JP5826311B2

JP5826311B2 - 哺乳類遺伝子発現のためのヒトハイブリッド宿主細胞

Info

Publication number: JP5826311B2
Application number: JP2014032748A
Authority: JP
Inventors: ミユング−サム・チヨー
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 2014-02-24
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2019-12-08
Also published as: SK287888B6; CA2353698A1; WO2000034462A1; EP1137768B1; CU23382A3; ID30448A; TR200101642T2; HUP0104681A2; BR9916095A; IL143351A; SK7912001A3; CZ20012023A3; NO20012806D0; JP2009148295A; EP1137768A1; CU23238A1; DE69927707T2; BG105566A; EP1137768A4; AU757188B2

Description

本発明は一般的に、生物学的に活性なタンパク質の生産のために遺伝子操作された哺乳類細胞系に関する。特定的には、本発明はヒト胎児性腎臓（２９３Ｓ）細胞（以下、本明細書では、ヒト胚腎臓細胞ともいう）及びＢｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞の融合プロセスから誘導されるヒトハイブリッド細胞クローンに関する。これらのヒトハイブリッド細胞を異種タンパク質の生産のために用いることができる。

今日まで、ほとんどの治療用組換えタンパク質は非−ヒト哺乳類細胞から生産されてきた。いくつかの例を挙げる：

増幅可能な選択マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（非特許文献１および非特許文献２参照）を有するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（ｄｈｆｒ−）細胞（非特許文献３参照）が治療用組換えタンパク質の生産のために用いられてきた。

多様な組換え治療用タンパク質、例えば組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）（非特許文献４）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）（特許文献１）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）（特許文献２）及びモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（特許文献３）が哺乳類細胞において生産されることが既知である。

ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（ＢＨＫ２１）は、Ｇ４１８選択及びＧ４１８耐性細胞のメトトレキセート（ＭＴＸ）増幅の後に、ｒＦＶＩＩＩの生産に用いられた（特許文献４）。

マウス骨髄腫（ＮＳ０）細胞は操作されたヒト抗−ＴＮＦ抗体（ＥＨＡＴ）の生産に用いられた。（特許文献５）。しかしながらこの細胞系は、ヒトに用いるのに好ましくないマウス特異的炭水化物パターンを有するタンパク質を生産する。

ヒト細胞系、（Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫起源の）Ｎａｍａｌｗａは、ＷｅｌｌｃｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙによりアルファ−インターフェロンの生産に、ならびにＴｏｋｙｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによりプロウロキナーゼ（非特許文献５）、組織−プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）（非特許文献６）、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（非特許文献７）、インターフェロン及びリンホトキシン（非特許文献８）、及び顆粒球コロニー刺激因子（非特許文献９）の生産に用いられた。しかしながら、ＤＮＡを用いてこれらの細胞をトランスフェクションするのは非常に困難である。

非特許文献１０は、ヒト胚腎臓細胞（２９３Ｓ細胞）において機能性プロテインＣを発現するためのｄｈｆｒ／ＭＴＸ共−増幅戦略の使用につき報告している。２９３細胞（非特許文献１１）は懸濁液中で、特に高カルシウム濃度下で（＞１００μＭ）、大きな凝集体を形成することが知られており、それはより大きな凝集及びより低い細胞生存能を助長する（非特許文献１２）。引用したすべての参照文献は、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる。

米国特許第４，７６６，０７５号明細書米国特許第４，７０３，００８号明細書米国特許第４，８１６，３９７号明細書米国特許第４，９６５，１９９号明細書米国特許第４，８１６，３９７号明細書

Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．，１９８２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１Ｇａｓｓｅｒｅｔａｌ．，１９８２，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７９：６５２２−６５２６Ｕｒｌａｕｂｅｔａｌ．，１９８０，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７７：４２１６−４２２０Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．，１９８８，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６３：６３５２−６３６２Ｓａｔｏｈｅｔａｌ．，１９９６，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８：１６７−１８５，１９９６Ｋｈａｎｅｔａｌ．，１９９５，ＢｉｏｃｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ２３：Ｓ９９Ｏｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．，１９９１，ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ２８６：５６２−５６８Ｈｏｓｏｉｅｔａｌ．，１９９１，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：１７−３４Ｈｏｓｏｉｅｔａｌ．，１９９１，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：２５−３２Ｗａｌｌｓｅｔａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ８１：１３９−１４９Ｓｔｉｌｌｍａｎｅｔａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２０５１−２０６０Ｐｅｓｈｗａｅｔａｌ．，１９９３，ＢｉｏｔｅｃｈａｎｄＢｉｏｅｎｇ４１：１７９−１８７

今回、エレクトロポレーション又はカチオン性リポソームにより容易にトランスフェクションされ、懸濁培養における生育に容易に適応するハイブリッド形成されたヒト細胞のクローンが確立された。ヒト細胞環境で低レベル（５０〜１００ｎＭ）のＭＴＸ増幅を用いて異種タンパク質を発現させることができる。さらに、該細胞は容易に無血清培地での生育に適合する。

これらの細胞はヒト胚腎臓（２９３Ｓ）細胞とＢｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞との間の融合の生成物である。概要に関しては図１を参照されたい。ＨＫＢｓと呼ばれるこれらのハイブリッドクローンは、Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞、Ｐ３ＨＲ１（Ｈｉｎｕｍａｅｔａｌ．，１９６７，ＪＶｉｏｌ１：１０４５−１０５１）に由来する細胞系であるＨＨ５１４−１６から誘導される欠陥ＥＢＶ−ゲノムを宿している。Ｐ３ＨＲ１細胞は非−不死ＥＢＶを宿している。ＨＨ５１４−１６は、非−不死ＥＢＶを宿しているＰ３ＨＲ１（Ｈｉｎｕｍａｅｔａｌ．，１９６７，ＪＶｉｏｌ１：１０４５−１０５１）のクローンである。ＨＨ５１４−１６はクローニングプロセスの間にｈｅｔ−ＤＮＡ、潜在性−中断ＤＮＡ（ｌａｔｅｎｃｙ−ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇＤＮＡ）を失っている（Ｒａｂｓｏｎｅｔａｌ．，１９８３，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ
ＵＳＡ８７：３６６０−３６６４）。従って、ＨＫＢクローンのＥＢＶは非−不死ウィルスであり、潜在性（ｌａｔｅｎｃｙ）として留まっている。

ＨＫＢｓは治療用タンパク質の組換え生産に適したヒトハイブリッド宿主細胞である。これらの宿主細胞は、それぞれ種々の有利な性質を有する種々の親細胞系のハイブリッド形成により得られる。それぞれの親細胞系の有利な性質を有する宿主細胞が、ハイブリッド形成から生ずる細胞から得られる。

広範囲のタンパク質を多量に発現するように宿主細胞を遺伝子操作することができる。操作された宿主細胞により生産され得るタンパク質には、可溶性ＩＣＡＭ−１、組換えインターロイキン−４（ＩＬ−４）、ｔＰＡ、ＥＰＯ、ｒＦＶＩＩＩ及びＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（第ＶＩＩＩ因子のＢ−ドメイン−欠失変異型）ならびにこれらのタンパク質の誘導体が含まれるが、これらに限られるわけではない。第ＶＩＩＩ因子はＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２のドメイン構成（ｄｏｍａｉｎｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を有しており、２３５１アミノ酸の１本鎖ポリペプチドとして合成され、小胞体のルーメン中に輸送されるとその中から１９−アミノ酸シグナルペプチドが切断される。第ＶＩＩＩ因子が重度にグリコシル化されているという事実のために、第ＶＩＩＩ因子の多量発現（＞０．２ｐｇ／ｃ／ｄ）は達成するのが困難であった（Ｌｉｎｄｅｔａｌ．，１９９５，Ｅｕｒ
ＪＢｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９−２７；Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．，１９８９，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．９：１２３３−１２４２）。哺乳類細胞における第ＶＩＩＩ因子の発現は、類似のベクター及び方法を用いる他の遺伝子の場合に観察される大きさより典型的に２〜３桁低い。第ＶＩＩＩ因子に関する生産細胞系の生産性は０．５〜１Ｕ／ｃ／ｄ（０．１〜０．２ｐｇ／ｃ／ｄ）の範囲内であった。

第ＶＩＩＩ因子のＢ−ドメインはプロコアギュラント活性（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ
ａｃｔｉｖｉｔｙ）に関して必ずしも必要でないことが示された。第ＶＩＩＩ因子の切頭変異型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄｖａｒｉａｎｔｓ）を用い、哺乳類細胞における第ＶＩＩＩ因子の向上した発現が種々のグループにより報告されている（Ｌｉｎｄｅｔａｌ．，１９９５，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ２３２：１９−２７；Ｔａｊｉｍａｅｔ
ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ６ｔｈＩｎｔＳｙｍｐＨ．Ｔ．ｐ．５１−６３；Ａｌｍｓｔｅｄｔへの米国特許第５，６６１，００８号、１９９７）。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子変異型の発現量は安定な細胞クローンから１ｐｇ／ｃ／ｄ未満に留まった。内在性免疫グロブリン（Ｉｇ）は発現されなかったが、操作された宿主細胞からの組換えＩｇ発現は高かったことも見いだされた。ＨＫＢ１１細胞から生産されるタンパク質はヒト特異的グリコシル化プロフィール（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ）を有する。従って該クローンは遺伝子−操作されたＩｇ及び他のタンパク質の生産のために最適な宿主細胞である。

本明細書で用いられる場合、Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫起源の細胞とは、Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞である細胞、Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞から誘導される細胞、Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫起源の他の細胞から誘導される細胞、あるいは上記のいずれかの有糸分裂から生ずる細胞である。これに関し、“から誘導される”とは、通常の有糸細胞分裂ならびにトランスフェクション、細胞融合あるいは細胞を改変するか、又は新しい性質を有する細胞を作るために用いられる他の遺伝子操作もしくは細胞生物学法のようなプロセスを含むがこれらに限られないことが意図されている。類似して、ヒト胚腎臓起源の細胞とは、ヒト胚腎臓細胞である細胞、ヒト胚腎臓細胞から誘導される細胞、ヒト胚腎臓起源の他の細胞から誘導される細胞、あるいは上記のいずれかの有糸分裂から生ずる細胞である。又、２９３Ｓ起源の細胞とは、２９３Ｓ細胞である細胞、２９３Ｓ細胞から誘導される細胞、２９３Ｓ起源の他の細胞から誘導される細胞、あるいは上記のいずれかの有糸分裂から生ずる細胞である。又、２Ｂ８起源の細胞とは、２Ｂ８細胞である細胞、２Ｂ８細胞から誘導される細胞、２Ｂ８起源の他の細胞から誘導される細胞、あるいは上記のいずれかの有糸分裂から生ずる細胞である。異種タンパク質とは、細胞が生産するように操
作されたタンパク質である。

ＨＫＢ細胞の誘導の概要を示す。本文中で言及する発現ベクターの物理的地図を示す。すべてのプラスミドはｐＢＲ３２２バックボーンに基づいて構築され、ｄｈｆｒ発現単位を含有する。問題のタンパク質をコードするすべての遺伝子はＣＭＶエンハンサー／プロモーター（ＣＭＶｅ／ｐ）の調節下にあり；５’イントロン（ＭＩＳ又はＣＩＳ）は、ＢＺＬＦ１を除いて遺伝子の５’末端に位置した。ポリＡシグナル領域をｐＡとして示した。ｐＳＨ１５７及びｐＣＩＳ２５ＤＴＲの両プラスミドはＥＢＶ−ＴＲ（４０２ｂｐ）の配列を含有した。トランジェントトランスフェクションアッセイ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎａｓｓａｙ）における遺伝子発現に関する宿主細胞系の比較を示す。トランスフェクションは同じ条件下で行った：同数の２９３Ｓ、２Ｂ８及びＨＫＢ１１の細胞を同じトランスフェクション試薬を用いて同量のプラスミドＤＮＡｓでトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後に組織培養液を収穫した。ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ及びＩＣＡＭ−１；１０^６個の細胞当たり且つ２日当たりのｎｇタンパク質として測定）及びＣｏａｔｅｓｔ^(R)アッセイキット（ｒＦＶＩＩＩ；１０^７個の細胞当たり且つ２日当たりのミリ単位として測定）によりタンパク質生産量を決定した。

＜特定の態様＞
材料及び方法
ＨＨ５１４−１６はＤｒ．ＧｅｏｒｇｅＭｉｌｌｅｒ（ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により親切に提供された。２９３Ｓ細胞はＤｒ．ＢｒａｄＺｅｒｌｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＷｅｓｔＨｅａｖｅｎ，ＣＴ）から得た。２９３Ｓ細胞は、懸濁培養において生育するように適合させた２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）である（Ｓｔｉｌｌｍａｎｅｔａｌ．，１９８５，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ５：２０５１−２０６０）。

プラスミド
この報告において用いられたすべての発現ベクターは基本的に、機能ｄｈｆｒ遺伝子発現セグメントを有するｐＢＲ３２２に基づくプラスミドであった。発現ベクターの物理的地図を図２に記載する。プラスミド、ｐＳＨ１５７及びｐＣＩＳ２５ＤＴＲはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスの末端繰り返し配列（ＥＢＶ−ＴＲ）も有する。ＥＢＶ−ＴＲ配列に関し、ＭＳＢ−７２５４と指定されたＣｈｏａｎｄＣｈａｎの特許出願、“ＴｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒｕｓｅｎｈａｎｃｅｓｄｒｕｇｓｅｌｅｃｔｉｏｎｒａｔｉｏ”を参照されたい。ＣｈｏａｎｄＣｈａｎ（ＭＳＢ−７２５４、同上）に記載されている通り、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたベクターｐＳＨ１３１、ＡＴＣＣ９８８７９を用い、選ばれたタンパク質のための発現ベクターを作ることができる。

ＥＬＩＳＡ
ｔＩＣＡＭ−１分泌を測定するために、ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体であるＣ９２．５（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄｅｔａｌ．，１９９１，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８８：７９９３−７９９７）を丸底ミクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅｓ）上に吸着させた。１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の溶液を用いる処理によりプレートを遮断し、次いでｔＩＣＡＭ−１含有試料と一緒にインキュベーションした。次いでプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳプラス０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ｔＩＣＡＭ−１上の異なるエピトープに対する第２のモノクローナル抗体であるビオチン化（ｂｉｏｔ
ｉｎｙｌａｔｅｄ）Ｃ７８．５（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄｅｔａｌ．，１９９１、同上）と一緒にインキュベーションした。洗浄の後、プレートをＨＲＰ−ストレプタビジンと一緒にインキュベーションした。次いでプレートを洗浄緩衝液で洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応させ、１ＮＨＣｌを用いて反応を停止させた。４５０／５７０ｎｍにおいてＯＤを読み取り、精製ｔＩＣＡＭ−１の標準曲線と比較することによりｔＩＣＡＭ−１濃度を決定した。

免疫グロブリン（Ｉｇ）分泌の測定のために、抗−Ｉｇ抗体を用いてプレートをコーティングし、検出抗体としてビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗−Ｉｇ抗体を用いた。標準として既知濃度のＩｇ分子を用いた。他の点では、プロセスは同じままである。

インターロイキン−４（ＩＬ−４）分泌の測定のために、抗−ＩＬ−４抗体を用いてプレートをコーティングし、検出抗体としてビオチン化抗−ＩＬ−４抗体を用いた。標準として精製ＩＬ−４分子を用いた。

ｒＦＶＩＩＩ分泌の測定のためのアッセイ
Ｃｏａｔｅｓｔ^(R) ＶＩＩＩ：Ｃ／４キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｍｏｅｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）からの試薬を用いてｒＦＶＩＩＩ分子を定量した。ＭＥＧＡ１（ＯｆｆｉｃｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＲｅｖｉｅｗ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）として既知の合衆国標準抗−血友病因子（第ＶＩＩＩ因子）を、ＳｅｌｅｃｔＨｅａｔＢｌｏｃｋｓ（ＶＷＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）上で３７℃に予備−加温されたＥＩＡ／ＲＩＡＡ／２プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）への測定の標準として用いた。第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、リン脂質及びＣａＣｌ_２を各試料に加え、第Ｘ因子の活性化のために１０分間インキュベーションした。次いで発色基質（Ｓ２２２２）を加え、１０分間インキュベーションして発色基であるｐＮＡを遊離させた。５０％酢酸の添加によりこの反応を停止させた。次いでＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ^(R) ２５０分光光度計ミクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で４０５／４５０ｎｍにおいて比色吸光度を測定し、データをＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓにより提供されたＳＯＦＴｍａｘ^(R) ＰＲＯソフトウェアを介して計算した。

ＨＡＴ−感受性及びＧ４１８−耐性Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞系の誘導
ＨＡＴ−感受性細胞を得るために、Ｓｉａｄａｋｅｔａｌ．（米国特許第４，８３４，９７５号、１９８９）により記載されている標準的案により、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）−欠失細胞系（Ｓｚｙｂａｌｓｋａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２６−２０３４，１９６２；Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５０：５６８−５７６，１９６３）を確立した。

ＥＢＶｈｅｔ−ＤＮＡを含有しない（Ｒａｂｓｏｎｅｔａｌ．，１９８３，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８７：３６６０−３６６４）ＨＨ５１４−１６細胞（Ｄｒ．Ｇ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手）を、１５％胎児牛血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＬｏｇａｎＵＴ）が補足されたＲＰＭＩ−１６４０懸濁培地（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で３００μｇ／ｍｌのメタンスルホン酸エテルエステル（ＭＳＥ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて２４時間処理した。培地で細胞を洗浄した後、６−チオグアニン（６ＴＧ）（Ｓｉｇｍａ）（５μｇ／ｍｌ）を含有する培地中で細胞を平板培養し、ＨＧＰＲＴ−陰性細胞に関して選択した。６カ月の選択期間の間に６ＴＧの濃度を５μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌに増加させた。次いでＨＡＴ−含有培地に対するそれらの感受性に関して細胞を調べた。ＨＡＴ−感受性集団Ａ５の限界希釈クローニング（９６−ウェ
ルプレートにおいてウェル当たりに１細胞）から単細胞クローン（ＳＣＣｓ）を得た。ＳＣＣｓの１つであるＡ５／１Ｄ７を、ｐＢＲベクター中でＳＶ４０プロモーター下にネオ遺伝子（ｎｅｏｇｅｎｅ）を有するｐＳＶ２ｎｅｏを用いてトランスフェクションし、Ｇ４１８−耐性細胞を得た。２Ｂ８と指定されたＧ４１８（１．５ｍｇ／ｍｌ）耐性ＳＣＣｓの１つ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託、番号ＣＲＬ−１２５６９）を融合のために用いた。

＜実施例＞

細胞融合及び単細胞クローンの誘導
主にＫｅｎｎｅｔｔ（１９７９，ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ５８：５−３５９）により記載されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）融合法に従って細胞融合を行った。対数成長にあるそれぞれ５００万個の２９３Ｓ及び２Ｂ８細胞をＣａ^＋＋及びＭｇ^＋＋なしのＰＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で洗浄し、ピーナッツアグルチニン（Ｓｉｇｍａ）（５μｇ／ｍｌ）で予備−処理された６−ウェルプレートの１つのウェル上に播種した（ｓｅｅｄｅｄ）。細胞が添加された６−ウェルプレートをＢｅｃｋｍａｎＪ−６Ｍ／Ｅ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）において４００ｇで６分間遠心した。ウェルからＰＢＳを除去した後、細胞を２ｍｌの４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）で１分間処理した。標準として、１つのウェルをＰＥＧで処理しなかった。細胞を５％のＤＭＳＯを含有する５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、続いてＰＢＳで３回洗浄した。１５％のＦＢＳが補足された新しい培地を用いて細胞を２５分間インキュベーションした。Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）及びＨＡＴ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有し、１５％のＦＢＳが補足された新しい培地を用い、細胞を９６−ウェルプレート上に播種した（プレート当たりに１．２ｘ１０^６個の細胞）。選択培地を用いて１週間に２回、細胞を供給した。この例では、初期選択のために、２９３Ｓ細胞はＨＡＴ含有培地に対する感受性の欠乏という望ましい性質を有し、類似して２Ｂ８細胞はＧ４１８に耐性であるという望ましい性質を有した。

選択条件下で融合細胞は生育したが、混合細胞は同じ条件下で生育しなかった。選択から３週間後、初期集団をもっと大きなフォーマット（ｆｏｒｍａｔｓ）に転移させた。ＳＣＣｓを得るために、安定して生育する２０個の初期集団を混合し、選択培地を用いて限界希釈クローニングに供した（ウェル当たり１個の細胞）。顕微鏡を用いて個々のクローンを注意深く監視した後、１５ｘ９６−ウェルプレートから１９個のＳＣＣｓを選択した。融合実験から誘導されたＳＣＣｓをＨＫＢ細胞（ヒト腎臓−及びＢ−細胞のハイブリッド細胞）と指定した。トランスフェクション研究から７個のＳＣＣｓを選んだ。これらの７個のＳＣＣｓを種々のタンパク質の安定な生産に関してさらに調べた。７個のＳＣＣｓの１つであるＨＫＢ１１を異種タンパク質の生産のための好ましい哺乳類細胞宿主として選んだ。概要に関し、図１を参照されたい。

ＨＫＢクローンの特性化
すべてのハイブリッド細胞は選択条件下で選択されたが、細胞中の染色体数をカウントすることにより、ハイブリッド状態（ｈｙｂｒｉｄｓｔａｔｕｓ）を確認した。事実、ＨＫＢｓのすべてが９０〜１１０の最頻染色体数（ｍｏｄａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｎｕｍｂｅｒ）を示した。これらの数は２９３Ｓ及び２Ｂ８の最頻染色体数の合計と類似していた（ＡＴＣＣデータに従うと、それぞれ６４及び４７）。２９３Ｓ（Ｓｔｉｌｌｍａｎｅｔａｌ．，１９８５，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ５：２０５１−２０６０）は懸濁液適合２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）である。

メタノール固定細胞を用い、直接免疫蛍光アッセイにより、すべてのハイブリッド細胞クローンを内在性Ｉｇ（ミュー及びカッパ）発現に関して調べ、どの細胞クローンが内在性Ｉｇを分泌するかを決定した。比較的長期間に及ぶ繰り返し実験において、免疫蛍光試験（表１）及びＥＬＩＳＡ（データは示されていない）に基づき、これらの細胞はミュー−及びカッパ−鎖発現に関して陰性であることが観察された。

表１は、３つの型の細胞の免疫蛍光試験から観察された結果を示す。細胞をＰＢＳ中に再懸濁させ、ガラススライド上にスミアとして適用した。細胞を乾燥した後、スライドを冷（−２０℃）メタノール中で５分間固定した。ＦＩＴＣ−抗ヒトカッパ及び抗ヒトミュー鎖（１：２０希釈）（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏ．ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用い、加湿室中で、３７℃において細胞を４５分間染色した。ＰＢＳを用いてスライドを１０分間濯いだ後、ＰＢＳ／グリセロール（１：１）を用い、スライドにカバーグラスを載せた。細胞を蛍光顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で観察した。

ＦＩＴＣ共役サムブクス・ニグラ（Ｓａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａ）レクチン（ＳＮＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いるＨＫＢ細胞のＦＡＣＳ分析により、シアル酸結合のヒト特異的パターン、アルファ（２−６）シアリルトランスフェラーゼを確認した。ＨＫＢ細胞（クローン１Ｇ２）から分泌されるタンパク質は、オリゴ糖指紋法により分析されるグリコシル化プロフィールのシアル酸のアルファ（２−３）及びアルファ（２−６）結合を示した（データは示されていない）。この観察は、２９３Ｓ及び２Ｂ８細胞の融合から誘導されたＨＫＢ細胞がヒト特異的グリコシル化酵素を保持したことを示している。

これらのハイブリッド細胞が異種遺伝子を発現する能力を有しているかどうかを調べるために、ＩＣＡＭ−１及びＩｇＧ（抗−ＴＮＦ抗体）のための発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクションした。ＩｇＧの分泌を調べるために、重（ガンマ）及び軽（カッパ）鎖の機能的発現を与える１０μｇのプラスミドＤＮＡを用いるエレクトロポレーションにより、ＨＫＢ細胞（５ｘ１０^６個の細胞）をトランスフェクションした。可溶性ＩＣＡＭ−１の分泌量を調べるために、可溶性ＩＣＡＭ−１の機能的発現を与える１０μｇのプラスミドＤＮＡを用いるエレクトロポレーションにより、ＨＫＢ細胞（５ｘ１０^６個の細胞）をトランスフェクションした。ＩｇＧ又はＩＣＡＭ−１に関し、ＥＬＩＳＡによって分泌量を決定した。１９個のＳＣＣｓはすべて、トランジェントトランスフェクションアッセイ（表２）において、比較的多量のＩＣＡＭ−１（１００〜５００ｎｇ／ｍｌ／２日）及びＩｇＧ（３０〜２００ｎｇ／ｍｌ／２日）を分泌した。これらのデータは、内在性Ｉｇ遺伝子発現は消滅したが、トランスフェクションされたＩｇ遺伝子の発現をハイブリッド細胞が支持していることを示している。

ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒウィルス（ＥＢＶ）は２Ｂ８細胞においてエピソームとして存在する。すべてのＳＣＣＳはＥＢＮＡ−１発現に関して陽性であり（データは示されていない）、それはＥＢＶに関してそれらが陽性であることを示している。しかしながら、完全なＥＢＶゲノムがハイブリッド細胞中にまだ存在しているかどうかはわからなかった。従って、ＥＢＶゲノムフラグメントＢＺＬＦ１、潜在性切断トランス−活性化遺伝子を用いて細胞をトランスフェクションすることにより、ハイブリッド細胞中におけるＥＢＶゲノムの状態を調べた。ＢＺＬＦ１の機能的発現を可能にする１０μＧのプラスミドＤＮＡ（ｐＳＨ１２１）を用いてＨＫＢ細胞（５ｘ１０^６個の細胞）をトランスフェクションした。抗ＥＢＶ−ＶＣＡ力価を含有するヒト血清及びＦＩＴＣ共役抗−ヒトＩｇＧを用いる間接免疫蛍光法により、ＥＢＶキャプシド抗原（ＥＢＶ−ＶＣＡ）の検出を行った。免疫蛍光試験の技術的詳細は上記に記載されている。表３に示す通り、模擬（ｍｏｃｋ）トランスフェクションされた細胞はＥＢＶキャプシド抗原（ＥＢＶ−ＶＣＡ）の発現に関して陰性であり、それはＥＢＶ複製に関してそれらが陰性であることを示した。しかしながら、トランスフェクションされた細胞の小さいパーセンテージは抗原発現に関して陽性であった。これらのデータは、ハイブリッド細胞がＥＢＶゲノムをその潜在形態で宿していることを示す。

震盪フラスコ中におけるＦＢＳの連続２倍希釈により、ハイブリッド細胞を無血清培地に適応させた。２週間後、細胞をＦＢＳなしの培地中で生育させた。細胞は震盪フラスコ中で小さい凝集体として生育した。２９３Ｓ細胞と対照的に、ハイブリッド細胞は無血清懸濁培養に容易に適応可能であった。トランスフェリン及びインスリンが補足された無血清及び無アルブミン培地中におけるハイブリッド細胞を、震盪フラスコを用いる懸濁培養において１年より長期間保持することができた。

トランスフェクションされた遺伝子の産物の分泌量を比較するために、クローンの１つ、ＨＫＢ１１ならびに親細胞、２９３Ｓ及び２Ｂ８をｐＳＭ９８（可溶性ＩＣＡＭ−１）、ｐＳＨ１２５（抗−ＴＮＦＩｇＧ）及びｐＣＩＳＦ８（ｒＦＶＩＩＩ）を用いてトランスフェクションした。図３に示す通り、ＩＣＡＭ−１及びＩｇＧの分泌量は２９３Ｓ細胞よりＨＫＢ１１細胞においてずっと高かった（約１０−倍）。２Ｂ８からの両タンパク質の分泌量は検出不可能であった。ＨＫＢ１１細胞におけるｒＦＶＩＩＩの分泌量は２９３Ｓ細胞の分泌量に似ていた。これらのデータは、ＨＫＢ１１細胞のトランスフェクション効率が親細胞よりずっと高いことを示している。

異種タンパク質を分泌する安定なＨＫＢクローンの誘導
遺伝子増幅可能な系（ｄｈｆｒ／ＭＴＸ）において、タンパク質の安定な発現に関してハイブリッドクローンを調べた。最初に適した発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクションし、次いでトランスフェクションされた細胞（通常は９６−ウェルプレート当たりに１０^６個の細胞）を播種し、ヒポキサンチン及びチミジンはないがＦＢＳ及びＭＴＸ（５０ｎＭ）が補足されている選択培地を用いて選択／増幅した。プレートの第１のスクリーニングの後、高分泌ウェルからの細胞を選択し、６−ウェルプレートに移した。６−ウェルプレート中の細胞を、培地中で濃度を増加させたＭＴＸ（１００、２００及び４００ｎＭ）を用いてさらに増幅した。最良の集団の誘導のために、６−ウェルプレートの初期集団をさらにスクリーニングした。結局、単細胞から誘導されるクローンのクローニングのためにこれらの集団を用いた。表４に示す通り、ＨＫＢ１１細胞は多量の異種ヒトタンパク質の生産のために最適であった。ＩＣＡＭ−１、Ｉｇ及びＩＬ−４誘導体の生産のために、ＨＫＢ１１細胞はＣＨＯ細胞と同じに優れていた（データは示されていない）。しかしながら、ＨＫＢクローンはＣＨＯクローンより速く生育し、懸濁培養及び無血清条件に容易に適応させることができた。ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ生産の場合、ＨＫＢ１１クローンはＣＨＯクローンより約１０倍大きい生産性を示した。上記の結果は、ＨＫＢ１１細胞がヒト治療用タンパク質の発現に有用な最適のヒト細胞宿主であることを示している。

１）ＨＫＢクローンからのＩＣＡＭ−１生産量は２９３Ｓ細胞からのそれと似ていた。ＩＣＡＭ−１を分泌するＨＫＢクローンは懸濁培養に容易に適応可能であったが、２９３Ｓクローンは懸濁培養に適応させるのが非常に困難であった。
２）ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ分泌の分泌量は、同じ発現ベクターを用いてトランスフェクションされたＣＨＯ細胞から誘導されるクローンからのものより約１０倍高かった。
３）グラム量のＩＬ−４ＳＡ（Ｔ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ）生産は、ＨＫＢ１１を用いるとトランスフェクションから６カ月後に可能であったが、同じ発現ベクター及び類似の方法を用いる同時の実験において、ＣＨＯ細胞を用いるとそれは数カ月長くかかった。

上記の方法により誘導される細胞系は、（ｉ）１００ｎＭのＭＴＸ中における増幅の後にｐＳＭ９８を用いてトランスフェクションされたＨＫＢ１１細胞から誘導される可溶性ＩＣＡＭ−１分泌クローン（１０ｐｇ／細胞／日）、（ｉｉ）５０ｎＭのＭＴＸ中における増幅及びＭＴＸなしの限界希釈クローニングの後にｐＳＳ１２５を用いてトランスフェクションされたＨＫＢ１３から誘導されるモノクローナル抗体（抗−ＴＮＦ）分泌単細胞クローン（１２ｐｇ／細胞／日）、（ｉｉｉ）増幅（４００ｎＭのＭＴＸ）及びＭＴＸなしの限界希釈クローニングの後にｐＣＩＳ２５ＤＴＲを用いてトランスフェクションされたＨＫＢ１１細胞から誘導される切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｒＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）分泌単細胞クローン（無血清条件において５〜１０μＵ／ｃ／ｄ）、ならびに（ｉｖ）ＭＴＸ増幅の後にｐＳＨ１５７を用いてトランスフェクションされたＨＫＢ１１から誘導されるＩＬ−４誘導体（ＩＬ−４選択的アゴニスト、ＩＬ−４ＳＡ；アミノ酸の２つの位置が突然変異、Ｔ１３Ｄ及びＲ１２１Ｅ）分泌クローン（５ｐｇ／ｃ／ｄ）を含む。ＩＬ−４ＳＡ分泌ＨＫＢクローン、１Ｇ２を少量のタンパク質（グラム量）の比較的迅速な生産に用いた。上記の発現ベクターの物理的地図に関して図２を参照されたい。

＜本発明の主な特徴または態様＞
本発明の主な特徴または態様を以下に示す。
（１）ヒト胚腎臓起源の細胞とＢｕｒｋｉｔｔのリンパ腫起源の細胞との融合から誘導される細胞。
（２）ヒト胚腎臓起源の細胞が２９３起源の細胞である上記１に記載の細胞。
（３）ヒト胚腎臓起源の細胞が２９３Ｓ起源の細胞である上記１に記載の細胞。
（４）Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫起源の細胞が２Ｂ８細胞（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１２５６９）である上記３に記載の細胞。
（５）異種タンパク質を発現する上記１に記載の細胞。
（６）異種タンパク質がＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、モノクローナル抗体、抗−ＴＮＦ抗体、ｒＩＬ４、ｔＰＡ及びＥＰＯより成る群から選ばれる上記５に記載の細胞。
（７）ＨＫＢ１１（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１２５６８）と称される細胞系。
（８）ＨＫＢ１１（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１２５６８）と称される細胞系から誘導される、異種タンパク質を発現する細胞系。
（９）タンパク質がＩＣＡＭ−１である上記８に記載の細胞系。
（１０）タンパク質がＢＤＤ−ＦＶＩＩＩである上記８に記載の細胞系。
（１１）タンパク質がモノクローナル抗体である上記８に記載の細胞系。
（１２）モノクローナル抗体が抗−ＴＮＦである上記１１に記載の細胞系。
（１３）タンパク質がｒＩＬ４である上記８に記載の細胞系。
（１４）タンパク質がＦＶＩＩＩである上記８に記載の細胞系。
（１５）タンパク質がｔＰＡである上記８に記載の細胞系。
（１６）タンパク質がＥＰＯである上記８に記載の細胞系。
（１７）タンパク質がＩＬ−４ＳＡ（Ｔ１３Ｄ／Ｒ１２１Ｅ）であり、１Ｇ２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７）と称される上記８に記載の細胞系。
（１８）タンパク質がヒトグリコシル化プロフィールを有するヒトタンパク質である上記８に記載の細胞系。
（１９）ａ）第１の望ましい性質を有するヒト胚腎臓起源の細胞を得、
ｂ）第２の望ましい性質を有するヒトＢｕｒｋｉｔｔのリンパ腫起源の細胞を得、
ｃ）段階ａ）の細胞を段階ｂ）の細胞と、細胞融合が起こるのを可能にする条件下で接触させ、
ｄ）段階ｃ）から得られる細胞を、段階ａ）及びｂ）の細胞のそれぞれの少なくとも１つの望ましい性質を示す細胞に関してスクリーニングする
段階を含んでなる異種タンパク質の発現のために有用なハイブリッドヒト細胞の作製方法。
（２０）ヒト胚腎臓起源の細胞が２９３起源の細胞である上記１９に記載の方法。
（２１）ヒト胚腎臓起源の細胞が２９３Ｓ起源の細胞である上記２０に記載の方法。
（２２）Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫起源の細胞が２Ｂ８細胞（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１２５６９）である上記２１に記載の細胞。

本明細書に記載したハイブリッドヒト細胞系は、それらの親細胞系が保有する望ましい性質を示す。ヒト胚腎臓細胞（又はヒト胚腎臓細胞から誘導される細胞）とＢｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞（又はＢｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞から誘導される細胞）の融合により作られるＨＫＢ細胞系は、異種タンパク質の発現のための細胞系を開発するのに有用である。

２９３Ｓ及び２Ｂ８のハイブリッド細胞系を確立する初期の目的は、懸濁培養において生育させる時に固まる傾向（望ましくない性質）がある２９３Ｓ細胞の凝集の問題を解決することであった。ハイブリッド形成法から出現したＨＫＢ細胞は、Ｔ−フラスコ中で培養されると単層として生育する。しかしながら、これらの細胞を懸濁様式で培養すると、それらは懸濁細胞として生育する（大きな凝集体を形成しない）。ＨＫＢ細胞はトランスフェクションのために取り扱うのが非常に容易であり、トランスフェクション効率は２９３Ｓ細胞の場合よりずっと高い。

安定な細胞系を作るためにほとんどの場合に必要な形質転換又はハイブリッド形成の結果（ｅｖｅｎｔ）は、改変されたグルコシル化プロフィールを生じ得るが（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，１９８９，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６４：２４１５−２４２３）、体ハイブリッド細胞系であるＨＫＢ１１は典型的なヒトグリコシル化酵素、例えばアルファ（２−３）及びアルファ（２−６）シアリルトランスフェラーゼを有することが見いだされた。さらに、トランスフェクションされたＨＫＢ細胞から生産されるタンパク質はアルファ（２−３）及びアルファ（２−６）シアリル酸結合の正常なヒトグリコシル化パターンを有する。

要するに、ＨＫＢｓは親細胞系のそれぞれからの望ましい性質；すなわち懸濁培養における凝集なしの容易な生育（２Ｂ８細胞の場合に観察されるような）、ならびにトランスフェクションの容易さ及び望ましい分泌特性（２９３Ｓ細胞の場合に観察されるような）を有するハイブリッドヒト細胞である。好ましいハイブリッドヒト細胞系、ＨＫＢ１１は、２９３Ｓ細胞の場合にそうであるように、免疫グロブリン遺伝子発現に関して陰性である。この特色は、ヒト細胞からモノクローナル抗体を組換え的に生産することが望まれている場合に有利である。ヒト細胞の融合が有利な性質を有する細胞を生じたという発見は、種々の親細胞系の融合からハイブリッド細胞において新しい特色の組み合わせを得るために、２９３ＳとＢ−細胞起源の他の細胞系、例えばＮａｍａｌｗａ及び６Ｆ１１を用いるさらに別の融合研究を勇気づけるのに役立つ。

特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の第７規定に基づく寄託
（１）生物名：Hybrid cell line HKB11
寄託した機関の名称およびあて名：
American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209 USA
寄託した日付：１９９８年９月１６日
受託番号：ＡＴＣＣＣＲＬ−１２５６８
（２）生物名：HAT-Sensitive cell line
寄託した機関の名称およびあて名：
American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209 USA
寄託した日付：１９９８年９月１６日
受託番号：ＡＴＣＣＣＲＬ−１２５６９
（３）生物名：IL-4 selective agonist secreting HKB11 clone IG2 (Ref. MSB7241)
寄託した機関の名称およびあて名：
American Type Culture Collection, Manassas, VA 20110-2209 USA
寄託した日付：１９９９年５月１９日
受託番号：ＡＴＣＣＰＴＡ−８７

Claims

異種タンパク質の発現のために有用なハイブリッドヒト細胞の作製方法であって、
ａ）ヒト胎児性腎臓から予め得られた細胞を用意する工程、
ｂ）ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ−１２５６９の細胞から有糸細胞分裂により誘導された２Ｂ８細胞を用意する工程、
ｃ）工程ａ）の細胞を工程ｂ）の細胞と、細胞融合が起こるのを可能にする条件下で接触させる工程、
ｄ）工程ｃ）から得られる細胞を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞よりも多量の異種タンパク質を分泌する細胞に関してスクリーニングする工程
を含むこと、かつ、ヒト胎児性腎臓起源の細胞が２９３細胞であることを特徴とする、方法。
ヒト胎児性腎臓起源の細胞が２９３Ｓ細胞である請求項１に記載の方法。