RU1807079C - Способ получени атоксигенных вариантов возбудител сибирской звы - Google Patents

Abstract

Использование: микробиологи , сибирска   зва, возбудитель, атоксигенность, отбор , селекци . Сущность изобретени : в плотную питательную среду ввод т в концентрации 15-25% коммерческую лечебную антитоксическую сыворотку, засевают 105- 10 спор культуры, ингибируют при 37°С в атмосфере 6-25% углекислого газа в течение 18-24 ч и колонии атоксигенных клонов отсевают иглой на свежую среду. Способ обеспечивает атоксигенность всех полученных вариантов В. anthrans. 4 табл.

Description

Изобретение относитс  к медицине, а более конкретно к микробиологии и иммунологии .

Целью изобретени   вл етс  упрощение и ускорение способа. Эта цель достигаетс  тем, что в среду дл  выращивани  В. anthracis ввод т в концентрации 15-20% коммерческую лечебную антисибире звенную сыворотку, содержащую антитоксические антитела, которые в специальных услови х ингибируют рост токсигенных клеток , но не ингибируют рост вариантов, не имеющих плазмиды токсигенности, т.е. атоксигенных.

Этот неизвестный ранее дл  В. anthracis эффект про вл етс  в первые 18- 24 ч инкубации, при последующем выращивании Тох+ - клетки прорастают. Дальнейшее упрощение и ускорение способа достигаетс  зй счет отказа от необходимости исследовать выросшие колонии на отсутствие (наличие) токсинопродукции по

вышеперечисленным тестам, примен емым в известном способе.

Описанные принцип и система вы влени  атоксигенных вариантов в полной мере осуществимы на бескапсульных штаммах В.. anthracis. Поэтому при необходимости получени  атоксигенных вариантов из попул ции капсульных штаммов необходимо предварительное выделение из них бескап- сульныл клонов..

Испытуемую культуру засевают на полусинтетическую среду известного состава (Haines et al., 1965) с добавлением агарозы. Данна  среда обеспечивает получение изолированных колоний атоксигенных вариантов В. anthracis. Посевы инкубируют в течение ч. при 37°С в атмосфере 6- 25% С02. Посевной материал нанос т на плотную среду.в дозе, не меньшей 10°-10 клеток.

Сочетание указанных приемов позволило достичь указанной цели и обеспечить

ел

С

со

О vj

О

3

токсигенность всех получаемых вариантов . anthracis.

Пример 1. Получение атоксигенных ариантов из попул ции бескапсульных акцинных штаммов В. anthracis СТИ и терне.

Готовитс  среда следующего состава Haines В. W., Klein F. a. Lincoln R. Е. uantitative assay for crude anthrax toxins //J. acteriol. - 1965. - v. 89- № 1. - P. 74-83), г/л:

CaCl2 2 H207,36 MgS04 7 H20 9,9 MnS04 H20 0,9 KH2P04 680,0 К2НРСм 872,0 NaHCOa 9900,0 Тиамин HCI 0,5 Аденин-сульфат 2,0 Урацил 1,4 Л-триптофан 52,0 Л-цистеин 1,0 -Л-глицин 15,0 Казаминовые кислоты 3600,0 Глюкоза 2000,0 .Агароза . До 2% Дистиллированна  вода До 1 л рН среды . 8,5 Непосредственно в день работы в расплавленную и охлажденную до 45°С среду внос т коммерческую лечебную антисибире звенную сыворотку до 20%, бикарбонат и глюкозу; среду разливают в чашки Петри. Инокулум В. anthracis дл  посева на среду готов т в концентрации 10 клеток на 1 мл. Засевают на пластинки среды пипеткой по 0,1 мл или петлей из агаровой колонии 1-2 сут возраста. Общее количество клеток внесенных на пластинку агара должно быть не менее 105.

Чашки инкубируют при 37°С в атмосфере С02 (от 6 до 25%) в течение 18-24 ч. Вырастающие колонии  вл ютс  атоксиген- ными вариантами, их отсевают на свежую среду иглой. Колонии, вырастающие после 26 ч.инкубации,  вл ютс  Тох+-вариантами. Атоксигенность полученных клонов по предлагаемому способу удостовер етс  методами ин виво (заражение крыс линии Фишер или внутрикожной пробой на морских свинках с культуральной жидкостью исследуемых клонов) и ин витро (иммунодиффу- зи  с антитоксической сывороткой и плазмидный анализ).

Пример 2. Получение атоксигенных вариантов из попул ции капсульнь х вирулентных штаммов В. anthracis 88/1 и 44/1. Взвесь спор (не менее 10 /мл) по 0,1 мл высевают на пластинки упом нутой среды,

содержащей 20% нормальной лошадиной сыворотки. Посев инкубируют 1-2 сут в атмосфере 6-25% С02 при 37°С. Среди выросших слизистых колоний (капсульные клоны)

отбирают шероховатые колонии или секторы колоний (бескапсульные клоны). Последние высевают на данную среду с антисибире звеиной сывороткой (см. при- мер 1) и через 1 сут снимают атоксигенные

клоны.

Пример 3. Получение атоксигенных вариантов В. anthracis СТИ и Стерне в присутствии разных концентраций иммунной сыворотки. Все этапы работы те же, что и в

5 примере 1, за исключением того, что сыворотку ввод т в концентрации 10,15, 25,30%. Результаты отражены в табл. 1.

Таким образом, оптимальной концентрацией антисибире звенной сыворотки дл 

0 получени  Тох вариантов  вл етс  15-25%. Пример 4. Получение атоксигенных вариантов В. anthracis Сти и Стерне в зависимости от концентрации посевного, материала . Все этапы опыта те же, что и в

5 примере 1, за исключением того, что дозы посевного материала варьировали: 10 , 10 , 105 и 107 спор. Результаты отражены в табл. 2.

Таким образом, оптимальной дл  п.ол0 учени  Тох вариантов  вл етс  посевна  доза 105-107 спор.

При м.е р 5. Получение атоксигенных вариантов В. anthracis Сти и Стерне в зависимости от концентрации С02. Все этапы

5 опыта те же, что и в примере 1, за исключением того, что посевы выращивали при разных концентраци х С02. Результаты отражены в абл. 3,

Из табл. 3 видно, что существенным

0 фактором  вл етс  наличие С02 в инкубаторе (при концентрации газа меньше чем 6% наблюдаетс  недифференцированный рост обоих типов колоний). Повышение концентрации газа более 6% не вли ет на результат.

5П р и м е р 6. Получение атоксигенных вариантов при различных сроках инкубации .

Все этапы опыта те же, что и в примере 1, за исключением того, что посевы выращи0 вали 10, 18, 24 и 36 ч. Результаты отражены в табл. 4.

Таким образом, оптимальный срок инкубации культур по предлагаемому способу 18-24ч.

5 Суммиру  вышеизложенное можно заключить , что предлагаемый способ позвол ет получать атоксигенные варианты В. . anthracis, Последние могут найти применение при генетических исследовани х (дл  изучени  признака токсинообразовани  у

микроба, дл  внедрени  в бесплазмидные штаммы любых других плазмид с полезными свойствами), а сам способ может быть применен при исследовании соотношени  числа Тох+ (иммуногенных) и Тох (неимуно- генных) клеток в попул ци х культур В. anthracis, предназначенных дл  использовани  в качестве вакцин.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  атоксигенных вариантов возбудител  сибирской  звы путем посева спор в питательную среду, инкуби0

   ровани  в услови х, обеспечивающих элиминацию плазмиды токсигенности,с последующим пересевом и скринингом колоний на плотной питательной среде, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  и ускорени  способа, дл  посева используют плотную питательную среду, включающую 15-25% лечебной антисибире звенной сыворотки , засевают спорами в концентрации 10-107 кл/см3, а инкубируют при 37°С в атмосфере 6-25% углекислого газа в течение 18-24 ч.

   Таблица 1

   Зависимость выхода Тох - вариантов от различных концентраций антисибире звенной

   сыворотки

   Обозначени : + - наличие колоний Тох - вариантов - - отсутствие роста х - совместный рост Тох и Тох+ - вариантов.

   Учет роста Тох - колоний пр разной посевной дозе

   Обозначени  те же, что и в табл. 1

   ± - редко встречающиес  Тох -колонии.

   Таблица 3 Зависимость выхода Тох - вариантов от различных концентраций СОа

   Обозначени  те же, что и в табл. 1

   Таблица 2

   .7. 1807079 8

   Таблица 4 Учет роста колоний Тох -вариантов при различных сроках инкубации