KR100255228B1

KR100255228B1 - 글리코프로테인을 발현시키는 포유류 세포계 및 글리코프로테인의 제조 방법

Info

Publication number: KR100255228B1
Application number: KR1019950704749A
Authority: KR
Inventors: 볼프 한스; 샤르펜베르그 클라우스; 바그너 롤랜드
Original assignee: 볼프 한스
Priority date: 1993-04-26
Filing date: 1994-04-26
Publication date: 2000-05-01
Also published as: WO1994025599A1; CA2161517A1; EP0695357A1; DE4313620A1; JPH08509369A; AU6722094A; CN1124502A; NZ266146A

Abstract

본 발명은 글리코프로테인을 발현시키는 포유류 세포계 및 상기 글리코프로테인의 제조방법에 관한 것으로서, 포유류 세포계, 특히 Epstein-Barr 비루스 항원으로서 글리코프로테인 250(220), 350 및 250(220)/350을 안정하게 발현시키는 햄스터 세포계 및 혈청이 없는 매질내에서 배양된 세포로부터 상기 글리코프로테인을 수득하는 것을 특징으로 한다.

Description

글리코프로테인을 발현시키는 포유류 세포계 및 글리코프로테인의 제조 방법

Epstein-Barr 비루스는 아동의 가장 흔한 전염병 중의 하나인 전염성 단일 뉴클레오시스를 인간에게 발생시킨다.

성인 인구의 90% 이상이 Epstein-Barr 비루스에 전염되어 있다. EBV 양성인 사람은 나중에 비인강 암, B 세포 임과종, T 세포 임파종, 호지킨 임파종, 및 다른 가능한 종양등의 질병으로 발전한다. 1차 감염시 또는 감염후의 단계에서는 만성, 드문 경우에는 상당히 치명적으로 될 수 있음이 보고되어 왔다.

아동이 Epstein-Barr 비루스로 감염되면 임상적으로는 표시가 나지 않으며, Epstein-Barr 비루스 막 항원 gp 250/350(BLLF-1 리딩 프레임, Bear et al., 1984)를 발현시키는 재조합 백신 비루스로 백신접종을 하면 감염 및/또는 발병에 대해 방어를 하므로(Gu et al., 1993), Epstein-Barr 비루스에 연관된 질병을 예방하기 위한 백신접종이 가능하다.

생(生) 백신의 경우 부작용이 일어날 가능성 때문에 순수한 단백질 백신을 개발하는 것이 중요한 목적이 된다. Epstein-Barr 비루스 막 단백질 gp 250/350(BLLF-1)은 고도로 글리코실화되어 있고 이러한 후-해독 변형(posttranslational modification)은 정확한 면역원 특성(Emini et al., 1988)의 중요한 성분이기 때문에 gp 250/350을 기본으로 진핵세포에서 생성가능한 글리코프로테인을 기본으로하는 백신을 개발하는 것이 매우 유망하다.

본 발명은 포유류 세포계, 특히 단백질이 유리된 매질내에서 Epstein-Barr 비루스 항원으로서 글리코프로테인(gp 250 (220)), 글리코프로테인(gp 350) 및/또는 하이브리드 글리코프로테인(gp 250(220)/(gp)350)을 안정하게 발현시켜 매질 보충물을 통해 비루스 또는 박테리아의 오염을 피하게 하는 햄스터 세포계에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 글리코프로테인의 제조방법에 관한 것이다.

EBV 항원으로서 gp 250(220), gp 350 및/또는 gp 250(220)/gp 350을 안정하게 발현시키는 햄스터 세포계가 예를 들면 Motz et al., Gene, 44(1986), 353-359 및 Vaccines, 87 (1987), 374-379, 100 Jahre Blutserum-Therapie 1890-1990, Halle(Saale), (1991), 93-100 Gu Shyan et al. 에 공지되어 있다. 그러나, 최근까지는 상기 글리코프로테인이 안정하게 발현될 수 있는 햄스터 세포계가 공지되어 있지 않다. Motz et al의 Vaccines 87(1987), 374-379, 376에 따르면, CHO 세포막안으로 비루스성의 외래 글리코프로테인을 결합시키면 특정한 시점 이상에서 독성일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 햄스터 세포계는 세포계가 안정하게 발현되고 다량으로 상기 글리코프로테인을 분비하며 하기와 같은 방법으로 수득될 수 있는 특별한 유전학적인 기술에 의해서 제공되었다.

- 막 앵커가 아닌 것을 제외하고 상기 글리코프로테인을 발현시키는 백터로 상기 세포계를 형질감염시키고(Motz et al., 1987),

- 상기 세포계에 없는 선택 마커로 상기 벡터가 구성되어 있으며,

- 상기 세포계를 배양한 후 선택 마커의 도움으로 세포를 선택하여, 세포를 안정하게 발현시키고 일단 선택 요인(역제제)이 제거되면 글리코프로테인을 분리시킨다.

추가의 구체적인 실시예는 단백질이 유리된 매질내에서 상기 글리코프로테인을 안정하게 발현시키며 하기에 의해 수득될 수 있는 햄스터 세포계를 제조하는 방법을 제공하고 있다.

A) (A)(d)에 따라 염색체적으로 결합될 벡터 또는 (B)(재조합 세포계)에 따라 염색체적으로 결합될 벡터에 따라 이후에 나타날 선택 마커가 없는 햄스터 세포계(숙주세포계)로부터 출발하고,

(a)혈청-함유 매질내에서 세포를 배양한 후 이를 기질과 서로 부착하도록 하고,

(b)소비된 매질의 일부를 반복적으로 교환하고, 이때 매질의 형청 성분을 점차로 감소시켜서 혈청이 없는 상태에서 배양함으로써

-세포의 부착이 실질적으로 제거되지 않도록 하고

-선택적으로 세포 구상체가 형성 분리되도록 하고, 분리된 세포 구상체를 분리한후 이를 현탁액내에서 조심스럽게 교반하면서 배양하고, 작은 응집체로 또는 단독으로 성장하는 세포를 선택하며,

(c)최종적으로 선택된 세포를 청구범위 제1항에 따른 제조방법으로 처리하고, 또는

(B)청구범위 제1항에 따른 햄스터 세포를 제조방법 (A)(a) 및 (A)(b)로 처리한다.

상기 세포계는 매질내로 옮겨지지도 않고 혈청이 없는 매질내에서 배양되지도 않기 때문에 출발 세포계 또는 숙주 세포계를 혈청이 함유된 배양 매질, 즉 MEM 알파^-또는 a^-+5% FCS내에서 성장시킨다. 이러한 배양 매질의 예로는 DIF 1000, RPMI 1640, ASF 103 및 HDB가 있다.

단백질이 없는 배양 매질내에서 성장시키기 위해서는 다음의 3가지 국면이 적절하다.

1. 배양액의 혈청을 제거시키는 도중 배양 플라스크를 사용하면서 부착(adherence)이 생성된다. 그 결과는 양성 성장 자극이다. 또한 오랫동안 사용된 매질과 가수분해 생성물 및 죽은 세포가 쉽고 매우 조용하게(원심분리를 거치지 않고) 분리될 수 있다.

2. 오래된 매질의 극히 일부가 반복적으로 교환되어 혈청 제거 중 매질의 양호한 자기-조건화를 확실하게 한다.

3. 상기 세포가 현탁 배양액내에서 예를 들면, 방적 플라스크내에서 조용히 혼합되면서 장기간 배양되어 구상체가 형성된다. 부착 경향을 감소시키기 위해서는 특별한 선택에 의하여 작은 응집체(구성체)나 단독으로 성장하는 세포를 분리한다.

우선, 큰 구상체가 분리된 후, 낮은 g 값에서 상층액이 원심분리되어 분리된 작은 구상체 및 단일 세포가 추가의 처리를 위해 사용된다.

청구범위 제2항이 나타난 방법을 사용하면 하기와 같이 단백질이 없는 매질내에서 성장이 가능하다. 상기 매질은 이후 SMIF(Scharfenberg's Modified Iscove's F12 Medium)으로 언급된다. 상기는 대략 1 : 1의 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 과 Ham's F12 nutrient(IF)의 혼합물로 구성된 매우 풍족한 매질로서 여기에 예를 들면 푸트레신(예를 들면 1.2 마이크로몰 L^-1)과 L-히드록시프롤린(예를들면 153 마이크로몰 L^-1)(SMIF1)이 첨가될 수 있다. 또한, 현탁액내에서 성장시키기 위해서는 복합 2가 이온으로서 그리고 혈청이 없는 매질내(SMIF2)에서 통상 사용되는 단백질 성분 트랜스퍼린의 치환물로서 무기철을 이용하기 위해서는 아우린트리카르복실산(ATA, 예를 들면 3 마이크로몰 L^-1)(Bertheussen, 1993), EDTA(예를들면, 4.3 마이크로몰 L^-1) 및 시트르산(예를 들면 40 마이크로몰 L^-1)과 같은 킬레이트제가 바람직하게는 첨가되어야 한다.

본 발명의 특별히 바람직한 구체적 실시예에 따라서 햄스터 세포계는 차이니즈 햄스터 오바리 세포계(CHO), 예를 들면 CHO K1 〓 ATCC CCL 61 로부터, 또는 베이비 햄스터 키드니 세포계(BHK), 예를 들면 BHK 21C13 〓 ATCC CCL 10으로부터 출발시킴으로써 수득될 수 있다.

본 발명에 따라 상기 언급된 글리코프로테인이 안정하게 발현되면서 예를 들면 15 내지 40 시간, 특히 20 내지 30 시간의 생성시간으로 햄스터 세포계를 생성하는 것이 가능하다면, 선택적으로 유전학적인 조작(유전공학적으로)으로 단백질이 유리된 매질내에서 햄스터 세포계를 배양하는 것이 가능하다는 관점에서 발명성이 있는 것으로 고려되어야 한다. 이러한 관점에서, 유전공학에 의하여 단백질이 없는 매질에서 성장시키기 위하여 포유류 세포계가 제조되어 소망의 유전자 생성물을 발현시켜야 한다(NSO 세포계, Hassel et al., 1992). 선택 마커와 억제제를 사용시 숙련된 기술자는 공지 기술에 의존할 수 있다. 적당한 선택 마커의 예로서는 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자(DHFR 유전자)가 있으며 적당한 억제제의 예로는 메토트레세이트(MTX)(Motz et al.,1987)가 있다.

본 발명의 특수한 구체적인 실시예는 햄스터 세포계 CHO pMDIIIGPTR-PFC6 〓 DSM ACC 2121 이다.

gp 250(220), gp 350 및/또는 gp 250(220)/gp 350은 하기와 같은 본 발명에 따라 수득될 수 있다.

(a) 본 발명에 따라 세포계를 배양한 후 소망의 글리코프로테인을 발현시키고,

(b) 상기 세포를 배양 매질로부터 특히 미세여과에 의하여 분리하고,

(c) 연속해서 농축시킨 후 초여과, 특히 교차-흐름 초여과에 의하여 청정한 원료상층액을 정제하고,

(d) 음이온 교환 컬럼을 사용하여 연속적으로 정제하고,

(e) 초여과하고

(f) 겔 여과해서 순수한 글리코프로테인(gp)의 생성 단편을 수득한다.

본 발명의 제조방법에 따르면 글리코프로테인은 천연상태 및 글리코실화 형태로 수득될 수 있다. 따라서 상기 글리코프로테인은 천연의 항원성을 갖는다. 상기 방법으로 수득된 백신은 따라서 활성 EB 비루스의 개별 단백질에 상응하는 항원성을 나타낸다. 수득된 백신은 병원성이 없고 고 항원 보호능력을 갖는 안정한 백신이다. 따라서 상기 재조합 백신은 약화된 비루스의 반전성도(potential for reversion), 불활성화된 비루스의 최소 위험 및 독성도 기대되지 않기 때문에 불활성화된 또는 약화된 백신보다 안정성의 면에서 강하다.

[실시예 1 : CHO pMDIIIGPTR-PFC6의 수득]

디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자(dhfr-1)가 부족한 세포계 CHO K1〓ATCC CCL61으로부터 유래된 클론이 Motz et al의 Gene, 44(1986), 353-359, Motz et al의 Gene, 58(1987), 149-154 및 백신, 87(1987) 374-379에 따라 플라스미드 pMDIIIGP로 형질감염되었다. 상기 세포가 배양된 후, 억제제가 사용되지 않더라도 안정하게 gp 250/350을 발현시키는 메토트레세이트(MTX)로 클론이 선택된다. gp 250-350을 안정하게 발현시키는 상기 클론은 CHO C6로서 언급되었다.

단백질이 없는 매질내에서 CHO C6의 배양표준 세포 배양 조건하에서 배양했다. CHO C6는 1 내지 2개의 큰 배양 플라스크(185㎠, 대락 40 내지 50ml 부피 ; Falcon)내에 5%의 태아기 송아지 혈청(FCS)을 함유하는 IF 매질내에서 배양기 바닥 전체가 한켜의 세포로 덮힐때(absolute cell confluence)까지 배양되었다. 몇몇 경우에서는 다수층이 이미 형성되었다. 신선한, 예열된 SMIF1에 의하여 분해물 뿐 아니라 살아있는 세포와 죽은 분리 세포를 포함하는 오래된 매질의 4/5를 시간마다 교체함으로써 1, 0.2, 0.04 및 0.008%의 FCS함량으로 FCS를 연속해서 점차 희석하였다. 유리된 구상체가 낮은 FCS 함량에서 배양액내에서 형성된다면, 매질이 제거되기 전에 놓여질 수 있다. 교환시간은 배양액의 수명 및 배양액의 수명 및 배양액의 조건에 달려있고 배양액 상층액이 소량의 영양물질을 함유하고 있을 때 마지막까지 개별적으로 측정되었다. 교환시 양호한 표준값은 대략 0.7 내지 1 g/l의 글루코오스 함량이다. 상기 매질은 적어도 일주일 후 낮은 분배량으로 교환되어 분해된 영양분을 보충하게 된다.

상기 매질이 0.008%의 FCS 함량에서 사용되었을 때 전체 매질은 신선한 단백질이 없는 예열된 SMFI1에 의해 교체되고 추가로 배양 플라스크에서 배양되었다. 상기 조건하에서 충분량의 구상체가 형성되거나 분리된다면, 상기 구상체는 작은 방적배양 플라스크(40ml의 최소 부피)로 전달되고 대략 40rpm에서 40ml의 SMIF1(1/4의 오래된 매질 + 3/4 신선한 매질)내에서 배양된다. 상기 세포가 분리되지 않았다면, 상기 세포층은 부착 세포를 통과시키기 위해 통상 수행되는 기질로부터 효소학적으로 분리되어야 한다. 상기 조건에서 쉽게 응집되는 세포는 상기 세포가 또한 작은 방적 플라스크로 옮겨질 수 있기 전에 SMIF1 매질로 두 번 세척시켜 분리된 후 프로테아제로부터 정제되었다.

40시간 이하의 발생 시간이 얻어지고 배양물이 작은 회전 타원면내에서 성장할 때까지 세포는 방적 플라스크내에서 배양된다. 매질내에서 약 0.5내지 1g 남아있는 글루코스/ℓ의 표준 값으로 통과된다. 작은 회전 타원면 및 단일 세포가 선택적으로 통과된다. 상기 목적을 위해서, 세포 배양 현탁액은 커다란 회전 타원면이 분리될 수 있도록 짧은 기간동안 교반되지 않는다. 상층액(100g)은 그 후 원심분리에 의해 제거된다. 펠릿내의 세포는 그 다음 통과로 전달된다. 배양 매질은 전에 죽은 세포 및 세포 단면으로부터 여과 또는 원심분리에 의해 세정되는 이전의 통과의 20 내지 30부피% 매질을 첨가함에 의해 조절된다.

두가지 적합한 전체 공정이 각각 두달 이상 동안 취해진다.

[실시예 3]

배양 상층액으로부터 재조합 단백질의 제조 및 정제

[I. 재완충 후 교차-흐름 초여과]

상기 목적을 위해 단백질이 없는 SMIF1 또는 SMIF2 내 발효 미소여과 결과물이 2ℓ 규모까지 연속적으로 주입된 배양액 또는 10ℓ 에어리프트 발효기내 회분식 배양액으로부터 사용된다. 100kD(밀리포어 또는 필트론)로 절단된 노미날(nominal)의 필터 카세트가 사용된다. 교차-흐름 초여과시 표준 값은 (비교적 랜덤하게 선택된) 다음과 같다:

- 1 bar를 넘지 않는 투과막 압력;

- 회로내 존재하는 조야한 상층액의 대략 3분의 1이 여과물로서 부피 흐름으로부터 제거되고, 이것은 하나의 필터 카세트에 대하여 약 2∼3ℓ의 여과물 및 흡인용량 8ℓ/분에 상당하고;

- 완충액 교환시 보다 낮은 펌핑 용량이 사용된다.

일반적으로, 다음 단계가 제시된다. 처음 두 개의 단계는 없앨 수 있지만, 그것은 수득율을 개선한다.

1. 전체 결과물 부피가 측정되고 약 15부피%의 여과물이 막을 조정하기 위해, 즉 막을 부하하고 편광시킴에 의해 절단된 일정한 유효 필터를 조정하기 위해서(통상적인 여과 조건하 부피 흐름을 기초로 하여) 발생된다.

2. 상기 첫 번째 여과물은 보유물(retentate)로 재통합된다.

3. 실제 교차-흐름 초여과가 잔류물이 개시 부피의 약 50분의 일로 감소될 때까지 실행된다. 그러나, 심지어는 보다 구체적으로 단백질이 없는 매질을 사용함에 의해 잔류물을 농축시키는 것이 가능하다.

4. 초기 잔류물은 완충-교환되고 말기 부피가 얻어질 적에 세척된다. 이러한 목적을 위해, 잔류물은 인산염 완충액(20mM; pH 7)으로 (펌프 부피 및 초여과 시스템을 포함해서) 세 번 내지 네 번 두배의 부피까지 채워지고 최소 잔류물까지 농축되며 또 한차례 가공을 위해 구비된다. 상기 단계는 저분자량 자생적인 단백질을 제거하고 이후의 정제 단계를 위한 이온 강도를 감소시킨다.

[II. 양이온 교환 컬럼 상에서의 정제]

다음의 장치가 사용된다.

컬럼 물질 : Q-세파로스 고 성능(파르마시아의 생물공정 물질)

완충제 시스템 : 완충액 A: 20mM 인산염 완충액(pH 5.1)

완충액 B: 1M NaCl이 있는 20mM 인산염 완충액(pH 5.1)

규모 : 예컨대 1mℓ층 부피를 가진 FPLC 및 HR 5/5컬럼이 달린 작은 규모; 규모확대 가능함. 흐름 속도: HR 5/5 컬럼내 1mℓ/분에 상응하는 일정한 5.1cm/분.

초여과 잔류물은 3mS의 전도도로 밀리Q 공정수로 희석되고 HCl을 가지고 pH 5.1(예컨대, 자생적인 단백질의 보다 많은 양을 분리하기 위해서 pH 4.2로 일단 조정하고 난 후 pH 5.1)로 조정된다. 최종 혼탁도는 원심분리에 의하여 제거된다. 그후 컬럼은 처음 자생적인 단백질을 용리하기 위해서 완충액 5%를 첨가하면서 FPLC 펌프를 거쳐 투명한 상층액으로 채워진다. 최대 부하량은 대략 8mg 총 단백질/mℓ겔이다. 그 후, 단백질이 0.4M NaCl에 대한 구배(22컬럼 부피에 대한 구배)를 거쳐 용리된다.

바람직스러운 gp 250/350 단백질은 0.15 내지 0.35M NaCl로 용리되고 좀 더 정제된 분율의 정확한 선택이 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 후 이루어진다. 완충액 B를 첨가하지 않고 또한 상이한 pH(예컨대, pH 7)에서 단백질 부하량 및 분리를 이루는 것이 가능하다. 부하시 보다 낮은 pH 뿐만 아니라 완충액 B의 첨가는 크로마토그래피하는 동안 gp 단백질과 관련된 용량을 증가시킨다.

만약 인산염 완충액이 사용된다면, 이 후의 공정 단계에 앞선 재완충 단계는 없앨수 있다. 그러나, 시트르산염 완충액과 같은 기타 완충액 시스템이 또한 유용하다.

[III. 초여과]

단계 II의 선택되어 수집된 단백질 단편이 약 10 내지 20의 인자로 초여과에 의해 겔 여과 컬럼상에서 농축된다. 단백질 말기 농도는 예컨대 1 내지 2 mg/mℓ의 범위이다. 미니콘 CS15 챔버(아미콘)이 초여과를 위해 사용된다. (보다 큰 용매 부피에서, 보다 큰 용량을 가진 상당히 보다 큰 여과 장치는 예컨대 교반 셀 또는 교차-흐름 초여과 모듈로 고려되어야만 함).

[IV. 겔 여과에 의한 정제]

컬럼물질 : 수퍼로스 5(파마시아)로 미리채워진 컬럼 HR 10/30; XK 26/100 컬럼(파마시아)내에서 주로 규모 확대를 위해 세파크릴 S-300 고분해능 및 세파크릴 S-400 고분해능이 사용된다.

완충액 시스템 : 20mM 인산염 완충액(pH 7)내 이소크라틱 100 또는 200mM NaCl.

흐름 속도 : 예컨대, 2∼2.5mm/분.

컬럼의 평행 후, 예컨대, 우선 농축되고(CS15), 혼탁물이 원심분리에 의해 제거된 mℓ 겔 층당 10g 단백질이 적용된다. 약 2.5mm/분의 흐름 속도에서 용리되고 분리된다. PAGE 및 은 얼룩짐 후 가시적인 오염없이 gp 250 및/또는 gp 350을 함유하는 용리 분율이 수집된다.

순수한 gp 250/350은 안정하게 약 -20℃에서 냉각된 상태로 겔 여과의 수집된 gp 단편으로 안정하게 저장될 수 있다. 정제 공정은 순수하게 조야한 생성물 약 25∼40%의 총 수득율을 가진다.

[비교실시예 1]

실시예 2는 혈청 제거 단계시 어떠한 세포 집합도 허용되지 않고 FCS고갈이 세포 부착이 폐기될 적에 수행된다는 것을 제외하고 반복된다. 이러한 공정에 따라, 단백질이 없는 매질내에서 배양될 수 있는 어떠한 셀도 얻어지지 않는다.

[문헌]

1. Bear, R. et al. DNA 시퀀스 및 B95-8 Epstein-Barr 비루스 유전자 발현, Nature, 310(1984) 207∼211.

2. Bertheussen, K. 신규하게 정의된 단백질이 없는 매질내에서 세포의 성장. Cytotechnology, 11(1993), 219∼231.

3. Emini, E.A. et al. 효모 및 포유류 세포내에서 발현된 Epstein-Barr 비루스 주요 막 항원(gp 350/220)의 항원 분석; 서브유닛 백신의 전개를 위한 함축. Virology, 166(1988) 387∼93.

4. Gu, S. et al. 주요 막 항원을 발현하는 재조합 백신을 사용하여 인간에 제 1 EBV 백신 시험. “Epstein-Barr 비루스 및 관련된 질병”에 관한 V번째 국제 심포지엄의 진행, Annency, 1992(1993).

5. Hassel, T. et al. 글루타민 합성제 증폭된 CHO 및 NSO 세포계로부터 제조된 재조합 항체의 안정성. 동물 세포 기술: 개발, 공정 및 생성물(Spier, R.E., Griffiths, J.B., MacDonald, C., eds.) Butterworths-Heinemann, 옥스퍼드, (1992) 42∼47.

6. Motz M. et al. 두 개의 주요 Epstein-Barr 비루스 글리코프로테인(gp 250/350)이 재조합 차이니즈 햄스터 오바리 세포에 의해 분비된다. Gene, 58(1987) 149∼154.

Claims

Epstein-Barr 비루스 항원으로서 글리코프로테인(gp) 250(220), 글리코프로테인(gp) 350 및/또는 하이브리드 글리코프로테인(gp) 250 (220)/(gp) 350을 프로테인-프리(protein-free) 매질내에서 안정하게 발현시키고 하기 방법에 따라 수득될 수 있는 것을 특징으로 하는 포유류 세포계. (A) (A)(C)에 따라 염색체적으로 결합된 벡터 또는 (B)에 따라 염색체적으로 결합된 벡터에 의하여 이후에 나타나는 선택 마커가 없는 햄스터 세포계로부터 출발하고, (a) 혈청이 함유된 매질내에서 세포를 배양한 후 기질에 상기 세포를 서로 부착시키고, (b) 소비된 매질의 일부를 반복적으로 교환하며, 그동안에 매질의 혈청 성분을 천천히 감소시켜서 최종적으로 혈청이 없게 배양하고 - 세포의 부착을 능동적으로는 제거하지 않고, - 선택적으로 세포 구상체를 형성시키고 떨어뜨리고, 떨어진 세포 구상체를 분리하고, 현탁액내에서 조용히 교반하면서 배양한 후 1작은 응집체로 또는 단독으로 성장하는 세포를 분리하고, (c) 마지막으로, 선택된 세포를 하기의 제조방법으로 처리하거나 (ca) 상기 언급된 글리코프로테인(gp)을 발현시키고 상기 세포계에는 없는 선택 마커로 구성된 벡터로 세포계를 형질감염시키고, (cb) 일단 선택 요인(억제제)이 더 이상 사용되지 않을 때 세포계를 배양하고, 안정하게 글리코프로테인을 발현시키는 선택 마커의 도움으로 세포를 선택하거나 (B) 포유류 세포계를 우선 제조단계 (A)(ca) 및 (A)(cb)를 거치게 한 후 다시 제조단계 (A)(a) 내지 (A)(b)를 거치게 함.
제1항에 있어서, 햄스터 세포계는 포유류 세포계로서, 특히 차이니즈 햄스터 오바리 세포계(CHO), 예를들면 CHO K1 〓 ATCC CCL61 또는 베이비 햄스터 키드니 세포계(BHK), 예를들면 BHK 21 C13 〓 ATCC CCL10를 사용하는 것을 특징으로 하는 포유류 세포계.
제1항 또는 제2항에 있어서, 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자(DHFR 유전자)가 선택 마커로서, 메토트레세이트(MTX)가 억제제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 포햄스터 세포계.
CHO-K1 pMDIIIGPTR-PFC6가 DSM ACC 2121인 것을 특징으로 하는 햄스터 세포계.
하기단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 글리코프로테인(gp) 250 (220), 글리코프로테인(gp) 350 및/또는 하이브리드 프로테인(gp) 250 (220)/(gp) 350의 제조방법. (a) 제1항 내지 제4항에 따른 세포계를 배양한 후 원하는 글리코프로테인을 발현시키고 이를 매질내로 분비하고, (b) 상기 글리코프로테인을 매질로부터 분리함.
하기 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 글리코프로테인(gp) 250(220), 글리코프로테인(gp) 350 및/또는 하이브리드 프로테인(gp) 250(220)/(gp) 350의 제조방법. (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 세포계를 배양한 후 이것이 원하는 글리코프로테인을 발현하여 매질내로 분비시키고, (b) 특히 미세여과에 의하여 배양 매질로부터 세포를 분리하고, (c) 교차-흐름 초여과에 의하여 농축한 후 이를 정제하고, (d) 이후 음이온 교환 컬럼의 도움으로 이를 정제하고, (e) 초여과하고, (f) 겔여과 후 생성된 순수한 글리코프로테인 단편(gp)을 수득함.
제5항 또는 제6항에 따른 제조방법으로 수득될 수 있는 글리코프로테인(gp) 250(220), 글리코프로테인(gp) 350 및/또는 하이브리드 프로테인(gp) 250 (220)/(gp) 350을 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium과 Ham's F12 nutrient의 대략 1 : 1 혼합물로 구성되고 추가로 Putrescin 및 L-히드록시오프로 테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테인-프리(protein-free) 배양 매질.
제8항에 있어서, Putrescin이 1.2μMol/1의 농도로, L-히드록시프로테인은 153 μMol/1의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 매질.
제8항 또는 제9항에 있어서, 추가로 적어도 하나의 킬레이트제를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 배양 매질.
제10항에 있어서, 적어도 하나의 킬레이트제는 바람직하게는 3 μMol/1 농도인 아우린 트리카르복실산, 바람직하게는 4.3 μMol/1 농도인 EDTA 또는 바람직하게는 40 μMol/1농도인 시트르산인 것을 특징으로 하는 배양 매질.