JPH074237B2 - ヒト又は動物細胞の不滅化法 - Google Patents

ヒト又は動物細胞の不滅化法

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JPH074237B2
JPH074237B2 JP62200109A JP20010987A JPH074237B2 JP H074237 B2 JPH074237 B2 JP H074237B2 JP 62200109 A JP62200109 A JP 62200109A JP 20010987 A JP20010987 A JP 20010987A JP H074237 B2 JPH074237 B2 JP H074237B2
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ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、不滅化した即ち永久培養可能な細胞系の製法
に関する。
従来の技術 通常のヒト及び動物の細胞は培養において限定された寿
命を有する。細胞は一定の培加時間で増殖するか又は細
胞サウクルのG0/G1期の静止細胞のままでとどまり得
る。細胞が増殖する際に、培養における老化の開始は細
胞の型、令、並びに供与体の種に左右される。腫瘍形成
細胞系は無限に培養することができるが、正常な老化す
る細胞とは多くの性質において異なつている。
例えば、ヒトの末梢血液からのリンパ球は細胞サイクル
の静止期（G0/G1）にあるが、培養においては、増殖期
に入りかつ成熟（分化）するように様々に励起される。
静止期のＢリンパ球は抗原、Ｂリンパ球発育因子、ある
いはＴリンパ球と発育因子（インターロイキン:Interle
ukin）による刺激によつて増殖しかつ成熟する。同様
に、Ｔリンパ球は細胞分裂を励起する物質（分裂促進
剤）又は特異的な成長因子により培養において増殖しか
つ成熟し得る。正常なリンパ球の長時間培養は培地中の
相応する発育因子又は抗原の存在に左右される。更に、
ヒトリンパ球は培養においてウイルスの感染によつても
永久増殖するように励起することができる。その際に、
この細胞は正常なリンパ球の性質のいくつかを失ない、
かつ腫瘍形成性リンパ球と共通している新しい性質を持
つ。E-Bウイルス（Epstein-Barr Virus）は培養におい
て感染後に、C-3レセプター及びE-Bウイルスレセプター
が著しいヒトＢリンパ球の亜族を励起して絶えず増殖さ
せる。その際に、リンパ球は早期の分化工程に維持され
る。これに対して、ヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウイル
ス（HTLV）、型Ｉ、IIは、一定の表面成分OKT4＋マーカ
ーによつて特徴付けられるＴリンパ球をほぼ専ら感作す
る。若干の細胞系は、HTLV感作後でもこの増殖に関して
Ｔリンパ球発育因子に左右される。
更に、永久細胞系は細胞／細胞融合により得ることがで
きる。その際には、例えばリンパ球を無限に分裂性の系
の細胞（例えば骨髄腫、リンパ腫細胞、E-Bウイルス感
作したリンパ様細胞）と融合し、引続いて生成した雑種
細胞を優先的に増殖し得るように選択する。この雑種細
胞は出発細胞の２倍の染色体一組を有しかつ部分的に次
の細胞世代において正常な出発細胞（リンパ細胞）の染
色体を失なう。その際に例えば抗体、表面蛋白質、分泌
蛋白質の産生又は細胞の他の合成能のような雑種の所望
の性質が再び失なわれ得る。永久的な細胞系を取得する
ためのこの細胞融合法は、リンパ球及び神経細胞にのみ
適用可能である。
ヨーロツパ公開特許第83104243:7号明細書からは、正常
細胞から、形質転換された細胞の非増殖性フラグメント
と融合し、かつ培地中で選択物質なしに培養することに
より不滅化されたヒト又は動物の細胞を製造することが
公知である。この際、非増殖性フラグメントとしては細
胞質体も使用することができる。これにより、任意の動
物及びヒトの細胞を不滅化し、同時に選択物質を使わな
いことにより収率を高めることができる。更に、細胞／
細胞‐融合で引続いて培養する際に後からしばしば起る
前記の細胞特性の変化が回避される。しかしながら収率
及び不滅化した細胞の不滅性を更に改良することが所望
された。
発明が解決しようとする問題点 本発明は、不滅化収率及び不滅化した細胞の性質を更に
改良するという課題に基いている。
問題点を解決するための手段 本発明によりこの課題は、永久培養可能な細胞の非増殖
性フラグメントとトランスフエクシヨンしかつそれを培
地中で選択物質なしに培養することによりヒト又は動物
細胞を不滅化する際に、永久培養可能なヒト又は動物の
細胞の細胞質から得られたDNAを不滅化すべき細胞とト
ランスフエクシヨンすることを特徴とする該方法により
解決される。ここで非増殖性フラグメントとは、自体全
く固有の複製能または増殖能を有していない生物学的遺
伝材料を表わす。
本発明により、培養において無限に増殖可能な細胞系が
得られ、その際に細胞系の確立の一定の欠点は細胞融合
又は化学的発癌因子並びに形質転換するウイスルによる
感作により回避される。本発明方法により得られた細胞
系はほぼその正常特性を保持し、このことは細胞の多様
な使用を可能にする。
得られた細胞系は細胞特異的な外因性発育因子と関係な
く成長する。
本発明方法は、リンパ球等のような免疫系の細胞、結合
組織細胞、分化した器官細胞、上皮細胞等を含めて任意
のヒト又は動物細胞の不滅化に使用することができる。
本発明により、これらの細胞の不滅化は、永久培養可能
なヒト又は動物細胞の細胞質から得られる一定の種類の
DNAの導入（トランスフエクシヨン）により行なう。そ
れ故、細胞核DNA（ゲノムDNA）を使うのではなく、核の
周囲の細胞質から単離可能なDNAを使用する。それ故、
このDNAを取得するために細胞質体から出発する。トラ
ンスフエクシヨンされたDNAを取得するための永久培養
可能なヒト及び動物細胞として腫瘍細胞又は他の方法で
不滅化した非腫瘍発生細胞例えば本発明方法により既に
製造された不滅化細胞を使用することができる。特に良
好な結果は、トランスフエクシヨンされたマウスL-細胞
（L-929細胞、ATCC CCL1）、マウス骨髄腫細胞（Ag8.65
3細胞ATCC CRL-1580）、エールリヒ腹水細胞（EAZ、ATC
C CCL77）又はヒト白血病細胞（例えばヒーラ229、ATCC
CCL2.1）の細胞質からのDNAの使用下に得られる。腫瘍
細胞系及び不滅化した非腫瘍発生系が極めて多数存在す
ることを鑑みれば、それを列挙することは不可能であ
る。しかしながら細胞質DNAの永久培養可能な細胞系と
しての適性は、簡単にこのDNAを単離しかつそれをトラ
ンスフエクシヨンされた正常細胞の成長特性を試験する
ことにより確認することができる。
細胞質DNAの獲得は、単離した細胞質あるいは有利に細
胞質体から出発して行なう。細胞質体から出発する際
に、これをまず初めに溶解しかつ可溶性の溶解液をプロ
テイナーゼと共に恒温保持する。インキユベーシヨン混
合物の可溶性分からDNAを公知方法により分離する。好
適な方法は密度勾配を介して、例えばCsCl〔Nucleid Ac
id Research and Molecular Biology"、３、１〜32（19
64）〕により、アフイニテイクロマトグラフイ又は電気
泳動分離〔Mariatis,Fritsch,Sambrook編、“Molecular
Cloning"、Cold Spring Harbour Lab（1982）〕を介し
て及びDNA-溶剤による抽出を介して単離することであ
る。DNA-溶剤で抽出し、抽出物をRNアーゼと恒温保持し
かつ遊離DNAを再びDNA-溶剤で抽出して分離すると優れ
ている。例えばアルコールで沈殿することにより細胞質
DNAを単離することができる。細胞質体ではなく、既に
別個に単離した細胞質から出発する場合、明らかに初め
に行なう小胞の溶解は不要である。
他の優れた実施形では核DNAを除いた細胞質フラクシヨ
ンからのトランスフエクシヨン用DNAを使用する。この
細胞質フラクシヨンの製造は、例えば細胞を３ミリモル
／ MgCl2〔“Meth.Enz."、31 253〜262頁（1974
年）〕の存在におけるナトリウムドデシルサルフエート
（SDS）又はエチルフエニルポリエチレングリコール（N
P40、Roth社、西ドイツ）で溶解するかあるいは細胞をN
aCl及びSDSで溶解し〔Hirt-抽出、“J.Mol.Biol."、2
6、365〜369頁（1967年）〕かつ引続いて遠心すること
により行なうことができる。このようにして得られた上
澄みは核DNAを含まない。この上澄みから、トランスフ
エクシヨン用DNAが前記のようにして得られる。
他の特に優れている実施形では、ミトコンドリア不含の
細胞質フラクシヨンからのトランスフエクシヨン用DNA
を使用する。例えば、このフラクシヨンは細胞質からス
クロース勾配による勾配遠心を介して単離することがで
きる。
細胞質のミトコンドリア不含のDNAフラクシヨンの不滅
化活性度は、細胞質体からのDNAで得られる活性度より
も約10倍高いことが判明し驚異的であつた。
DNA-溶剤は、DNAを含有する媒体からの抽出に好適であ
る場合には当業者に公知の、このために好適である溶剤
を使用することができる。水溶液には、DNA-溶剤として
は特にフエノール及び／又はクロロホルム‐イソアミル
アルコール混合物が抽出に好適である。
不滅化すべき細胞は殊に成長もしくは分裂に対して励起
された状態で、細胞質DNAとのトランスフエクシヨンに
使用する。この状態への変換は当業者に公知の方法、例
えば“ポーク・ウイード分裂促進剤（poke-weedmitoge
n）”を細胞含有媒体に添加することにより行なう。プ
ロテイナーゼとしては、当業者に公知のプロテナーゼ、
殊にプロテイナーゼＫを使用する。RNアーゼとしてはRN
アーゼＡが優れている。
不滅化すべき正常細胞としてリンパ球を使用する場合、
増殖期Ｉのものを使用すると優れている。増殖期Ｉと
は、分裂促進剤（例えばポーク・ウイード分裂促進
剤）、抗原等を用いてリンパ球を刺激した後で増殖が行
なわれる時期を表わす。
得に良好な結果は、本発明により得られた不滅化細胞
（一次トランスフエクタント）から得られる全DNAを他
の方法工程で正常なヒト又は動物の細胞にトランスフエ
クシヨンしかつこのようにして特に高い収率で更に永久
培養可能である二次トランスフエクタントを獲得する場
合に得られる。第２のトランスフエクシヨンの正常細胞
としては第１のトランスフエクシヨンと同種の細胞か又
はそれとは異なる細胞を使用する。
細胞質体の取得にあたつては、培養における細胞が媒体
中でサイトカラシンＢ（菌類からの作用物質）により作
用を受けて、細胞表面上でくびれ込む小胞（細胞質体）
を形成する。遠心力の作用により細胞質体と残りの細胞
との間の結合が切断されかつ細胞質体と核含有残細胞
（核質体）から密度勾配で遠心分離により単離すること
ができる。細胞質体を単離するこれらの方法は、例えば
M.M.Wigler及びI.B.Weinstein共著、“ア・プレパライ
テブ・メソード・フォー・オブテイニング・イニユーク
リエイテツド・ママリアン・セルズ（A preparative Me
thod for obtaining enucleated mammalian cells）”
〔“Biochem.Biophys.Res.Comm."、63、669〜674頁（19
75年）〕に記載されている。引続いて、本発明方法によ
り細胞質体を溶解し、DNAをそれから単離しかつ目的細
胞に変換する。場合により本発明で使用するDNAは、本
発明方法により得られた永久培養可能な細胞から取得す
ることができる。その際に細胞中に含まれる全DNAを当
業者に公知の方法により単離する。このDNAを公知方法
により目的細胞に変換する。
本発明の基本的特徴は、DNA受容後に、永久増殖する細
胞が選択物質を用いずに培地中で選択作用する。この点
で本発明方法は、専ら雑種細胞の増殖について選択作用
しかつ出発細胞の増殖に対抗して選択作用すべきである
細胞融合法とは異なつている。培地中で選択物質に対し
て敏感ではなく、それ故直ちに正常細胞との細胞融合に
は使用することのできない永久成長する細胞系は多数あ
る。本発明方法ではこの限定は除かれかつこれらの細胞
の原形質体から永久増殖性の細胞系を確定するのに使用
することのできるDNAを単離することができる。
確定されたヒト及び動物の細胞系からは、細胞産生物、
例えば免疫グロブリン、血液凝固因子、リンフオカイ
ン、発育因子、ホルモン、酵素、表面蛋白質、糖蛋白
質、リポ蛋白質、サツカリド等を無制限の量で取得する
ことができる。診断及び治療のために、永久増殖性ヒト
Ｂリンパ球からヒトモノクロナール抗体を取得すること
ができる。リンフオカインをヒトＴリンパ球及びマクロ
フアージから産生することができる。更に、永久増殖性
細胞を異種遺伝子産生物の製造に使用することができ
る。この際に、異種遺伝子産生物についての遺伝情報が
本発明により得られた永久増殖性細胞に伝達され、そこ
で発現される。哺乳動物の細胞のゲノムによるのではな
くて細胞のE.コリ（Coli）のゲノムにより暗号付けされ
る酵素キサンチン‐グアニン‐ホスホトランスフエラー
ゼについての遺伝情報を永久増殖性細胞中に導入するこ
とができ、そこで発現することを明らかにすることがで
きた。得られた細胞系は、細菌性酵素を合成し、それ故
新しい代謝活性を含有する。更に、本発明により得られ
た無限に培養可能な細胞系を突然変異試験及び毒性試験
で並びに作用物質の薬理試験に使うことができる。
本発明により、比較的僅少量でしか単離し得ない一定の
分化度の細胞を不滅化しかつ大規模に培養できるはずで
ある。このようにして、所望の細胞産物の物質代謝特性
又は合成能を有する、これらの不滅化した細胞のDNA並
びにRNAを、所望の細胞産物についての遺伝情報の単離
に十分な量で取得することができる。本発明のこの適用
形では、適当な操作により、遺伝情報を媒介物を用いて
他の真核細胞あるいは細菌並びに真菌に伝達しかつこの
ために開発された条件下に所望の細胞産物を製造するた
めに発現される。所望の細胞産物を異種宿主から任意の
量で取得することができる。
実施例 次に本発明を実施例により詳説する。
例 １ 末梢血液からのヒトリンパ球の不滅化 材料： サイトカラシンＢ（Sigma）、リンフオプレプ（Lymphop
rep;Nyegaard、Oslo在）、イスコブズ（Iscove′ｓ）DM
EM（Iscove′s modifiziertes Dulbecco′s Minimal Ea
gle′s Medium;Boehringer Mannheim）、胎生小牛血清
（Sebio）、DEAE-デキストラン（Pharmacia）、フイコ
ル（Ficoll、Pharmacia）、ポリエチレングリコール（B
oehringer Mannheim） 方法： 1.末梢血液からのヒトリンパ球の単離 成人供与者の末梢血液を公知方法でヘパリン処理しかつ
３ミリモルクエン酸、100ミリモルデキストロース、70
ミリモルnaCl、30ミリモルクエン酸Na（pH6.1）中で３
倍に稀釈した、リンパ球を他の核含有細胞（顆粒白血
球、単核白血球等）からリンフオプレプ（Metrizoat）
勾配（Naygaard、Oslo）中、400×ｇで、35分間遠心す
ることにより分離した〔A.Boyum著、“A one-stage pro
cedure for isolation of granulocytes and lymphocyt
es from human blood"、“Scand.J.Clin.Invest."、2
1、補遺97:51〜76（1968年）〕。リンパ球をホスフエー
ト緩衝生理食塩水（PBS）（136ミリモルNaCl、2.7ミリ
モルKCl、1.5ミリモルKH2PO4、6.5ミリモルNa2HPO4、0.
4ミリモルMgSO4、0.7ミリモルCaCl2、pH7.4）中で３回
洗いかつイスコブズDMEM、４ミリモルL-グルタミン、１
ミリモルピルベート、１ミリモルオキサル酢酸、0.1U/m
lインシユリン、10μg/mlトランスフエリン、15％胎生
小牛血清中、細胞３×106/mlの細胞密度、37℃、５％CO
2で培養した。
2. 不滅化DNAの単離 不滅化用DNAをマウスL929-細胞の細胞質体から取得す
る。サイトカラシンＢとの恒温保持による、トランスフ
エクシヨン細胞の細胞質体の誘導及び単離は文献に記載
されている〔E.Allikmets,I.Vasil′ev,I.Rovenskii共
著、“Effect of cytochalasins on the surface topog
raphy of neoplastic cells in suspension"、“Bull.E
xp.Biol.Med."95、84〜87（1984）;M.M.Wigler.I.B.Wei
nstein共著、"A preparative method for obtaining en
ucleated mammalian cells"、“Biochem.Biophys.Res.C
omm"、63、669〜674（1975）〕。次のように実施すると
優れている： 指数的に成長するL929-細胞をトリプシン処理し、血清
不含のDMEM中で洗いかつ細胞106個/mlの密度でサイトカ
ラシンＢ（50μg/ml）と37℃で恒温保持する。90秒で細
胞質体が生成し、これは細胞表面でくびれ込んでいる。
細胞質体を細胞から強力な懸濁化により分離する。残り
の細胞を100×ｇで10分間遠心することにより沈降させ
る。上澄み中の細胞質体を1200×ｇで15分間遠心するこ
とにより沈降させかつ血清不含のDMEM、15％フイコル
（Pharmacia）中に再懸濁させる。残りの核含有小胞か
ら、細胞質体を血清不含のDMEM中の25％フイコル2ml、1
7％フイコル2ml、16％フイコル0.5ml、15％フイコル0.5
ml、12.5％フイコル2mlを含む勾配（下部から上部へ）
において100000×ｇで60分間30℃で遠心することにより
分離する。15〜16％フイコル領域の細胞質体バンドを集
めかつ２回血清不含のDMEM中、1200×ｇで、15分間遠心
する。
DNAの単離に当つては、細胞質体沈殿物を血清不含のDME
M200μに再懸濁させ、50ミリモルトリス、pH7.2、10
ミリモルEDTA、1.5ミリモルMgCl2、5mlを添加する。細
胞質体をNP40（Roth）２μの添加により溶解しかつ溶
解液を14000×ｇで15分間遠心する。上澄みにプロテナ
ーゼＫ（100μg/ml、Boehringer Mannheim）を加え、37
℃で２時間恒温保持しかつフエノールで２回抽出する。
引続いて、上澄みをRNアーゼＡ（100μg/ml、Boehringe
r Mannheim）と一緒に37℃で１時間恒温保持し、プロテ
イナーゼＫ（100μg/ml、Boehringer Mannheim）を添加
しかつ再度２時間恒温保持する。DNAをそれぞれ２回フ
エノール及びクロロホルム／イソアミルアルコール（2
4:1）でかつエーテルで１回抽出し、エタノール中で沈
殿させかつ10ミリモルトリス、0.1ミリモルEDTA、pH7.5
中に取る。収量はDNA約５μg/108個（細胞質体）であ
る。
3. 不滅化用DNAをヒトリンパ球へ導入方法１により調
製したリンパ球（細胞２×108個）を当業者に公知の条
件下に“ポークウイード分裂促進剤”（PWM、10μg/m
l）により成長に対して励起しかつ２日後にそれぞれ細
胞108個の２つの平行培養物（A,B）に分離する。培養物
Ａの細胞を方法２により得られたL929-細胞の細胞質体
からのDNAと恒温保持する。培養物Ｂの細胞を培養物Ａ
と同様に処理するが、但し導入すべきDNAは恒温保持培
地には存在していない。引続いて、リンパ球を“HEPES
緩衝生理食塩液”（HeBS;20ミリモルHEPES、137ミリモ
ルNaCl、0.5ミリモルKCl、３ミリモルグリコース、pH7.
1）中で３回洗いかつDEAE-デキストラン（MW500000、He
BS0.3mg/ml）と細胞106個/mlの密度で37℃で洗う。L929
細胞質体からのDNA（３μｇ）を250ミリモルCaCl2100μ
に加えかつこの溶液を２倍濃縮のHeBS（100μ）に
ピペツト滴加する。リンパ球を細胞５×106個/mlの密度
で37℃でこのDNA溶液と恒温保持する。引続いて、リン
パ球を１回HeBS中37℃で洗い、HeBS0.8ml中に再懸濁し
かつ90秒間ポリエチレングリコール（MW4000、500mg/HE
BS ml、pH7.1）0.5mlと37℃で90秒間恒温保持する。５
分間にわたつて、温いHeBS5mlをピペツト添加し、リン
パ球を２回HeBS中で洗い、細胞107個/mlの密度で24穴微
量滴定皿（1ml/穴１個）中のイスコブズDMEM、４ミリモ
ルL-グルタミン、１ミリモルピルベート、１ミリモルオ
キサル酢酸、0.1U/mlインシユリン、10μg/mlトランス
フエリン、15％胎生小牛血清中に植込みかつ37℃、５％
CO2で恒温保持する。次の２週間の間、穴１個当り培地1
00μを２日同毎に新しい培地に代える。５週間目に培
養物を３倍に稀釈する。更に、引続いて成長する不滅化
した細胞系をイスコブズDMEM、RPMI培地（それぞれ15％
胎生小牛血清）又は血清不含媒地（HB-104、NEN-DuPon
t;DMEM-SFM-2、Boehringer Mannheim）中で恒温保持す
る。
結果： 培養物ＡではDNA導入して３日後にリンパ球コロニーが
認められ、これは次の５日間で大きさと細胞数が増加し
た（細胞500個／コロニーまで）。これらのコロニーは
数個の小さなコロニーに分解し、そのうちのいくつかは
DNA導入してから約20日以降に連続的に成長し始めた。D
NA導入してから30日目に微量滴定皿のすべての穴でリン
パ様細胞のコロニー数個が認められた（表１）。
細胞はDNA導入してから５週間後に３倍に稀釈すること
ができた。その後、細胞は７カ月まで培養増殖し、その
際に細胞の老化は認められなかつた。
培養物Ｂでは見掛けDNA導入後にリンパ球の増殖及びリ
ンパ様細胞の連続成長コロニーは見られなかつた。細胞
は見掛けDNA導入後４日間で老化して、死滅した。
例 ２ 末梢血液からのヒトＢリンパ球の不滅化 材料： セフアロース6MB、CNBr活性化 （Pharmacia）、マウスモノクロナール抗体抗‐ヒト‐
パン‐B-リンパ球（Miles）、ヒト血清アルブミン（Ser
va） 方法： 末梢血液からのヒトリンパ球の単離は例１と同様に行な
つた。
1. ヒトＢリンパ球の単離 Ｂリンパ球の取得に当り、リンパ球調製物をアフイニテ
イクロマトグラフイにより分離した。そのために次の方
法を適用する。
マウスモノクロナール抗‐ヒト‐パン‐B-リンパ球抗体
を0.1モルNaHCO3、0.5モルNaCl、pH8.5中に溶解しかつC
NBr活性化セフアロース6MB（抗体1ml/ゲルml）と４℃で
１晩恒温保持する。セフアロースを３回30分間0.1モルN
aHCO3、0.5モルNaCl、pH8.5中及び３回30分間0.1モル酢
酸Na、0.5モルNaCl、pH4.5中で洗浄する。なお遊離して
いる反応性基を遮断するために、セフアロースを0.2モ
ルグルコサミン、0.1モル酢酸Na、0.5モルNaCl、pH4.5
と２時間恒温保持する。このセフアロースを“ホスフエ
ート緩衝生理食塩液”（PBS）0.2％ヒト血清アルブミン
（HSA）中で２回洗浄する。Ｂリンパ球の単離に当つ
て、末梢血液からのリンパ球調製物の細胞をPBS、0.2％
HSA中で洗浄し、セフアロースカラム上に層状に装入し
かつ15分間恒温保持する。カラムに結合しない細胞（Ｔ
リンパ球等）をPBS50ml、0.2％HSAで洗い流す。結合細
胞（Ｂリンパ球）を取得するために、セフアロースをPB
S2ml、0.2％HSA、10mg/ml IgGと37℃で20分間恒温保持
する。Ｂリンパ球をPBS、0.2％HSA、10mg/ml IgGで洗い
出す。
Ｂリンパ球調製物の純度は当業者に公知の間接免疫螢光
法により測定する。この調製物で細胞の90％以上はＢリ
ンパ球マーカーである。
2. Ｂリンパ球の不滅化 リンパ球を“ポークウイード分裂促進剤（PWM,10μg/m
l）と恒温保持することにより成長に対して励起させ
る。２日後に培養物をそれぞれ細胞３×107個の２つの
平行培養物（A,B）に分ける。培養物Ａの細胞にL929-細
胞質体からのDNAを導入する（例１に記載されているよ
うに）。培養物Ｂの細胞も同じように処理するが、DNA
は加えない。それぞれの培養物の細胞を細胞５×106個/
mlの密度で24穴微量滴定皿（穴１個当り1ml）中に接種
する。
結果： 培養ＡではDNA導入して２日後に顕微鏡でリンパ球コロ
ニーが観察され、これは続く10日間で大きくなつた。次
の１週間でコロニーは数個の小さなコロニーに分解し
た。DNA導入して３週間目から、培養Ａのすべての穴で
細胞系に成長した連続成長のコロニーが観察された（表
２）。５日目からは細胞をより大きな培養容器に移しか
つ更に増殖させた。培地中で連続増殖している10カ月後
も細胞の老化は確認されなかつた。培養Ｂでは見掛けDN
A導入後、成長するリンパ様コロニーは観察されなかつ
た。細胞は老化しかつ見掛けDNA導入して５日以内に死
滅した。
不滅化した細胞を、Ｂリンパ球に特徴的である表面マー
カーの発現について試験した。これは、Ｂリンパ球膜イ
ムノグロブリンの検出のために羊赤血球ロゼツト法（M.
E.Kaplan et.al.、“J.Immunol.Methods"、５、131、19
74）、一次抗体としてマウスモノクロナール抗‐ヒト‐
パンB-もしくはパンT-リンパ球抗体（Miles）及び二次
抗体としてフルオレセインイソチオシアネート接合抗‐
マウス‐IgG1（Miles）の使用下に並びに螢光標識した
抗‐ヒト‐Ig-抗体（Dako）の使用下に螢光法を用いて
行なつた。これらの方法は免疫学の標準方法に含まれ
る。表３から、不滅化したリンパ球の90％以上がＢリン
パ球マーカーであることが明らかである。
例 ３ 末梢血液からのヒトＴリンパ球の不滅化方法： 末梢血液からのヒトリンパ球の調製は例１に記載したよ
うに行なつた。ヒトＴリンパ球はアフイニテイクロマト
グラフイによりリンパ球の全集団から例２の方法と同様
にして単離した。例２の方法とは、モノクロナールマウ
ス抗‐ヒト‐パンT-リンパ球抗体をセフアロースに結合
させた点で異なつていた。このようにしてＴリンパ球を
セフアロースに結合させかつPBS、0.2％ヒト血清アルブ
ミン、10mg/ml IgGにより洗い出すことができた。Ｔリ
ンパ球調製物の純度は、マウス抗‐ヒト‐パンT-リンパ
球抗体の間接免疫螢光により測定して90％を上廻つてい
た。
Ｔリンパ球を“ポークウイード分裂促進剤”（PWM、10
μg/ml）との恒温保持により成長するように励起した。
２日後に、それぞれ細胞４×107個の２つの平行培養物
（A,B）に分けた。培養物Ａの細胞に例１に記載したよ
うにL929-細胞質体からDNA（１μｇ）を導入した。培養
物Ｂの細胞では見掛けDNA導入を行なつた。細胞を細胞
５×106個/mlの密度で24穴微量滴定皿に接種した（穴１
個当り1ml）。
結果： 培養物Ａでは、成長するリンパ球コロニー数個が観察さ
れ、これはDNA導入後10日目から小さいコロニーに分解
した。DNA導入後３週間目で連続的に増殖するリンパ球
コロニーが成長した。結果を表４に示す。細胞は４カ月
まで増殖し、その際に細胞の老化は観察されなかつた。
培養物Ｂでは見掛けDNA導入後、リンパ球の成長は観察
されなかつた。細胞は次の５日間で死滅した。
培養物Ａの細胞を例２と同様にその表面マーカーについ
て調べた。培養物Ａの90％を上廻る細胞で表面マーカー
が発現し、これはＴリンパ球の特徴である（表５参
照）。
例 ４ 本発明により不滅化したリンパ球からのDNAの導入によ
りヒトリンパ球の不滅化 方法： 末梢血液からのヒトリンパ球を例１と同様にして単離し
た。
不滅化用DNAを、本発明により（例１と同様にして）不
滅化したリンパ様細胞系（C-9）の細胞から取得した。
リンパ様細胞系（C-9）は、L929-細胞質体からのDNAを
末梢血液のリンパ球に導入することにより得られた。C-
9細胞をPBS中で洗いかつ200ミリモルトリス、100ミリモ
ルEDTA、0.2％SDS、pH7.2中に溶菌した。RNAをRNアーゼ
Ａ（100μg/ml、Boehringer Mannheim）と37℃で２時間
恒温保持し、蛋白質をプロテイナーゼＫ（100μg/ml、B
oehringer Mannheim）と37℃で３時間恒温保持すること
により分解した。DNAをフエノール袖出及びクロロホル
ム／イソアミルアルコール（24:1）‐抽出により単離し
た。
ヒトリンパ球の不滅化は、本発明によりC-9細胞からのD
NAの転移により行なつた。そのために、リンパ球を“ポ
ークウイード分裂促進剤”、（PWM、10μg/ml）と恒温
保持により成長するように励起した。３日後に、それぞ
れリンパ球５×107個の２つの平行培養物（A,B）に分け
た。培養物Ａの細胞に（例１に記載したように）C-9細
胞からのDNAを導入した（10μg/細胞107）。培養物Ｂの
細胞には見掛けDNA導入を前記のように行なつた。
結果： 培養物ＡではDNA導入後25日してリンパ様細胞のコロニ
ーが成長し（表６参照）、これを56日目により大きな培
養容器に移した。細胞は６カ月間老化も観察されずに培
養された。培養物Ｂの細胞は見掛けDNA導入後５日目か
ら老化が認められかつ次の３日間で死滅した。
本発明により培養物Ａで不滅化した細胞（C-17、二次ト
ランスフエクシヨン細胞系）からのDNAを末梢血液のリ
ンパ球に導入した後で再び不滅化リンパ様細胞系を生成
した（C-28、三次トランスフエクシヨン細胞系）。その
際に永久に分裂するリンパ様コロニーのより高い収率が
達成された（表７参照）。これらの結果は、本発明によ
り不滅化したリンパ球からのDNAをヒトリンパ球に導入
した後で再び永久成長するリンパ様細胞系が得られるこ
とを示す。その際に、L929-細胞質体からのDNAを導入し
た場合よりも高い不滅化頻度が観察される。
例 ５ ヒト羊膜線維芽細胞の不滅化 方法： ヒト胚線維芽細胞を調製するに当り、羊水を妊婦の羊腹
腔の減菌穿刺により取得した。細胞を100×ｇで10分間
遠心して沈降させ、イスコブズDMEM、15％胎生小牛血
清、10μg/mlトランスフエリン、0.1U/mlインシユリ
ン、15ミリモルHEPES中に再懸濁させかつ37℃、５％CO2
で恒温保持した。10日後に、１コロニー当り30個より多
くの細胞を含む細胞コロニーを継代培養した。
ヒト線維芽細胞を第３継代で、それぞれ細胞106個を含
有する２つの平行培養物（A,B）に分ける。不滅化用DNA
は例１の方法によりL929-細胞質体から得られた。培養
物Ａの細胞を２回HeBS中で洗いかつDEAE-デキストラン
（MW500000、0.1mg/ml HeBS）と37℃の15分間恒温保持
した。CaCl21200μ（125ミリモル）中のDNA（0.8μ
ｇ）を２倍濃縮したHeBS（pH7.1）1200μにピペツト
滴加しかつ室温で20分間恒温保持した。羊膜線繊芽細胞
を２回HeBS中で洗いかつ37℃で２時間DNA溶液と恒温保
持した。細胞を２回HeBS中で洗いかつDMEM、10μg/mlト
ランスフエリン、0.1U/mlインシユリン、15ミリモルHEP
ES、15％胎生小牛血清中で恒温保持した。培養物Ｂの細
胞は前記のように見掛けDNA導入に使用した。
結果： 培養物Ａの細胞はDNA導入後９カ月連続成長し、その際
に細胞老化は観察されなかつた。対照培養物Ｂは50〜60
日後に老化しかつ死滅した。
例 ６ キサンチン‐グアニンホスホトランスフエラーゼの細胞
遺伝子を不滅化されたヒトリンパ球に導入 方法： ヒトリンパ球を本発明により例１に記載したように不滅
化しかつそれぞれ細胞３×107個を含む２つの平行培養
物（A,B）に分けた。培養物Ａの細胞中に、キサンチン
‐グアニンホスホトランスフエラーゼ（gpt）の細菌遺
伝子を担持するプラスミドpSV2gpt（10μｇ）（R.C.Mul
ligan,P.Barg,“Science"、209、1422〜1427、1980）を
導入した。培養物Ｂの細胞では見掛けDNA導入を行なつ
た。DNA導入後１日間細胞を選択培地（DMEM、２μg/ml
アミノプテリン、250μg/mlキサンチン、15μg/mlヒポ
キサンチン、150μg/mlグルタミン、10μg/mlチミジ
ン、25μg/mlミコフエノール酸）中で、gpt遺伝子を受
容しかつ相応する酵素を含有する細胞を選択するように
培養した。gpt遺伝子を発現しない細胞は選択培地中で
死滅した。10日後に生存し、選択培地中で増殖している
コロニーを数えた。
結果： 培養物ＡはDNA導入して10日後に、選択培地中で増殖す
るリンパ様コロニーを含有していた（表８）。gpt遺伝
子はこれらのコロニーの細胞中に存在するはずである。
それというのもこれらの一次トランスフエクタントから
のDNAによるトランスフエクシヨンにより改めて導入す
ることができたからである。その際に得られた二次トラ
ンスフエクタントのゲノム中でgpt遺伝子はサウザンブ
ロツト分析（Southern blot Analyse）により検出し
た。
培養物Ｂの細胞は見掛けDNA導入後に死滅し、その際に
成長コロニーは選択培地中で認められなかつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘルベルト・ユングフエル ドイツ連邦共和国トウツイング・ベリンガ ーヴエーク 10 (72)発明者 ハインリツヒ・バルヒエト ドイツ連邦共和国トウツイング・ブロイハ ウス・シユトラーセ ３ (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．103（1986) Ｐ．795−805

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト又は動物細胞を永久培養可能な細胞の
    非増殖性フラグメントと融合しかつその融合細胞を培地
    中で選択物質なしに培養することによりヒト又は動物細
    胞を不滅化する方法において、永久培養可能なヒト又は
    動物細胞の細胞質から得られたDNAを不滅化すべき細胞
    にトランスフェクションすることを特徴とするヒト又は
    動物細胞の不滅化法。
  2. 【請求項２】永久培養可能な細胞として腫瘍細胞又は不
    滅化された非腫瘍発生性細胞を使用する特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】DNAを取得するに当り、永久培養可能な細
    胞の細胞質体を溶解し、可溶性の溶解液をプロティナー
    ゼと恒温保持し、その後でDNAを分離し、RNアーゼと共
    に恒温保持しかつ再びDNA−溶剤で抽出する特許請求の
    範囲第１項又は第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】DNAを取得するに当り、永久培養可能な細
    胞の細胞質を溶解し、該DNAを分離し、上澄みをプロテ
    ィナーゼと恒温保持し、その後でDNAを分離し、RNアー
    ゼと共に恒温保持しかつ再びDNA−溶剤で抽出する特許
    請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
  5. 【請求項５】DNAを取得するに当り、永久培養可能な細
    胞の細胞質を溶解し、ミトコンドリアを含まないフラク
    ションを取得し、可溶性の溶解液をプロティナーゼと恒
    温保持し、その後でDNAを分離し、RNアーゼと共に恒温
    保持しかつ再びDNA−溶剤で抽出する特許請求の範囲第
    １項又は第２項記載の方法。
  6. 【請求項６】分離するに当りフェノール及び／又はクロ
    ロホルム−イソアミルアルコール混合物のようなDNA−
    溶剤で抽出する特許請求の範囲第３項から第５項までの
    いずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】成長もしくは分裂に対して励起された状態
    の不滅化すべき細胞に細胞質DNAをトランスフェクショ
    ンする特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか
    １項記載の方法。
  8. 【請求項８】増殖期Ｉのリンパ球を使用する特許請求の
    範囲第７項記載の方法。
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