SU1495375A1 - Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по тимидинкиназе дл гибридизации и трансфекции - Google Patents
Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по тимидинкиназе дл гибридизации и трансфекции Download PDFInfo
- Publication number
- SU1495375A1 SU1495375A1 SU874339112A SU4339112A SU1495375A1 SU 1495375 A1 SU1495375 A1 SU 1495375A1 SU 874339112 A SU874339112 A SU 874339112A SU 4339112 A SU4339112 A SU 4339112A SU 1495375 A1 SU1495375 A1 SU 1495375A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- cells
- strain
- hybridization
- dna
- defective
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биотехнологии. Целью изобретени вл етс получение штамма культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектного по ферменту тимидинкиназа, что необходимо дл расширени спектра клеток, пригодных дл гибридизации и трансфекции. Достигаетс это селекцией дефектных по ферменту тимидинкиназа клеток из попул ции перевиваемой линии PZC/PRF - 5 путем многоступенчатого отбора с помощью 5-бром-2-дезоксиуридина. Полученный штамм может быть использован при гибрифизации соматических клеток, а также дл трансференции рекомбинантной ДНК.
Description
Изобретение относитс к биотехнологии .
Целью изобретени вл етс получение штамма культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектного по ферменту тимидинкиназа, что необхортмо дл расширени спектра клеток, пригодных дл гибридизации и трансфекции.
Пример 1. Культивирование штамма BCKK(II) № 82Д.
Клетки мутантного штамма культивируют в среде Игла MEM, содержащей 10-15% сыворотки эмбриона коровы или бычьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 15- 20 мМ HEPES, 30-50 мкг/мп ентамицина, при 37°С в стационарных услови х. При посеве 1-210 кл/мл через 3- 5 сут формируетс монослой. Клетки
снимают с помощью растворов 0,25%- ного трипсина и 0,02%-ного, версена . в соотношении 1:9-1:10. Кратность рассева 1:3-1:5. Необходимо регул рно (через 2-4 мес культивировани ) проводить в присутствии 20 мкг/мп S-БДУ дл предотвращени образовани ревер- тантов.
Пример 2. Реверсивный анализ штамма ВСКК(11 № 82Д.
Дл проведени реверсионного анализа мутантного штамма клетки высевают в количестве 2-3-103 кл/см. Чере 2 сут ростовую среду замен ют на среду Игла MEM, содержащую 100 мкг/мп этил- метансульфоната. Клетки инкубируют с мутагеном 18-20 ч и после этого куль- тивир.уют в течение 7-10 дней (обычно 2-3 пассажа). Клетки, обработанные
01
со
.- сд
ivfyrareHOM, высевают по 1-2 10 кл/см в ростовую среду, содержащую гипо- ксантин (13,6 мкг/мл), аминоптерин (0,5 мкг/мл) и тимидин (30 мкг/мл). Смену среды провод т через каждые 3- 4 дн . На 12-14-й день культивировани клетки фиксируют с помощью 70% этанола и окрашивают 1%-ным раствором красител Унна.
Подсчет колоний (ревертантов) провод т визуально и путем г-шкроскопи- ровани (об«10, ок«7). Исследуют 1,2 кл., среди НИХ ревертанты не обнаруживают.
П р и м е р 3. Использование штам- ма дл БСКК(11) № 82 гибридизации соматических клеток.
В качестве второго партнера по сли нию используют клетки перевивае- мой линии плазмицитомы мьшейЫ5-0, дефектные по ферменту гипоксантингуа- нин-фосфорибозилтрансфераза (ГФРТ). Эти клетки, растущие в суспензии, также, как и клетки PLC/PRF-5-C4-TK, не способны размножатьс в среде ГАТ. Клетки обоих родительских партнеров подготавливают к сли нию: снимают клетки на вторые сутки культивировани , дважды отмьшают от сыво- ротки центрифугированием (1000 об/мин в течение 10 мин) в среде Игла MEM. Подсчитьшают количество жизнеспособных клеток и смешивают клетки обеих родительских линий в соотношении 1:5 (клетки PLC/PRF-5C4-TK : NS-0). После совместного центрифугировани ( (1000 об/мин в течение 10 мин) над- осадочную жидкость отсасьшают, оставл не более 50 мкл. Осадок разбива- ют поколачива11ием i по дну центрифужной пробирки.К осадку сразу же до-, бавл ют 0,5 МП 50%-ного раствора по- лиэтиленгликол (ПЭГ) с мол. массой
Дл трансфекции используют очищ ную ДНК плазмиды pFF, несущую ген ТК ВПГ-1. Клетки высевают sa один день до опыта по 1,5-10 кл/см в среду Игла MEM, содержао ую 10% диа зованной сыворотки эмбриона коровы Диализ сыворотки провод т против PBS(0,01 М NaCl, 0,1 М NaH2P04, 0, М NaHP04, рН 7,2) при +4°С в течен 48 ч. ДНК плазмиды стерилизуют пут переосаждени 80%-ным этанолом и р раствор ют в стерильном буфере В (О,1 мМ ЭДТА - 1 мМ трис-НС, рН 9 К стерильному раствору ДНК в буфер В добавл ют раствор CaCl (2М) до конечной концентрации 250 мМ. Раст вор ДНК в 250 мМ CaCl добавл ют п капл м к равному объему двухкратно буфера А (275 мМ, 10мМ КС1, 10 мМ глюкозы, 1,5 мМ Na2HP04 40 мМ HEPE рН 7,05) и инкубируют 40 мин при +
50
1 мкг на 10 клеток, высе нных в ча ки Петри диаметром 60 мм.
В качестве ДНК-носител использу высокомолекул рную ДНК спермы лосос концентрации 30 мкг на 10 кл.
1550 и осторожно ресуспевдируют клет-45 Концентраци ДНК должна составл ть ки пипеткой. Клетки вьщерживают 1 мин без перемешивани , затем раствор ПЭГ быстро развод т, добавл 10 мл среды без сыворотки.
Суспензию клеток распредел ют в чашки Петри по 2-10 кл/см , Через 30 мин осторожно отсасывают культу- ральную жидкость и. добавл ют ростовую среду, содержащую 3%- сыворотки . эмбриона коровы. Клетки инкубируют при 37°С в атмосфере 7,5% СО. Через 24 ч среду замен ют на новую, содержащую 10% сыворотки эмбриона коровы. Еще через 24 ч клетки снимают: растуСреду из чашки сливают, клетки промывают PBS (рН 7,2), добавл ют преципитат ДНК-фосфат кальци (1,5 на чашку) и инкубируют 2,5-3 ч при 55 37-С в атмосфере 7,5% СО. Затем клетки промывают средой без сьшорот и заливают среду Игла MEM, содержащ 3% сыворотки эмбриона коровы, диали зованной против PBS (рН 7,2). Спусщие в суспензии - путем встр хивани а прикрепленные к субстрату - с помощью раствора версена с трипсином. Клетки высевают по кл/см в селективную среду ГАТ (гипоксантин 13,6 мкг/мл, аминоптерин 0,5 мкг/мл, тимидин 30 мкг/мл). Смену среды провод т через каждые 2-3 дн . Через 10-14 сут после сли ни обнаруживают гибридные колонии. Клонирование провод т с использованием металлических цилиндров. Клонированные гибридные клетки культивируют в ростовой среде содержащей 13,6 мкг/мл гипоксантина, 15 мкг/мл тимидина, 5 мкг/мл глиитдна до получени массовых культур (обычно 7-10 дней).
Пример 4. Использование штамма BCKK(II) № 82 дл трансфекции ДНК плазмидой, содержащей ген ТК вируса простого герпеса I (БПГ-1).
Дл трансфекции используют очищенную ДНК плазмиды pFF, несущую ген ТК ВПГ-1. Клетки высевают sa один день до опыта по 1,5-10 кл/см в среду Игла MEM, содержао ую 10% диали зованной сыворотки эмбриона коровы. Диализ сыворотки провод т против PBS(0,01 М NaCl, 0,1 М NaH2P04, 0,01 М NaHP04, рН 7,2) при +4°С в течение 48 ч. ДНК плазмиды стерилизуют путем переосаждени 80%-ным этанолом и раствор ют в стерильном буфере В (О,1 мМ ЭДТА - 1 мМ трис-НС, рН 9). К стерильному раствору ДНК в буфере В добавл ют раствор CaCl (2М) до конечной концентрации 250 мМ. Раствор ДНК в 250 мМ CaCl добавл ют по капл м к равному объему двухкратного буфера А (275 мМ, 10мМ КС1, 10 мМ глюкозы, 1,5 мМ Na2HP04 40 мМ HEPES, рН 7,05) и инкубируют 40 мин при +4
Концентраци ДНК должна составл ть
1 мкг на 10 клеток, высе нных в чашки Петри диаметром 60 мм.
В качестве ДНК-носител используют высокомолекул рную ДНК спермы лосос концентрации 30 мкг на 10 кл.
Концентраци ДНК должна составл ть
Среду из чашки сливают, клетки промывают PBS (рН 7,2), добавл ют преципитат ДНК-фосфат кальци (1,5 мл на чашку) и инкубируют 2,5-3 ч при 37-С в атмосфере 7,5% СО. Затем . клетки промывают средой без сьшоротки и заливают среду Игла MEM, содержащую 3% сыворотки эмбриона коровы, диали- зованной против PBS (рН 7,2). Спус5
т 10-14 ч среду замен ют на свежую содержащую 10% сыворотки.
Через 24 ч клетки рассеивают по 1-10 кл/см в чашки Петри диаметро 100 мм в среде ГАТ (гипоксантин 30 мкг/мп), аминоптерин 0,5 мкг/мл и тимидин 50 мкг/мл). Смену среды осуществл ют через каждые 2-3 дн . Через 10-14 дней обнаруживают коло- НИИ трансформантов.
Пример 5. Определение продукции HBSAg в клетках штамма ВСКК (11)82.
Культуральную жидкость при культивировании клеток предлагаемого i штамма используют дл тестировани HBSAg в РПГА (реакци пассивна гена г глютинации) .
Диагностический набор (производг ства Горьковского НИИЭМ) представл ет
с 0
5
0
756
собой стабилизированные эр троииты кур, сенсибилизированные антителами к HBSAg. Результаты тестированкл показывают , что титр HBSAg измен етс в пределах 1:4-1:64, в зави- имости от состо ни клеток культуры.
С помощью реакции иммунофлюоре- сценции (пр мой и eпp мoй вариант с использованием моноклональных антител к HBSAg) изучают зкспрессию HBSAg в клетках.
Экспрессию HBSag наблюдают у 45- 50% ,клеток попул ции на 4-6 сут культивировани .
Claims (1)
- Формула изобретениШтамм культивируемых клеток ге- (Патокарциномы человека BCKK(II) № 82Д, Дефектный по ти tидинкинaзe дл гибридизации и трансфекции.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU874339112A SU1495375A1 (ru) | 1987-11-05 | 1987-11-05 | Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по тимидинкиназе дл гибридизации и трансфекции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU874339112A SU1495375A1 (ru) | 1987-11-05 | 1987-11-05 | Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по тимидинкиназе дл гибридизации и трансфекции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1495375A1 true SU1495375A1 (ru) | 1989-07-23 |
Family
ID=21340509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU874339112A SU1495375A1 (ru) | 1987-11-05 | 1987-11-05 | Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по тимидинкиназе дл гибридизации и трансфекции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1495375A1 (ru) |
-
1987
- 1987-11-05 SU SU874339112A patent/SU1495375A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Авторское свидетельство СССР PJ275905, кл. С 12 N 5/00, 08,08.86. Цитологи . 1985, т. 27, № 2, с. 221-228. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schwartz et al. | Correction of a genetic defect in a mammalian cell | |
| Kennett | [28] Cell fusion | |
| Peehl et al. | Anchorage-independent growth of normal human fibroblasts. | |
| Sun et al. | Staining method for the banding patterns of human mitotic chromosomes | |
| ES2249929T3 (es) | Celula hospedadora hibrida humana para la expresion de genes de mamiferos. | |
| JP2010226991A (ja) | シート状細胞培養物の製造方法 | |
| CN1240831C (zh) | 微载体培养中国仑鼠卵巢细胞生产异源性分泌蛋白质的方法 | |
| Lewis et al. | Isolation of hydroxyurea-resistant CHO cells with altered levels of ribonucleotide reductase | |
| Roscoe et al. | Isolation of temperature sensitive mammalian cells by selective detachment | |
| SU1495375A1 (ru) | Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по тимидинкиназе дл гибридизации и трансфекции | |
| CN102057038B (zh) | 用于以高品质和高数量制造重组蛋白的人类宿主细胞 | |
| Lazarus et al. | Cultivation of hematopoietic cells | |
| Capstick | Studies on Cells in Culture: Growth of Baby Hamster Kidney Cells in Suspension | |
| JP7002497B2 (ja) | シート状細胞培養物の製造方法 | |
| US4229541A (en) | In vitro cultivation of horseshoe crab amebocytes | |
| JP6546219B2 (ja) | シート状細胞培養物の製造方法 | |
| JPH074237B2 (ja) | ヒト又は動物細胞の不滅化法 | |
| Misfeldt et al. | Complementation of the plaque-forming cell responses of T-cell-deficient nude mice by a T-cell hybridoma. | |
| SU1645296A1 (ru) | Штамм культивируемых гибридных клеток животных МUSмUSсULUS L - продуцент моноклональных антител против фактора Н @ эритроцитов крупного рогатого скота | |
| Klebe | Genetic mapping of a human regulator gene | |
| RU2184776C1 (ru) | Мутантная линия клеток почки овцы ovis arie l, дефектная по тимидинкиназе по-100-тк-, для гибридизации клеток животных in vitro | |
| HANAOKA et al. | Assignment of the human gene for DNA polymerase α to the X chromosome | |
| RU1791453C (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к мембраносв занной и растворимой формам Н-антигена человека | |
| Peterson | [54] Cell hybridization | |
| RU1807079C (ru) | Способ получени атоксигенных вариантов возбудител сибирской звы |