MXPA01005783A - Celula huesped hibrida de humano para expresion de gen de mamifero - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a células humanas/híbridas de humanos se elaboraron por fusión de células de riñón embriónico humano (293S) y células de linfoma de Burkitt modificadas (2B8). Las células de fusión sonútiles como células huésped para la expresión recombinante de genes de mamíferos. Las ventajas de utilizar estos clones híbridos de riñón humano y células-B denominadas HKBs, para expresión de gen de mamífero, incluyen (i) las células son negativas para expresión de inmunoglobulina, (ii) las células se desarrollan fácilmente en medio libre de proteína de plasma (con o sin la adición de insulina recombinante) como cultivo de suspensión en un matraz de agitación o en un fermentador (iii) las células son muy susceptibles para transfección de ADN, y (iv) las células secretan altos niveles de proteínas recombinantes heterólogas, tales como anticuerpos monoclonales recombinantes, ICAM-1 soluble, rIL-4, y rFVIII.

Description

CÉLULA HUÉSPED HÍBRIDA DE HUMANO PARA EXPRESIÓN DE GEN DE MAMÍFERO Solicitudes Relacionadas: La solicitud de Cho y Chan designada MSB-7254 (solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 09/209,915), "Vectors Having Terminal Repeat Sequence of Epstein-Barr Virus" (Vectores que tienen Secuencia Repetitiva Terminal de virus Epstein-Barr) y la solicitud de Cho y colaboradores, designada MSB-7255 (solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 09/209,916), "Expression system for factor VIII" (Sistema de Expresión para Factor VIII) contienen materia relacionada. Ambas solicitudes se presentaron en Diciembre 10, 1998. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo : Esta invención se refiere en general a líneas de célula de mamífero sometidas a ingeniería genética para la producción de proteína biológicamente activa. Específicamente, la invención trata con clones células híbridas de humano derivados de proceso de fusión de células de riñon embriónico humano (293S) y células de linfoma de Burkitt. Estas células híbridas de humano pueden utilizarse para la producción de proteínas heterólogas.

Antecedentes : A la fecha, la mayoría de las proteínas recombinantes terapéuticas se han producido a partir de células de mamíferos no humanos. Algunos ejemplos son: Células de ovario de hámster chino (CHO = Chínese hámster ovary) (dhfr-) (Urlaub y colaboradores, 1980, Proc Nati Acad Sci USA 77: 4216-4220) con el marcador de selección amplificable dihidrofolato reductasa (Kaufman y colaboradores, 1982, Mol. Biol. 159: 601-621; Gasser y colaboradores, 1982, Proc Nati Acad Sci USA 79: 6522-6526) se han empleado para la producción de proteína recombinante terapéutica . Una variedad de proteínas recombinantes terapéuticas se conoce que se produce en células de mamífero, por ejemplo, factor recombinante VIII (rFVIII) (Kaufman y colaboradores, 1988, J Biol Chem 263: 6352-6362), activador de plasminógeno de tejido (tPA) (patente de los E.U.A. No. 4,766,075 otorgada a Goeddel y colaboradores, 1988), eritropoyetina (EPO) (patente de los E.U.A. No. 4,703,008 otorgada a Lin. 1987), y anticuerpos monoclonales (mAbs) (patente de los E.U.A. No. 4,816,397 otorgada a Boss y colaboradores, 1989) . Se emplearon células de riñon de hámster bebé (BHK) (BHK21) para la producción de rFVIII después de selección G418 y amplificación con metotrexato (MTX) de células resistentes a G418 (patente de los E.U.A. No. 4 , 965 ,199 otorgada a Capón y colaboradores, 1990) . La mayoría de las células de mieloma (NSO) se emplearon para la producción de anticuerpos anti-TNF humano sometido a ingeniería (EHAT) . (La patente de los E.U.A. No. 4,816,397 otorgada a Boss y colaboradores, 1989). Sin embargo, esa línea celular produce proteínas que tienen patrones de carbohidrato específicos que no son favorecidos para uso humano . Una línea celular humana, Namalwa (de origen de linfoma de Burkitt) , se emplea para producción de alfa-interferona por Wellcome Research Laboratory y para la producción de pro-urocinasa (Satoh y colaboradores, 1996, Cytotechnology (Citotecnología) 18: 167- 185, 1996), activador de plasminógeno de tejido (t-PA) (Khan y colaboradores, 1995, Biochem Soc Trans 23: S99), factor estimulante de colonias de granulocito-macrófagos (Okamoto y colaboradores, 1991, Arch Biochem Biophys 286: 562-568), interferonas y linfotoxina (Hosoi y colaboradores, 1991, Cytotechnology 5: 17-34), y factor estimulante de colonia de granulocito (Hosoi y colaboradores, 1991, Cytotechnology 7: 25-32) por Tokyo Research Laboratories. Sin embargo, estas células fueron muy difíciles de transfectar con ADN.

Walls y colaboradores, (1989, Gene 81: 139-149) han reportado el uso de la estrategia de co-amplificación dhfr/MTX para expresar proteína C funcional en células de riñon embriónicas humanas (células 293S) . Las células 293 (Stillman y colaboradores, 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 2051-2060) se conoce que hacen grandes agregados en suspensión, especialmente bajo alta concentración de calcio (> 100 µM) , que promueve mayor agregación y menor viabilidad celular (Peshwa y colaboradores, 1993, Biotech and Bioeng 41: 179-187). Todas las referencias citadas aquí se incorporan. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Clones de células humanas hibridizadas ahora se ha establecido que se transfectan fácilmente por electropuración o liposoma catiónico y que se adaptan fácilmente a crecimiento en cultivo de suspensión. Pueden expresarse proteínas heterólogas utilizando bajos niveles (50-100 nM) de amplificación MTX en un ambiente de células humanas. Además, las células se adaptan fácilmente a crecimiento en medio libre de suero. Estas células son el producto de una fusión entre células de riñon embriónico humano (293S) y células de linfoma de Burkitt. Ver Figura 1 para el compendio. Estos clones híbridos, denominados HKBs, alojan un genoma EBV defectuoso derivado de HH514-16, que es una línea celular que se origina de las células de linfoma de Burkitt, P3HR1 (Hinuma y colaboradores, 1967, J Virol 1: 1045-1051) . Las células P3HR1 hospedan EBV no inmortalizante. HH514-16 es un clon de P3HR1 (Hinuma y colaboradores, 1967, J Virol 1: 1045-1051) que hospeda EBV no inmortalizante. HH514-16 ha perdido un het -ADN un ADN que interrumpe latencia, durante el proceso de clonación (Rabson y colaboradores, 1983, Proc Nati Acad Sci USA 87: 3660-3664). Por lo tanto, EBV de clones HKB es un virus no inmortalizante y permanece como una latencia. HKBs son células huésped híbridas de humano adecuadas para la producción recombinante de proteínas terapéuticas. Estas células huésped se obtienen por la hibridización de diferentes líneas celulares padre, cada una que tiene diferentes características ventajosas. Las células huésped que poseen características ventajosas de cada una de las líneas celulares padre se obtienen de las células que resultan de la hibridización. Las células huésped pueden someterse a ingeniería genética para expresar altos niveles de un amplio rango de proteínas. Proteínas que pueden producirse por las células huésped de ingeniería incluyen pero no están limitadas a ICAM-1 soluble, interleucina-4 recombinante (IL-4), tPA, EPO, rFVIII, y BDD-FVIII (variantes eliminadas de dominio B de Factor VIII), y derivados de estas proteínas. El factor VIII tiene una organización de dominio de A1-A2-B-A3-C1-C2 y se sintetiza como un polipéptido de cadena sencilla de 2351 amino ácidos, de los cuales un péptido de señal de 19-amino ácidos se escinde ante traslocación en el lumen del retículo endoplásmico . Debido al hecho de que el factor VIII está fuertemente glicosilado, la expresión de alto nivel (>0.2 pg/c/d) del factor VIII ha sido difícil de lograr (Lind y colaboradores, 1995, Eur J Biochem 232: 19-27; Kaufman y colaboradores, 1989, Mol Cell. Biol. 9: 1233-1242). La expresión de factor VIII en células de mamífero típicamente es de 2-3 órdenes de magnitud inferior que la observada con otros genes que utilizan similares vectores y enfoques. La productividad de líneas celulares de producción para factor VIII ha estado en el rango de 0.5 -1 U/c/d (0.1 - 0.2 pg/c/d) . Se ha demostrado que el dominio B del factor VIII es prescindible para actividad de procoagulación. Utilizando variantes truncadas de factor VIII, una expresión mejorada del factor VIII en células de mamífero se ha reportado por diversos grupos (Lind y colaboradores, 1995, Eur J Biochem 232: 19-27; Taj ima y colaboradores, 1990, Proc 6th Int Symp H.T. p.51-63; patente de los E.U.A.

No. 5,661,008 otorgada a Almstedt, 1997). Sin embargo, el nivel de expresión de las variantes del factor VIII permanece inferior a 1 pg/c/d desde un clon de célula estable. También se ha encontrado que, aunque no se expresó inmunoglobulina endógena (Ig), la expresión Ig recombinante de las células huésped de ingeniería era elevada. Proteínas producidas a partir de células HKB11 tienen perfil de glicosilación específico de humano. Por lo tanto, los clones son células huésped óptimas para la producción de Ig de ingeniería de genes y otras proteínas. Como se emplea aquí, una célula de origen de linfoma de Burkitt es una célula de linfoma de Burkitt, derivada de una célula de linfoma de Burkitt, derivada de otra célula de origen de linfoma Burkitt o una célula que resulta de división mitótica de cualquiera de las anteriores. "Derivado (a) de" en este contexto se pretende que incluya, pero no limitado a, división de células mitóticas normales y procesos tales como transfecciones, fusiones celulares, u otras técnicas de biología celular o ingeniería genética empleadas para alterar células o producir células con nuevas propiedades. Similarmente, una célula de origen de riñon embriónico humano es una célula de riñon embriónica humana, derivada de una célula de riñon embriónico humano, derivada de otra célula de origen de riñon embriónico humano, o una célula resultante de una división mitótica de cualquiera de las anteriores. También, una célula de origen 293S es una célula 293S, derivada de una célula 293S, derivada de otra célula de origen 293S o una célula que resulta de la división mitótica de cualquiera de las anteriores. También, una célula de origen 2B8 es una célula 2B8 derivada de una célula 2B8, derivada de otra célula de origen 2B8, o una célula que resulta de la división mitótica de cualquiera de las anteriores. Una proteína heteróloga es una proteína que una célula se ha sometido a ingeniería para producir. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un resumen de la derivación de las células HKB. La Figura 2 muestra mapas físicos de vectores de expresión mencionados en el texto. Todos los plásmidos se construyen con base en una estructura principal pBR322 y contienen una unidad de expresión dhfr. Todos los genes que codifican proteínas de interés están bajo la regulación de mej orador/promotor CMV (CMVe/p) ; el intron 5' (MIS o CIS) se coloca en el extremo 5' de los genes, excepto BZLF1. la región de señal Poli A se indica como pA. Ambos plásmidos pSH157 y pCIS25DTR, contiene una secuencia de EBV-TR (402 bp) . La Figura 3 muestra una comparación de líneas de células huésped para expresión de genes en ensayo de transfección transitorio. Se realizaron transfecciones bajo las mismas condiciones: el mismo número de células de 293S, 2B8, y HKB11 se transfectaron con la misma cantidad de ADNs de plásmido utilizando el mismo agente de transfección. Fluidos de cultivo de tejido se cosecharon a 2 días después transfección. Se determinaron niveles de producción de proteína por ELISA (IgG y ICAM-1; medido como ng de proteína/106 células/2 días) y por el equipo de ensayo CoatestMR (rFVIII; medido como miliunidades/107 células/2 días) . MODALIDADES ESPECÍFICAS Materiales y Métodos HH514-16 se proporcionó amablemente por el Dr. George Miller (Yale University) . Células 293S se obtuvieron de Dr. Brad Zerler (Molecular Therapeutic Institute, West Heaven, CT) , las células 293S son células 293 (ATCC CRL-1573) que se han adaptado para crecer en cultivo de suspensión (Stillman y colaboradores, 1985, Mol Cell. Biol 5: 2051-2060). Plásmidos Todos los vectores de expresión empleados en este reporte básicamente fueron plásmido basado en pBR322 con función de segmento de expresión de gen dhfr. Mapas físicos de vectores de expresión se describen en la Figura 2. Plásmidos, pSH157 y pCIS25DTR, también tienen secuencia de repetición de terminal de virus Epstein-Barr (EBV-TR) .

Ver la solicitud de patente otorgada a Cho y Chan designada a MSB-7254, "Terminal repeat sequence of Epstein-Barr virus enhances drug selection ratio" (Secuencia de repetición de terminal de virus Epstein-Barr mejora la proporción de selección de droga) , para la secuencia EBV-TR. El vector pSH131, que se ha depositado con la Colección de Cultivos Tipo Americana (American Type Culture Collection) ATCC 98879, puede emplearse para generar vectores de expresión para una proteína selecta como se describe por Cho y Chan (MSB-7254, arriba) ELISA Para medir la secreción de tICAM-1, un anticuerpo monoclonal a ICAM-1, C92.5 (McClelland y colaboradores, 1991, Proc Nati Acad Sci USA 88: 7993-7997) se adsorbe sobre placas de microtitulación de fondo redondo. Las placas se bloquearon por tratamiento con una solución de salino amortiguado con fosfato (PBS = Phosphate Buffered Saline) que contiene albúmina de suero bovino al 1% (BSA = Bovine Serum Albumin) , luego incubaron con muestras que contienen tICAM-1. Las placas luego se lavaron con amortiguador de lavado (PBS más 0.005 % Tween 20) e incubaron con C78.5 biotinilado, un segundo anticuerpo monoclonal a un epítope diferente en tICAM-1 (McClelland y colaboradores, 1991, arriba) . Después de lavar, las placas se incubaron con HRP-estreptavidina . Las placas luego se lavaron con amortiguador de lavado, reaccionaron con tetrametil benzidina (TMB) , y la reacción se detuvo con HCl 1 N. La concentración de tICAM-1 se determina al leer el OD a 450/570 nm y comparar con una curva standard de tICAM-1 purificado. Para medir la secreción de inmunoglobulina (Ig), anticuerpo anti-Ig se emplea para revestir la placa y anticuerpo anti-Ig biotinilado se utiliza como un anticuerpo de detección. Una concentración conocida de molécula de Ig se emplea como una norma. De otra forma, el proceso permanece igual . Para medir la secreción de interleucina-4 (IL-4) , anticuerpo anti-IL-4 se utiliza para revestir la placa y anticuerpo anti-IL-4 biotinilado se utiliza como un anticuerpo de detección. Una molécula IL-4 purificada se utiliza como una norma. Ensayo para medir secreción de rFVIII La molécula rFVIII se cuantificó con reactivos del Equipo CoatestMR VIII :C/4 (Chromogenix, Mólndal, Suecia) . Un factor anti-hemofílico standard de los E.U.A. (factor VIII) conocido como MEGA 1 (Office of Biologics Research and Review, Bethesda, MD) , se utiliza como la norma de medición a placas EIA/RIA A/2 (Corning, Corning, NY ) pre-calienta a 37°C en Bloques Térmicos de Selección (Select Heat Blocks) (VWR Scientific, San Francisco, CA) . Factor IXa, factor X, fosfolípido y CaCl2 se agregaron a cada muestra e incubaron por 10 minutos para la activación del factor X. Un substrato cromogénico (S2222) luego se agrega e incuba por 10 minutos para liberar el grupo cromogénico pNA. Esta reacción se detiene por la adición de ácido acético al 50%. La absorbancia colorimétrica luego se mide a 405/450 nm en un lector de microplacas espectrofotómetro SPECTRAmaxMR 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y los datos se calculan con un soporte lógico SOFTmaxMR PRO que se proporciona por Molecular Devices . Derivación de línea celular de linfoma de Burkitt resistente a G418 y sensible a HAT Para obtener células sensibles a HAT, líneas celulares deficientes en hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa (HGPRT) (Szybalska y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48: 2026-2034, 1962; Littlefield, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 50: 568-576, 1963) se establecieron por el protocolo standard descrito por Siadak y colaboradores, (patente de los E.U.A. No. 4,834,975, 1989). Células HH514-16 (obtenidas de Dr . G. Miller, Yale University) , que están libres de het-ADN EBV (Rabson y colaboradores, 1983, Proc Nati Acad Sci USA 87: 3660-3664), se trataron con 300 µg/ml de etil éster de ácido metansulfónico (MSE) (Sigma, St . Louis, MO) en medio de suspensión RPMI-1640 (Life Science, Gaithersburg, MD) suplementado con suero bovino fetal al 15% (FBS) (Hyclone, Logan, UT) por 24 horas. Después de lavar las células con medio, se revistieron células en medio que contiene 6-tioguanina (6TG) (Sigma) (5 µg/ml) para seleccionar células negativas HGPRT. La concentración de 6TG se incrementa de 5 µg/ml a 30 µg/ml durante el período de selección de seis meses. Las células luego se probaron por su sensibilidad al medio que contiene HAT. clones de célula sencilla (SCCs) se obtienen de clonación con dilución limitante (una célula por pozo en placas de 96-pozos) de población sensible a HAT A5. Una de las SCCs, A5/ID7, se transfecta con pSV2neo, que tiene el neo gen bajo el promotor SV40 en el vector pBR, para obtener células resistentes a G418. Una de las SCCs resistentes a G418 (1.5 mg/ml) referido como 2B8 (depositado con la Colección de Cultivos Tipo Americano, No. CRL-12569), se emplea para fusión. EJEMPLO 1 Fusión de células y derivación de clones de célula sencilla Fusión de célula se realiza primordialmente de acuerdo con el método de fusión de polietilen glicol (PEG) descrito por Kennett (1979, Meth Enzymol 58: 5-359) . Cinco millones de cada una de células 293S y 2B8 en crecimiento logarítmico se lavaron con PBS sin Ca++ y Mg++ (Life Technologies, Rockville, MD) y sembraron sobre un pozo de una placa de 6 pozos pre-tratada con aglutinina de cacahuate (Sigma) (5 µg/ml) . Las placas de 6-pozos cargadas con células se centrifugaron a 400 g por 6 minutos en una centrífuga Beckman J-6M/E (Beckman, Palo Alto, CA) . Después de retirar el PBS del pozo, se trataron células con 2 ml de PEG al 40% (p/v) (Sigma) por un minuto. Como un control, un pozo no se trató con PEG. Las células se lavaron tres veces con 5 ml de PBS que contiene DMSO al 5% seguido por tres lavados de PBS. Se incubaron células con medio fresco suplementado con FBS al 15% por 25 minutos. Se sembraron células en placas de 96-pozos (1.2 x 106 células por placa) utilizando el medio fresco que contiene G418 (1 mg/ml) y HAT (Life Technology) suplementado con FBS al 15%. Las células se alimentaron dos veces a la semana utilizando el medio de selección. En este ejemplo, para la selección inicial, las células 293S tuvieron la característica conveniente de carecer de sensibilidad al medio que contiene HAT, y de manera semejante, las células 2B8 tuvieron la característica conveniente de ser resistentes a G418.

Mientras que las células fusionadas crecieron bajo condiciones selectivas, las células mixtas no crecen bajo las mismas condiciones. Tres semanas después de selección, las poblaciones iniciales se transfirieron a formatos más grandes. Para obtener SCCs, la población inicial de veinte creciente en forma estable se mezcló y sometió a clonación de dilución limitante (una célula por pozo) utilizando el medio selectivo. Diecinueve SCCs se seleccionaron de 15 placas x 96 pozos después de verificación cuidadosa de los clones individuales utilizando un microscopio. Los SCCs derivados del experimento de fusión se refirieron como células HKB (células híbridas de células de riñon humano y B) . Siete SCCs se seleccionaron del estudio de transfección. Estas siete SCCs se probaron adicionalmente para la producción estable de diversas proteínas. Una de las siete SCCs, HKBll, se seleccionó como una célula huésped de mamífero preferida para la producción de proteínas heterólogas . Ver Figura 1 para el resumen EJEMPLO 2 Caracterización de clones HKB Aunque todas las células híbridas se seleccionaron bajo condiciones selectivas, el estado híbrido se confirma al contar los números de cromosomas en células. Sin duda, todas las HKBs mostraron un número de cromosomas modal de 90-110. Estos números fueron similares con la suma de números de cromosomas modales de 293S y 2B8 (64 y 47, respectivamente de acuerdo con datos ATCC) . 293S (Stillman y colaboradores, ]985, Mol Cell Biol 5: 2051-2060) es 293 adaptada en suspensión (ATCC CRL-1573) . Todos los clones de célula híbrida se probaron para expresión de Ig endógena (mu y kappa) por ensayo de inmunofluorescencia directo utilizando células fijas con metanol para determinar que clones celulares secretan Ig endógeno. En experimentos repetidos sobre un más largo período, estas células se observaron como negativas para la expresión de cadenas mu- y kappa-, con base en prueba de inmunofluorescencia (Tabla 1) y ELISA (datos no mostrados) . Tabla 1. Detección de expresión de Ig-gen Expresión de genes Células Cadena pesada (mu) Cadena Ligera (kappa) 293S negativo negativo 2 2BB88 ppoossiittiivvoo positivo HKB negativo negativo La Tabla 1 muestra los resultados que se observan de la prueba de inmunofluorescencia de tres tipos de células. Las células se resuspendieron en PBS y aplicaron como frotis en un porta-objetos de vidrio. Después de secar las células, los porta-objetos se fijaron en metanol en frío (-20°C) por 5 minutos. Las células se tiñeron con cadenas kappa FITC antihumano y mu antihumano (1:20 dilución) (Zymed Laboratories, Inc., So. San Francisco, CA) en una cámara humidificada a 37°C por 45 minutos. Después de enjuagar los porta-objetos con PBS por 10 minutos, se montaron porta-objetos con cubre objetos utilizando PBS/Glicerol (1:1). Se observaron células en un microscopio de fluorescencia (Cari Zeiss, Inc., Thornwood, NY) . El patrón específico humano de enlace de ácido siálico, alfa (2-6) sialiltransferasa se confirma por análisis FACS de las células HKB utilizando lectina de Sambucus nigra conjugada con FITC (SNA) (Sigma, St . Louis, MO) . Proteínas secretadas de las células HKB (clon IG2) mostraron enlace alfa (2-3) y alfa (2-6) de ácido siálico de perfil de glicosilación analizado por el método de impresión de huella de oligosacárido (datos no mostrados) . Esta observación indica que células HKB derivadas de fusión de células 293S y 2B8 mantienen enzimas de glicosilación específicas de humano.

Para probar si estas células híbridas tienen la capacidad por expresar genes extraños, las células se transfectaron con vectores de expresión para ICAM-1 y IgG (anticuerpo anti-TNF) . Para probar la secreción de IgG, células HKB (5 x 106 células) se transfectaron por electroporación con 10 µg de ADN plásmido proporcionando la expresión funcional de cadenas pesadas (gamma) y ligeras (kappa) . Para probar niveles de secreción de ICAM-1 soluble, células HKB (5 x 10d células) se transfectaron por electroporación con 10 µg de ADN plásmido, proporcionando la expresión funcional de ICAM-1 soluble. Niveles de secreción se determinaron por ELISA para IgG o ICAM-1. Todos los 19 SCCs secretaron niveles relativamente elevados de ICAM-1 (100-500 ng/ml/2d) y IgG (30-200 ng/ml/2d) en una ensayo de transfección transitorio (Tabla 2) . Estos datos indican que las células híbridas soportan la expresión de genes Ig transfectados , aunque se extinguió la expresión de Ig endógena . Virus Epstein Barr (EBV) existen como episoma en células 2B8. Todos los SCCs fueron positivos para expresión EBNA-1 (datos no mostrados) , que indican que son positivos para EBV. Sin embargo, no se sabía si aún existe un genoma EBV completo en las células híbridas . Tabla 2. Ensayos de transfección transitoria para la secreción de IgG e ICAM soluble a partir de clones HKB que se obtienen temprano después del proceso de clonación. Los valores son niveles de secreción de proteína (ng/ml/2d) . nd = no realizado Por lo tanto, el estado del genoma EBV en las células híbridas se probó por transfección de las células con fragmento de genoma EBV BZLF1, un gen de trans-activación que interrumpe latencia. Células HKB (5 x 106 células) se transfectaron con 10 µG de ADN plásmido (pSH121) permitiendo expresión funcional de BZLF1. Detección de antígeno de cápsido de EBV (EBV-VCA) se realiza inmunofluorescencia indirecta utilizando suero humano que contiene título anti EBV-VCA e IgG anti-humano conjugado FITC. Detalles técnicos de la prueba de inmunofluorescencia se describieron anteriormente . Como se ilustra en la Tabla 3, células transfectadas de mímica fueron negativas para expresión de antígeno de cápsido EBV (EBV-VCA) , que indica que fueron negativas para replicación EBV. Sin embargo, un pequeño porcentaje de las células transfectadas es positivo para la expresión de antígeno. Estos datos indican que las células híbridas hospedan el genoma EBV en su forma latente. Tabla 3. Inducción de replicación EBV por transfección con BZLF1.

Las células híbridas se adaptaron a medio libre de suero por reducción doble en serie de FBS en matraces de agitación. Después de dos semanas, se desarrollaron células en el medio sin FBS. Las células se desarrollaron como pequeños agregados en matraces de agitación. En contraste a células 293S, las células híbridas fueron fácilmente adaptables a cultivos de suspensión libre de suero. Células híbridas en medio libre de suero y libre de albúmina suplementado con transferina e insulina pudieron mantenerse por más de un año en cultivo de suspensión utilizando matraces de agitación. Para comparar niveles de secreción de productos de gen transfectado, uno de los clones, HKBll, y las células padre, 293S y 2B8, se transfectaron con pSM98 (ICAM-1 soluble) , pSH125 (anti-TNF IgG) , y pCISF8 (rFVIII) . Como se ilustra en la Figura 3, los niveles de secreción de ICAM-1 y IgG fueron muy superiores (aproximadamente 10 veces) en células HKBll que las células 293S. Niveles de secreción de ambas proteínas a partir de 2B8 fueron indetectables . Niveles de secreción de rFVIII en células HKBll fueron similares a aquéllos de células 293S. Estos datos indican la eficiencia de transfección de células HKBll son mucho mejores en las células padre. EJEMPLO 3 Derivación de clones HKB estables que secretan proteínas heterólogas Clones híbridos se probaron para la expresión estable de proteínas en un sistema amplificable por genes (dhfr/MTX) . Células primero se transfectaron con un vector de expresión apropiado, y luego las células transfectadas (usualmente 106 células por placa de 96-pozos) se sembraron y seleccionaron/amplificaron con el medio de selección que carece de hipoxantina y timidina, pero suplementado con FBS y MTX (50 nM) . Después de la primer clasificación de las placas, las células de los pozos de alta secreción se seleccionaron y transfirieron a las placas de 6 pozos. Las células en placas de 6 pozos se amplificaron adicionalmente con concentraciones incrementadas de MTX (100, 200, y 400 nM) en medio. Las poblaciones iniciales de las placas de 6 pozos se clasificaron adicionalmente para derivar la mejor población. Eventualmente, estas poblaciones se emplearon para clonar clones derivados de célula simple.

Como se ilustra en la Tabla 4, células HKBll fueron óptimas para producir altos niveles de proteínas humanas heterólogas. Para la producción de ICAM-1, Ig, y un derivado IL-4, células HKBll fueron tan buenas como células CHO (los datos no se muestran) . Sin embargo, clones HKB crecieron más rápido que clones CHO y pudieron adaptarse fácilmente a un cultivo de suspensión y a condiciones libres de suero. En caso de producción de BDD-FVIII, clones HKBll mostraron aproximadamente una productividad diez veces mayor que los clones CHO. Los resultados anteriores indican que las células HKBll son huéspedes de células útiles óptimas para la expresión de proteínas terapéuticas humanas. Tabla 4. Producción de proteínas heterólogas a partir de clones HKB. Proteína Célula ampl if icación Productividad huésped MTX especí f ica ICAM- 1 HKBll 100 nM 10 pg/c/d11 Ig HKB13 50 nM 12 pg/c/d BDD- FVI I I HKBll 400 nM 5 - 10 uU/c/d2 ) IL- 4SA HKBll 100 nM 5 pg/c/d3 ) 1 ) Nivel de producción ICAM- 1 a partir de clones HKB fueron similares con aquél los de células 293S . Clon HECB que secreta ICAM-1 se adapta fácilmente a cultivo de suspensión, mientras que clones 293S fueron muy difíciles de adaptar a cultivo de suspensión. 2) El nivel de secreción de BDD-FVIII fue aproximadamente 10 veces superior que aquél de clones derivados de células de CHO transfectados con el mismo vector de expresión. 3) Cantidad en gramos de producción de IL-4SA(T13D/R12IE) fue posible 6 meses posteriores a transfección utilizando HKBll, mientras que tardó unos cuanto meses más utilizando células CHO en experimentos simultáneos utilizando el mismo vector de expresión y proceso similar. Las líneas celulares derivadas por el proceso anterior incluyen (i) clones que secretan ICAM-1 soluble (10 pg/célula/día) derivado de células de HKBll transfectado con pSM98 después de amplificación en 100 nM MTX (ii) clones de célula sencilla que secretan anticuerpo monoclonal (anti-TNF) (12 pg/célula/día) derivado de HKB13 transfectada con pSS125 después de amplificación en 50 nM MTX y clonación de dilución limitante sin MTX, (iii) clones de célula sencilla que secretan rFVIII (BDD-FVIII) truncado (5-10 µU/c/d, en condición libre de suero) derivada de células HKBll transfectadas con pCIS25DTR después de amplificación (400 nM MTX) y clonación con dilución limitante sin MTX, y (iv) clones que secreta derivado IL-4 (IL-4 agonista selectivo, IL-4SA; mutado dos posiciones de amino ácido, T13D y R121E) (5 pg/c/d) derivado de HKBll transfectado con pSH157 después de amplificación con MTX. El clon IL-4SA que secreta HKB, IG2 , se utiliza para producción relativamente rápida de pequeñas cantidades de proteína (cantidad en gramos) . Ver la Figura 2 para el mapa físico de los vectores de expresión anteriormente mencionados . DISCUSIÓN Las líneas de células humanas híbridas aquí descritas exhiben características convenientes que tienen sus líneas celulares padre. Líneas celulares padres HKB, que se producen por la fusión de células de riñon embriónico humano (o células derivadas de células de riñon embriónico humano) , con células de linfoma de Burkitt (o células derivadas de células de linfoma de Burkitt) son útiles para desarrollar líneas celulares para la expresión de proteínas heterólogas. El propósito inicial de establecer las líneas celulares híbridas de 293S y 2B8 fue resolver el problema de agregación de células de 293S, que tienden a aglomerarse cuando se desarrollan en medio de suspensión (una característica indeseable) . Las células HKB que se desarrollaron del proceso de hibridización crecen como una monocapa cuando se cultivan en matraces T. Sin embargo, estas células crecen como células de suspensión (no forman grandes agregados) cuando se cultivan en modo de suspensión. Células HKB fueron fáciles de manejar para transfección, y la eficiencia de transfección es muy superior que con células 293S. Aunque la transformación o el evento de hibridización requerido en la mayoría de los casos para producir una línea celular estable, puede resultar en perfiles de glicosilación alterados (Yamashita, 1989, J Biol Chem 264: 2415-2423), se encontró que HKBll, que es una línea celular híbrida somática, tiene enzimas de glisocilación humanas típicas, por ejemplo, alfa (2-3) y alfa (2-6) sialil transferasa. Aún más, proteínas producidas a partir de células HKB transfectadas tienen patrones de glicosilación humanos normales de enlaces de ácido alfa(2-3) y alfa(2-6) siálico. En resumen, HKBs son células humanas híbridas que tienen características convenientes de cada una de las líneas celulares padre; es decir crecen fácilmente en cultivo de suspensión sin agregación (como se observa con células 2B8) y características de facilidad de transfección y conveniente secreción (como se observa con células 293S) . La línea celular humana de hibridoma preferida HKBll, es negativa para expresión de gen de inmunoglobulina como las células 293S. Este rasgo es ventajoso en casos en donde se desea producir en forma recombinante anticuerpos monoclonales a partir de células humanas. El descubrimiento de que la fusión de células humanas ha resultado en células que tienen características ventajosas sirve para estimular mayores estudios de fusión utilizando 293S y otras líneas celulares de origen célula B, por ejemplo Namalwa y 6F11, para obtener nuevas combinaciones de rasgos en las células híbridas a partir de fusión de diferentes líneas celulares padre. Los ejemplos anteriores se pretende que ilustren la invención y se considera que se les ocurrirán a aquéllos con destreza en la especialidad variaciones. De acuerdo con esto, se pretende que el alcance de la invención habrá de limitarse solo por las reivindicaciones siguientes.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES 1. Una célula derivada de la fusión de una célula de origen de riñon embriónico humano con una célula de origen de linfoma de Burkitt.
2. 2. Una célula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la célula de origen de riñon embriónico humano es una célula de origen 293.
3. 3. Una célula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la célula de origen de riñon embriónico humano es una célula de origen 293S.
4. 4. Una célula de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la célula de origen de linfoma de Burkitt es una célula 2B8 (número de depósito ATCC: CRL-12569) .
5. 5. Una célula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque que expresa una proteína heteróloga.
6. 6. Una célula de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteína heteróloga se elige del grupo que consiste de FVIII, BDD-FVIII, anticuerpo monoclonal, anticuerpo anti-TNF, rIL4, tPA, y EPO.
7. 7. Una línea celular designada HKBll (ATCC número de depósito: CRL-12568) .
8. 8. Una línea celular que expresa una proteína heteróloga, la línea celular se deriva de la línea celular designada HKBll (número de depósito ATCC: CRL-12568) . 9. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína es
9. ICAM-1.
10. 10. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína es BDD-FVIII.
11. 11. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína es un anticuerpo monoclonal .
12. 12. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el anticuerpo monoclonal es anti-TNF.
13. 13. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína es rIL4.
14. 14. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína es FVIII.
15. 15. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína es tPA.
16. 16. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína es EPO.
17. 17. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína es IL-4SA (T13D/R121E) , la línea celular designada IG2 (número de depósito ATCC: PTA-87) .
18. 18. Una línea celular de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína es una proteína humana que tiene un perfil de glicosilación humano .
19. 19. Un método para producir células humanas híbridas útiles para expresión de una proteína heteróloga, caracterizado porque comprende las etapas de: a) obtener células de origen de riñon embriónico humano que tienen una primer característica conveniente, b) obtener células de origen de linfoma de Burkitt humano que tiene una segunda característica conveniente, c) contactar las células de la etapa a) con las células de la etapa b) bajo condiciones que permiten que ocurra fusión celular, d) clasificar las células que resultan de la etapa c) por células que exhiben al menos una característica conveniente de cada una de las células de etapas a) y b) .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las células de origen de riñon embriónico humano son células de origen
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las células de origen de riñon embriónico humano son células de 293S.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la célula de origen de linfoma de Burkitt es una célula 2B8 (número de depósito ATCC: CRL-12569) .