選んで24穴プレートへ拡
張を行う。増えてきたら最初５％牛胎児血清を含む無血
清培地で培地交換を行い、徐々に牛胎児血清濃度を下げ
無血清培地に切り替えて行く。生き残ったウェルの細胞
密度を計測し、別の24穴プレートに2X105cells/mlの密
度で細胞をまき込み遺伝子導入試験に供する。残りの細
胞は試験の結果が判明するまでそのまま無血清培地中で
培養を続ける。遺伝子導入試験は24穴プレートにまき込
んだ細胞がウェルの底に沈むのを待って、上清を0.3ml
静かに抜いて容量を0.3ml/ウェルに合わせる。滅菌蒸留
水に溶解した適当な発現プラスミドベクター（例えば、
抗体のＬ鎖を発現せしめるプラスミドベクター等、図
１）と適当な遺伝子導入剤（DEAEデキストラン、燐酸カ
ルシウム、リポフェクチン等）を混ぜ合わせ0.3mlとす
る。室温で15分静置したのち0.01mlずつこれを24穴プレ
ートの細胞へ滴下し、37℃で５ないし24時間培養する。
培養後0.3mlの20％牛胎児血清を含む無血清培地を添加
し２ないし３日間培養したのち、培養上清を適当なアッ
セイ法を用いて遺伝子の発現を調べる。
目的産物の発現効率の高い融合細胞プールを選別し、
さらに96穴マイクロプレートを使った限界希釈法による
クローニングを実施して再び同様な遺伝子導入試験を繰
り返すことによって遺伝子組換え体の宿主として適切な
融合細胞クローンを獲得することができる。
以上のように、得られた融合細胞株に外来遺伝子を導
入する場合のほか、最初からマウスミエローマに外来遺
伝子を導入しておき、得られた組換え体を正常リンパ系
細胞あるいは他の雑種細胞と融合しても本発明の目的と
する無血清培地で増殖可能な遺伝子組換え体を作出せし
めることが可能である。すなわち、外来遺伝子の導入は
融合細胞を獲得する工程の前後いずれでも実施すること
ができる。外来遺伝子の導入を細胞融合の前に実施した
場合には、まず無血清培地で選択を行いマウスミエロー
マ（例えば、P3X63Ag8.653）由来の細胞を死滅させ、そ
の後１％牛胎児血清を添加した選択培地（MTX、G418を
含有する）で培養して抗体産生細胞を得る。こうして獲
得された細胞は徐々に無血清培地に順化せしめることが
できる。なお、たくさんの形質転換体を得ようとすると
きは、細胞融合の後で外来遺伝子導入を実施する方法
が、細胞融合の手間を省くことができるため便利であ
る。
細胞融合の相手としてSp2/0等のセルラインを用いる
時には、融合の選択マーカーとしてG418耐性遺伝子発現
ユニット等をあらかじめマウスミエローマP3X63Ag8.653
に導入しておけば、融合後、適当な選択培地で培養する
ことによって融合細胞を簡単に選択可能である。これら
遺伝子導入剤を用いるとマウスミエローマP3X63Ag8.653
は効率的に外来遺伝子を取り込むが、Sp2/0細胞自体は
殆ど外来遺伝子を取り込まないことが確認された。
遺伝子導入の宿主細胞としての能力としては、形質転
換効率が良いこと、無血清培養が可能であることのほか
に、目的の遺伝子産物を多量に産生し得ることも重要な
要件となる。したがって、宿主細胞の発現能力を事前に
検定しておくことが重要で、最も発現能力の高い細胞を
宿主として選択すべきである。細胞の発現能力は適当な
遺伝子を導入して形質転換した後に、形質転換体の培養
上清、細胞表面もしくは細胞内に発現する量を測定する
ことによって検定される。例えば、表２は26種類の融合
細胞とその親株（P3X63Ag8.653およびSp2/0）を図２お
よび図３で示されたようなプラスミドで形質転換し、G4
18で選別した後に培養上清中に発現する組換え蛋白量を
酵素抗体法で測定した結果である。26種類の融合細胞の
うちのほとんどはそれぞれの親株よりも高い発現能力を
示し、中でもクローン34細胞は高い産生量を有してい
た。したがって、クローン34細胞のような細胞が外来遺
伝子の発現の宿主細胞としては最も適当であると考えら
れた。そしてこの細胞を宿主細胞として図４に示す発現
遺伝子によって抗体を発現させたところ、細胞１個あた
り20pg/cells dayという多量の抗体を産生していた。
従来、マウスミエローマ細胞系で多量の抗体分子を発
現させるためには遺伝子増幅等による別の細胞育種手段
を講じる必要があった。例えば、Gilliesら（BioTecnol
ogy,7,p799（1989））は抗破傷風毒素抗体遺伝子をSP2/
0細胞に導入し形質転換体を得、MTXで遺伝子増幅を行っ
て産生量を数倍上昇させた。この細胞の発現量は約20pg
/cells day/mlであった。Robbingtonら（BioTecnology,
10,p169（1992））もミエローマ細胞に抗体遺伝子を発
現させ9.5−15pg/cells dayの産生能力を有する形質転
換体を得ているが、この場合もグルタミンシンセターゼ
遺伝子増幅を利用することによって達成された値であ
る。
遺伝子増幅の欠点としては、第一に増幅するために時
間がかかり、一般的には高発現株を得るためには数カ月
の期間が必要となる。第二は増幅された遺伝子の安定性
の問題で、MTXやMSXのような選択試薬を添加せずに培養
すると遺伝子の脱落が起こり産生量が増幅前と同程度に
低下する場合がある。そのため培養期間中にこれらの選
択試薬を添加しておくか、もしくは安定な細胞株をクロ
ーニングしなければならなかった。
これに対し、本発明により確立された融合細胞株を用
いた形質転換細胞は遺伝子増幅を行わずとも既に前述の
細胞株と同程度の発現能力を有していた。本発明者らは
これまでP3−X63Ag8.653やSp2/0細胞に抗体遺伝子を発
現させたが、高い発現能を有するものでも数pg/cells d
ayかそれ以下であり、遺伝子増幅なしで今回作成した融
合細胞のように高い産生量を与えた例はなく、この融合
細胞を用いて初めてかかる高産生量が達成された。従っ
て、この融合細胞を用いて形質転換を行えば遺伝子増幅
を行わずとも簡単に高い産生量の発現細胞を得ることが
できる。
またこの細胞はMTXやMSXのような試薬を用いて遺伝子
増幅を行い、さらに発現産物を増加させることも可能で
ある。例えば実施例６に示すように形質転換体の培養中
のMTX濃度を上昇することによって遺伝子増幅を行った
ところ、多いもので10倍の組換え蛋白の発現増加が観察
された。
以下、本発明を実施例に従いさらに詳細に説明する
が、本発明は以下の実施例に何等限定されるものではな
い。
実施例 実施例１ 免疫されていないマウスより脾臓を摘出し無菌的に血
清を含まない10mLのRPMI1640培地に脾臓細胞を浮遊させ
た。これを遠心管に移し結合組織等を沈澱させた後、上
清の細胞浮遊液を集めた。この脾細胞遠心沈渣を牛胎児
血清を含む増殖培地の0.5mLを添加し、次に10希釈培地1
0mLをすばやくピペットにて懸濁し、室温で15ないし20
秒間処理の低張処理により赤血球除去を施した。低張処
理後、２倍濃縮培地を10mL速やかに添加し、よくピペッ
トで細胞を懸濁し、さらに増殖培地を10ないし20mL加え
て遠心（1500rpm,5分間）し、脾細胞沈渣を得た。これ
に20ないし30mLの増殖培地を添加し、ピペットにてよく
混合した後、遠心（1500rpm、５分間、室温）して正常
リンパ系細胞を調製した。このマウス由来の脾細胞１な
いし5X108個とP3X63Ag8.653株１ないし10X107個を、５
ないし10:1の細胞比率にて混合した。これに血清を含ま
ないRPMI1640培地の40mlを加え、1500rpm10分間遠心し
て細胞を洗浄する。細胞沈渣をピペットでよく懸濁した
のち、45％ポリエチレングリコール（1500から4000の重
合度）を１分間に1mlの速度で滴下し、ゆっくりと１分
間混合した。次に、1mlのRPMI1640培地を１分間かけて
滴下し、さらに1mlの培地を１分間かけて滴下したの
ち、8mlのRPMI1640培地でPEG（ポリエチレングリコー
ル）を希釈し、1200rpm10分間遠心して細胞を回収す
る。細胞融合後、10％牛胎児血清を含むHAT培地（ピポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン含有）で数週間
培養したのち、上記の完全無血清培地中で培養すると、
融合しなかったP3.653株は徐々に死滅してゆき、融合細
胞は死滅せず増殖を続けた。この結果、無血清培地中で
増殖可能な融合細胞を獲得することができた。
実施例２ 予めDHFR遺伝子発現ユニットおよびG418耐性遺伝子発
現ユニットを含む抗体遺伝子発現ベクターをP3X63Ag8.6
53株に導入して作製しておいた形質転換体とSp2/0株（A
TCC番号1581）を細胞融合して、無血清培地にて選択を
行い、さらにMTX（メトトレキセート）を含む上記無血
清培地中で培養し、約２週間後に、ペルオキシダーゼ標
識抗IgG抗体を用いたEIA法を行って培養上清の抗体を調
べた。その結果、融合していない形質転換体は無血清培
地中では増殖できずに死滅した。一方融合しなかったSp
2/0株は、MTXおよびG418を含む無血清培地中で生育でき
ずに死滅し、融合細胞はMTXを含む無血清培地で生存
し、その結果、目的の抗体を大量に発現するクローンを
極めて効率よく得ることができた。また、実施例１では
融合細胞をHAT培地等の選択培地で培養しなければなら
ずクローニングに時間を要したが、実施例２では短時間
に目的のクローンを得ることができた。
実施例３ マウスハイブリドームSp2/0株は無血清培地に容易に
順化し、製造レベルでの無血清培養を可能にする。しか
もSp2/0株は抗体非分泌であるから、P3X63Ag8.653との
融合によってSp2/0の増殖性とP3X63Ag8.653の高遺伝子
導入率及び高発現効率の両者の特性を持った外来遺伝子
導入用の宿主ができる。
本発明の方法に準じて両者を細胞融合したのち、24穴
プレートの無血清培地中で培地交換をしながら約２ヶ月
間培養を行った。増殖のよいプールを選んで、10％牛胎
児血清を含むRPMI1640培地にてクローニングを実施し
た。96穴プレートより融合細胞単一クローンのウェルを
選んで24穴プレートへ細胞を拡張した。５％牛胎児血清
を含む無血清培地で増殖してきたら、完全無血清培地で
培地交換していった。得られた融合細胞クローンについ
て細胞数を計測し、リポフェクチンを用いて遺伝子導入
試験を実施した。その結果、無血清培地で増殖し、かつ
P3X63Ag8.653株と同等の発現効率を示すものが獲得され
た（表２）。対照として、P3X63Ag8.653自体では、無血
清培地中で増殖できず、Sp2/0では増殖性は有するが抗
体産生能は著しく低かった。
上記で得られた融合細胞を利用して、DHFR遺伝子を組
み込んだ組換え抗体を作製し、抗体産生の安定性を調べ
た。クローンによって抗体産生能の安定性は様々である
が、上記のうち比較的安定なクローンは、MTX存在下に
おいて600Lスケールまでの大量培養を行ったが、抗体の
産生能の低下は認められなかった。
実施例４ 上記で得られた融合細胞を利用して組換え蛋白質の発
現能力を調べた。図２および図３は組換え抗体Ｈ鎖およ
びＬ鎖をコードする発現ベクターの構造を示している。
実施例３で得られた融合細胞のうち、クローン番号34の
細胞にこれら２種類の発現遺伝子導入を試みた。すなわ
ち、抗体ＨおよびＬ鎖発現プラスミド10μｇをLipofect
in（BRL）50μｌと混ぜて106個の細胞にトランスフェク
ションした。３日目より1mg/ml G418,0.25×10-7M MTX,
5％牛胎児血清を含むRPMI1640培地で形質転換体を選別
した。選別後、形質転換細胞を限界希釈法によりクロー
ニングし抗体産生細胞（「83−２−10」と命名）を得
た。
この細胞を無血清培地で培養したが、細胞は死滅する
ことなく良好に増殖した。小スケールでの培養の結果で
は、最高到達細胞密度は1.5×106/ml（生存率92％）、
倍加時間はおよそ16時間であった。
実施例５ 実施例４で得た83−２−10細胞を無血清培地で600リ
ットルの大スケール培養を試みた。図４は細胞の増殖曲
線および培養上清中に発現される抗体量の推移を示した
ものである。本細胞は無血清培地中でも良好に増殖し、
最高到達細胞密度は1.45×106cells/mlであった。また
１日１細胞あたりの抗体産生量は20pg/cells dayであっ
た。
実施例６ 上記で得られた融合細胞を利用した発現細胞の遺伝子
増幅能力を調べた。組換え抗体Ｈ鎖およびＬ鎖をコード
する発現ベクターを、実施例３で得られた融合細胞のう
ちクローン番号34の細胞に導入した。すなわち、pSV2−
neoに抗体Ｈ鎖遺伝子を、またpSV2−dhfrに抗体Ｌ鎖遺
伝子を、組み込んだ発現プラスミド10μｇを、Lipofect
in（BRL）50μｌと混ぜて106個の細胞にトランスフェク
ションした。３日目より1mg/ml G418,0.25×10-7M MTX,
5％牛胎児血清を含むRPMI1640培地で形質転換体を選別
した。選別後、形質転換細胞を限界希釈法によりクロー
ニングし、抗体産生細胞SP119−2,3,7,10,15および16を
得た。
次にこれら６種類の細胞を、1mg/ml G418,1×10-7M M
TX,5％牛胎児血清を含むRPMI1640培地で培養した。１カ
月後、耐性株の培養上清中に発現する抗体濃度を酵素抗
体法で測定し、遺伝子増幅前のそれと比較した。下記表
３にその結果を示す。
上記から明らかなように、培地中のMTX濃度を４倍に
上昇させ遺伝子増幅を行うことによって、多いもので10
倍の抗体発現量の増加が観察された。
これらのことよりクローン番号34細胞は遺伝子増幅に
も充分使える細胞であることが分かった。
従って、実施例４、５に示した82−３−10細胞を遺伝
子増幅させればさらに高い発現量が期待できる。
産業上の利用可能性 本発明の産生方法により、外来遺伝子、特に組換え抗
体遺伝子を発現させる場合に、無血清培養により目的の
組換え抗体等を無血清培地中に大量に安定的に産生させ
ることが可能となり、目的の外来蛋白質の精製が極めて
容易となり、これまでにない優れた外来蛋白質の産生方
法が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 時吉 幸男 熊本県熊本市若葉３丁目14―19 (56)参考文献 特表 昭62−502377（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．141, Ｎｏ．11（1988）ｐ．4053−4060 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】マウスミエローマと無血清培地で培養可能
    な雑種細胞とを融合して得られる、無血清培地で培養可
    能な融合細胞を発現宿主細胞として用い、該融合細胞を
    無血清培地で培養することにより、該融合細胞に組み込
    まれた外来蛋白質産生遺伝子を発現させ、培地中から該
    外来蛋白質を回収することを特徴とする外来蛋白質の産
    生方法。
  2. 【請求項２】外来蛋白質産生遺伝子が、融合される前の
    マウスミエローマに組み込まれる請求項１の産生方法。
  3. 【請求項３】外来蛋白質産生遺伝子が、融合された後の
    融合細胞に組み込まれる請求項１の産生方法。
  4. 【請求項４】マウスミエローマが、P3X63Ag8.653株であ
    る請求項１の産生方法。
  5. 【請求項５】雑種細胞が、ミエローマとリンパ系細胞と
    から調製されたリンパ系雑種細胞である請求項１の産生
    方法。
  6. 【請求項６】雑種細胞が、雑種細胞Sp2/0株である請求
    項１または５の産生方法。
  7. 【請求項７】外来蛋白質が、組換え抗体である請求項１
    の産生方法。
  8. 【請求項８】組換え抗体が、そのアミノ酸配列として、
    マウス以外の動物種の抗体由来のアミノ酸配列を少なく
    ともその一部に有する請求項７の産生方法。
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