JP5503636B2 - 優秀な組換え蛋白質を生産するためのヒト宿主細胞 - Google Patents
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Description
本発明の他の目的は、組換え蛋白質を生産するための用途の前記ヒト宿主細胞を提供することである。
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、モノクローナル(monoclonal)抗体を含んだ組換え蛋白質を生産するための用途の前記ヒト宿主細胞を提供する。
本発明のヒト宿主細胞は、ヒト胚芽腎臓由来の細胞(human embryonic kidney-derived cell)と、EBV(Epstein-Barr virus)ゲノムが染色体内に挿入されたヒトB細胞由来の細胞との融合(fusion)から誘導されたことを特徴とする。
本発明の一実施例では、酪酸ナトリウム処理下で、F2N78細胞の抗体生産性を確認するために、2種の抗体生産細胞株であるCHO細胞とF2N78細胞とを比較した。酪酸ナトリウムを処理したCHO細胞株の場合、細胞成長は、対照群(0mM酪酸ナトリウム)と比較して、50%まで減少し、生産性は、2倍ほど上昇した(図11参照)。一方、酪酸ナトリウムを処理したF2N78細胞株の場合、細胞成長率は、対照群(0mM酪酸ナトリウム)と比較して、最大2倍ほど上昇し、生産性も、対照群細胞(0mM酪酸ナトリウム)と比較して、4倍ないし5倍の高い上昇率を示した(図12参照)。かような現象は、酪酸ナトリウムによるF2N78細胞株のアポトーシス抑制現象が、細胞の抗体生産性上昇にも、影響を与えたものであると見ることができる。
以下、本発明について、実施例によってさらに詳細に説明する。下記実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
1.細胞及びプラスミド
ヒト胚芽腎臓(293)細胞(ATCC CRL−1573)及びナマルワ細胞(ATCC CRL−1432)は、米国・微生物保存センター(ATCC:American Type Culture Collection)からそれぞれ譲り受けた。
本発明に使われた発現ベクターの開裂(cleavage)地図は、図3に記載されている。
細胞内の形質移入のために、電気穿孔法(electrophoration)及び陽イオン性ポリマー(cationic polymer)を利用した方法が使われた。
EBNA1の発現を感知するために、蛍光物質と間接的に結合して染色される方法である染色蛍光物質が接合された(conjugated)抗血清蛋白質(ACIF)(Reedman and Klein,1973;Fresen and zur Hausen,1976)との反応を行った。まず、スライドガラス上に塗抹された細胞を、−20℃で5分間メタノールで固定させた。最初の反応抗体としては、抗EBNAの力価(titer)の高いヒト血清を使用した。その後、EBNA1染色のシグナルを増大させるために、ヒト補体(血清蛋白質、complement)で処理し、蛍光物質が接合された抗ヒト補体C3抗体(FITC−conjugated anti human complement C3 antibody、USBiological、C7850−14C)で処理した。このように処理されたスライドをグリセロールとホスフェートバッファ(PBS)とが1:1で混合された溶液で覆って仕上げた。
また、α(2,6)STの蛋白質発現を確認するために、蛍光物質が接合されたサンブクスニグラ(Sambuicus nigra)レクチン(FITC conjugated Sambucus nigra(Elderberry bark)−SNA−1、EY laboratories、F−2602)で、前記と類似した方法で細胞を染色した。
RNeasy(R)Plus Mini kit(Qiagen、74134)を使用し、細胞からmRNAを抽出した後、OneStep RT−PCR Kit(Qiagen、210212)を使用してRT−PCRを行った。それぞれのプライマー配列は、下記表1に表示した。RT−PCR実験は、GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems)を使用して進め、RT−PCR段階及び条件は、次の通りである:(i)逆転写段階(50℃で30分、1サイクル);(ii)逆転写酵素不活性化及びcDNA変性(denaturation)段階(95℃で15分、1サイクル);(iii)PCR増幅段階(94℃で30秒、52℃で1分、72℃で30秒、35サイクル);(iv)伸張段階(72℃で10分、1サイクル)。RT−PCRの生成物は、電気泳動でアガロースゲル上で確認した。
分泌される抗体の濃度は、酵素結合免疫吸収分析法によって測定された。まず、ヤギの抗ヒト免疫グロブリンG(Fcγ)(Jackson ImmunoReserarch、109−006−098)を96ウェル・マイクロタイタ(microtiter)プレート(Nunc、449824)上に吸着させた。このプレートを、1%ウシ血清アルブミン(BSA)が含まれたホスフェートバッファで処理してブロッキングした後、2倍ずつ連続して希釈したサンプルをプレートの各ウェルに入れた。室温で2時間インキュベーションした後、ヤギのペルオキシダーゼ標識抗−ヒトλ抗体(peroxidase-labeled goat anti-human λ antibody)(Sigma、A5175)で処理した。室温で1時間インキュベーションした後、テトラメチルベンジジン(TMB)と反応させ、この反応を1N HClで中止させた。スタンダード(standard)としては、骨髄腫プラズマで精製されたヒトIgG1λ(human IgG1 lampda purified myeloma plasma)(Sigma、I5029)を250ng/mlの濃度から使用した。プレートリーダ(Spectramax plus 384、Molecular Device)を使用し、450/570nmで吸光度を読んで濃度を測定した。
まず、細胞融合パートナーとして、HAT(Sigma、H0262)に感受性があり、G418(Calbiochem、345810)に耐性があるナマルワ細胞株を誘導するために、ナマルワ細胞株を、10%FBS(Hyclone、SH30070.03)及び6−チオグアニン(Sigma、A4660)が添加されたRPMI1640培地で培養した。4ヵ月の選別期間の間、6−チオグアニンの濃度を5μg/mlから30μg/mlまで上昇させて処理した後、1xHAT含有培地に対する前記細胞の感受性を確認した。HATに感受性があるナマルワ細胞群に、pSV2neoプラスミドを形質移入した後、1.5mg/ml濃度のG418に耐性を有する細胞群を選別し、細胞融合パートナーとして使用した。
F2Nクローンの選別のために、一時的形質移入を利用し、一次的にIgGの発現が高い17個のクローンを選別し(図4A)、それらクローンを対象に、二次スクリーニングを実施した(図4B)。それらのうちIgGの発現が最も高いF2N78クローンに対して、293細胞とIgGとの生産性を比較するために、pCT132ベクターを利用して一時的形質移入試験を反復的に行い、その結果、F2N78細胞のIgG発現率が293細胞より2〜3倍高いということを確認した(図4C)。
新薬開発過程に必要な蛋白質を短時間内に生産するためには、一時的形質移入による生産方法が使われている。このために、FreeStyle 293培地で浮遊培養されたF2N78細胞と293細胞とを2つの異なる構造のoriP発現ベクター(pCT132及びpCT125)で形質移入して抗体生産性を比較した。2つのベクターのうちpCT132は、プラスミド内にEBNA1コーディング配列がなく、pCT125は、EBNA1コーディング配列がプラスミド内に存在する。
酪酸ナトリウム処理は、生産細胞株に2種の影響を及ぼす。さまざまな遺伝子上の過アセチル化(hyper-acetylation)を介して遺伝子発現を活性化させる一方、アポトーシスを誘導して細胞成長率を低下させる。かような現象を確認するために、EX−CELL 293培地に適応させたCHO、293、ナマルワ及びF2N78の細胞を1ml当たり3x105個の細胞になるように接種した後、3日目に、さまざまな濃度(0,1,2及び4mM)の酪酸ナトリウムで処理した。
一般的に、EBVゲノムがウイルス・パーティクルを生成するために、EBVライフサイクルのエピソーム状態にある一方、ナマルワ細胞は、染色体に挿入された2つのコピーのEBVゲノム(Henderson et al.,1983,PNAS USA 80:1987-1991及びRose et al.,2002,J.Clin.Microbiol.40:2533-2544)を有する。かような例外的な染色体内に、EBVゲノムが挿入された形態は、組換え蛋白質を生産する宿主細胞に2種のメリットを提供する。第一に、染色体に挿入されたEBVゲノムからウイルス生成の恐れがないというメリットがあり、第二に、潜伏期(latent)のEBNA1蛋白質並びにBALF1の初期遺伝子は持続的に発現される一方、BHRF1の発現は消失するEBV遺伝子の発現様相にそのメリットを見出すことができる。これと関連して、特にウイルス性bcl−2と関連した2つの遺伝子のうり一つであるBHRF1遺伝子の消失は、F2N78クローンのアポトーシス抑制的成長を提示する予期できなかった結果である。また、EBNA1遺伝子の持続的な発現は、EBNA1遺伝子のないoriP発現ベクターを使用できるという長所として作用する。それ以外にも、GnTIIIとα(2,6)STとの発現は、ヒト細胞としての特別のメリットを提供するものである。また、Ig−muchainとIg−kappa chainの発現が消失し、組換えモノクローナル抗体の製造においても、本発明によるヒト宿主細胞は有用である。
配列番号2:GnTIII遺伝子の第1プライマー(アンチセンス)
配列番号3:GnTIII遺伝子の第2プライマー(センス)
配列番号4:GnTIII遺伝子の第2プライマー(アンチセンス)
配列番号5:Ig−mu遺伝子のプライマー(センス)
配列番号6:Ig−mu遺伝子のプライマー(アンチセンス)
配列番号7:EBNA1遺伝子の第1プライマー(センス)
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配列番号9:EBNA1遺伝子の第2プライマー(センス)
配列番号10:EBNA1遺伝子の第2プライマー(アンチセンス)
配列番号11:BHRF1遺伝子のプライマー(センス)
配列番号12:BHRF1遺伝子のプライマー(アンチセンス)
配列番号13:BALF1遺伝子のプラーマー(センス)
配列番号14:BALF1遺伝子のプラーマー(アンチセンス)
Claims (4)
- ヒト胚芽腎臓由来の細胞と、エプスタイン・バール・ウイルス(EBV)ゲノムを挿入した染色体を有するヒトB細胞由来の細胞との融合から誘導されたヒト宿主細胞であって、
前記ヒト胚芽腎臓由来の細胞は293細胞であり、前記ヒトB細胞由来の細胞はナマルワ細胞であり、
前記ヒト宿主細胞は寄託番号KCTC11309BPのF2N78であり、BALF1を発現するがBHRF1は発現しないことを特徴とするヒト宿主細胞。 - 組換え蛋白質を生産するためであることを特徴とする請求項1に記載のヒト宿主細胞。
- 前記組換え蛋白質が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項2に記載のヒト宿主細胞。
- 前記組換え蛋白質が、モノクローナル抗体以外の治療用蛋白質であることを特徴とする請求項2に記載のヒト宿主細胞。
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