UA77642C2 - Human hybrid cell for expression of gene of mammals, human cell line hkb11, method for producing hybrid human cells suitable for expression of heterologic protein - Google Patents
Human hybrid cell for expression of gene of mammals, human cell line hkb11, method for producing hybrid human cells suitable for expression of heterologic protein Download PDFInfo
- Publication number
- UA77642C2 UA77642C2 UA2001074776A UA2001074776A UA77642C2 UA 77642 C2 UA77642 C2 UA 77642C2 UA 2001074776 A UA2001074776 A UA 2001074776A UA 2001074776 A UA2001074776 A UA 2001074776A UA 77642 C2 UA77642 C2 UA 77642C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cells
- cell
- human
- protein
- cell line
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 42
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 title claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 title abstract description 18
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 199
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 12
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 abstract description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract description 2
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 abstract 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 abstract 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 14
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- MYLBTCQBKAKUTJ-UHFFFAOYSA-N 7-methyl-6,8-bis(methylsulfanyl)pyrrolo[1,2-a]pyrazine Chemical compound C1=CN=CC2=C(SC)C(C)=C(SC)N21 MYLBTCQBKAKUTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150004533 EBM gene Proteins 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100268066 Mus musculus Zap70 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150072488 Nsun4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010046016 Peanut Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003976 glyceryl group Chemical group [H]C([*])([H])C(O[H])([H])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 229960000160 recombinant therapeutic protein Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 108010073863 saruplase Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Опис винаходу
Споріднені заявки: Заявка Чо і Чена "Месіогз Наміпд Тегтіпа! Кереаї бедцепсе ої Ервіеіп-Вагт Мігив", 9 позначена М5В-7254 (ОБ, 09/209,915), і заявка Чо та ін. "Ехргезвіоп вувіет ог Тасіог МІ", позначена
М5В-7255 (05, 09/209,916), містять споріднений об'єкт винаходу. Обидві заявки були подані 10.12.1998.
Цей винахід стосується, в основному, одержаних шляхом генетичної інженерії клітинних ліній ссавців для отримання біологічно активного протеїну. Зокрема, винахід стосується людських гібридних клітинних клонів, отриманих за допомогою процесу злиття людських ембріональних клітин нирки (2935) та клітин лімфоми Беркітта. 70 Ці людські гібридні клітини можуть використовуватися для отримання гетерологічних протеїнів.
До даного часу більшість терапевтичних рекомбінантних протеїнів отримувались з клітин ссавців, окрім людини. Деякими прикладами є: (апіт-) - клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) |Опацр еї аїЇ. // Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА. - 1980. - 77. - Р. 4216-4220) з селективним маркером дигідрофолат редуктази, здатним до ампліфікації (Кашїтап еї а). 79 М Мої. Вісі. - 1982. - 159, - Р. 601-621; Савзвзег еї аЇ. / Ргос. Май. Асай. сі ОБА. - 1982. - 79. - р. 6522-6526), використовувались для отримання терапевтичного рекомбінантного протеїну.
Різноманітність рекомбінантних терапевтичних протеїнів, відомі як такі, що одержують у клітинах ссавців, наприклад, рекомбінантний фактор МІ (ТЕМІ) І(Кашйтап ек аї. // 9. Віої. Спет. - 1988. - 263. - Р. 6352-6362), тканинний активатор плазміногену (-РА) (5, 4766075, 1988), еритропоетин (ЕРО) (5, 4703008, 1987) і моноклональні антитіла (монАт) (05, 4816397, 1989). Клітини (ВНК) нирки ембріону хом'яка (ВНК21) використовувалися для отримання гЕМІІ! після селекції 5418 та метотрексатної (МТХ) ампліфікації резистентних клітин 5418 (05, 4965199, 19901.
Клітини мишиної мієломи (МО) використовувались для отримання одержаного шляхом генетичної інженерії людського антитіла анти-ТМЕ (ЕНАТ) (5, 4816397, 1989). Проте, ця клітинна лінія генерує протеїни, які мають с 22 особливі мишині вуглеводні структури, які не є бажаними для застосування на людях. о
Людська клітинна лінія Матама (джерело лімфоми Беркітта) використовувалась для отримання альфа-інтерферону у УУеїЇсот Кезеагсі І арогагу і для отримання проурокінази |Зап еї аї. // Суюіесппоіоду. - 1996. - 18. - Р. 167-185), тканинного активатора плазміногену (І-РА) ІКпап еї аї. // Віоспет. бос. Тгапв. - 1995. - 23. - Р. 99), колонієстимулювального фактора гранулоцитів та макрофагів |ОКатоїо еї аї. // Агсп. сч
Віоспет. Віорпуз. - 1991. - 286. Р. 562-568), інтерферонів та лімфотоксинів (Нової еї аїЇ. // Суїоїесппоіоду. «Ж - 1991.- 5. - Р. 17-34) колонієстимулювального фактора гранулоцитів (Нової еї аї. // СуїюїесппоЇоду. - 1991. -7.- Р. 25-32) у ТоКуо Кезеагсй І арогаюгіев. Проте, ці клітини дуже важко піддавалися трансфекції ДНК. ее,
Уельс та ін. (1989, Сепе 81: 139-149) повідомили про використання стратегії сумісної ант/мтх ча ампліфікації для експресії функціонального протеїну С в ембріональних клітинах людської нирки (клітини 2935) повідомили (Уеллс та ін. // Сепе. - 1989. - 81. - Р. 139-149). Клітини 293 |З(Штап еї аїЇ. // Мої. Сеї). в
Вісі. - 1985. - 5. - Р. 2051-2060) відомі як ті, що утворюють великі агрегати в суспензії, зокрема, при високій концентрації кальцію ("100мМкМ), яка сприяє збільшенню агрегації та зниженню життєздатності клітин (Резпмжа еї аї. // Віоїесп. апа Віоепд. - 1993. - 41. - Р. 179-187). Усі ці відомості наведені у даній заявці « як посилання.
Клони гібридизованих людських клітин на даний момент визначені як такі, що легко піддаються трансфекції - с електропорацією або катіонною ліпосомою і які легко адаптувати до росту в суспензійній культурі.
І» Гетерологічні протеїни можуть експресувати низькі рівні (50-ТООНМ) МТХ ампліфікації в оточуючому середовищі людської клітини. Окрім того, клітини легко адаптуються до росту у вільному від сироватки середовищі.
Ці клітини є продуктом злиття між ембріональними клітинами людської нирки (2935) та клітинами лімфоми
Беркітта. Дивіться Фіг.1 для коментарю. Ці гібридні клони, названі НКВ, містять дефектні ЕВМ-геноми, що це. походять від НН5Б14-16, які є клітинною лінією, що походить з клітин лімфоми Беркітта, РЗНА1 |ІНіпита еї аї. // -І У. Мігої. - 1967. - 1. - Р. 1045-1051). Клітини РЗНК1 несуть неіморталізований ЕВМ. НН514-16 є клоном РЗНК1
ІНіпита еї аї. // 9. МігоЇї. - 1967. - 1. - Р. 1045-1051), який несе неіморталізований ЕВМ. НН514-16 втратив б гетерологічну ДНК, ДНК, яка перериває латентний стан протягом процесу клонування |Карзгоп еї аї.// Ргос. «їз» 20 Май, Асай. Зсі. БА. - 1983. - 87. - Р. 3660-3664. Тому ЕВМ НКВ клони є неморталізованим вірусом і залишається в латентному стані. їз НКВ є людськими гібридними клітинами хазяїна, придатними для рекомбінантного отримання терапевтичних протеїнів. Ці клітини хазяїна отримуються шляхом гібридизації різних батьківських клітинних ліній, кожна з яких має різні корисні характеристики. Клітини хазяїна, які мають корисні характеристики кожної з 22 батьківських клітинних ліній, отримуються з клітин, одержаних в результаті гібридизації.
ГФ) Клітини хазяїна можна одержувати шляхом генетичної інженерії для експресії високих рівнів широко поширених протеїнів. Протеїни, які можуть бути одержані за допомогою клітин хазяїна, отриманих в результаті о генетичної інженерії, включають, але не обмежуються розчинним ІСАМ-1, рекомбінантним інтерлейкіном-4 (ІІ -4),
ІРА, ЕРО, гЕМІП, Її ВОО-ЕМІ (варіанти Фактору МІ з делетованим доменом В) і похідні цих протеїнів. 60 Фактор МІ має структуру домену А1-А2-В-АЗ-С1-С2 і синтезується як одноланцюговий поліпептид з 2351 амінокислот, із яких сигнальний пептид, що має 19 амінокислот, розщеплюється під час транслокації у порожнину ендоплазматичного ретикулюму. Беручи до уваги той факт, що фактор МІІЇ важко глікозилюється, було важко досягнути експресії високого рівня ( 20,2пг/кл/дн.) фактора МІ (іпа ек аї. // Еицг. 9. Віоспет. - 1995. - 232. - Р. 19-27; Кацїтап еї аїЇ. // Мої. СеїЇ. Віої. - 1989. - 9. - Р. 1233-1242). Експресія фактора МІ у бо клітинах ссавців, типово на 2-3 порядки нижча по величині ніж та, що спостерігалась у решті генів з використанням подібних векторів та підходів. Продуктивність отримання клітинних ліній для фактора МИ! знаходилася в інтервалі 0,5-1,0од./кл/дн. (0,1-0,2пг/кл/дн.).
Було продемонстровано, що В-домен фактора Мі є несуттєвим для прокоагулянтної активності.
Використовуючи вкорочені варіанти фактора МІЇЇ, різними групами відзначалася поліпшена експресія фактора МІЇЇ у клітинах ссавців (па еї а/. // Ешг. У. Віоспет. -- 1995. - 232. - Р. 19-27; Тата еї а/. // Ргос. 61 |Іпї. Зутр. Н.Т. - 1990. - Р. 51-63; 5, 5661008, 1997)Ї. Проте, рівень експресії варіантів фактора МІ зі стабільного клітинного клону залишався нижчим Іпг/кл/дн. Також було виявлено, що незважаючи на те, що ендогенний імуноглобулін (Ід) не експресувався, експресія рекомбінантного Ід з клітин хазяїна, отриманих в результаті 70 генетичної інженерії, була високою. Протеїни, отримані з клітин НКВ11, мають специфічний людський профіль глікозилювання. Тому, клони є оптимальними клітинами хазяїна для отримання Ід, одержаного за допомогою генетичної інженерії, та решти протеїнів.
Використовувана тут клітина, що має походження від лімфоми Беркітта, є клітиною лімфоми Беркітта, що походить від клітини лімфоми Беркітта, що має походження від іншої клітини лімфоми Беркітта, або клітиною, 75 яку отримують в результаті мітотичного поділу будь-якої з вищезгаданих. "Походить від" в цьому контексті має намір включати, але не обмежуватися нормальним мітотичним поділом клітин та способами, такими як трансфекція, злиття клітин або іншими способами генетичної інженерії або біології клітин, які використовуються для зміни клітин або отримання клітин з новими властивостями. Подібним чином, клітина людської ембріональної нирки є клітиною людської ембріональної нирки, отриманої від клітини людської ембріональної нирки, отриманої з іншої клітини джерела людської ембріональної нирки, або клітиною, яка отримується в результаті мітотичного поділу будь-якої з вищезгаданих. Також клітина джерела 2935 є клітиною 2935, отриманою з клітини 2935, отриманої з іншої клітини джерела 2935, або клітиною, яка отримується в результаті мітотичного поділу будь-якої з вищезгаданих. Також клітина джерела 288 є клітиною 288, отриманою з клітини 288, отриманої з іншої клітини джерела 288, або клітиною, яка отримується в результаті мітотичного Га поділу будь-якої з вищезгаданих. Гетерологічний протеїн є протеїном, який отримувався в результаті генетичної інженерії клітини. і9)
На Фіг.1 зображено спрощений варіант дериватизації клітин НКВ.
На Фіг.2 зображено фізичні карти векторів експресії, зазначених у тексті. Усі плазміди утворюються на основі рРВКЗ322 та містять одиницю експресії ант. Всі гени, які кодують протеїни, що представляють інтерес, Ге зо знаходяться під регуляційним контролем енхансера СММ/промотора (СММ е/р); 5-й інтрон (МІЗ або СІБ5) розміщувався біля 5-го кінця генів, за виключенням ВА Е1. Полі-А сигнальна область, позначалася рА. Обидві М плазміди реН157 та рСІЗ25ОТЕ містять послідовність ЕВМ-ТЕ (402 п.о.). (Те)
На Фіг.3 зображено порівняння клітинних ліній хазяїна для генної експресії у перехідних аналізах трансфекції. Трансфекції проводилися при тих же умовах: та ж кількість клітин 2935, 288 і НКВ11 - трансфікувалася тією ж кількістю плазмідної ДНК, використовуючи той же трансфекційний агент. Рідкі культури - тканин збиралися через 2 дні після трансфекції. Рівні отримання протеїну визначалися ЕГІЗА (до та ІСАМ-1; виміряні як нг протеїну/105 клітин/2 дні) і комплектом проби Соаїеві? (ТЕМІ; виміряні як міліодиниці/10" клітин/2 дні). «
Особливі варіанти реалізації
Матеріали та способи - с НН514-16 були любязно надані доктором Джорджем Міллером (Єльський Університет). Клітини 2935 були отримані від доктора Бреда Зелера (Моіесціаг ТПегарецшіїс Іпвійше, МУеві Неамеп, СТ). Клітини 2935 є )» клітинами 293 (АТСС СТІ -1573), які були адаптовані для росту в суспензійній культурі (З(ЇШтап еї аї. // Мо).
Сеїї. Вісі. - 1985. - 5. - Р. 2051-2060).
Плазміди -| Всі вектори експресії, які використовувались в цій доповіді, головним чином, були плазмідою на основі - рВКЗ322 з функціональним сегментом генної експресії апіт. Фізичні карти векторів експресії описуються на
Фіг2. Плазміди рЗНІ5/ та рсСІБ25ОТК мають також термінальну повторювану послідовність вірусу (о) Епштейна-Барра (ЕВМ-ТК). Дивіться заявку на патент Чо та Чена "Месюогв Наміпуд Тегтіпа! Кереаї Зедцепсе ої 1» 50 Ерзівїіп-Ваїт Мігив", позначену М5ЗВ-7254 (05, 09/209,915), для послідовності ЕВМ-ТК. Вектор реНІ31, який депонований в Американській Колекції Типових Культур АТСС 98879, можна використовувати з метою генерації що) векторів експресії для вибраного протеїну, як описано у Чо та Чена (М5В-7254).
ЕПЗА
Для вимірювання секреції (САМ-1, моноклонального антитіла для ІСАМ-1, С92.5 |МеСіейНапа еї аї. // Ргос.
Май). Асад. Зсі. ОБА. - 1991. - 88. - Р. 7993-7997| абсорбувався на мікротитрувальних планшетах з круглим дном. Планшети закупорювалися обробкою фосфатно-буферним розчином (РВ5), який містив 195 альбуміну з о коров'ячої сироватки (ВЗА), а потім витримувалися з пробами, які містили ЯСАМ-1. Потім планшети промивалися іме) буферним розчином для промивання (РВ5 плюс 0.005956 Тмееп 20) та інкубувалися з біотинільованим С78.5, другим моноклональним антитілом для іншого епітопу на ЧСАМ-1 |МеСіейапа еї аЇ. // Ргос. Май. Асай. збі. 60 БА. - 1991. - 88. - Р. 7993-7997). Після промивання планшети інкубувалися з НКР-стрептавідином. Потім планшети промивалися буферним розчином для промивання, вводились у взаємодію з тетраметилбензидином (ТМБ) і реакцію зупиняли 1М НСЇ. Концентрація ЧСАМ-1 визначалася зчитуванням ОО при 450/57Онм і порівнювалася зі стандартною кривою очищеного САМ-1.
Для вимірювання секреції імуноглобуліну (Ід) використовувалось антитіло анти-Ід для покриття планшету і 65 біотинільоване антитіло анти-д використовувалось як антитіло детекції. Відома концентрація молекули Ід використовувалась як стандарт. В усьому іншому спосіб залишався тим же.
Для вимірювання секреції інтерлейкіну-4 (І/-4) антитіла анти-І/-4 використовувались для покриття планшету, а біотинільоване антитіло анти-1ІІ-4 використовувалось як антитіло детектування. Молекула очищеного
І--4 використовувалась як стандарт.
Проба для вимірювання секреції гЕМПЇ
Кількісний склад молекули гЕМІІ! визначався за допомогою реагентів з Соаіеві У МП:С/4 Кії (Спготодепіх,
Моїіпаа!, Зул"едеп). Стандартний для США антигемофілічний фактор (фактор МІ), відомий як МЕСА 1 (Ойісе ої
Віоіодіеєз Кезеагсії апа Кеміему, Веїіпезаа, МО) використовувався як стандарт вимірювання для планшетів ЕІА/КІА
А/2 (Сотіпод, Согпіпд, МУ), попередньо нагрітих до 372С на Селективних Нагрівальних Блоках (М/УУК Зсіепіййс, Зап 70 Егапсізсо, СА). Фактор ІХа, фактор Х, фосфоліпід та СасСі» додавалися до кожної проби і витримувалися протягом 10хв. для активування фактора Х. Потім додавався хромогенний субстрат (52222) і інкубувався протягом 1Охв. для виділення хромогенної групи, РМА. Ця реакція зупинялася додаванням 5095 оцтової кислоти. Потім вимірювалась колорометрична абсорбція при 405/450нм на спектрофотометричному зчитувачі для мікропланшетів ЗРЕСТЕАтах? 250 (Моїіесцшіаг Оімісев, Зиппумаіє, СА) і дані обраховувалися за допомогою 75 програмного забезпечення ЗОЕТтах 7 РКО, забезпечуваного Моіесціаг Оемісе.
Модифікація НАТ-чутливої та 0418-резистентної клітинної лінії лімфоми Беркітта
Для отримання клітин чутливих до НАТ, гіпоксантин-гуанін фосфорибозил трансферази (НОРКТ)-дефіцитні клітинні лінії І(З2ураївКа еї аїЇ. // Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА. - 1962. - 48. - Р. 2026-2034; І їШейеїй //
Ргос. Май. Асай. сі. ОБА. - 1963. - 50. - Р. 568-576)| відновлювалися за стандартним прописом, описаним Сядаком та ін. (05, 4834975, 19891.
Клітини НН514-16 (отримані від доктора Дж. Міллера, Єльський Університет), в яких була відсутня ЕВМ гетерологічна ДНК |Кабзоп еї аїЇ. // Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА. - 1983. - 87. - Р. 3660-3664| вводилися у взаємодію протягом 24год. з ЗООмкг/мл етилового складного ефіру метансульфокислоти (СЕМ) (Зідта, 51. І оців,
МО) у середовищі суспензії ВРМІ-1640 (І їе Зсіепсе, Зайпегзриго, МО) з добавкою 1595 ембріональної коров'ячої ЄМ сироватки (ЕВ5) (Нусіопе, І одап, ОТ). Після промивання клітин середовищем, вони висівалися на планшети у Ге) середовищі, яке містило б-тіогуанін (6ТГ) (бЗідта) (Омкг/мл) для селекції на НОРКТ-негативних клітинах.
Концентрація 6ТГ збільшувалась від 5мкг/мл до ЗОмкг/мл протягом шестимісячного періоду відбору. Потім клітини тестувалися на чутливість до середовища, яке містить НАТ. Окремі клітинні клони (5СС) отримувалися з обмежувального клонування розведень (одна клітина на лунку у 96-лункових планшетах) популяції А5, чутливої до с
НАТ. Один з 5СС, АБ/107 трансфікувався роМ2пео, який має ген пео під контролем промотора 5М40 у векторі р. «Е для отримання клітин стійких до 5418. Один з ЗСС, стійких до 5418 (1,5мкг/мл), названий 288 (депонований в
Американській Колекції Типових Культур, Мо. СКІ -12569) використовувався для злиття. ісе)
Приклад 1. Злиття клітин та модифікації одиничних клітинних клонів ча
Злиття клітин спочатку проводилося згідно з поліетиленгліколевим (ПЕГ) способом злиття, описаним ІКеннет
Зо // Ме Епгутої. - 1979. - 58. - Р. 5-359). П'ять мільйонів кожної з клітин 2935 та 288 промивалися РВ5 за - відсутності Са"" та Мд"" у логарифмічній фазі росту (Пе Тесппоіодієз, Коскмійє, МО) та висівалися в одну лунку б-лункового планшету, який попередньо піддавався обробці арахісовим аглютиніном (Зідта) (5мкг/мл). б-лункові планшети, заповнені клітинами, центрифугувалися при 4009 протягом бхв. на центрифузі Бекмана « 3-6М/Е (ВесКтап, Раїо Айо, СА). Після видалення РВ5 з лунки, клітини вводилися у взаємодію з 2мл 4090 50 (вага/об'єм) ПЕГ (Зідта) протягом їхв. Для контролю одна лунка не вводилась у взаємодію з ПЕГ. Клітини З с промивалися три рази 5мл РВ5, який містив 595 ЮМ5О після трьох промивань РВ5. Клітини інкубувалися у 1» свіжому середовищі з добавкою 1595 ЕВЗ протягом 25хв. Клітини висівалися на 96-лункові планшети (1,2х10 5 клітин на планшет) з використанням свіжого середовища, яке містило 5418 (мг/мл) і НАТ (Ге Тесппоіоду) з добавкою 1595 РВ5. Клітини підживлювалися двічі на тиждень з використанням селективного середовища. У цьому прикладі для початкового відбору клітини 2935 мали бажану характеристику відсутності чутливості до це. середовища, яке містить НАТ, і подібним чином, клітини 288 мали бажану характеристику стійкості до (3418. -І В той час як злиті клітини вирощувались при селективних умовах, змішані клітини не росли при тих же умовах. Через три тижні після відбору, початкові популяції переносилися на більші формати. Для отримання 5СС б двадцять початкових популяцій зі стабільним ростом перемішувалися та піддавалися обмежувальному «їз» 20 клонуванню розведень (одна клітина на лунку) з використанням селективного середовища. Дев'ятнадцять СС вибиралися з 15хХ96-лункових планшетів після обережної реєстрації індивідуальних клонів з використанням із мікроскопу. ЗСС, отримані з експерименту по злиттю, називалися клітинами НКВ (Гібридні клітини людської нирки і В-клітин). Сім ЗСС вибиралися з трансфекційного дослідження. Ці сім ЗСС надалі тестувалися для стабільного отримання різних протеїнів. Один з семи СС, НКВ11 вибирався як клітина хазяїна, якій надається перевага у 29 ссавців для отримання гетерологічних протеїнів (Фіг.1).
ГФ) Приклад 2. Характеристика клонів НКВ
Хоча всі гібридні клітини вибиралися при селективних умовах, гібридний статус підтверджувався підрахунком о кількості хромосом у клітинах. Насправді, всі НКВ показали кількість модальних хромосом 90-110. Ці кількості збігалися з сумою кількостей модальних хромосом 2935 та 288 (64 та 47, відповідно, згідно з даними АТСС). 60 2935 (ЗШ танп еї а). // Мої. СеїІ. Віої. - 5.- Р. 2051-2060) є суспензією, адаптованою 293 (АТСС СКІ -1573).
Всі гібридні клітинні клони тестувалися для ендогенної (мю та каппа) експресії Ід за допомогою прямого імунофлюорисцентного аналізу з використанням фіксованих метанолом клітин для визначення того, які клітинні клони секретують ендогенний Ід. У повторних експериментах протягом довшого періоду ці клітини спостерігались як такі, що є негативними для експресії мю- та каппа-ланцюгів на основі імунофлюорисцентного тесту (табл. 1) бо тає ІА (дані не зображені).
клітини 70 Таблиця 1 зображує результати, які спостерігалися в імунофлюорисцентному тестуванні трьох типів клітин.
Клітини повторно суспендувалися у РВ5 та наносилися як мазок на скляне предметне скло. Після просушування клітин предметні скельця фіксували у холодному (-20 22) метанолі протягом бхв. Клітини забарвлювалися протягом 45хв. за допомогою анти-РІТС каппа та мю ланцюгами людини (розведення 1:20) (7утеа І арогаюгіев,
Іпс., 5о. Зап Егапсізсо, СА) у зволоженій камері при 372. Після промивання предметних скелець РВЗ протягом 75 Охв., вони покривалися покрівним склом, використовуючи РВЗ/Гліцерил (1:1). Клітини досліджувалися під флуоресцентним мікроскопом (Сагі 2еївв, Іпс., Ппогпумоой, МУ).
Особлива людська структура зв'язку сиалової кислоти, альфа(2-6б)сиалілтрансфераза підтверджувалася аналізом ЕАСЗ клітин НКВ з використанням РІТС-зв'язаного лектину Затрисиз підга (МА) (5ідта, 5. І оців, МО).
Протеїн, виділений з клітин НКВ (клон 102), відображав альфа(2-3) та альфа(2-6) зв'язок сиалової кислоти профілю глікозилювання, проаналізований олігосахаридним способом "відбитків пальців" (дані не зображені). Це дослідження вказує на те, що клітини НКВ, отримані злиттям клітин 2935 та 288, зберігали особливі людські ферменти глікозилювання.
Для перевірки, чи мають ці гібридні клітини функціональну активність для експресії сторонніх генів, клітини трансфікувалися векторами експресії для ІСАМ-1 та до ( антитіло анти-ТМЕ). Для тестування секреції Га |дО, клітини НКВ (5х1059 клітин) трансфікувалися електропорацією з 1Омкг плазмідної ДНК, як передбачалося для о функціональної експресії важких (гамма) та легких (каппа) ланцюгів. Для тестування рівнів секреції розчинного
ІСАМ-1, клітини НКВ (5х105 клітин) трансфікувалися електропорацією з 1Омкг плазмідної ДНК, як передбачалося для функціональної експресії розчинного ІСАМ-1. Рівні секреції визначалися за допомогою ЕЇІЗА для до або
ІСАМ-1. Усі 19 5СС секретували відносно високі рівні ІСАМ-1 (100-500нг/мл/2дн.) та дО (30-200нг/мл/гдн) у СМ тимчасовій трансфекційній пробі (табл. 2). Ці дані вказують на те, що гібридні клітини підтримують експресію « трансфікованих генів Ід, хоча ендогенна експресія гену Ід припинялася.
Вірус Епштейна-Барра (ЕВУ) існує у вигляді епісом у клітинах 288. Усі БСС були позитивними для експресії іс),
ЕВМА-1 (дані не зображені), що відображає той факт, що вони позитивні для ЕВУ. Тим не менше, було невідомо, чн чи все ще існує весь геном ЕВУ у гібридних клітинах. і - та розчинного ІСАМ з клонів НКВ, які отримуються зразу після « процесу клонування то Клон НКВ що с ї» 47 юю - юю
Ф пили ВИ Но то пили: тн го юр ю 5в ЕЕ ни и и не Ст шили т о т 6 рю ею во вро сю шили ШЕ ПО 65 Тому, статус геному ЕВМ у гібридних клітинах тестувався за допомогою трансфекції клітин фрагментом ВАГ Е1 геному ЕВМ, (гапв-активуючим геномом, що перериває латентний період. Клітини НКВ (5х109 клітин)
трансфікувалися 1Омкг плазмідної ДНК (реН121) для одержання функціональної експресії ВА Е1. Визначення капсидного антигену ЕВМ (ЕВМ-МСА) проводилося непрямою імунофлюорисценцією з використанням людської сироватки, яка містила титр анти ЕВМ-МУСА та зв'язаний РІТС - кон'югований антилюдський Ід. Технічні деталі імунофлюорисцентного тесту описуються вище. Як зображено у табл. 3, фіктивно трансфіковані клітини були негативними для експресії капсидного антигену ЕВМ (ЕВМ-МУСА), що вказує на те, що вони були негативними для реплікації ЕВМ. Тим не менше, незначний процент трансфікованих клітин був позитивним для антигенної експресії. Ці дані вказують на те, що гібридні клітини містять геном ЕВМ у латентній формі. трансфекції ВІ Е1 т ю
Гібридні клітини адаптувалися до середовища, що не містить сироватки, двократним зменшенням ЕВ5 у колбах для струшування. Після двох тижнів клітини вирощувались у середовищі без ЕВ5. Клітини вирощувалися як невеликі агрегати у колбах для струшування. На противагу до клітин 2935, гібридні клітини легше с 29 пристосовувалися до росту суспензійних культур без сироватки. Гібридні клітини у середовищі без сироватки та (У альбуміну з добавкою трансферину та інсуліну могли зберігатися протягом більше, ніж року в суспензійній культурі з використанням колб для струшування.
Для порівняння рівнів секреції трансфікованих генних продуктів, один з клонів, НКВ11 та батьківські клітини 2935 та 288 трансфікували р5Ме98 (розчинний ІСАМ-1), реМ125 (Ід анти-ТМЕ) ії рСІБЕ8 (ТЕМІ). Як сч 30 зображено на Фіг.3, рівні секреції ІСАМ-1 та до були набагато вищими (приблизно у 10 разів) у клітин НКВІЯЇ, «Ж ніж у клітин 2935. Рівні секреції обох протеїнів з 288 були такими, що не піддавались детекції. Рівні секреції ТЕМІ у клітинах НКВІ11 були подібними до тих, що спостерігалися у клітин 2935. Ці дані вказують на шо те, що ефективність трансфекції клітин НКВ11 набагато краща, ніж у батьківських клітинах. їч-
Приклад 3. Модифікація стабільних клонів НКВ, які секретують гетерологічні протеїни
Зо Гібридні клони тестувалися на стабільність експресії протеїнів у генній системі, здатній до ампліфікації - (ант/мтх). Клітини спочатку трансфікували прийнятним вектором експресії, а потім трансфіковані клітини (зазвичай 105 клітин на Об-лунковий планшет) висівалися та відбиралися/ампліфікувалися селективним середовищем, в якому були відсутні гіпоксантин та тимідин, але з добавкою ЕВЗ та МТХ (5ОНМ). Після першого « відбору планшетів, клітини з лунок з високою секрецією відбиралися та переносилися до б-лункових планшетів. шо
Клітини у б-лункових планшетах надалі ампліфікувалися зі зростаючими концентраціями МТХ (100, 200, та 40ОнНМ) с у середовищі. Початкові популяції б-лункових планшетів надалі відбиралися для одержання найкращої популяції. 1» Накінець, ці популяції використовувалися для клонування окремих виділених клітинних клонів. Як зображено в табл. 4, клітини НКВ11 були оптимальними для отримання високих рівнів гетерологічних людських протеїнів. Для отримання ІСАМ-1, Ід та похідної ІІ -4, клітини НКВ11 були такими ж придатними, як і клітини СНО (дані не -1 що показані). Проте, клони НКВ росли швидше, ніж клони СНО і могли легше пристосовуватися до суспензійної культури та до умов відсутності сироватки. У випадку отримання ВОО-ЕМІИЇ, клони НКВ11 показали наближено в -і десять раз більшу продуктивність, ніж клони СНО. Вищенаведені результати вказують на те, що клітини НКВ11 є
Фу оптимальною людською клітиною хазяїна, придатною для експресії людських терапевтичних протеїнів. то
Отримання гетеролопчного протеїна о 56000800 855 о ю
Примітки: бо 1). рівень отримання ІСАМ-1 з клонів НКВ був подібним до того, що мав місце для клітин 2935. Клон НКВ, який секретував ІСАМ-1, легше адаптувався до суспензійної культури, в той час як клони 2935 дуже важко пристосовувалися до суспензійної культури. 2) - Особлива продуктивність в од./к/дн. Рівень секреції ВОО-ЕМІЇЇ був в десять раз вищим, ніж той, що мав місце для клонів, виділених з клітин СНО, трансфікованих тим же вектором експресії. 3) - Грам-кількість отримуваного 1І-45А(Т130/К121ЄЕ) була можливою через 6 місяців після трансфекції з використанням НКВ11, і в той же час забирало на декілька місяців більше з використанням клітин СНО в одночасних експериментах з використанням того ж вектору експресії бо та подібного способу.
Клітинні лінії, отримані вищезгаданими способами, містили ( див. Фіг.2 для фізичної карти векторів експресії): (ї) клони, що секретують розчинний ІСАМ-1 (1Опг/кл./дн.), отриманих з клітин НКВ11, трансфікованих ремов8 після ампліфікації у ї00нНМ МТХ; (її) окремі клітинні клони, що секретують моноклональне антитіло (анти-ТМЕ) (12пг/кл./дн.), отримані з
НКВІ13, трансфікованих ре5125 після ампліфікації у ХОНМ МТХ та обмежувального клонування розведень без
МтХ; (її) окремих клітинних клонів, що секретують вкорочений гм (В00О-ЕМІ) (5-1Омкод./кл./дн., за умов відсутності сироватки), отримані з клітин НКВ11, трансфікованих рСІЗ25ОТК після ампліфікації (40О0НМ МТУ) та 70 обмежувального клонування розведень без МТХ; (ім) клонів, які секретують ко-похідну 1/-4 (селективний агоніст 1/-4, 1/-45А; мутовані по двох положеннях амінокислот Т13О0 та К121Е) (5пг/кл./дн.), отримані з НКВ11, трансфікованих реН157 після МТХ ампліфікації. Клон НКВ, що секретує ІІЇ-45А, 152 використовувався для відносно швидкого отримання малих кількостей протеїну (грамкількості).
Обговорення
Гібридні людські клітинні лінії, описані тут, відображують бажані характеристики, якими володіють їх батьківські клітинні лінії. Клітинні лінії НКВ, які отримані злиттям людських ембріональних клітин нирки (або клітин, отриманих з людських ембріональних клітин нирки) з клітинами лімфоми Беркітта (або клітинами, отриманими з клітин лімфоми Беркітта), придатні для одержані клітинних ліній з метою експресії гетерологічних протеїнів.
Початковою метою одержання гібридних клітинних ліній 2935 та 288 було повторне вирішення проблеми, пов'язаної з клітинами 2935, які мають тенденцію до агрегації при вирощуванні у суспензійній культурі (небажана характеристика). Клітини НКВ, що отримувалися в процесі гібридизації, вирощуються у вигляді моношару при культивуванні у Т-колбах. Проте, ці клітини вирощуються у вигляді клітин суспензії (не утворюють сч ов Великих скупчень) при культивуванні у вигляді суспензії. Клітини НКВ дуже легко піддаються трансфекції і продуктивність набагато вища ніж у клітин 2935. о);
Хоча явище трансформації або гібридизації, необхідне у більшості випадків для отримання стабільної клітинної лінії може приводити до змінених профілів глікозилювання |Матазийа // У. Віої. Спет. - 1989. - 264. - Р. 2415-2423), було виявлено, що НКВІ11, який є соматичною гібридною клітинною лінією, має типово с зо людські ферменти глікозилювання, наприклад, альфа(2-3) та альфа(2-6) сиаліл трансферази. Більше того, протеїни, отримані з трансфікованих клітин НКВ мають нормальні людські моделі глікозилювання альфа(2-3) та - альфа(2-6) зв'язків сиалових кислот. Ге
На довершення клітини НКВ та гібридні людські клітини, які мають бажані характеристики з кожної з батьківських клітинних ліній; а саме, які легко вирощуються у суспензійній культурі без агрегації (що ї- спостерігалося у клітин 288) і полегшують трансфекцію та бажані характеристики секреції (що спостерігалося у ї- клітин 2935). Гібридна клітинна лінія, якій надавалась перевага, НКВІ11 є негативною для іммуноглобулінової генної експресії, як і клітини 2935. Ця риса є корисною у випадках, коли бажаним є отримання рекомбінантним способом моноклональних антитіл з людських клітин. Відкриття того, що злиття людських клітин давало в результаті клітини, які мали корисні характеристики, слугує для заохочення подальших вивчень злиття з « використанням 2935 та інших клітинних ліній В-клітинного джерела, наприклад, Мата/ма та 6Е11 для отримання шв с нових комбінацій рис у гібридних клітин зі злиттям різних батьківських клітинних ліній.
Вищенаведені приклади мають намір проілюструвати винахід, як гадають, для фахівців у цій галузі будуть )» очевидними варіантами цього винаходу. Відповідно, вважається, що мета винаходу повинна обмежуватися тільки приведеною нижче формулою.
Ше
Claims (1)
- Формула винаходу -І ФО 1. Клітина, отримана злиттям клітини людської ембріональної нирки , що має походження від 293 та клітини, що має походження від лімфоми Беркітта і є клітиною 288 (депозитний номер АТСС: СНІ -12569).ї 2. Клітина за п. 1, в якій клітина людської ембріональної нирки є клітиною, що має походження від 2935. ГЕ 3. Клітина за п. 1, яка експресує гетерологічний протеїн.4. Клітина за п. З, в якій гетерологічний протеїн вибрано з групи, яка складається з ЕМ, ВОБ-ЕМІ, моноклонального антитіла, антитіла анти- ГМЕ, пі 4, «РА та ЕРО.5. Клітинна лінія людини, позначена НКВ11 (депозитний номер АТСС: СКІ-12568), придатна для рекомбінантного отримання терапевтичних протеїнів. ІФ, 6. Клітинна лінія людини, позначена НКВ11 (депозитний номер АТСС: СКІ -12568), модифікована шляхом ГІ введення гетерологічного гена і здатна експресувати гетерологічний протеїн.17. Клітинна лінія за п. б, в якій протеїном є ІСАМ-1. во 8. Клітинна лінія за п. б, в якій протеїном є ВОО-ЕМІІЇ.9. Клітинна лінія за п. б, в якій протеїном є моноклональне антитіло.10. Клітинна лінія за п. 9, в якій моноклональним антитілом є анти-ТМЕ.11. Клітинна лінія за п. б, в якій протеїном є гі! 4.12. Клітинна лінія за п. 6, в якій протеїном є ЕМП. 65 13. Клітинна лінія за п. 6, в якій протеїном є ІРА.14. Клітинна лінія за п. 6, в якій протеїном є ЕРО.15. Клітинна лінія за п. б, в якій протеїном є І/-45А (Т130/К121Е), клітинна лінія позначена 152 (депозитний номер АТСС: РТА-87).16. Клітинна лінія за п. б, в якій протеїном є людський протеїн, який має людський профіль глікозилювання.17. Спосіб отримання гібридних людських клітин, придатних для експресії гетерологічного протеїну, який містить наступні стадії: а) отримання клітин людської ембріональної нирки, що має походження від 293, які мають першу бажану характеристику, р) отримання клітин, що мають походження від лімфоми Беркітта і є клітиною 288 ((депозитний номер АТСС: 7/0 ЄтІ-12569), які мають другу бажану характеристику, с) введення в контакт клітин, отриманих на стадії а) з клітинами, отриманими на стадії Б) при умовах, за яких відбувається злиття клітин, а) відбір клітин, які отримують на стадії с) для одержання клітин, які виявляють щонайменше одну бажану характеристику кожної з клітин, отриманих на стадіях а) та б).18. Спосіб за п. 17, в якому клітинами людської ембріональної нирки є клітини 2935. с щі о с « (Се) ча і - - с і» -І -І (о) щ» Ко) Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/209,920 US6136599A (en) | 1998-12-10 | 1998-12-10 | Human hybrid host cell for mammalian gene expression |
| PCT/US1999/029332 WO2000034462A1 (en) | 1998-12-10 | 1999-12-08 | Human hybrid host cell for mammalian gene expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA77642C2 true UA77642C2 (en) | 2007-01-15 |
Family
ID=22780882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2001074776A UA77642C2 (en) | 1998-12-10 | 1999-08-12 | Human hybrid cell for expression of gene of mammals, human cell line hkb11, method for producing hybrid human cells suitable for expression of heterologic protein |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6136599A (uk) |
| EP (1) | EP1137768B1 (uk) |
| JP (3) | JP4332300B2 (uk) |
| KR (1) | KR100627753B1 (uk) |
| CN (1) | CN1230532C (uk) |
| AT (1) | ATE306547T1 (uk) |
| AU (1) | AU757188B2 (uk) |
| BG (1) | BG65263B1 (uk) |
| BR (1) | BRPI9916095B8 (uk) |
| CA (1) | CA2353698C (uk) |
| CU (2) | CU23382A3 (uk) |
| CZ (1) | CZ302677B6 (uk) |
| DE (1) | DE69927707T2 (uk) |
| DK (1) | DK1137768T3 (uk) |
| ES (1) | ES2249929T3 (uk) |
| HU (1) | HU229775B1 (uk) |
| ID (1) | ID30448A (uk) |
| IL (2) | IL143351A0 (uk) |
| NO (1) | NO330548B1 (uk) |
| PL (1) | PL205549B1 (uk) |
| RO (1) | RO121563B1 (uk) |
| RU (1) | RU2228355C2 (uk) |
| SI (1) | SI20693B (uk) |
| SK (1) | SK287888B6 (uk) |
| TR (1) | TR200101642T2 (uk) |
| UA (1) | UA77642C2 (uk) |
| WO (1) | WO2000034462A1 (uk) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6358703B1 (en) | 1998-12-10 | 2002-03-19 | Bayer Corporation | Expression system for factor VIII |
| US6136599A (en) * | 1998-12-10 | 2000-10-24 | Bayer Corporation | Human hybrid host cell for mammalian gene expression |
| US6348192B1 (en) * | 1999-05-11 | 2002-02-19 | Bayer Corporation | Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells |
| US20040235715A1 (en) * | 1999-11-12 | 2004-11-25 | Bayer Corporation | Method of producing glycosylated bikunin |
| US6569657B1 (en) * | 2000-06-27 | 2003-05-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 32140, a novel human aldehyde dehydrogenase and uses therefor |
| US7094587B2 (en) * | 2000-06-27 | 2006-08-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 16002 Molecules and uses therefor |
| US7723102B2 (en) * | 2000-09-28 | 2010-05-25 | Bayer Corporation | Enhanced transfection system |
| MY139948A (en) * | 2000-09-28 | 2009-11-30 | Bayer Corp | Enhanced transfection system |
| US20060073141A1 (en) * | 2001-06-28 | 2006-04-06 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
| KR100496861B1 (ko) | 2002-09-26 | 2005-06-22 | 삼성전자주식회사 | 하나의 핸들러에 2개 이상의 테스트 보드를 갖는 테스트장비 및 그 테스트 방법 |
| WO2004050683A2 (en) | 2002-12-02 | 2004-06-17 | Abgenix, Inc. | Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof |
| US7244616B2 (en) | 2003-06-27 | 2007-07-17 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells |
| WO2006053299A2 (en) | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Bayer Healthcare Llc | Site-directed modification of fviii |
| NZ580530A (en) | 2007-06-06 | 2012-04-27 | Domantis Ltd | Anti vegf polypeptides, antibody variable domains and antagonists |
| WO2009126564A1 (en) | 2008-04-07 | 2009-10-15 | Bayer Healthcare Llc | Methods of recombinant production of glycoproteins |
| KR101005967B1 (ko) * | 2008-04-12 | 2011-01-05 | (주)셀트리온 | 우수한 재조합 단백질을 생산하기 위한 인간 숙주 세포 |
| US9090948B2 (en) | 2008-09-30 | 2015-07-28 | Abbott Molecular Inc. | Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples |
| MY155287A (en) * | 2009-06-10 | 2015-09-30 | B T S Res Internat Pty Ltd | Methods of generating hybrid/chimeric cells, and uses thereof |
| US11401514B2 (en) | 2016-07-19 | 2022-08-02 | Brandeis University | Compositions and methods for identifying RNA binding polypeptide targets |
| EP3793596A1 (en) | 2018-05-16 | 2021-03-24 | MorphoSys AG | Antibodies targeting glycoprotein vi |
| JP2022524449A (ja) | 2019-03-14 | 2022-05-02 | モルフォシス・アーゲー | Ｃ５ａＲを標的とする抗体 |
| EP4217391A1 (en) | 2020-09-24 | 2023-08-02 | MorphoSys AG | Novel human antibodies binding to human cd3 epsilon |
| CN113604425B (zh) * | 2021-06-22 | 2022-10-18 | 中山康天晟合生物技术有限公司 | 一种适应无血清培养基环境的wayne293 lvpro细胞及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6045849B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-12 | 林原 健 | ヒトエリトロポエチンの製造方法 |
| US6136599A (en) * | 1998-12-10 | 2000-10-24 | Bayer Corporation | Human hybrid host cell for mammalian gene expression |
-
1998
- 1998-12-10 US US09/209,920 patent/US6136599A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-08-12 UA UA2001074776A patent/UA77642C2/uk unknown
- 1999-12-08 CZ CZ20012023A patent/CZ302677B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-12-08 CA CA2353698A patent/CA2353698C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 HU HU0104681A patent/HU229775B1/hu unknown
- 1999-12-08 RU RU2001119161/13A patent/RU2228355C2/ru active
- 1999-12-08 BR BRPI9916095A patent/BRPI9916095B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-12-08 EP EP99963067A patent/EP1137768B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 CN CNB998142999A patent/CN1230532C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 AT AT99963067T patent/ATE306547T1/de active
- 1999-12-08 TR TR2001/01642T patent/TR200101642T2/xx unknown
- 1999-12-08 ES ES99963067T patent/ES2249929T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 DE DE69927707T patent/DE69927707T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 ID IDW00200101235A patent/ID30448A/id unknown
- 1999-12-08 AU AU19383/00A patent/AU757188B2/en not_active Expired
- 1999-12-08 KR KR1020017007224A patent/KR100627753B1/ko active IP Right Grant
- 1999-12-08 WO PCT/US1999/029332 patent/WO2000034462A1/en active IP Right Grant
- 1999-12-08 DK DK99963067T patent/DK1137768T3/da active
- 1999-12-08 SI SI9920096A patent/SI20693B/sl active Search and Examination
- 1999-12-08 PL PL349625A patent/PL205549B1/pl unknown
- 1999-12-08 SK SK791-2001A patent/SK287888B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-12-08 RO ROA200100648A patent/RO121563B1/ro unknown
- 1999-12-08 IL IL14335199A patent/IL143351A0/xx unknown
- 1999-12-08 JP JP2000586896A patent/JP4332300B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-05-24 IL IL143351A patent/IL143351A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-06-06 BG BG105566A patent/BG65263B1/bg unknown
- 2001-06-07 NO NO20012806A patent/NO330548B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-06-07 CU CU20010130A patent/CU23382A3/es not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-08-26 CU CU20020182A patent/CU23238A1/es unknown
-
2009
- 2009-03-06 JP JP2009053279A patent/JP5508740B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-02-24 JP JP2014032748A patent/JP5826311B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA77642C2 (en) | Human hybrid cell for expression of gene of mammals, human cell line hkb11, method for producing hybrid human cells suitable for expression of heterologic protein | |
| RU2266325C2 (ru) | Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки | |
| US8361790B2 (en) | Human host cell for producing recombinant proteins with high quality and quantity | |
| AU600481B2 (en) | Method of producing peptides, recombinant plasmid for use in the same and animal cells transformed with the same | |
| JP3415840B2 (ja) | 外来蛋白質の産生方法 | |
| MXPA01005783A (es) | Celula huesped hibrida de humano para expresion de gen de mamifero | |
| Kreuzburg-Duffy et al. | Establishment and characterization of murine macrophage-like cell lines following transformation with simian virus 40 DNA deleted at the origin of replication | |
| JP2960552B2 (ja) | 動物細胞の育種方法 | |
| JP3084030B2 (ja) | 新規ハイブリドーマ | |
| SU1495375A1 (ru) | Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по тимидинкиназе дл гибридизации и трансфекции | |
| KR20220024478A (ko) | 단백질 기반 의약들 (protein-based pharmaceuticals) 의 고 수준 생산을 위한 세포주들 (cell lines) | |
| Hosoi et al. | A human-mouse hybrid cell line expressing both human leukocyte and histocompatibility-2 antigens | |
| MXPA98003051A (en) | Preparation of recombinant factor viii in a protei free medium |