AT409379B - Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen - Google Patents

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Description


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   Die Erfindung betrifft ein Medium zur protein- und serumfreien Kultivierung von Zellen. 



   Die Kultivierung von Zellen, Insbesondere von eukaryontischen Zellen bzw. Säugetierzellen, bedingt stets den Einsatz spezieller Kultivierungsmedien, die den Zellen die für ein effizientes Wachstum und Produktion der erwünschten Proteine erforderlichen   Nähr- und   Wuchsstoffe zur Verfügung stellt. In der Regel wird hierbei als Mediumkomponente Serum oder aus Serum abgeleitete Verbindungen eingesetzt   (z. B.   bovines Serum). 



   Bei der Verwendung von Serum in Zellkulturen bzw von Proteinadditiven, die aus menschlichen oder tierischen Quellen abgeleitet sind, existieren allerdings zahlreiche Probleme, vor allem, wenn mit der Zellkultur Ausgangsmaterial für die Herstellung eines Arzneimittels, das am Menschen verabreicht werden soll, zur Verfügung gestellt wird. 



   So variiert die Zusammensetzung und die Qualität bei solchen Serumpräparaten alleine schon auf Grund der Verschiedenheit der Spenderorganismen für derartige Präparate von Charge zu Charge. Dies stellt vor allem bei der Standardisierung der Zeitproduktion und bei der Etablierung von Standardzuchtbedingungen für derartige Zellen ein erhebliches Problem dar. In jedem Fall ist aber eine intensive und ständige Qualitätskontrolle des eingesetzten Serummaterials erforderlich. 



  Dies ist aber speziell bei derartig komplexen Zusammensetzungen wie Serum äusserst aufwendig und kostenintensiv. 



   Weiters enthalten solche komplexen Präparate eine Vielzahl von Proteinen, die vor allem im Zuge des Aufreinigungsprozesses des zu gewinnenden rekombinanten Proteins aus der Zellkultur störend wirken können. Dies gilt vor allem für diejenigen Proteine, welche dem zu gewinnenden Protein homolog oder ähnlich sind. Naturgemäss sind diese Probleme vor allem bei der rekombinanten Gewinnung von Serumproteinen akut, da das biogene Pendant im eingesetzten Medium   (z. B.   etwa das bovine Protein) im Zuge der Aufreinigung nur verlässlich durch ganz spezifische differenzielle Reinigung   (z. B.   mit Antikörpern, die spezifisch nur auf das rekombinante Protein, nicht jedoch auf das bovine gerichtet sind, entfernt werden kann   (Björck. L.,   J. Immunol., 1988, Vol 140, pp.   1194-1197 ; Nilson etal.,   J.

   Immunol Meth., 1993,164, pp. 33-40). 



   Ein entscheidendes Problem bei der Verwendung von Serum oder aus Serum abgeleiteten Verbindungen im Kulturmedium ist aber auch das Risiko an Kontamination mit   Mycoplasmen,   Viren oder BSE-Agenzien. In Zusammenhang mit aus menschlichem Blut abgeleiteten Präparaten ist hierbei das Risiko der Kontamination mit Viren, wie Hepatitis oder HIV, besonders hervorzuheben. Bei aus bovinem Material abgeleitetem Serum oder Serumkomponenten besteht vor allem die Gefahr einer BSE-Kontamination. Darüberhinaus können   sämtliche   Serum-abgeleiteten Materialien auch mit Krankheitserregern die noch unbekannt sind kontaminiert sein. 



   Gerade aber für die Kultivierung von Zellen an festen Oberflächen wurde die Zugabe von Serumkomponenten zur Gewährleistung einer ausreichenden Haftung der Zellen an den Oberflächen und einer ausreichenden Produktion an den erwünschten Substanzen aus den Zellen bis auf wenige Ausnahmen bislang als unumgänglich angesehen worden. So konnte zwar beispielsweise mit dem in der WO 91/09935 beschriebenen Methodik ein Verfahren zur serum-und proteinfreien Kultivierung von   FSME-VirusNirusantigen   durch serum-und proteinfreie Kultivierung von Oberflächen-abhängigen permanenten Zellen, vorzugsweise Verozellen, erreicht werden (s. WO 96/15231). Es handelte sich dabei jedoch nicht um rekombinante Zellen, sondern um Wirtszellen, die für die Produktion von Virusantigen in einem lytischen Prozess eingesetzt werden. 



   Im Gegensatz dazu sind die vorrangig für die rekombinante Herstellung eingesetzten Zellen, beispielsweise CHO-Zellen, nur bedingt haftungsfähig. So können mittels konventioneller Methoden angezogene CHO-Zellen nur unter serumhaltigen Bedingungen sowohl an glatte als auch an poröse Mikroträger binden (s. US 4, 978, 616 ; Cytotechnology 9 (1992), 247-253). Werden aber derartige Zellen unter serumfreien Bedingungen angezogen, so verlieren sie diese Eigenschaft und haften nicht an glatten Trägern oder lösen sich leicht von diesen ab, soferne nicht andere Adhärenz-fördernde Zusätze, wie beispielsweise Fibronektin, Insulin oder Transferrin im Medium vorgesehen werden. Auch hierbei handelt es sich jedoch um aus Serum abgeleitete Proteine. 



   Alternativ dazu können die Zellen zwar auch in Suspensionskultur gezogen werden, beispielsweise im Batch-Verfahren oder in einer kontinuierlichen Kultur. Bevorzugterweise erfolgt die Kultivierung im Chemostat-Verfahren (Ozturk   S. S.   et al., 1996, Abstr. Pap. Am. Chem. Soc., BIOT 164 ; Payne   G. F.   et al., in "Large Scale Cell Culture Technology", 1987, ed. Lydersen B. K., Hauser publishers,   S. 206-212).   

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   Die JP 7-39386 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zellulose, wobei Mikroorganismen aus der Familie Acetobacter, die die Fähigkeit zur Produktion von zelluloseartigen Substanzen haben, in Kulturmedium kultiviert werden, dem Carbonsäuren oder deren Salze als Zellulosewachstum fördernde Faktoren zugesetzt werden, um die Produktivität der Zellen zu steigern. Als Bestandteile der Kultivierungsmedien werden u. a. Petaton und Hefeextrakt angegeben. Dieser Stand der Technik ist beschränkt auf die Zelluloseproduktion in   Aceto-bacter-Kulturen.   



   Die JP 5-123178 bechreibt die Herstellung von Phenylalanin durch Einwirken von Mikroorganismen mit ss-Tyrosinaseaktivität auf ein Medium, das Phenylalanin und Tyrosin enthält. Es wird betont, dass jegliche Fermentationslösung verwendet werden kann, die diese beiden Aminosäuren enthält, beispielsweise werden als Stickstoffquellen Fleischextrakt oder Pepton angegeben. Auch der Zusatz von Vitamin B6 erfolgt nur deshalb, um die ss-Tyrosinaseaktivität zu erhöhen. 



   Die JP 3-244391 beschreibt die Verwendung von Bakterienzellen, i. e. Coli-Bakterien, zur Herstellung von rekombinanten Proteinen, wobei die Effizienz der Entfernung von aminoterminalen Methioninresten verbessert werden soll. Dazu werden spezielle Expressionsplasmide verwendet, die die Expression in   Ecoli ermöglichen.   Gemäss diesem Dokument wird die Verwendung eines   M9-Mediums   empfohlen, dem anstelle   der "Kasaminosäure" hydrolysiertes   Sojaprotein zugegeben wird. Dieses Medium enthält ausserdem auch Hefeextrakt. 



   Die WO 96/26266 beschreibt die Zugabe von Proteinhydrolysaten zu Medien für die Kultivierung von Zellen. Bei den angeführten Beispielen, die die Vorteilhaftigkeit der Zugabe der Proteinhydrolysate für die Expression von rekombinanten Proteinen in Zellkultur beschreiben sollen, wird aber stets   u. a. fetales Kälberserum   zum Basismedium zugesetzt. 



   Das RD   415 051   (Quest International) beschreibt die Zugabe von Peptid-Mischungen, darunter auch Sojapepton, zu Zellkulturmedien für die Kultivierung von eukaryontischen Zellen. Dies führt zu einem verstärkten Zellwachstum. Es wird betont, dass die Zugabe von Sojapepton zum Medium den Bedarf an Serum im Medium für die Kultivierung von BHK- und CHO-Zellen lediglich um 80% reduziert, nicht jedoch eliminiert. 



   Die W098/15614 beschreibt die Zugabe von Zusatzstoffen aus Pflanzen in Zellkulturen tierischer Zellen. Dabei wird zwar ein serumfreies Medium verwendet, nicht aber ein proteinfreies Medium, wie die Passagen belegen, worin die Zugabe von EGF, Insulin, Transferrin oder Insulin für die Herstellung eines basalen Mediums, das für die weiteren Vergleichsversuche verwendet wird, beschrieben wird. Weiters wurde der Effekt der Zugabe von Pflanzen-Derivaten im Hinblick auf die Wachstumsrate der Zellen gemessen, nicht aber auf deren Produktivität. 



   Die W091/10726 beschreibt Kulturmedium für die Kultivierung von Tumor- und Nicht-TumorZellen, wobei hier das Ziel lediglich darin besteht, die Zellen zu kultivieren, nicht aber rekombinante Proteine mittels dieser Zellen herzustellen. Weiters wird hier ein Basalmedium (PDRG) beschrieben, dem fötales Kälberserum zugesetzt wurde. Weiters wird dem Medium gemäss diesem Dokument eine Vielzahl von Aminosäuren zugegeben, nicht jedoch eine gezielte Auswahl weniger Aminosäuren. 



   Zudem wurde im Stand der Technik mehrfach versucht, Zellen ausgehend von serumhaltigen Bedingungen auf proteinfreies Medium zu adaptieren. Bei dieser Adaptierung wurde jedoch immer wieder festgestellt, dass die Ausbeute an exprimiertem Protein und die Produktivität der rekombinanten Zellen nach Adapation im proteinfreien Medium im Vergleich zu serumhaltigen Bedingun- 
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 Teil erheblich eingeschränkt ist.

   Beim Versuch der Adaptierung von Zellen an protein- oder serumfreien Medien kommt es auch immer wieder zu Instabilitäten unter reduziertem Wachstum der eingesetzten Zellen, so dass Zellen mit verringerter Expression oder auch nicht-produzierende Zellen entstehen, die gegenüber den produzierenden Zellen in protein- und serumfreien Medien einen Wachstumsvorteil haben, der dazu führt, dass diese die produzierenden Zellen überwuchern und letztendlich dann die ganze Kultur nur mehr sehr geringe Produktausbeuten liefert. 



   Die vorliegende Erfindung stellt sich daher zur Aufgabe, die Möglichkeiten zur protein- und serumfreien Kultivierung von rekombinanten Zellen zu verbessern und Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit welchen rekombinante Zellen in effizienter Weise serum- oder proteinfrei kultiviert werden können. Weiters soll damit die Kultivierung nicht nur von Oberflächenabhängigen Zellen möglich sein, sondern auch   In Suspensionskultur,   wobei Instabilitäten in der Produktivität 

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 der Zellen möglichst hintangehalten werden sollen. 



   Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darüberhinaus auch in einer effizienten Produktionssteigerung der rekombinanten Zellen. 



   Schliesslich soll erfindungsgemäss auch die Adaptierung von rekombinanten Zellen auf serumund proteinfreie Medien verbessert und effizienter gestaltet werden können. 



   Diese Aufgaben werden erfindungsgemäss gelöst durch ein Medium zur protein- und serumfreien Kultivierung von Zellen, insbesondere von Säugetierzellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen Anteil an Soja-Hydrolysat mit einem Molekulargewicht < 500 Dalton enthält. 



   Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass die oben definierten Ziele durch das   Kulti-   vieren von Zellen in   Soja-Hydrolysat-hältigem   Medium erreicht werden können, ohne dass die im Stand der Technik beschriebenen Nachteile der serumfreien Kultivierung in Kauf genommen werden müssten. Es hat sich gezeigt, dass im Gegensatz zu anderen im Stand der Technik bekannten Hydrolysaten, wie etwa Weizen-, Reis- oder Hefehydrolysaten, nur das Soja-Hydrolysat die erfindungsgemässen Eigenschaften vermittelt und beispielsweise zu einer signifikant erhöhten Ausbeute an rekombinantem Zielprotein führt. 



   Bevorzugterweise enthält das erfindungsgemässe Medium Soja-Hydrolysat in einer Menge von mehr als 10   Gew.-%,   bezogen auf die Gesamttrockenmasse des Mediums. In der Regel wird das Soja-Hydrolysat in einer Menge von 4-40 % im Medium vorgesehen. 



   Erfindungsgemäss ist die Wahl des spezifischen Soja-Hydrolysats nicht kritisch. Eine Vielzahl von am Markt befindlichen Soja-Präparaten kann erfindungsgemäss eingesetzt werden, z. B. Peptone aus Sojamehl, enzymatisch verdaut (beispielsweise durch Papain), mit einem pH-Wert zwischen 6, 5 und 7, 5, einem Gesamtstickstoffgehalt zwischen 9% und 9, 7% und einem Aschegehalt zwischen 8 und 15%. Es handelt sich dabei um Peptone aus Sojabohnen, wie sie im allgemeinen vom Fachmann für die Zellkultur verwendet werden. 



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird im erfindungsgemässen Medium eine gereinigte Präparation eines Soja-Hydrolysats bzw. einer Rohfraktion hiervon verwendet. Bei dieser Reinigung werden bevorzugterweise Verunreinigungen, die mit einer effizienten Kultivierung interferieren könnten, eliminiert oder aber die Definiertheit des Hydrolysas, beispielsweise hinsichtlich des Molekulargewichtes, verbessert. 



   Erfindungsgemäss besonders bewährt hat sich bei dieser Reinigung das Vorsehen eines Ultrafiltrationsschrittes, weshalb die Verwendung von ultrafiltriertem Soja-Hydrolysat im erfindungsgemässen Medium besonders bevorzugt ist. 



   Die Ultrafiltration kann gemäss Verfahren erfolgen, wie sie im Stand der Technik ausführlich beschrieben sind, beispielsweise unter Verwendung von Membranfiltern mit definierter Ausschlussgrenze. 



   Die Reinigung des ultrafiltrierten Sojapeptons kann durch Gelchromatographie, beispielsweise mittels Sephadex-Chromatographie, beispielsweise Sephadex G25 oder Sephadex G10, oder äquivalente Materialien, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Grössenausschlusschromatographie   oder "reversed phase"-Chromatographie erfolgen.   Es handelt sich dabei um Verfahren, wie sie dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt sind. 



   Ein besonders vorteilhaftes   Soja-Hydrolysat   ist dadurch gekennzeichnet, dass es einen Gehalt an freien Aminosäuren zwischen 10, 3 und 15, 6%, bevorzugt zwischen 12 und 13, 5%, einen Ge- 
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6toxin-Gehalt ovn < 500 E/g aufweist, und dass mindestens 40%, bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 55%, ein Molekulargewicht von 200-500 Dalton und mindestens 10%, bevorzugt mindestens 15%, ein Molekulargewicht von 500-1000 Dalton aufweisen. Ein derartiges Soja-Hydrolysat eignet sich besonders gut für die industrielle Produktion von rekombinanten Proteinen, da es auf Grund seiner Merkmale besonders leicht standardisierbar und in Routineverfahren einsetzbar ist. 



   Das erfindungsgemässe Medium kann neben   Soja-Hydrolysat   auch noch in an sich bekannter Weise synthetische Medien enthalten, wie beispielsweise DMEM/HAM's F12, Medium 199 oder   RPMI,   die aus der Literatur hinreichend bekannt sind. 



   Bevorzugterweise enthält das erfindungsgemässe Medium auch weiters Aminosäuren, vorzugsweise ausgewählt aus L-Asparagin, L-Cystein, L-Cystin, L-Prolin, L-Tryptophan, L-Glutamin oder Mischungen davon. 

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 Kombination zugesetzt werden. Besonders bevorzugt ist die kombinierte Zugabe der AminosäureMischung enthaltend alle oben genannten Aminosäuren. 



   In einer besonderen Ausführungsform wird ein serum-und proteinfreies Medium verwendet, das zusätzlich eine Kombination der oben genannten Aminosäuremischung und gereinigtes, ultrafiltriertes Sojapepton enthält. 



   Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass, beispielsweise zur Inaktivierung von Viren oder anderen Pathogenen, das Medium ohne negative Effekte ca. 5 bis 20 Minuten, bevorzugt 15 Minuten, auf 70"C bis   95 C,   bevorzugt 85 bis   95 C,   erhitzt werden kann. 



   Erfindungsgemäss kann jedes bekannte synthetische Medium in Kombination mit Soja-Hydrolysat eingesetzt werden. Konventionelle synthetische Minimalmedien können anorganische Salze, Aminosäuren, Vitamine, eine Kohlehydratquelle und Wasser enthalten. Beispielsweise kann DMEM/HAM's F12-Medium eingesetzt werden. Der Gehalt an Sojaextrakt kann im Medium bevorzugterweise zwischen 0, 1 und 100   g/l,   besonders bevorzugt zwischen 1 und 5   g/l,   liegen. Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann Sojapepton, das hinsichtlich seines Molekulargewichtes stardardisiert ist, verwendet werden. Das Molekulargewicht des Sojapeptons beträgt vorzugsweise weniger als 50kD, besonders bevorzugt weniger als   10kD,   insbesondere weniger als 1kD. 



   Als besonders vorteilhaft für die Produktivität der rekombinanten Zelllinien hat sich die Zugabe von ultrafiltriertem Sojapepton erwiesen, dessen durchschnittliches Molekulargewicht 350 Dalton beträgt (Fa. Quest). Dies ist ein Sojaisolat mit einem Gehalt an Gesamtstickstoff von ca. 9, 5% und einem Gehalt an freien Aminosäuren von ca. 13%. 



   Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines gereinigten, ultrafiltrierten Sojapeptons mit einem Molekulargewicht von    <    1000 Dalton, bevorzugt    <    500 Dalton, besonders bevorzugt   : s ;   350 Dalton. 



   Vorzugsweise enthält das erfindungsgemässe Medium weiters Hilfssubstanzen, wie z. B. Puffersubstanzen, Oxidationsstabilisatoren, Stabilisatoren gegenüber mechanischer Beanspruchung oder Proteaseinhibitoren. 



   Besonders bevorzugt wird ein Medium mit folgender Zusammensetzung verwendet : syntheti- 
 EMI4.2 
 
5Na-Selenit (1   bis 15 g/l).   



   Dem erfindungsgemässen Medium kann gegebenenfalls ein nichtionisches Oberflächenmittel, wie etwa Polypropylenglycol   (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC   F-71 oder PLURONIC   F-108) als   Entschäumer zugegeben werden. 



   Dieses Mittel wird allgemein angewendet, um die Zellen vor den negativen Auswirkungen der Belüftung zu schützen, da ohne Zugabe eines Oberflächenmittels die aufsteigenden und zerplatzenden Luftblasen zur Schädigung jener Zellen führen können, die sich an der Oberfläche dieser Luftblasen befinden. ("sparging") (Murhammer und Goochee, 1990, Biotechnol. Prog. 6 : 142-148)
Die Menge an nichtionischem Oberflächenmittel kann dabei zwischen 0, 05 und 10   g/l liegen,   besonders bevorzugt ist jedoch eine möglichst geringe Menge zwischen 0, 1 und 5 g/l. 



   Weiters kann das erfindungsgemässe Medium auch Cyclodextrin oder ein Denvat davon enthalten. 



   Vorzugsweise enthält das serum-und proteinfreie Medium einen Proteaseinhibitor, wie etwa Serinproteaseinhibitoren, die   Gewebekultur-tauglich   und synthetischen oder pflanzlichen Ursprungs sind. 



   Als Zellen zur Kultivierung   ! m erfindungsgemässen   Medium werden bevorzugterweise bereits adaptierte Zellen verwendet,   d. h. Zellen,   die bereits an das Wachstum in protein- und serumfreien 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 Medien adaptiert worden sind. Es hat sich gezeigt, dass mit derartigen voradaptierten Zellen nicht nur erhöhte Ausbeuten erzielt werden können, sondern dass sich deren Stabilität bei der serumund proteinfreien Kultivierung deutlich durch die Verwendung des erfindungsgemässen Mediums verbessert. 



   Besonders bewährt haben sich aber erfindungsgemäss rekombinante Zellklone, die von vornherein in serum-und proteinfreien Medien für mindestens 40, vorzugsweise mindestens 50 Generationen stabil sind und rekombinante Produkte exprimieren
Derartige Zellklone sind erhältlich aus einer Zellkultur, die nach Kultivierung eines rekombinanten Ursprungszellklons auf serumhaitigem Medium und Umadaptierung der Zellen auf serum-und proteinfreies Medium erhalten wird. 



   Unter Ursprungszellklon kann ein rekombinanter   Zeliklon-Transfektant   verstanden werden, der nach Transfektion von Wirtszelle mit einer rekombinanten Nukleotidsequenz unter Laborbedingungen stabil rekombinantes Produkt exprimiert. Der Ursprungskion wird zur Optimierung des Wachstums in serumhaltigem Medium angezüchtet. Zur Erhöhung der Produktivität wird der Ursprungsklon gegebenenfalls in Gegenwart eines Selektionsmittels und Selektion auf den Selektionsmarker und/oder Amplifikationsmarker angezogen. Für die grosstechnische Produktion wird der Ursprungszeltklon unter serumhaitigen Kultivierungsbedingungen bis zu einer hohen Zelldichte angezogen und kurz vor der Produktionsphase auf serum-und/oder proteinfreies Medium umadaptiert. Die Kultivierung erfolgt dabei vorzugsweise ohne Selektionsdruck. 



   Die Kultivierung des rekombinanten Ursprungszellklons kann bereits von Anfang an in serumund proteinfreiem Medium erfolgen, wodurch eine Umadaptierung nicht mehr notwendig ist. Gegebenenfalls kann auch in diesem Fall ein Selektionsmittel verwendet werden und die Selektion auf den Selektions- und/oder Amplifikationsmarker erfolgen. Ein Verfahren dafür Ist beispielsweise in der EP 0 711 835 beschrieben. 



   Die nach Umadaptierung auf serum-und proteinfreies Medium erhaltene Zellkultur wird auf diejenigen Zellklone der Zellpopulation getestet, die unter serum-und proteinfreien Bedingungen, gegebenenfalls in Abwesenheit eines Selektionsdruckes, stabil Produkte produzieren. Dies kann beispielsweise durch Immunfluoreszenz mit markierten, spezifischen, gegen das rekombinante Polypeptid oder Protein gerichteten Antikörpern erfolgen. Die als Produkt-Produzenten identifizierten Zellen werden aus der Zellkultur isoliert, und unter serum-und proteinfreien, vorzugsweise unter produktionsäquivalenten Bedingungen erneut vermehrt. Die Isolierung der Zellen kann dabei durch Vereinzelung der Zellen und Testen auf Produkt-Produzenten erfolgen. 



   Die Zellkultur, enthaltend die stabilen Zellen, kann erneut auf stabile rekombinante Klone getestet und diese aus der Zellkultur isoliert und auskloniert werden. Anschliessend können die unter serum-und proteinfreien Bedingungen erhaltenen stabilen rekombinanten   Zell klone   unter serumund proteinfreien Bedingungen weitervermehrt werden. 



   Die derart hergestellten im erfindungsgemässen Medium rekombinanten Zellklone bzw. Zellpopulationen zeichnen sich insbesondere dadurch aus, dass sie in serum-und proteinfreiem Medium für mindestens 40, vorzugsweise mindestens 50, insbesondere mehr als 60 Generationen stabil sind und rekombinantes Produkt exprimieren. 



   Ein Beispiel für einen derartigen stabilen   Zell klon   bzw. Zellpopulation wurde unter der Nummer 98012206 bei der ECACC (UK) gemäss Budapester Vertrag hinterlegt. 



   Die erfindungsgemäss zu kultivierende Zellkultur ist vorzugsweise von einer rekombinanten Säugerzelle abgeleitet. Rekombinante Säugerzellen können dabei alle Zellen sein, die für ein rekombinantes Polypeptid oder Protein kodierende Sequenzen enthalten. Umfasst sind dabei alle kontinuierlich wachsenden Zellen, die sowohl adhärent als auch nicht-adhärent wachsen. Besonders bevorzugt sind rekombinante CHO-Zellen oder BHK-Zellen. Rekombinante Polypeptide oder Proteine können Blutfaktoren, Wachstumsfaktoren oder andere biomedizinisch relevante Produkte sein. 



   Gemäss der vorliegenden Erfindung werden   Zellklone   bevorzugt, die die kodierende Sequenz für einen rekombinanten Blutfaktor wie Faktor 11, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Protein S, Protein C, eine aktivierte Form eines dieser Faktoren, oder vWF enthalten, und in der Lage sind, diesen stabil über mehrere Generationen zu exprimieren. Besonders bevorzugt sind dabei rekombinante CHO-Zellen, die vWF oder ein Polypeptid mit vWF-Aktivität, Faktor VIII oder ein Polypeptid   mit Vill-Aktivität,   vWF und Faktor VIII, Faktor IX oder Faktor 11 exprimieren. 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 



   Um eine   Masterzellbank   anzulegen, werden 30 Generationen benötigt. Um eine durchschnittliche Batchkultur mit 1000   I-Massstab   durchzuführen, sind mindestens etwa 40 Generationen erforderlich. Mit dem erfindungsgemässen Medium ist es möglich, ausgehend von einem Einzelklon eine "Master Cell Bank" (MCB), eine'Working Cell Bank" (WCB) mit etwa 8 bis 10 Generationen und damit eine Zellkultur im Produktionsmassstab (Produktionsbiomasse) mit bis zu 20 bis 25 Generationen unter protein- und serumfreien Bedingungen herzustellen, wohingegen mit bisherigen Zell- klonen und Medien einige Generationen nach Wachstum auf serum- oder proteinfreiem Medium instabil wurden, wodurch a) keine einheitliche Zellkultur mit Produkt-Produzenten und b) keine stabile Produktproduktivität über eine längeren Zeitraum möglich war. 



   Erfindungsgemäss konnte aber demgegenüber sogar eine erhöhte Produkt-Produktivität selbst im Vergleich zum Ursprungszellklon, der in serumhaltigem Medium kultiviert wurde, gefunden werden. 



   Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren von Kultivierung von Zellen, insbesondere von Säugetierzellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass diese Zellen in ein erfindungsgemässes Medium eingebracht und in diesem Medium kultiviert werden. 



   Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung des erfindungsgemässen Mediums zur Kultivierung von rekombinanten Zellen, vorzugsweise eukaryontischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen. 



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäss auch eine Zellkultur, welche das erfindungsgemässe Medium und Zellen, vorzugsweise eukaryontische Zellen, insbesondere Säugetierzellen, umfasst. 



   Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht eingeschränkt werden soll, näher erläutert. 



   Es zeigen :
Fig. 1 : die mikroskopische Aufnahme einer Arbeitszellbank eines Ursprungszellklons zum Zeitpunkt der Umadaptierung von serumhaltigem auf serum-und proteinfreies Medium (A), nach 10 Generationen mit serum-und proteinfreiem Medium (B) und nach 60 Generationen mit serumund proteinfreiem Medium   (C) ;  
Fig. 2 : die mikroskopische Aufnahme einer Zellkultur, ausgehend von einem stabilen rekombinanten Zellklon unter serum-und proteinfreien Bedingungen auf der Stufe der Arbeitszellbank (A), nach Generationen (B) nach 60 Generationen   (C) ;  
Fig. 3 :

   die Ergebnisse der Kultivierung eines rFVIII-CHO-Zellklons in einem 10 I-Perfusionsbioreaktor a) Faktor   VIII-Aktivität   (mEinheiten/ml) und Perfusionsrate   (1-5/Tag)   über einen Zeitraum von
42 Tagen. b)   Votumetrische Produktivität (Einheiten Faktor Vttt/t/Tag) im Perfusionsbioreaktor ;  
Fig. 4 : einen Vergleich der Faktor   VIII-Produktivität     (mE/ml)   bei Kultivierung im BatchVerfahren von rFaktorVIII-exprimierenden CHO-Zellen in verschiedenen Medien ;
Fig.   5 : die Faktor VIiI-Produktivität (E/l) bei kontinuierlichem Wachstum von rFaktor VItI-expri-   mierenden CHO-Zellen in serum-und proteinfreiem Medium nach Beginn der Zugabe von gereinigtem, ultrafiltiertem Sojapepton am 6.

   Tag der Kultivierung ; und
Fig. 6 : die in dem protein- und serumfreien Medium gezüchteten   BH, K-Zellen enthaltend 50-   ja-Hydrolysat. 



   Beispiele : 
Beispiel 1 :
Stabilität von   rvWF-CHO-Zellen   nach Umstellen von serumhaltigem auf serum-und proteinfreies Medium   CHO-dhfr'-Zellen   wurden Plasmid phAct-rvWF und pSV-dhfr, co-transfiziert und vWF exprimierende Klone, wie in Fischer et al. (1994, FEBS Letters 351 : 345-348) beschrieben,   subkloniert.   Von den Subklonen, die stabil rvWF exprimierten, wurde unter serumhaltigen Bedingungen, jedoch in Abwesenheit von MTX, eine Arbeitszellbank (Working Cell Bank, WCB) angelegt und die Zellen 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 unter serumhaltigen Bedingungen auf einem porösen Mikroträger   (CytoporeO)   immobilisiert. Nach-   dem eine Zelldichte von 2x10@ Zellen/ml Trägermatrix erreicht wurde, erfolgte die Umstellung der   Zellen auf serum-und proteinfreies Medium.

   Die Zellen wurden für mehrere Generationen unter serum-und proteinfreien Bedingungen weiterkultiviert. Mittels Immunfluoreszenz mit markierten anti-vWF-Antikörpern wurden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten in serum-und proteinfreiem Medium getestet. Die Bewertung der Stabilität der Zellen erfolgte bei der   Arbeitszellbank   vor der Mediumsumstellung, nach 10 und 60 Generationen Im serum-und proteinfreien Medium Während die Arbeitszellbank noch 100% rvWF-Produzenten aufwies (Figur 1 A), sank der Anteil der rvWFProduzenten nach 10 Generationen in serum-und proteinfreiem Medium auf etwa 50% ab (Figur 1 B). Nach 60 Generationen wurden mehr als 95% der Zellen als Nicht-Produzenten identifiziert (Figur 1 C). 



   Beispiel 2 : Kionierung von stabilen rekombinanten CHO-Klonen 
Von der Zellkultur, enthaltend   rvWF-CHO-Zellen   gemäss Beispiel 1 (dieser mit r-vWF-CHO F7 bezeichnete stabile Zellklon wurde bei der ECACC (European Collection of Cell Cultures), Salisbury, Wilshire SP4 OJG, UK, gemäss Budapester Vertrag am 22. Jänner 1998 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 98012206), die für 60 Generationen in serum-und proteinfreiem Medium kultiviert worden war (Figur 1 C), wurde eine Verdünnung angelegt und jeweils   0, 1 Zeilen/weil   einer Mikrotiterplatte ausgesät. Die Zellen wurden in DMEM/HAM's F12 ohne Serum- oder Proteinzusätze und ohne Selektionsdruck für etwa 3 Wochen kultiviert und die Zellen mit Immunfluoreszenz mit markierten anti-vWF-Antikörpern getestet.

   Ein als positiv identifizierte Zellklon wurde als Ausgangskion für die Herstellung einer   Saat-Zellbank   eingesetzt. Von der Saat-Zellbank wurde eine Master-Zellbank (MCB) in serum-und proteinfreiem Medium angelegt und Einzelampullen für die weitere Herstellung einer Arbeitszellbank weggefroren. Ausgehend von einer Einzelampulle wurde eine Arbeitszellbank In serum-und proteinfreiem Medium hergestellt. Die Zellen wurden auf poröse Mikroträger immobilisiert und für mehrere Generationen unter serum-und proteinfreien Bedingungen weiterkultiviert. Mittels Immunfluoreszenz mit markierten anti-vWF-Antikörpern wurden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten in serum-und proteinfreiem Medium auf Produktivität getestet.

   Die Bewertung der Stabilität der Zellen erfolgte auf der Stufe der Arbeitszellbank und nach 10 und 60 Generationen in serum-und proteinfreiem Medium. Sowohl auf Stufe der Arbeitszellbank (Figur 2 A), als aucn nach 10 (Figur 2 B) und ôû Generationen (Figur 2 C) wurden annähernd 100% der Zellen als positive stabile rekombinante Klone identifiziert, die rvWF exprimieren 
Beispiel 3 :
Zellspezifische Produktivität der rekombinanten Zellklone 
Von definierten Stufen während der Kultivierung von rekombinanten Zellen wurde eine definierte Zellzahl entnommen und mit frischem Medium für 24 inkubiert. Die   rvWF : Risto-CoF-Aktivität   wurde in den   Zellkulturüberständen   bestimmt.

   Tabelle 1 zeigt, dass die zellspezifische Produktivität bei den erfindungsgemässen stabilen rekombinanten Zellklonen auch nach 60 Generationen in serum-und proteinfreiem Medium stabil war, und sogar im Vergleich zum Ursprungsklon, der in serumhaltigem Medium kultiviert war, erhöht war. 



   Tabelle 1 
 EMI7.1 
 
<tb> 
<tb> Zeltklon <SEP> zellspezifische <SEP> zellspezifische <SEP> zellspezifische <SEP> 
<tb> Produktivität <SEP> Produktivität <SEP> Produktivität
<tb> der <SEP> Arbeitszellen <SEP> nach <SEP> 10 <SEP> Generationen <SEP> nach <SEP> 60 <SEP> Generationen
<tb> mU <SEP> rvWF/106ZellenfTag <SEP> mU <SEP> rvWF/106ZellenfTag <SEP> mU <SEP> rvWF/106ZellenfTag
<tb> rvWF-CHO <SEP> &num;808. <SEP> 68 <SEP> 55 <SEP> 30 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> 
<tb> Ursprungszellkoln
<tb> r-vWF-CHO <SEP> F7 <SEP> *)
<tb> stabiler <SEP> Klone <SEP> 62 <SEP> 65 <SEP> 60
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 *) hinterlegt am 22. 1. 1998 (ECACC (European Collection of Cell Cultures,
Salisbury, Wiltshire SP4 OJG,   UK) ;

   Hinterlegungsnummer   98012206)   Beispiel 4 :    Zusammensetzung eines synthetischen serum-und proteinfreien Mediums 
Tabelle 2 
 EMI8.1 
 
<tb> 
<tb> Komponente <SEP> g/l <SEP> Bevorzugte <SEP> Menge
<tb> in <SEP> all
<tb> Synthetisches <SEP> 1-100 <SEP> 11, <SEP> 00-12, <SEP> 00 <SEP> 
<tb> Minimalmedium
<tb> (DMEM/HAM's <SEP> F12)
<tb> Sojapepton <SEP> 0,5-50 <SEP> 2,5
<tb> L-Glutamin <SEP> 0,05-1 <SEP> 0,36
<tb> NaHCO3 <SEP> 0,1-10 <SEP> 2,00
<tb> Ascorbinsäure <SEP> 0, <SEP> 0005 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 0035 <SEP> 
<tb> Ethanolamin <SEP> 0, <SEP> 0005 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 0015 <SEP> 
<tb> Na-Selenit <SEP> 1-15 <SEP>  g/l <SEP> 8,6 <SEP>  g/l
<tb> optional <SEP> :

   <SEP> 
<tb> Synperonic <SEP> F68 <SEP> 0, <SEP> 01-100, <SEP> 25 <SEP> 
<tb> 
 
Beispiel 5 :
Kultivierung von   rFVIII-CHO-Zellen   in protein- und serumfreiem Minimalmedium 
Eine Zellkultur, enthaltend rFVIII-CHO-Zellen, wurde in einem 10 I-Rührtan und Perfusion kultiviert. Dabei wurde ein Medium gemäss Beispiel 4 verwendet. Die Zellen wurden dabei auf einem 
 EMI8.2 
 



   Figur 3 zeigt die Ergebnisse der Kultivierung eines rFVIII-CHO-Zellkolns in einem 10 I-Perfusionsbioreaktor. a) Faktor   VIII-Aktivität     (mEinheiten/ml)   und Perfusionsrate (1-5/Tag) über einen Zeitraum von 42 Tagen. b) Volumetrische Produktivität (Einheiten Faktor   VlH/I/Tag)   im Perfusionsbioreaktor. 



   Tabelle 3 
 EMI8.3 
 
<tb> 
<tb> Kultivierungstage <SEP> Zellspecifische <SEP> Immunfluoreszenz
<tb> Produktivität <SEP> (% <SEP> FVIII-positive
<tb> (mE/106Zellen/Tag) <SEP> Zellen) <SEP> 
<tb> 15 <SEP> 702 <SEP> n. <SEP> a.
<tb> 



  21 <SEP> 1125 <SEP> n. <SEP> a. <SEP> 
<tb> 



  28 <SEP> 951 <SEP> > 95%
<tb> 35 <SEP> 691 <SEP> > 95% <SEP> 
<tb> 42970na
<tb> 
 
Tabelle 3 zeigt die Stabilität und spezifische Produktivität der rFVIII exprimierenden Zellen. Für diese Ergebnisse wurden nach 15,21, 28,35 und 42 Tagen Proben entnommen, bei 300 g abzentrifugiert und in frischem serum-und proteinfreien Medium resuspendiert. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Faktor   VIII-Konzentration   in den   Zellkulturüberständen   und die Zellzahl bestimmt. Ausgehend von diesen Daten wurde die spezifische   FVIII-Produktivität   berechnet. 



   Es wurde eine stabile durchschnittliche Produktivität von 888 mEinheiten/106-Zellen/Tag erreicht. Diese stabile Produktivität wurde auch durch Immunfluoreszenz mit markierten   anti-FVIII-   

 <Desc/Clms Page number 9> 

 Antikörpern nach 15,21, 28,35 und 42 Tagen in serum-und proteinfreiem Medium bestätigt 
Beispiel 6 :
Vergleich der Produktivität von rekombinanten FVIII-CHO-Zellen in protein- und serumfreiem Medium, enthaltend weitere Medienkomponenten. 



   Eine   rFVIII-CHO-Zellen   enthaltende Zellkultur wurde im Batch-Ansatz kultiviert. Dabei wurde ein Medium gemäss Beispiel 4 verwendet, dem folgende Aminosäuren zugegeben wurden : 
Tabelle 4 
 EMI9.1 
 
<tb> 
<tb> Aminosäure <SEP> : <SEP> mg/i <SEP> Bevorzugte <SEP> Menge
<tb> in <SEP> mg/l
<tb> L-Asparagin <SEP> 1-100 <SEP> 20
<tb> L-Cystein. <SEP> HCI. <SEP> H20 <SEP> 1-100 <SEP> 15
<tb> L-Cystin <SEP> 1-100 <SEP> 20
<tb> L-Prolin <SEP> 1 <SEP> - <SEP> 150 <SEP> 35
<tb> L-Tryptophan <SEP> 1-100 <SEP> 20
<tb> L-Glutamin <SEP> 50 <SEP> -1000 <SEP> 240
<tb> 
 
Die Zellen wurden bei   370C   gezüchtet, pH 6, 9-7, 2.

   Die Zellen wurden im Batch-Verfahren über 24-72 Stunden gezüchtet
Die Produktivität der rekombinanten FVIII-CHO-Zellen wurde in folgenden Medienzusammensetzungen gemessen :
Mix 1 bestehend aus serum-und proteinfreiem Medium ohne Sojapepton, enthaltend zusätzlich eine Aminosäuremischung gemäss der oben genannten Tabelle. 



   Mix 2 bestehend aus serum-und proteinfreiem Medium, enthaltend Sojapepton. 



   Mix 3 bestehend aus serum-und proteinfreiem Medium, enthaltend Sojapepton und zusätzlich eine Aminosäuremischung gemäss der oben genannten Tabelle. 



   Mix 4 bestehend aus serum-und proteinfreiem Medium, enthaltend zusätzlich eine Aminosäuremischung gemäss der oben genannten Tabelle und   2, 5 g/I   gereinigtes, ultrafiltriertes Sojapepton. 



  Die Reinigung des ultrafiltrierten Sojapepton erfolgte chromatographisch über eine   Sephadex&commat;-   Säule. 



   Beispiel 7 :
Kultivierung von rekombinanten FVIII-CHO-Zellen in protein- und serumfreiem Medium in Chemostat-Kultur. 



   Eine   rFVIII-CHO-Zellen   enthaltende Zellkultur wurde in einem 10   I   gerührten Bioreaktor-Tank kultiviert. Dabei wurde ein Medium gemäss Beispiel 4, ohne Sojapepton, enthaltend eine Aminosäuremischung gemäss Beispiel 6 verwendet. Die Zellen wurden bei   370C   gezüchtet, pH 6, 9-7, 2 ; die Sauerstoffkonzentration lag bei 20-50% Luftsättigung. Zur Bestimmung des Faktor VIII-Titers und der Zellkonzentration Im Kulturüberstand wurden alle 24 Stunden Proben entnommen. Die Gesamt-Zellkonzentration war vom 2. bis zum 14. Tag konstant. Ab dem 6. Tag wurde dem Medium ultrafiltriertes Sojapepton zugegeben. Die Faktor   VIII-Produktivität   ist in Figur 5 dargestellt, die Messung erfolgte mittels eines CHROMOGENIX CoA FVIII : C/4-Systems.

   Immunfluoreszenz mit markierten   anti-FVIII-Antikörpern.   Den Daten ist zu entnehmen, dass es durch Zugabe des Sojapeptons zu einem deutlichen Anstieg der Faktor   VIII-Produktivität   und damit der volumetrischen Produktivität des Bioreaktor-Systems kommt, ohne zu einem deutlichen Anstieg des Zellwachstums zu führen. Das Fehlen von Sojapepton in der kontinuierlichen Kultur führt nach wenigen Tagen zu einem deutlichen Abfall der Faktor   VIII-Produktivität,   während die Zugabe des Sojapeptons einen fast   10-fachen   Anstieg der Produktivität zu Folge hat.

   Da diese Zugabe jedoch nicht die Zellzahl erhöht, ist damit deutlich gezeigt, dass ultrafiltriertes Sojapepton eine deutliche Steigerung der Produktivität zur Folge hat, die aber unabhängig ist vom Zellwachstum. 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 
 EMI10.1 
 in protein- und serumfreiem Medium, enthaltend unterschiedliche Hydrolysate. 



   Eine rFVIII-CHO-Zellkultur wurde im Batch-Ansatz kultiviert. Dabei wurde ein serum-und proteinfreies Medium verwendet wie in Beispiel 4 beschrieben, dem unterschiedliche Hydrolysate (aus Soja, Hefe, Reis, Weizen zugegeben wurden. Als Kontrolle wird ein   serum- und proteinfreies   Medium verwendet, dem kein Hydrolysat zugegeben wurde. 



   Die Ausgangszelldichte betrug   O, 6x105   bzw.   O, 4x106 Zellen.   Die Zellen wurden bei   370C   im Batch-Verfahren gezüchtet, pH   6, 9-7, 2.   



     Tabelle 5 :   zeigt die Ergebnisse der Kultivierungsversuche von   rFVIII-CHO-Zellen   in serum-und proteinfreiem Medium, dem Soja- (ultrafiltriert) und Hefe-Hydrolysate zugegeben wurden. Die Ausgangszelldichte betrug 0,6x105 Zellen. Als Kontrolle wurde serum-und proteinfreies Medium ohne Hydrolysat-Zusätze verwendet. 



   Tabelle 5 
 EMI10.2 
 
<tb> 
<tb> Hydrolysat <SEP> End-Zelldichte <SEP> FViI-Titer <SEP> FVIII-Clotting- <SEP> 
<tb> (x108/ml) <SEP> (mE/ml) <SEP> Aktivität
<tb> (mE/mi)
<tb> Soja <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP> 485 <SEP> 508
<tb> Hefe <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> 226 <SEP> 230
<tb> 
 
Tabelle 6 : zeigt die Ergebnisse der Kultivierungsversuche von   rFVIII-CHO-Zellen   in serum-und proteinfreiem Medium, dem Soja-(ultrafiltriert), Reis- und Weizen-Hydrolysate zugegeben wurden. Die Ausgangszelldichte betrug 0,6x105 Zellen. Als Kontrolle wurde serum- und proteinfreies Medium ohne Hydrolysat-Zusätze verwendet. 



   Tabelle 6 
 EMI10.3 
 
<tb> 
<tb> Hydrolysat <SEP> End-Zelldichte <SEP> FVIII-Titer <SEP> vWF-Antigen
<tb> (x106/ml) <SEP> (mE/ml) <SEP> ( <SEP> g/ml)
<tb> Soja <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> 1142 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> Reis <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 479 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Weizen <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 522 <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 
<tb> Kontrolle <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 406 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 
 
 EMI10.4 
   proteinfreiem Medium, dem Soja- (ultrafiltriert) und Weizen-Hydrolysate zugegeben wurden.

   Die Ausgangszelldichte betrug O, 4x106 Zellen.    
 EMI10.5 
 
 EMI10.6 
 
<tb> 
<tb> Hydrolysat <SEP> End-Zell- <SEP> FVIII-Titer <SEP> FVIII-Anti-vWF-Anti- <SEP> 
<tb> dichte <SEP> (mE/ml) <SEP> gen <SEP> gen
<tb> (x106/ml) <SEP> ( <SEP> g/ml) <SEP> ( <SEP> g/ml)
<tb> Soja <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1427 <SEP> 166 <SEP> 17, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Weizen <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 1120 <SEP> 92 <SEP> 7,9
<tb> 
 
Beispiel 9 :
Kultivierung von BHK-Zellen in protein- und serumfreiem Medium enthaltend Soja-Hydrolysat 
BHK-21 (ATCC CCL 10)-Zellen wurden mittels eines   CaP04-Verfahrens   dreifach co-transifi- 

 <Desc/Clms Page number 11> 

 ziert mit folgenden Plasmiden :

   25   g   des Plasmids pSV-FII (Fischer B. et   al., J.Biol.Chem.,   1996, Vol. 271, pp. 23737-23742), das humane   Faktor 11 (Prothrombin) - cDNA   unter der Kontrolle eines SV40-Promotors (SV40 early gene Promoter) enthält ;   4 gag   des   Plasmids pSV-DHFR   für die Methotrexat-Resistenz und 1   g   des Plasmids pUCSV-neo (Schlokat U. et   al.,   Biotech. Appl. Biochem., 1996, Vol. 24, pp. 257-267), das die G418/Neomycin-Resistenz vermittelt. Stabile   Zellklone   wurden durch Kultivierung in einem Medium, das 500   tg/ml   G418 enthielt und durch schrittweise Erhöhung der Methotrexat-Konzentration bis zu einer Konzentration von 3 aM selektiert. 



   Die so erhaltenen Klone wurden subkloniert und auf protein- und serumfreies Medium adaptiert. Die Kultivierung erfolgte in Suspensionskultur. 



   Die Ergebnisse sind der Figur 6 zu entnehmen ; die in dem protein-und serumfreien Medium, enthaltend Soja-Hydrolysat,   gezücheteten     BHK-Zellen   zeigten eine hohe und stabile Produktionsrate von rekombinantem Faktor 11. 



   PATENTANSPRÜCHE : 
1. Medium zur protein- und serumfreien Kultivierung von Zellen, insbesondere   Säugetierzel-   len, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Anteil an Soja-Hydrolysat mit einem Moleku- largewicht      500 Dalton enthält.

Claims (1)

  1. 2. Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Menge von mehr als 10 Gew.-% Soja-Hydrolysat bezogen auf die Gesamt-Trockenmasse des Mediums enthält.
    3. Medium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine gereinigte Präpa- ration eines Soja-Hydrolysats enthält.
    4. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ein ultrafilt- riertes Soja-Hydrolysat enthält.
    5. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Soja-Hy- drolysat einen Endotoxin-Gehalt von < 500 E/g aufweist und dass mindestens 40% des Soja-Hydrolysats ein Molekulargewicht von 200-500 Dalton aufweisen.
    6. Medium nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 50 % des Soja-Hy- drolysats ein Molekulargewicht von 200-500 Dalton aufweisen.
    7. Medium nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 55 % des Soja-Hy- drolysats ein Molekulargewicht von 200-500 Dalton aufweisen.
    8. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters Aminosäuren, vorzugsweise ausgewählt aus L-Asparagin, L-Cystein, L-Cystin, L-Prolin, L-Tryptophan, L-Glutamin oder Mischungen davon, enthält.
    9. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters Hilfssubstanzen, vorzugsweise Puffersubstanzen, Oxidationsstabilisatoren, Stabilisatoren gegenüber mechanischer Beanspruchung oder Proteaseinhibitoren enthält.
    10 Verfahren zur Kultivierung von Zellen, insbesondere Säugetierzellen, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Zellen in ein Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 9 eingebracht und kultiviert werden.
    11 Verwendung eines Mediums nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Kultivierung von re- kombinanten Zellen, insbesondere Säugetierzellen.
    12. Zellkultur, umfassend Zellen, insbesondere Säugetierzellen, und ein Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
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ES00969319.3T ES2265991T5 (es) 1999-09-28 2000-09-27 Medio para el cultivo de células libre de proteínas y de suero
CNB008160201A CN1318577C (zh) 1999-09-28 2000-09-27 用于无蛋白无血清培养细胞的培养基
PL355233A PL215234B1 (pl) 1999-09-28 2000-09-27 Wolne od bialka zwierzecego i wolne od surowicy podloze do hodowania komórek ssaka, zastosowanie podloza, sposób hodowania komórek, sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika krwi, kompozycja hodowli komórkowej i sposób wytwarzania podloza
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PCT/EP2000/009453 WO2001023527A1 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
SK400-2002A SK288059B6 (sk) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for protein-free and serum-free cultivation of mammalian cells, its use, process for cultivation of mammalian cells, process for production of protein, cell culture and process for production of medium for cell culture
AT00969319T ATE331025T2 (de) 1999-09-28 2000-09-27 Medium für die protein- und serumfreie zellkultur
AU79083/00A AU780791B2 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
IL14864200A IL148642A0 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
DE60028989.3T DE60028989T3 (de) 1999-09-28 2000-09-27 Medium für die protein- und serumfreie zellkultur
DK00969319.3T DK1220893T4 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for protein-free and serum-free culture of cells
CN2007100968436A CN101173246B (zh) 1999-09-28 2000-09-27 用于无蛋白无血清培养细胞的培养基
TR200200757T TR200200757T2 (tr) 1999-09-28 2000-09-27 Hücrelerin proteinsiz veya serumsuz yerleştirilmesi için ortam
PT00969319T PT1220893E (pt) 1999-09-28 2000-09-27 Meio para a cultura de celulas sem proteina e sem soro
RU2005123274A RU2380412C2 (ru) 1999-09-28 2000-09-27 Среда, не содержащая белков и сыворотки, и способ культивирования клеток млекопитающих в такой среде
SI200030887T SI1220893T1 (sl) 1999-09-28 2000-09-27 Medij za kultiviranje celic brez proteina in brezseruma
HU0202759A HU228210B1 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
CZ2002-1096A CZ305307B6 (cs) 1999-09-28 2000-09-27 Bezbílkovinné a bezsérové médium pro kultivaci savčích buněk a jeho použití
JP2001526911A JP5441288B2 (ja) 1999-09-28 2000-09-27 細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地
EP00969319.3A EP1220893B2 (de) 1999-09-28 2000-09-27 Medium für die protein- und serumfreie zellkultur
CA002385299A CA2385299A1 (en) 1999-09-28 2000-09-27 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
IL148642A IL148642A (en) 1999-09-28 2002-03-12 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
US10/405,794 US20030203448A1 (en) 1999-09-28 2003-04-01 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
CY20061101076T CY1106135T1 (el) 1999-09-28 2006-07-31 Μεσο για την ελευθepη απο πρωτεϊνη και ελευθepη απο ορο καλλιεργεια κυτταρων
US11/841,915 US8021881B2 (en) 1999-09-28 2007-08-20 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
RU2009131610/10A RU2536244C2 (ru) 1999-09-28 2009-08-20 Среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки
JP2011018089A JP2011135880A (ja) 1999-09-28 2011-01-31 細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地
US13/198,476 US8722406B2 (en) 1999-09-28 2011-08-04 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
IL219969A IL219969A (en) 1999-09-28 2012-05-24 Cell culture containing recombinant cho cells expressing protein factor viii
JP2013047095A JP5777653B2 (ja) 1999-09-28 2013-03-08 細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地
US14/231,221 US9441203B2 (en) 1999-09-28 2014-03-31 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
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US15/244,302 US20170002392A1 (en) 1999-09-28 2016-08-23 Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
IL250619A IL250619B (en) 1999-09-28 2017-02-15 Substrate without proteins and without serum for cell cultivation
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WO (1) WO2001023527A1 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005066332A1 (en) * 2003-12-19 2005-07-21 Wyeth Serum-free vero cell banking process
US8329465B2 (en) 1997-06-20 2012-12-11 Baxter Innovations Gmbh Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US8440408B2 (en) 2004-10-29 2013-05-14 Baxter International Inc. Animal protein-free media for cultivation of cells
US8524497B2 (en) 2002-07-09 2013-09-03 Baxter International Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
US8722406B2 (en) 1999-09-28 2014-05-13 Baxter Innovations Gmbh Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2466881A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Sandoz Gmbh Cell culture process
US7195905B2 (en) 2001-12-10 2007-03-27 Baxter Healthcare S.A. Enveloped virus vaccine and method for production
JP3916516B2 (ja) * 2002-06-10 2007-05-16 独立行政法人科学技術振興機構 硬組織−軟組織界面再生用足場材料
RS50531B (sr) * 2004-03-01 2010-05-07 Ares Trading S.A. Upotreba podloge za ćelijsku kulturu bez sadržaja seruma za produkciju il-18bp u ćelijama sisara
AU2011221414B2 (en) * 2004-10-29 2012-09-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Animal Protein-Free Media for Cultivation of Cells
AU2005302516A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
FR2879214A1 (fr) * 2004-12-14 2006-06-16 Pierre Fabre Medicament Sa Fractions peptidiques favorisant la croissance et la synthese de produit(s) d'interet en culture de cellules et/ou de tissus
EP1851305B1 (de) * 2005-02-11 2012-01-18 Novo Nordisk Health Care AG Herstellung eines proteins in serumfreier zellkultur, die ein proteinhydrolysat aus pflanzen enthält
US7910366B2 (en) 2005-03-10 2011-03-22 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell strain capable of being cultured without ingredients derived from animals, method of producing the same, method of producing virus using the same, and method of producing vaccine
EP1707634A1 (de) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Verfahren zur Isolierung von rekombinant hergestellten Proteinen
KR100670105B1 (ko) 2005-06-29 2007-01-17 주식회사 셀트리온 콩가수분해물의 저분자량 분획을 이용하여 시알산 함량이증가된 에리스로포이에틴을 생산하는 방법 및 그에 의하여생산된 시알산 함량이 증가된 에리스로포이에틴
US7375188B2 (en) * 2005-07-29 2008-05-20 Mallinckrodt Baker, Inc. Vegetarian protein a preparation and methods thereof
CN102643777A (zh) 2006-01-04 2012-08-22 巴克斯特国际公司 无寡肽的细胞培养基
CN101501216B (zh) * 2006-03-06 2013-10-02 胡玛基因公司 制备重组人凝血酶的方法
MX345141B (es) 2006-09-13 2017-01-18 Abbvie Inc * Mejoras de cultivos celulares.
EP2500415A1 (de) 2006-09-13 2012-09-19 Abbott Laboratories Verbesserungen an Zellkulturen
WO2008063472A2 (en) * 2006-11-13 2008-05-29 Schering Corporation Method for reducing protease activity in plant hydrolysate
WO2008073425A2 (en) 2006-12-11 2008-06-19 Schering Corporation High-sensitivity proteolysis assay
EP1988101A1 (de) 2007-05-04 2008-11-05 Novo Nordisk A/S Verbesserung von Faktor-VIII-Polypeptid-Titern in Zellkulturen
KR101258949B1 (ko) 2007-06-15 2013-04-30 재단법인 목암생명공학연구소 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법
EP2257620A1 (de) * 2008-03-19 2010-12-08 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Methode zur steigerung der reklonierungseffizienz
CA2721585A1 (en) 2008-04-18 2009-10-22 Shanghai Cp Guojian Pharmaceutical Co. Ltd A concentrated medium and its usage
RU2377295C1 (ru) * 2008-06-11 2009-12-27 Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих
TW201012930A (en) 2008-06-16 2010-04-01 Intervet Int Bv Method of replicating viruses in suspension
JP5458536B2 (ja) * 2008-09-17 2014-04-02 不二製油株式会社 乳酸の製造方法及び乳酸発酵用添加剤
NZ591651A (en) * 2008-09-26 2012-12-21 Merck Sharp & Dohme High titer antibody production and culture media comprising glucose, soy or wheat hydrolsyate, amino acids, and other chemical compounds
EP2356247B2 (de) * 2008-11-12 2019-05-15 Baxalta Incorporated Verfahren zur herstellung von serumfreiem insulinfreiem faktor vii
US9051544B2 (en) 2008-12-30 2015-06-09 Baxter International Inc. Method of enhancing cell growth using alkyl-amine-n-oxide (AANOx)
CN101603026B (zh) * 2009-06-19 2011-01-19 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
US8313926B2 (en) 2009-07-31 2012-11-20 Baxter International Inc. Methods for expressing ADAMTS proteins in cell culture medium supplemented with zinc
CN102115728B (zh) * 2009-12-31 2012-09-26 北京清大天一科技有限公司 无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法
EP2563904B1 (de) * 2010-04-26 2015-01-21 Novartis AG Verbessertes zellkulturmedium
KR101828624B1 (ko) 2010-04-26 2018-02-12 노파르티스 아게 개선된 세포 배양 방법
MX2013000166A (es) 2010-07-08 2013-06-05 Baxter Healthcare Sa Metodo para producir el factor von willebrand (vwf) de alto peso molecular recombinante en cultivo celular.
CN101914485A (zh) * 2010-08-05 2010-12-15 乐能生物工程股份有限公司 一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法
US20130224855A1 (en) * 2010-08-31 2013-08-29 Abhishek Gupta Culture medium for eukaryotic cells
EP2625262B1 (de) * 2010-10-05 2015-09-23 Novo Nordisk Health Care AG Verfahren zur proteinherstellung
US9062106B2 (en) 2011-04-27 2015-06-23 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
CN103160458A (zh) * 2011-12-15 2013-06-19 西南民族大学 一种适合Vero细胞生长的低血清培养基
CN104302759A (zh) * 2012-03-08 2015-01-21 菲仕兰产品有限公司 用于真核细胞的培养基
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9334319B2 (en) 2012-04-20 2016-05-10 Abbvie Inc. Low acidic species compositions
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
AU2013381687A1 (en) 2013-03-12 2015-09-24 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
CN104593317B (zh) * 2013-10-31 2018-05-04 中国食品发酵工业研究院 一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
EP3069123B1 (de) 2013-12-30 2020-09-23 Baxalta GmbH Verfahren zur vorhersage der leistungseigenschaft eines pflanzen- oder hefehydrolysats und seine verwendung
RU2558253C1 (ru) * 2014-02-10 2015-07-27 Федеральное Казенное Предприятие " Щелковский Биокомбинат" Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих
IL294430B2 (en) 2014-06-04 2025-08-01 Amgen Inc Methods for harvesting mammalian cell cultures
TWI743024B (zh) 2014-06-06 2021-10-21 美商健臻公司 灌注培養方法及其用途
CN104560893B (zh) * 2015-01-30 2017-11-14 肇庆大华农生物药品有限公司 一种用于培养病毒的培养基及其制备方法
RU2588666C1 (ru) * 2015-03-23 2016-07-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" Компонент питательной среды для культивирования клеток млекопитающих
CN105002242A (zh) * 2015-07-23 2015-10-28 苏州康聚生物科技有限公司 用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用
HRP20230865T1 (hr) * 2015-07-31 2023-11-10 Exotropin, Llc Kompozicije egzosoma i postupci za njihovu pripremu i primjenu za reguliranje i kondicioniranje kože i kose
TW202440903A (zh) 2015-08-04 2024-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法（一）
KR102711870B1 (ko) * 2016-07-19 2024-10-02 아셀라타 리미티드 현탁 내 만능줄기세포를 배양하기 위한 배양 배지
US11070703B2 (en) * 2016-07-29 2021-07-20 Robert Bosch Tool Corporation 3D printer touchscreen interface lockout
JP6258536B1 (ja) 2017-03-03 2018-01-10 協和発酵キリン株式会社 ダルベポエチン組成物の製造方法およびダルべポエチン産生細胞の培養方法
EP3649144A4 (de) * 2017-07-06 2021-07-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Zellkulturverfahren zur herstellung eines glykoproteins
US10961500B1 (en) * 2019-04-23 2021-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium for eukaryotic cells
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
CN113151183A (zh) * 2021-04-21 2021-07-23 赵峻岭 一种促进蛋白表达的培养基添加物及其应用
WO2024024671A1 (ja) * 2022-07-27 2024-02-01 不二製油グループ本社株式会社 動物細胞増殖促進剤

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991010726A1 (en) * 1990-01-22 1991-07-25 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Co-independent growth medium for maintenance and propagation of cells
JPH03244391A (ja) * 1990-02-22 1991-10-31 Ajinomoto Co Inc 組換え蛋白質の生産方法
JPH05123178A (ja) * 1991-11-01 1993-05-21 Ajinomoto Co Inc Ｌ−フエニルアラニンの製造法
JPH0739386A (ja) * 1993-08-02 1995-02-10 Bio Polymer Res:Kk バクテリアセルロースの製造方法
WO1996026266A1 (en) * 1995-02-23 1996-08-29 Quest International B.V. Peptides for tissue and cell culture media
JPH09107955A (ja) * 1995-10-24 1997-04-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 動物細胞培養用培地
WO1998015614A1 (en) * 1996-10-10 1998-04-16 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT165999B (de) 1947-06-26 1950-05-25 Delle Atel Const Electr Einirchtung zum Schutz von Drehstrommotoren gegen Überstrom
FR2196386A1 (en) 1972-08-17 1974-03-15 Cudennec Alain Culture media selection - for identification of unknown bacteria
US4443540A (en) 1980-05-09 1984-04-17 University Of Illinois Foundation Protein hydrolysis
DK207980A (da) * 1980-05-13 1981-11-14 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et skumnings- eller emulgeringsmiddel paa sojaproteinbasis
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
FI86885C (fi) 1984-04-20 1992-10-26 Genentech Inc Foerfarande foer framstaellning av human rekombinantfaktor viii och nukleinsyrasekvenser och vektorer anvaend daertill
DE3688418T2 (de) 1985-02-13 1993-08-26 Scios Nova Inc Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.
US4978616A (en) * 1985-02-28 1990-12-18 Verax Corporation Fluidized cell cultivation process
ZA862768B (en) 1985-04-17 1986-12-30 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
GB8608020D0 (en) * 1986-04-02 1986-05-08 Beecham Group Plc Compounds
EP0318487B1 (de) 1986-08-04 1993-10-13 The University Of New South Wales Serumfreies gewebekulturmedium, das ein polymerzellenschutzmittel enthält
AU627427B2 (en) 1987-06-30 1992-08-27 Amgen, Inc. Production of kallikrein
US5024947A (en) * 1987-07-24 1991-06-18 Cetus Corporation Serum free media for the growth on insect cells and expression of products thereby
JP2507882B2 (ja) 1988-02-17 1996-06-19 工業技術院長 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
JP2815613B2 (ja) 1989-03-24 1998-10-27 株式会社リコー 静電荷像現像用トナー
US5573937A (en) 1989-12-07 1996-11-12 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Serum free culture medium
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
AT393356B (de) 1989-12-22 1991-10-10 Immuno Ag Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen
JP2859679B2 (ja) 1990-03-01 1999-02-17 協和醗酵工業株式会社 新規細胞株
JP2696001B2 (ja) 1991-04-15 1998-01-14 財団法人化学及血清療法研究所 組換え蛋白質産生用培地
US5378612A (en) 1990-05-11 1995-01-03 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Culture medium for production of recombinant protein
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
JPH04228066A (ja) 1990-10-23 1992-08-18 Rikagaku Kenkyusho 外来遺伝子発現用培養細胞
EP0531562A1 (de) * 1991-09-11 1993-03-17 Doerr, Hans-Wilhelm, Prof. Dr. med. Kultivierung von Säugetierzellen
DK53792D0 (da) 1992-04-24 1992-04-24 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner
RU2057176C1 (ru) * 1992-05-20 1996-03-27 Институт генетики АН Республики Молдова Питательная среда для культивирования клеток человека и животных
AU7895898A (en) 1993-04-26 1998-10-08 Hans Wolf Mammal cell lines and method of obtaining glycoproteins
DE4313620A1 (de) 1993-04-26 1994-10-27 Biotechnolog Forschung Gmbh Hamsterzellinien und Verfahren zur Glykoproteingewinnung
US5405637A (en) 1993-06-30 1995-04-11 Bristol-Myers Squibb Company Milk protein partial hydrolysate and infant formula containing same
CN1088984A (zh) * 1993-11-11 1994-07-06 江西省医学科学研究所 一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基
US5719050A (en) 1993-12-24 1998-02-17 Eiken Chemical Co., Ltd. Animal cell culturing media containing N-acetyl-L-glutamic acid
EP0666312A1 (de) 1994-02-08 1995-08-09 Wolfgang A. Renner Verfahren zur Förderung des Wachstums von Säugetierzellen
US5789247A (en) 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
JP2684521B2 (ja) 1994-08-19 1997-12-03 ハムス株式会社 ベルトループ縫付けミシンにおけるテープ折り曲げ端の形成維持方法及びその装置
EP0733100A1 (de) 1994-09-09 1996-09-25 Wolfgang A. Renner Chemisches verfahren zur förderung der proliferation von tierischen zellen
EP0791055B1 (de) 1994-11-10 2012-01-25 Baxter Healthcare S.A. Verfahren zur herstellung von biologischen produkten in protein-freier kultur
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
JP3244391B2 (ja) 1994-12-08 2002-01-07 財団法人国際超電導産業技術研究センター 複合基板及びそれを用いた単結晶基板の製造方法
JPH10511082A (ja) 1994-12-16 1998-10-27 ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト 組換え分泌成分の製造
US5741705A (en) 1995-02-23 1998-04-21 Quest International Flavors & Food Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. Method for in vitro cell growth of eucaryotic cells using low molecular weight peptides
AU6125396A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Novartis Ag Serum-free media for primitive hematopoietic cells and metho ds of use thereof
AUPN442295A0 (en) 1995-07-26 1995-08-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulated autocrine growth of mammalian cells
PT906029E (pt) * 1996-04-09 2002-11-29 Du Pont Produto de proteina de soja enriquecido em isoflavona e metodo para o seu fabrico
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
EP2243827B2 (de) * 1996-08-30 2017-11-22 Life Technologies Corporation Serumfreies kulturmedium für säugerzellen und seine verwendung
JPH10211488A (ja) 1997-01-28 1998-08-11 Akai Electric Co Ltd 紫外線殺菌装置
US6383810B2 (en) * 1997-02-14 2002-05-07 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
EP0983342B1 (de) 1997-05-28 2007-09-05 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Kulturmedium mit sojabohnenextrakt als aminosäuren-quelle und ohne proteinkomplexe tierischen ursprungs
US6475725B1 (en) * 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
CA2298015C (en) 1997-07-23 2015-01-27 Roche Diagnostics Gmbh Production of erythropoietin by endogenous gene activation
JPH11211488A (ja) 1998-01-21 1999-08-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 携帯情報端末を用いたデータ転送システム
FR2775983B1 (fr) * 1998-03-13 2000-11-10 Pasteur Merieux Serums Vacc Milieu et procede de propagation et de multiplication virales
WO1999057246A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising non-animal or plant-derived nutrients
US6406909B1 (en) * 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
PT1200561E (pt) 1999-08-05 2006-09-29 Baxter Ag Clone celular recombinante estavel, sua producao e utilizacao
IL148060A0 (en) 1999-08-25 2002-09-12 Immunex Corp Compositions and methods for improved cell culture
KR100927517B1 (ko) 2000-09-25 2009-11-17 폴리문 사이언티픽 임무노이비오로기쉐 포르슝 게엠베하 생균 백신
EP1208966A1 (de) 2000-11-27 2002-05-29 Cheng-Kun Liao Verfahren zur Herstellung eines Terrassentischs aus bruchsicherem Glas
ES2398706T3 (es) 2002-07-09 2013-03-21 Baxter International Inc. Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células
JP4316484B2 (ja) 2004-12-10 2009-08-19 シャープ株式会社 画像形成装置、トナー濃度制御方法、トナー濃度制御プログラムおよびその記録媒体

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991010726A1 (en) * 1990-01-22 1991-07-25 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Co-independent growth medium for maintenance and propagation of cells
JPH03244391A (ja) * 1990-02-22 1991-10-31 Ajinomoto Co Inc 組換え蛋白質の生産方法
JPH05123178A (ja) * 1991-11-01 1993-05-21 Ajinomoto Co Inc Ｌ−フエニルアラニンの製造法
JPH0739386A (ja) * 1993-08-02 1995-02-10 Bio Polymer Res:Kk バクテリアセルロースの製造方法
WO1996026266A1 (en) * 1995-02-23 1996-08-29 Quest International B.V. Peptides for tissue and cell culture media
JPH09107955A (ja) * 1995-10-24 1997-04-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 動物細胞培養用培地
WO1998015614A1 (en) * 1996-10-10 1998-04-16 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8329465B2 (en) 1997-06-20 2012-12-11 Baxter Innovations Gmbh Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US8722406B2 (en) 1999-09-28 2014-05-13 Baxter Innovations Gmbh Medium for the protein-free and serum-free cultivation of cells
US8524497B2 (en) 2002-07-09 2013-09-03 Baxter International Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
WO2005066332A1 (en) * 2003-12-19 2005-07-21 Wyeth Serum-free vero cell banking process
US8440408B2 (en) 2004-10-29 2013-05-14 Baxter International Inc. Animal protein-free media for cultivation of cells
US8748156B2 (en) 2004-10-29 2014-06-10 Baxter International Inc. Animal protein-free media for cultivation of cells

Also Published As

Publication number Publication date
ES2265991T5 (es) 2017-05-03
JP5441288B2 (ja) 2014-03-12
CY1106135T1 (el) 2011-06-08
JP6348521B2 (ja) 2018-06-27
US9441203B2 (en) 2016-09-13
JP2016127839A (ja) 2016-07-14
EP1220893B1 (de) 2006-06-21
IL219969A (en) 2017-06-29
IL250619A0 (en) 2017-06-29
IL219969A0 (en) 2012-06-28
CN101173246A (zh) 2008-05-07
JP2017212977A (ja) 2017-12-07
SK288059B6 (sk) 2013-03-01
EP1220893B2 (de) 2016-08-31
JP2011135880A (ja) 2011-07-14
RU2005123274A (ru) 2007-01-27
RU2380412C2 (ru) 2010-01-27
HUP0202759A2 (hu) 2002-12-28
PL355233A1 (en) 2004-04-05
CZ305307B6 (cs) 2015-07-29
AU780791B2 (en) 2005-04-14
US20150072415A1 (en) 2015-03-12
JP6467459B2 (ja) 2019-02-13
JP2019030306A (ja) 2019-02-28
TR200200757T2 (tr) 2002-09-23
DE60028989T3 (de) 2017-01-19
CN1318577C (zh) 2007-05-30
SK4002002A3 (en) 2002-07-02
WO2001023527A1 (en) 2001-04-05
US8021881B2 (en) 2011-09-20
RU2266325C2 (ru) 2005-12-20
PL215234B1 (pl) 2013-11-29
HUP0202759A3 (en) 2004-10-28
US20080182297A1 (en) 2008-07-31
HU228210B1 (en) 2013-01-28
DK1220893T3 (da) 2006-10-23
US8722406B2 (en) 2014-05-13
IL250619B (en) 2018-04-30
DE60028989D1 (de) 2006-08-03
RU2009131610A (ru) 2011-02-27
SI1220893T1 (sl) 2006-12-31
US20170002392A1 (en) 2017-01-05
CN101173246B (zh) 2011-03-09
US20160369316A1 (en) 2016-12-22
US20030203448A1 (en) 2003-10-30
JP5777653B2 (ja) 2015-09-09
AU7908300A (en) 2001-04-30
DE60028989T2 (de) 2007-01-25
JP2013135691A (ja) 2013-07-11
IL148642A0 (en) 2002-09-12
IL148642A (en) 2012-08-30
CZ20021096A3 (cs) 2003-01-15
US9982286B2 (en) 2018-05-29
DK1220893T4 (en) 2016-12-05
US20110287482A1 (en) 2011-11-24
CN1391604A (zh) 2003-01-15
RU2536244C2 (ru) 2014-12-20
JP2003510070A (ja) 2003-03-18
ATE331025T2 (de) 2006-07-15
ATA165999A (de) 2001-12-15
ES2265991T3 (es) 2007-03-01
CA2385299A1 (en) 2001-04-05
EP1220893A1 (de) 2002-07-10
PT1220893E (pt) 2006-10-31

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US6833271B2 (en) Serum-free cell culture media
AT409493B (de) Stabiler rekombinanter zellklon

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