KR20150014436A

KR20150014436A - 진핵 세포용 배양 배지

Info

Publication number: KR20150014436A
Application number: KR1020147027809A
Authority: KR
Inventors: 아비쉑 굽타; 미레일 마리아 가델라; 도미니크 이브 윌리 매스
Original assignee: 프리슬랜드 브랜즈 비브이
Priority date: 2012-03-08
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2015-02-06
Also published as: KR20150014435A; US20150017717A1; WO2013133715A1; US20150031128A1; WO2013133714A1; CN104302759A; JP2015512624A; JP2015509376A; CN104271734A; EP2823034A1; EP2823033A1

Abstract

본 발명은 진핵 세포를 배양하기 위한 배양 배지에서 성장- 및 생산 촉진 성분으로서, L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산 및 이들의 조합물에서 선택되는 C₂-C₆ 알파-히드록시산의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 알파-히드록시산 유도체를 적어도 0.001 mg/ℓ의 수준으로 함유하는 배양 배지에 관한 것이다.

Description

진핵 세포용 배양 배지{CULTURE MEDIUM FOR EUKARYOTIC CELLS}

본 발명은, 진핵 세포, 특히 동물 세포를 배양하기 위한 배지의 제조뿐 아니라 이렇게 제조된 세포 배양 배지, 및 진핵 세포, 특히 동물 세포의 시험관 내 배양을 위한 그의 용도에 관한 것이다.

포유동물, 식물 또는 곤충 세포를 배양하여 가치있는 생화학물질 및 바이오의약품(biopharmaceuticals), 예를 들어 항체 및 항생제를 제조하는 것은 적절한 배양 배지를 필요로 한다. 세포 배양 배지 제형에는 소태아 혈청(fetal calf serum, FCS), 다수 동물-유래 단백질 및/또는 소 기원의 단백질 가수분해물 등 한정되지 않은 성분들을 비롯한 광범위 첨가제가 보충된다.

동물 세포 배양에 사용되는 혈청 또는 혈청 유래 물질, 예를 들어 알부민, 트랜스페린 또는 인슐린은 이들로부터 얻어진 배양물 및 바이오의약 제품을 오염시킬 수 있는 원하지 않는 약제를 함유할 수 있다. 또한, 쇠고기 또는 콜라겐 가수분해물과 같은 소 유래 단백질 산물은 BSE 오염의 위험을 가진다. 더욱이, 인간 혈청으로부터 유도된 첨가제는 혈청에 의해 전달될 수 있는 간염 및 HIV를 포함하는 모든 공지된 바이러스에 대해 시험되어야 한다.

결론적으로, 모든 혈청-유래 산물은 미지의 약제에 의해 오염될 수 있다. 세포 배양시 인간 또는 기타 동물 원으로부터 유래된 혈청 또는 단백질 첨가제의 경우에, 수많은 문제(예를 들면, 상이한 배치의 조성 및 품질 변화와 바이러스, 마이코플라스마(mycoplasma) 또는 BSF에 의한 오염 위험)가 발생할 수 있다. 따라서, 식물 단백질 가수분해물 또는 식물 펩톤은 동물 성분이 없어야 하는 배양 배지에서 통상 사용되고 있다.

그러나, 동물-유래 세포 배양 첨가제 없이는 배지에서 동물 세포의 성장 및 생산성이 항상 만족스럽지는 않다. 시험관 내에서 배양되는 동물 세포들은 덩어리로 성장하는 것으로 자주 관찰된다. 이것은 덩어리의 핵에 있는 세포들이 영양분이 결핍되고, 사멸하게 되기 때문에 부적당한 조건인 것으로 여겨진다. 하류 처리(downstream processing) 중에 튜브 또는 필터의 막힘 위험도 있다. 세포의 생존성 감소가 이들의 외관에 의해 평가될 수 있다. 생존성이 감소된 세포들은 불규칙한 형상, 예를 들면 비원형상을 나타내며, 추가로 완전히 밝고 투명한 셀 함량을 갖는 건강한 세포들과 대조적인 "과립화" 세포 함량을 갖는다.

WO 제2006/123926호는 바람직하게는 평지씨, 밀 또는 캐러웨이(caraway)로부터 적어도 하나의 식물성 단백질 공급원을 기본으로 하는 미생물들 및/또는 세포를 성장 및/또는 배양시키기 위한 펩티드 조성물에 관한 것이다. 밀 가수분해물의 효과는 실시예에서 설명된다.

WO 제2006/128764호는 하나 이상의 식물-유래 펩톤이 세포 배양물에 공급되는 복합 단백질을 생산하는 포유동물 세포의 배양 방법을 개시하였다. 식물 원 콩, 면화씨 및 완두콩을 예로 들 수 있다. CHO 세포의 배양에 대한 콩 가수분해물의 효과는 관련된 실시예에서 입증되었다.

WO 제2009/020389호에 진핵 세포, 특히 동물 세포를 배양하기 위한 배양 배지의 구성성분으로서 헬리안투스(Helianthus)(해바라기) 종의 단백질 가수분해물의 용도가 기재되어 있다.

US 제2003/0203448A1호에 콩 가수분해물을 포함하고, 임의로 유리 아미노산이 첨가된, 세포 배양을 위한 무단백, 무 혈청 배지가 기재되어 있다.

니콜 등(Nicoll et al., Connective Tissue Research, vol. 42, no. 1, pp. 59-69)은 인간 피부 섬유아세포에서 연골형성(연골 발달)의 유도에 대한 락트산의 효과와 관련한 연구를 기술하였다. 여기에서는, 세포를 10% 소태아 혈청(FBS), 페니실린, 스트렙토마이신 및 80 mM 락트산이 보충된 최소필수배지(MEM)를 포함하는 배양 배지에서 성장시켰다.

모리시마 등(Morishima et al., Neuroscience Research, vol. 61, no. 1, pp. 18-26)은 배양된 래트 성상세포에서 수로 단백질 아쿠아포린(AQP4)의 발현 및 국소화에 대한 락트산의 효과를 연구하였다. 이를 위해, 성상세포를 듈베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)), 10% 소태아 혈청(FBS) 및 15-45 mM 락트산 또는 락테이트를 포함하는 배지에서 배양하였다.

램프 등(Lampe et al., Biotechnology and Bioengineering, vol. 103, no. 6, pp. 1214-1223)은 신경 전구 세포에 대한 락트산의 효과에 관한 조사를 기술하였다. 여기에서는, 세포를 DMEM, 페니실린, 스트렙토마이신, N2, L-글루타민, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 10 mg/ml 이하의 락트산을 함유하는 배지에서 배양하였다.

크로메나커 등(Kromenaker et al., J. Biotechnol., vol. 34, 1994, pages 13-34)은 하이브리도마 세포 성장의 세포 주기 역학 및 항체 생산에 대한 락트산 농도의 효과를 기재하였다. 세포를 DMEM, 페니실린, 스트렙토마이신, 가열-불활성 말 혈청 및 140 mM 이하의 락트산을 포함하는 배지에서 배양하였다.

발레즈 등(Ballez et al.)은 0.1% pluronic F68, 0.04 pM 소듐 셀레나이트 및 500 μM 구연산철(p. 105, 윗부분)과 쌀 또는 밀 단백질 가수분해물이 보충된 염기성 한정 배지(BDM)를 포함하는, 세포 배양을 위한 무단백질 배지를 개시하였다.

US 제2002/0039787호는 유효량의 인간 혈청의 존재 하에 미세혈관 내피 세포의 농축 군(enriched population)을 배양하는 것을 포함하는, 미세혈관의 내피 세포를 시험관 내 배양하기 위한 방법에 대해 기재하였다.

식물 단백질 가수분해물의 기능은 그의 화학적 조성의 직접적인 결과이다. 이는 원료, 처리 인자, 공정 제어 및 저장 조건과 같은 다수 인자에 의해 영향을 받는다. 따라서, 이는 "로트간 변동(lot-to-lot variation)"으로서 정의되는 아직 충분히 연구되지 않은 만성적인 현상을 초래한다.

10 내지 25%의 산물 수율의 변동을 나타낼 수 있고, 직접적인 재정 결과를 갖기 때문에, 이는 이들 가수분해물의 고객인 바이오의학품 업계에서 나타내는 주요 관심사이다. 본 발명의 목적은 이러한 관심사를 덜어주는 것이다.

발명의 개요

본 발명에 따라 특정의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르 및 이들의 조합물이 진핵 세포, 특히 동물 세포의 시험관 내 세포 배양에서 강한 성장 및 생산 촉진 효과를 갖는다는 것이 발견되었다. 최소 수준의 이들 화합물의 존재는 일관되고, 따라서, 상업적으로 매력적인 생산 성능으로 이어질 수 있다. 이러한 유도체를 포함하는 배지는, 진핵 세포, 특히 동물 세포를 배양하는데 매우 적합하다. 따라서, 본 발명은, 이러한 특정 알파-히드록시산, 그의 염 또는 그의 에스테르를 포함하는 세포 배양 배지뿐만 아니라 이러한 배지를 제조하는 방법, 및 배지의 구성성분으로서 이들 알파-히드록시산, 그의 염 또는 그의 에스테르를 함유하는 조성물을 사용한 시험관 내 동물 세포의 배양 방법을 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은, 성장-촉진 또는 생산-증진 성분으로서 L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르 및 이들의 조합물을 사용하는 것을 포함하는, 진핵 세포, 특히 동물 세포를 배양하기 위한 배양 배지의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 건조 중량을 기준으로, 적어도 0.02 ppm(0.02 mg/kg), 바람직하게 적어도 0.2 mg/kg, 보다 바람직하게 적어도 2 mg/kg, 보다 더 바람직하게 적어도 20 mg/kg, 가장 바람직하게 적어도 50 ppm(50 mg/kg)의 상기 알파-히드록시산 또는 그의 유도체의 하나 이상을 함유하는, 진핵 세포, 특히 동물 세포를 배양하기 위한 배지에 관한 것이다.

본원 명세서에서, 본 발명의 세포 배양 배지의 성분의 양이 건조 중량 기준으로 제공되는 경우에는 언제나, 액체 배지에서의 최종 농도는, 5% (50 g/ℓ)의 건조 고형물 함량을 임의로 취해 유도될 수 있거나, 그 반대로 유도될 수 있다. 따라서, 건조물질의 kg 당 100 mg의 양은, 바람직한 수준을 유도하기 위해, 최종 액체 배지의 ℓ당 5 mg에 상응한다. 이는, 액체 배지의 건조 고형물 함량이 5% 이어야 한다는 것을 의미하는 것은 아니다. 특정 세포 배양물의 농도에 따라, 예를 들어 0.5 내지 30 wt.%, 바람직하게 0.5 내지 15 wt.%, 보다 바람직하게 1 내지 15 wt.%, 가장 바람직하게 1 내지 5 wt.%의 건조 고형물 수준이 선택될 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 C₂-C₆ 알파-히드록시산은 C₂-C₆ 골격에서 임의로 치환될 수 있다. 적합한 치환체는 할로겐, 에스테르, 에테르, 히드록실, 아미노 및 방향족 그룹을 포함한다.

바람직한 염은 본 발명의 C₂-C₆ 알파-히드록시산의 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 또는 암모늄 염이다.

바람직한 에스테르는 본 발명의 C₂-C₆ 알파-히드록시산의 선형 또는 분지형 C₁-C₄ 에스테르이다.

본 발명에 따라 사용하기에 특히 바람직한 화합물은 점액산 및 메틸-L-3-페닐 락테이트이다.

본 발명에 따라 사용되는 알파-히드록시산, 그의 염 및 그의 에스테르는 그 자체로 사용될 수 있다. 대부분의 성분들은 상업적으로 입수가능하다. 대안적으로, 이들은 일반적으로 알려진 합성 또는 반합성 방법으로 제조될 수 있다. 대부분의 유도체는 또한, 적합한 단백질 분획 또는 가수분해물, 특히 콩, 완두콩, 렌틸(lentil), 밀(글루텐), 면화씨, 쌀, 해바라기, 홍화 등의 식물-유래 단백질로부터 분리될 수 있다. 이들은, 단백질 분획, 또는 더욱 편리하게는 단백질 가수분해물로부터 추출하거나, 강화(enrich)할 수 있다. 이러한 방법은 당해분야에 알려져 있다.

따라서, 본 발명은 배지에서의 최종 농도가 본 발명에 따른 개별적인 알파-히드록시산 또는 유도체 당 적어도 0.001 mg/ℓ, 바람직하게는 적어도 0.01 mg/ℓ, 보다 바람직하게는 적어도 0.1 mg/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 1 mg/ℓ이 되도록 하는 양의 L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르, 및 이들의 조합물을 배지의 추가 구성성분에 첨가하고, 이하에 더 상세히 설명하는 바와 같이 하여 세포 배양 배지를 제조하는 방법에 관한 것이다. 배지에서의 최종 농도가 개별적인 알파-히드록시산, 이 산의 염, 또는 이 산의 에스테르 당 최대 50 g/ℓ, 바람직하게는 최대 1 g/ℓ, 보다 바람직하게는 최대 100 mg/ℓ인 것이 바람직하다. 유도체는 그 자체로, 예를 들면 정제 및/또는 합성 생성물로서 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 정제 및/또는 합성 성분들은 순도가 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%이다. 대안적으로, 화합물은 농축물로서, 즉 본 발명에 따른 하나 이상의 알파-히드록시산 또는 그의 유도체의 용액을 농축하거나 또는 풍부하게 하여 수득할 수 있는 생성물로서 적어도 0.01 중량%, 바람직하게는 적어도 0.1%, 보다 바람직하게는 적어도 1%, 가장 바람직하게는 적어도 10%, 또는 심지어 적어도 25% 및 바람직하게는 최대 80%, 보다 바람직하게는 최대 70 중량%의 수준으로, 또는 건조물질 kg 당 바람직하게는 적어도 0.1 mg, 보다 바람직하게는 적어도 1 mg, 보다 더 바람직하게는 적어도 10 mg, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 1 g, 보다 더욱 더 바람직하게는 적어도 10 g, 가장 바람직하게는 적어도 100 g의 농도로 첨가될 수 있다.

본 발명의 문맥내에서, 용어 "배지의 추가 구성성분" 및 "추가의 통상적 배지 성분"이란 세포 배양 배지의 구성성분으로서 당해분야에 보통 알려져 있는 화합물, 예컨대 식물 또는 동물 사이토카인 및/또는 성장 인자(단, 이들은 동물 기원이 아니다), 비타민, 미네랄, 아미노산, 완충염, 미량 원소(trace element), 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 식물 호르몬, 글루코스 함유 당, 항생제 등을 가리킨다. 식물 호르몬은 옥신, 지베렐린, 아브시스산 및 이들의 조합물을 포함한다. 구상중인 세포주 및 세포 양상에 따라, 당업자들은 바람직하거나 필요한 추가 배지 구성성분의 타입 및 양을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명은 또한 상기 방법으로 수득할 수 있는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르, 또는 이들의 조합물을 최종 액체 배지 ℓ 당 적어도 0.001 mg, 바람직하게는 적어도 0.01 mg, 보다 바람직하게는 적어도 0.1 mg, 보다 더 바람직하게는 적어도 1 mg, 가장 바람직하게는 적어도 5 mg(여기서 농도는 개별적인 성분에 대한 것이다) 함유하는 진핵 세포를 배양하기 위한 배양 배지에 관한 것이다. 배지에서의 최종 농도가 상기 개별적인 성분당 최대 50 g/ℓ, 바람직하게는 최대 1 g/ℓ, 보다 바람직하게는 최대 100 mg/ℓ인 것이 바람직하다. L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르 또는 이들의 조합물을, 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 건조 중량으로, 건조물질 kg 당 적어도 0.02 mg, 바람직하게는 적어도 0.2 mg, 보다 바람직하게는 적어도 2 mg, 보다 더 바람직하게는 적어도 20 mg, 가장 바람직하게는 적어도 250 mg, 및 건조물질 kg 당 최대 1000 g, 바람직하게는 최대 20 g, 보다 바람직하게는 건조물질 kg 당 최대 2 g 함유하는데, 여기서 농도는 개별적인 성분에 대한 것이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 상기 알파-히드록시산 또는 그의 에스테르 또는 염의 하나 이상을 개별적인 성분당 5 mg/ℓ 내지 30 g/ℓ, 또는 건조물질 kg 당 100 mg 내지 600 g, 바람직하게는 250 mg 내지 150 g의 농도로 함유한다. 보다 바람직한 수준은 10 mg/ℓ 내지 1 g/ℓ 또는 건조물질 kg 당 200 mg 내지 100 g, 바람직하게는 500 mg 내지 50 g이고, 보다 더 바람직하게는 20 mg/ℓ 내지 500 mg/ℓ 또는 건조물질 kg 당 1 내지 25 g이다.

본 발명의 일 실시양태에 있어서, 본 발명에 따른 알파-히드록시산, 그의 염 또는 그의 에스테르는 하나 이상의 식물 단백질 가수분해물의 일부로서 사용된다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 있어서, 하나 이상의 알파-히드록시산, 그의 염 또는 그의 에스테르, 또는 이들의 조합물은 하나 이상의 식물 단백질 가수분해물과 조합하여 사용되거나, 또는 이에 첨가된다.

액체 배지중 (본질적으로 수용성인) 가수분해물의 양은 당업자들에 의해 결정될 수 있으나, 바람직하게는 0.001 내지 10.0 wt/vol%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10.0 wt/vol%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 4.0 wt/vol%, 보다 더 바람직하게는 0.05 내지 2.0 wt/vol%, 또는 0.05 내지 1.0 wt/vol%, 보다 더 바람직하게는 0.1 내지 1.0 wt/vol%, 및 가장 바람직하게는 0.2 내지 0.6 wt/vol%를 포함한다.

단백질 가수분해물은, 당해분야에 공지된 방법, 예를 들어 콩류, 콩과 식물(legumes), 종자 등을 가공하고, 가압, 분쇄, 탈부(dehulling) 및/또는 파쇄하고, 필요에 따라 예를 들어 헥산과 같은 유기 용매를 사용하여 탈지하여 제조할 수 있다. 바람직하게, 탈지된 종자 물질은 적어도 20 wt%의 단백질을 포함한다. 탈지된 종자 물질은 바람직하게는 지방 함량이 10 wt.% 미만이다.

단백질 가수분해물은 보통 효소적 단백질분해에 의해 수득되고, 프로테올리세이트(proteolysate)로서 칭해질 수도 있다. 임의로 세분된 (탈지된) 식물 종자 물질은, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 또는 이들의 혼합물 유래의 엔도 및/또는 엑소 프로테아제를 사용하여 가수분해에 적용된다; 그러나 바람직하게, 효소는 동물원으로부터의 것이 아니다. 효소는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 바람직한 효소는 엔도-프로테아제이다. 보다 바람직하게, 효소는 알칼리 프로테아제를 포함한다. 적절한 프로테아제는 서브틸리신(알칼라아제(Alcalase)), 세린 엔도프로테아제를 포함한다. 특히 적합한 효소는, 노보자임(Novozymes) 사로부터의 알칼라아제, 및/또는 머크(Merck) 사로부터의 파파인(papain)을 포함한다. 그밖의 적합한 효소는 예를 들어 뉴트라아제(Neutrase)를 포함한다.

가수분해 조건은 30 분 내지 30 시간; 바람직하게는 1 내지 6 시간, 가장 바람직하게는 2 내지 4 시간의 반응 시간을 포함하고; 온도는 20 내지 65 ℃, 바람직하게 40 내지 60 ℃인데, 이들은 모두 특정 단백질원 및 원하는 가수분해 정도에 좌우된다. pH는 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.6 내지 8.0, 가장 바람직하게는 7.0 내지 8.0이다. 용액에서 가수분해되는 단백질의 농도는 1 내지 10% 단백질, 바람직하게는 2 내지 8, 가장 바람직하게는 3 내지 6 wt.%이다. 사용되는 효소의 양은 기질을 기준으로 0.5 내지 10 wt%, 바람직하게는 1 내지 5 wt%, 가장 바람직하게는 1.5 내지 3.5 wt%이다.

가수분해는 바람직하게는 5 내지 50%, 바람직하게는 10 내지 40%, 가장 바람직하게는 10 내지 30%의 가수분해도에 도달될 때까지 수행된다. 가수분해 반응은, 열 처리(heat treatment)를 사용하여 종료된다. 바람직하게, 열 처리는 80 내지 100 ℃(배치 열 처리)에서 15 내지 90 분, 또는 100 내지 120 ℃에서 1 내지 5 분의 가열 시간을 포함한다. 가수분해도는 실시예에 나타낸 바와 같이, 통상적인 포르몰 적정법(formol titration)을 사용하여 측정될 수 있다. 가수분해 반응의 종료 후, 반응 혼합물을 임의로, 원심분리 또는, 예를 들어, 규조토(예컨대, Celite®, Dicalite®, Hyflo®)와 같은 당해분야에 알려진 여과 조제(aids)를 사용하여 불용성 부분이 제거되도록 연마할 수 있다. 바람직하게, 가수분해물은 건조물질 기준으로 10 wt.% 미만, 보다 바람직하게는 5 wt.% 미만, 가장 바람직하게는 2 wt.% 미만의 수불용성 물질을 포함한다. 가수분해물은, 예를 들어, 분무 건조 또는 동결 건조에 의해 건조될 수 있다. 가수분해물은 그대로 사용될 수 있거나, 또는 추가적으로 분별증류될 수 있다.

가수분해물은 바람직하게 전체 단백질 기준으로 분자량이 100 내지 500 Da인 펩티드 20 내지 80 wt.%, 특히 20 내지 60 wt.% 및/또는 분자량이 500 내지 1000 Da인 펩티드 10 내지 30 wt.%를 포함한다. 펩티드 길이와 관련하여, 가수분해물은 바람직하게 전체 단백질 기준으로, 적어도 15 wt.%, 보다 바람직하게 적어도 25 wt.%, 가장 바람직하게 적어도 35 wt.%, 예를 들어 85 wt.% 이하, 보다 바람직하게 65 wt.% 이하, 가장 바람직하게 55 wt.% 이하의 디- 내지 펜타-펩티드, 8 내지 30 wt.%의 헥사- 내지 노나-펩티드, 적어도 8 wt.%, 특히 15 내지 60 wt.%의 더 고급의 펩티드 및 0.1 내지 30 wt.%, 바람직하게 0.5 내지 10 wt.%의 유리 아미노산을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 가수분해물은 바람직하게 5 또는 10 kDa 분자량 컷 오프(cut-off)를 사용하여 한외여과될 수 있다. 가수분해물은 탄수화물, 가용성 섬유, 다가 금속염 등과 같은 추가의 구성성분을 포함할 수 있다. 바람직하게, 단백질 함량(유리 아미노산을 포함하는 모든 단백질성 물질)은 30 내지 90 wt.%, 보다 바람직하게 45 내지 85 wt.%이다. 이들 양은 건조 중량 기준이다.

가수분해물은, 식물 또는 동물 사이토카인 및/또는 성장 인자(단, 이들은 동물 기원이 아니다), 비타민, 미네랄, 아미노산, 완충염, 미량 원소, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 식물 호르몬, 글루코스를 포함하는 당, 항생제 등과 같은 배양 배지의 기타 통상적인 구성성분과 배합될 수 있다. 식물 호르몬은, 옥신, 지베렐린, 아브시스산 및 이들의 조합물을 포함한다.

본 발명에 따른 세포 배양 배지는 아미노산 유도체; 페놀산 유도체; 선형 C₂-C₆또는환형 C₆ 당 알코올; 피리딘산 유도체; 및 우라실, 아데닌, 아데노신 3'-모노포스페이트(3'-AMP) 및 아데노신 5'-모노포스페이트(AMP)에서 선택되는 뉴클레오염기(nucleobase) 및/또는 뉴클레오티드; 및 이들 화합물 그룹으로부터 선택되는 화합물들의 조합물중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 이들 화합물의 농도는 최종 액체 배지 ℓ 당 적어도 0.001 mg, 바람직하게는 적어도 0.01 mg, 보다 바람직하게는 적어도 0.1 mg, 보다 더 바람직하게는 적어도 1 mg, 가장 바람직하게는 적어도 5 mg이고, 여기서 농도는 개별적인 성분에 대한 것이다. 배지에서의 최종 농도가 상기 개별적인 성분당 최대 50 g/ℓ, 바람직하게는 최대 1 g/ℓ, 보다 바람직하게는 최대 100 mg/ℓ인 것이 바람직하다.

바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 추가로 γ-글루타밀 아미노산, 피로글루타밀 아미노산, 글루타메이트-함유 또는 프롤린-함유 디펩티드, 옥소-아미노산, 호모-아미노산, N-아세틸-아미노산 및 글리실-글리신에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 유도체를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 추가로 N-아세틸-메티오닌, N-아세틸-페닐알라닌, N-아세틸-오르니틴, γ-글루타밀-티로신, γ-글루타밀-페닐알라닌, 피로글루타밀-글루타민, 피로글루타밀-글리신, 발리닐-글루타메이트, 글리실프롤린, 사이클로-글리실-글루타민, 5-옥소프롤린 및 S-옥소-메티오닌, 및 β-알라닌, 2-아미노부티레이트, 글리실-글리신 및 호모세린에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 유도체를 포함한다.

또다른 바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 추가로 하나 이상의 페놀산 유도체, 이들 페놀산 유도체의 에스테르 또는 이들 페놀산 유도체의 염을 포함한다. 용어 "페놀산 유도체"는 페놀 고리 및 유기 카르복실산 작용기를 함유하고, C₁-C₆ 골격 및/또는 페놀 고리에서, 예를 들어 할로겐, 에스테르, 에테르, 히드록실, 아미노 및/또는 방향족 그룹에 의해 추가로 치환될 수 있는 C₁-C₆ 골격을 가지는 모든 유기 화합물을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 특히 바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 추가로 페룰산((E)-3-(4-히드록시-3-메톡시-페닐)프로프-2-에노익산), 시린지산(4-히드록시-3,5-디메톡시벤조산), 바닐릭산(4-히드록시-3-메톡시벤조산), 시나핀산(3-(4-히드록시-3,5-디메톡시페닐)프로프-2-에노익산), 이들 산의 C₁-C₄ 에스테르, 또는 이들 산의 염에서 선택되는 하나 이상의 페놀산 유도체를 포함한다. 가장 바람직한 페놀산 유도체는 페룰산, 시린지산, 이들 산의 C₁-C₄ 에스테르, 또는 이들 산의 염이다.

또다른 바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 추가로 하나 이상의 피리딘산 유도체를 포함한다. 용어 "피리딘산 유도체"는 피리딘 (C₅H₄N) 고리 및 유기 카르복실산 작용기를 함유하고, C₁-C₆ 골격 및/또는 피리딘 고리에서, 예를 들어 할로겐, 에스테르, 에테르, 히드록실, 아미노 및/또는 방향족 그룹에 의해 추가로 치환될 수 있는 C₁-C₆ 골격을 가지는 모든 유기 화합물을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 피리딘 질소는 또한 선형, 분지형, 포화 또는 불포화 지방족 또는 방향족 탄화수소로 사급화, 즉 알킬화될 수 있다.

바람직한 염은 본 발명의 피리딘산 유도체의 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 또는 암모늄 염이다.

바람직한 에스테르는 본 발명의 피리딘산 유도체의 선형 또는 분지형 C₁-C₄ 에스테르이다.

본 발명에 따라 사용하기에 특히 바람직한 피리딘산 유도체는 트리고넬린(1-메틸피리디늄-3-카르복실레이트)이다.

또다른 바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 추가로 하나 이상의 선형 C₂-C₆ 당 알코올 또는 환형 C₆ 당 알코올을 포함한다. 본 발명의 문맥내에서, 용어 "C₂-C₆ 당 알코올"이란 일반식 H(HCHO)_n+1H(여기서, n은 1, 3, 4, 또는 5이다)을 가지는 선형 화합물뿐만 아니라 환형 C₆ 화합물 사이클로헥산-1,2,3,4,5,6-헥솔을 가리킨다. 이들 화합물의 대표적인 예는 자일리톨, 트레이톨, 만니톨, 및 미오-이노시톨, 알로-이노시톨, L-카이로-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨 각각이다. 특히 바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 추가로 카이로-이노시톨, 에리스리톨, 트레이톨 및 소르비톨, 가장 바람직하게는 카이로-이노시톨에서 선택되는 하나 이상의 당 알코올을 포함한다.

그밖의 또다른 바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 추가로 우라실, 아데닌, 아데노신 3'-모노포스페이트(3'-AMP) 및 아데노신 5'-모노포스페이트(AMP)에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오염기 및/또는 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 대표적인 실시양태에서, 세포 배양 배지는 L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르; 및 γ-글루타밀 아미노산, 피로글루타밀 아미노산, 글루타메이트-함유 또는 프롤린-함유 디펩티드, 옥소-아미노산, 호모-아미노산, N-아세틸-아미노산 및 글리실-글리신에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 유도체를 포함하고, 여기서 이들 화합물의 농도는 최종 액체 세포 배양 배지 ℓ 당 적어도 0.001 mg, 바람직하게는 적어도 0.01 mg, 보다 바람직하게는 적어도 0.1 mg, 보다 더 바람직하게는 적어도 1 mg, 가장 바람직하게는 적어도 5 mg이고, 여기서 농도는 개별적인 성분에 대한 것이다. 배지에서의 최종 농도가 상기 개별적인 성분당 최대 50 g/ℓ, 바람직하게는 최대 1 g/ℓ, 보다 바람직하게는 최대 100 mg/ℓ인 것이 바람직하다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에 있어서, 세포 배양 배지는 L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르; γ-글루타밀 아미노산, 피로글루타밀 아미노산, 글루타메이트-함유 또는 프롤린-함유 디펩티드, 옥소-아미노산, 호모-아미노산, N-아세틸-아미노산 및 글리실-글리신에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 유도체; 하나 이상의 페놀산 유도체, 이들 페놀산 유도체의 에스테르 또는 이들 페놀산 유도체의 염; 하나 이상의 선형 C₂-C₆ 당 알코올 또는 환형 C₆ 당 알코올; 우라실, 아데닌, 아데노신 3'-모노포스페이트(3'-AMP) 및 아데노신 5'-모노포스페이트(AMP)에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오염기 및/또는 뉴클레오티드; 및 트리고넬린(1-메틸피리디늄-3-카르복실레이트)를 포함하고, 여기서 이들 화합물의 농도는 최종 액체 세포 배양 배지 ℓ 당 적어도 0.001 mg, 바람직하게는 적어도 0.01 mg, 보다 바람직하게는 적어도 0.1 mg, 보다 더 바람직하게는 적어도 1 mg, 가장 바람직하게는 적어도 5 mg이며, 여기서 농도는 개별적인 성분에 대한 것이다. 배지에서의 최종 농도가 상기 개별적인 성분당 최대 50 g/ℓ, 바람직하게는 최대 1 g/ℓ, 보다 바람직하게는 최대 100 mg/ℓ인 것이 바람직하다.

또한 상업적으로 입수가능한 기본 배지가 본 발명의 알파-히드록시산 및 임의로 단백질 가수분해물과 조합하여 사용될 수 있다. CHO-1으로서의 동물 세포주를 위해, CD-CHO, 론자(Lonza) 사로부터의 PowerCHO, 어빈 사이언티픽(Irvine Scientific) 사로부터의 ISCHO-CD, 또는 SAFC 사로부터의 Excell 325 PF CHO가 사용될 수 있다. 식물 세포를 위해, SAFC 사로부터 입수할 수 있는 Murashige and Skoog 기본 배지가 사용될 수 있다. 가수분해물은 또한 상이한 단백질원 유래의 가수분해물, 예컨대 밀 및 콩, 콩 및 완두콩, 쌀 및 면화씨 유래의 가수분해물일 수 있다. 세포 배양 배지는 바람직하게는, 완전히 재생될 수 있고/있거나 오염을 피하기 위해, 소태아 혈청과 같은 혈청 또는 혈청-유래 성분을 포함하지 않는다. 바람직하게, 세포-배양 배지는, 동물-유래 단백질과 같은 동물 성분 및/또는 동물, 예를 들어 소 기원의 단백질 가수분해물을 포함하지 않는다. 따라서, 바람직한 실시양태에 있어서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 진핵 세포를 배양하기 위한 무혈청 배양 배지 및 이러한 무혈청 배양 배지의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 세포 배양 배지 및 배양 방법은 모두, 진핵 세포, 특히 동물 세포의 배양을 지원할 수 있는 능력이 있으며, 여기서 능력은 적어도 시험관 내에서 세포에 의한 산물의 생존, 성장 및/또는 분화, 및 바람직하게는 또한 그의 발현을 가능케 함을 의미한다. 배치, 페드 배치(fed batch), 연속 또는 관류 반응기에서의 배양 모두가 구상된다.

세포 성장 곡선은, 세포를 증가 및 성장시키는 실제 성장 단계, 및 세포가 거의 안정한 상태이지만 관심 대사물질, 예를 들어 항체를 생산하기 시작하는 생산 단계로 분리될 수 있다. 본 발명의 알파-히드록시산은 동물 또는 다른 진핵 세포의 성장 단계 및 생산 단계 둘 다를 지원할 수 있다.

세포 배양 배지는 액체 또는 분말의 원하는 형상로 제공될 수 있다. 액체 배지에서의 (본질적으로 수용성인) 분말화 또는 건조된 세포 배양 구성성분의 양은 당업자들에 의해 결정될 수 있지만, 바람직하게는 0.01 내지 10.0 wt/vol%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 4.0 wt/vol%, 보다 더 바람직하게는 0.05 내지 2.0 wt/vol%, 또는 0.05 내지 1.0 wt/vol%, 보다 더 바람직하게는 0.1 내지 1.0 wt/vol%, 및 가장 바람직하게는 0.2 내지 0.6 wt/vol%를 포함한다.

물로 재구성될 수 있는 건조 배양 배지중 가수분해물의 양은 배지 성분에 따라 다르지만, 전형적으로 2 내지 80% w/w, 바람직하게는 5 내지 50% w/w의 범위이다. 세포 배양 배지는 또한 바람직하게는 10 내지 0.1, 보다 바람직하게는 2.5 내지 0.4의 글루코스 대 가수분해물의 건조 중량 비로 당, 특히 글루코스 및 상술된 바와 같은 추가의 구성성분을 포함한다.

또한, 본 발명은, 진핵 세포를 배양하기 위한 세포 배지의 용도에 관한 것이다. 진핵생물은 진균류(효모 포함), 원생생물, 크로미스타(Chromista), 식물계(Plantae), 후생동물(Metazoa)(동물)을 포함한다. 본 발명은 특히, 식물 세포, 예를 들어 쌀, 담배 및 옥수수, 및 특히 동물 세포를, 바람직하게는 시험관 내 배양으로 배양하기 위한 용도에 관한 것이다. 배양될 세포는 천연원으로부터의 것일 수 있거나, 유전적으로 변형된 것일 수 있다. 동물 세포는 특히, 인간 세포, 예를 들어 PER C6 cells®과 같은 포유동물 세포, 설치류 세포, 특히 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 조류, 어류, 파충류, 양서류 또는 곤충 세포를 비롯한 척추 동물 및 무척추 동물 세포를 포함한다.

본 발명의 방법으로 배양된 세포는 특히, 바이오의약품 산업에서 추가로 정제될 수 있는 단백질 산물의 발현을 위해 사용된다. 본 발명의 배양 배지에서 유리하게 생산될 수 있는 단백질 산물의 비-제한적인 예는, 에리스로포이에틴(혈액 질환 치료용), 엔타네르셉트(류마티스성 질환 및 통풍을 치료하기 위한 TNF-α 저해제), 알파 도나아제(낭포성 섬유증을 치료하기 위한 데옥시리보뉴클레아제), 베타-인터페론(다발성 경화증 치료용) 및 광범위 치료적 모노클로날 항체를 포함한다. 원하는 단백질 산물은 당해분야에 알려진 방법, 예컨대 분별, 친화성 크로마토그래피(흡착-탈착) 등, 또는 이들의 조합에 의해 배양 배지로부터 세포를 분리하고 무세포 액체(상등액)로부터 단백질 산물을 분리하는 것에 의해 회수할 수 있다.

또한, 본 발명은, L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르 및 이들의 조합물을 함유하는 분획과 식물 가수분해물, 식물 또는 동물 사이토카인 및/또는 성장 인자, 비타민, 미네랄, 아미노산, 완충염, 미량 원소, 뉴클레오시드, 식물 호르몬, 뉴클레오티드, 당 및 항생제에서 선택되는 배양 배지의 하나 이상의 구성성분을 포함하는 키트에 관한 것이다. 구성성분은 하나 이상의 조합으로서 키트에 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 알파-히드록시산은 건조 또는 용해된 형상로 별도로 존재할 수 있고, 식물 가수분해물, 식물 또는 동물 사이토카인 및/또는 성장 인자, 비타민, 미네랄, 아미노산, 완충염, 미량 원소, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 식물 호르몬, 당 및 항생제와 같은 배양 배지의 추가 구성성분의 일부 또는 전부는 분리된 조합물로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 알파-히드록시산은, 예를 들어 아미노산 및/또는 펩티드 및/또는 당과 사전혼합될 수 있고, 임의의 잔류 구성성분은 별도로 또는 하나 이상의 조합물로 존재할 수 있다. 조성의 적어도 하나가 액체인 것이 바람직하며, 액체는 유리하게는 멸균될 수 있다. 키트의 조성은 배양 배지의 사용 전에 혼합된다.

이와 같이, 본 발명에 따른 특정 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르 및 그의 용도는 몇 가지 중요한 장점을 가지는 것으로 발견되었다. 이들은, 보통의 단백질 구성성분이 제공하는 성장을 초과하는 성장 촉진 효과를 갖는다. 이는 생산 증진, 생산 및/또는 성장의 좀 더 낮은 변동으로 이어지며, 비용 효율적이다.

시험관 내에서 배양된 동물 세포는, 덩어리 또는 무리로 성장하지 않고, 단일 세포로서 존재한다. 둘째, 세포의 생존 능력은 이들의 완전히 둥근 형상 및 밝고 투명한 세포량으로 판단된 바, 뛰어나다. 셋째, 원하는 세포 산물의 발현 수준을 저하시키지 않으면서, 무혈청 단백질, 특히 콩 단백질에 기초한 것과 같은 최신 세포 배양 배지에 비해 훨씬 높은 세포 밀도를 얻을 수 있다. 넷째, 본 발명에 따른 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 그의 에스테르 및 그의 염은 동물 세포의 시험관 내 배양을 위한 어떠한 기본 배양 배지와도 조합될 수 있어서 상기에 언급된 장점과 함께 다양한 세포 배양 배지의 제조를 가능케 한다. 또한 배양은 장기간에 걸쳐 확장될 수 있어서 고도의 산물 수율로 이어질 수 있다.

실시예

실시예 1: 청구된 알파-히드록시산, 이들 산의 에스테르, 및 이들 산의 염을 함유하는 단백질 가수분해물의 분석 및 성장 촉진의 증거

미국 프리스랜드캠피나 도모(FrieslandCampina Domo) 사에서 입수한 SE50MAF-UF, WGE80M-UF, CNE80M-UF, PCE80B 등의 상업적인 식물 단백질 가수분해물을 전기분무 이온화(ESI) 소스 및 선형 이온-트랩(LIT) 질량 분석기로 이루어진, Thermo-Finnigan LTQ 질량 분광계 및 Waters Acquity UPLC를 사용하여 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC/MS, LC/MS₂)으로 분석하였다. 시료 추출물을 두 분할량로 나누어 건조시킨 후, 산성 또는 염기성 LC-적합 용매에서 재구성하였다. 분리된 전용 컬럼(separate dedicated column)을 사용하여 두 개의 독립된 주입부에서 하나의 분할량을 산성의 양이온 최적화 조건을 사용하여 분석하고, 다른 분할량을 염기성 음이온 최적화 조건을 사용하여 분석하였다. 산성 조건에서 재구성된 추출물은 각각 0.1% 포름산을 포함하는 메탄올 및 물을 사용하여 구배 용출시키고, 이에 반해 물/메탄올을 또한 사용하는 염기성 추출물은 6.5 mM 탄산수소암모늄을 포함한다. MS 분석은 MS와 동적 배제(dynamic exclusion)를 채용한 데이터-의존적 MS₂ 스캔을 번갈아 하였다. 정제된 표준의 메타볼로믹 라이브러리 엔트리(metabolomic library entries) 또는 반복되는 미지의 실체(recurrent unknown entities)와의 비교로 생화학 물질을 규명하였다. 색층 분석 특성(chromato-graphic properties)과 질량 스펙트럼의 결합은 특정 화합물 또는 등압 실재물(isobaric entity)에 일치하는 경향을 보인다. 이에 따라, 식물 단백질 가수분해물에 존재하는 생화학적 성분 및 그의 상대적 농도의 평가가 제공되었다. 또한, 모든 가수분해물은 세포 성장 및 항체 생산에 대해 세포 배양 분석에서 시험되었다. 세포 성장 및 항체 생산에 현저한 영향을 미치는 생화학적 성분들을 확인하기 위해서 세포 성장 및 화합물 분석 데이터에 대해 선형 회귀 분석을 행하였다. 마이크로소프트 엑셀 2003의 SLOPE 기능을 이용하여, 항체 생산과 성분의 상대 농도 사이의 상관 관계를 계산하고, 그의 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 양의 기울기(positive slope)가 더 높을수록, 세포 배양에서 생화학적 성분의 중요성이 더 높다. MS 엑셀의 상관 회귀 기능을 사용하여 또한 계산된 p-값은 값의 유의성을 나타내는데, p-값이 낮을수록(모두 0 내지 1 사이), 측정된 값이 더 유의적이다.

［표 1］

항체 생산과 알파-히드록 시산 유도체의 상대 농도의 상관관계

실시예 2 : 세포 배양 배지의 제조

세포 배양 시험은 상업적으로 입수가능한 IS CHO-CD 배지(Irvine Scientific, Cat. No. 91119)에서 수행하였다. 이 배지에 L-글루타민(2 mM), 플루론산, 하이포크산틴(100 μM) 및 티미딘(15 μM)을 첨가하였다. 성장 시험 동안 모든 세균 성장을 방지하기 위해 페니실린 및 스트렙토마이신을 첨가하였다. 모두 독일 시그마 알드리히(Sigma Aldrich) 사에서 구매한 메틸-L-3-페닐 락테이트 또는 점액산을 다양한 농도(1×10^-3 내지 1×10^-3%(w/v), 표 2 참조)로 배지에 보충하였다. 보충된 배지를 보르텍스 혼합물(vortex mixture)과 혼합하고, 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과한 다음에, 성장 시험에 사용하였다.

실시예 3 : IgG 생산 및 세포 성장: CHO 세포의 시험관 내 배양

세포주

IgG 발현 CHO 세포주를 사용하였다(CHO-2: ATCC CRL 11397, IgG4를 생산함). 세포주를 수 계대배양을 위한 부착 조건(adherent condition)에서 성장시키고, 합류되면(confluent), 이들을 실시예 2에 기재된 보충 배지에서 동물질 불함유 조건으로 옮겼다.

성장 및 생산 곡선

성장 및 생산 곡선을 측정하기 위해, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 배플 플라스크(baffled flasks)에서 현탁 배양으로 성장시켰다. 20×10⁶ 세포를 배플 플라스크로 25 ml 배지에 옮겼다. 알파-히드록시산 유도체의 존재 및 부재 하의 합성 배지를 시험하였다. 성장 분석 동안에 어떤 신선한 배지도 첨가되지 않았다. CEDEX HiRes 세포 계수기(Innovatis, 독일)를 사용하여 세포를 계수하였다. 세포 계수를 성장 곡선 아래 면적을 계산하는데 사용하고, [Ling, C. X, Huang, J. and Zhang, H. (2003), International joint conferences on artificial intelligence, pp. 329-341]에 상세히 기재된 바와 같이 곡선 아래 무차원 면적(AUC) 값으로서 나타내었다. 상등액 시료를 IgG 생산 측정을 위해 격일마다 취하였다. IgG 생산은 샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다. 성장 시험 11일에 측정된 누적 IgG 생산(mg/ml 단위) 및 AUC의 비를 취해 특이적 IgG 생산을 계산하였다. 세포를 위상차 현미경(Zeiss Axiovert 25, 400× 배율)을 사용하여 육안으로 검사하였다. 세포 외관은 충분한 수준의 알파-히드록시산 유도체가 배지에 존재하였을 때 상당히 개선되었다. 단일 세포만이 관찰되었으며, 세포의 집합은 볼 수 없었다. 세포 형상가 또한 긍정적인 영향을 받았다. 충분한 수준의 알파-히드록시산 유도체를 함유하는 배지에서 배양된 경우, 세포는 훨씬 더 둥글고, 밝은 외관을 가졌다. 이는 알파-히드록시산 유도체가 없는 합성 배지에서 성장된 CHO 세포 배양물에서 상당수의 세포 집합이 존재하는 것으로 관찰된 것과는 대조를 이룬다. 세포 성장 및 생산 데이터를 표 2에 요약하였다.

［표 2］

본 발명의 알파-히드록시산 유도체가 다양한 농도로 첨가된 합성 세포 배양 배지(세부사항은 실시예 5 참조)에서 CHO 세포의 특이적 IgG 생산 및 세포 성장. 알파-히드록시산 유도체가 첨가되지 않은 합성 세포 배양 배지 및 콩 단백질 가수분해물(0.4% w/v) 및 소태아 혈청(Gibco-Invitrogen; 5% v/v)이 보충된 합성 세포 배양 배지에서의 생산 및 성장 데이터가 비교를 위해 제공된다.

Claims

배지에서의 최종 농도가 개별적인 알파-히드록시산, 그의 에스테르 또는 그의 염 당 적어도 0.001 mg/ℓ가 되도록, L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르 및 이들의 조합물을 성장-촉진 및/또는 생산-증진 성분으로서 추가의 통상적 배양 배지 성분에 첨가하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 또는 이들 산의 에스테르는 순수한 물질 또는 농축물로서 첨가되는, 진핵 세포를 배양하기 위한 배양 배지의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 배지에서의 최종 농도가 적어도 0.01 mg/ℓ, 보다 바람직하게는 적어도 0.1 mg/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 1 mg/ℓ인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 C₂-C₆ 알파-히드록시산이 L-3-페닐 락트산 및 점액산에서 선택되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 단백질 가수분해물이 상기 배지에 추가로 첨가되는 방법.
제4항에 있어서, 상기 식물 단백질 가수분해물이 밀, 콩, 면화 또는 완두콩 단백질 가수분해물, 또는 2종 이상의 이들 가수분해물의 혼합물인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, γ-글루타밀 아미노산, 피로글루타밀 아미노산, 글루타메이트-함유 또는 프롤린-함유 디펩티드, 옥소-아미노산, 호모-아미노산, N-아세틸-아미노산 및 글리실-글리신에서 선택되는 아미노산 유도체; 페놀산 유도체; 선형 C₂-C₆또는 환형 C₆ 당 알코올; 피리딘산 유도체; 및 우라실, 아데닌, 아데노신 3'-모노포스페이트(3'-AMP) 및 아데노신 5'-모노포스페이트(AMP)에서 선택되는 뉴클레오염기(nucleobase) 및/또는 뉴클레오티드, 또는 이들 화합물 그룹으로부터 선택되는 화합물들의 조합물중에서 선택되는 추가의 하나 이상의 화합물이 배지에서의 최종 농도가 개별적인 화합물 당 적어도 0.001 mg/ℓ, 바람직하게는 적어도 0.01 mg/ℓ, 보다 바람직하게는 적어도 0.1 mg/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 1 mg/ℓ가 되도록, 상기 배지에 첨가되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득할 수 있는 세포 배양 배지.
L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르 및 이들의 조합물을 ℓ 당 적어도 0.001 mg, 또는 건조물질 kg 당 적어도 0.02 mg으로 함유하는, 진핵 세포를 배양하기 위한 배양 배지.
제7항 또는 제8항에 있어서, L-3-페닐 락트산, 점액(갈락타릭)산, 글루콘산, 글루카르산, 글리세르산, 2-히드록시 부티르산, 알파-히드록시이소발레르산, 알파-히드록시이소카프로산 및 에리스론산에서 선택되는 하나 이상의 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르 및 이들의 조합물을 ℓ 당 적어도 0.01 mg, 보다 바람직하게는 적어도 0.1 mg, 보다 더 바람직하게는 적어도 1 mg, 가장 바람직하게는 적어도 5 mg, 또는 건조물질 kg 당 적어도 0.2 mg, 보다 바람직하게는 적어도 2 mg, 보다 더 바람직하게는 적어도 20 mg, 가장 바람직하게는 적어도 250 mg으로 함유하는 배양 배지.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 그의 에스테르, 그의 염, 또는 이들의 조합물의 하나 이상을 상기 개별적인 성분 당 최대 50 g/ℓ, 바람직하게는 최대 1 g/ℓ, 보다 바람직하게는 최대 100 mg/ℓ, 또는 건조물질 kg 당 최대 1000 g, 바람직하게는 최대 20 g, 보다 바람직하게는 최대 2 g으로 함유하고, 상기 농도는 개별적인 성분에 대한 것인 배양 배지.
제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C₂-C₆ 알파-히드록시산, 이들 산의 염, 이들 산의 에스테르 및 이들의 조합물의 하나 이상을 개별적인 성분마다 5 mg/ℓ 내지 30 g/ℓ, 또는 건조물질 kg 당 100 mg 내지 600 g, 바람직하게는 5 mg/ℓ 내지 3 g/ℓ, 또는 건조물질 kg 당 100 mg 내지 150 g, 보다 바람직하게는 250 mg 내지 60 g의 농도로 함유하는 배양 배지.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 비타민, 미네랄, 아미노산, 완충염, 미량 원소(trace element), 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 식물 호르몬, 당, 항생제 및 단백질 가수분해물에서 선택되는 배양 배지의 하나 이상의 통상적인 구성성분을 추가로 함유하는 배양 배지.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 밀, 콩, 면화 또는 완두콩 단백질 유래의 하나 이상의 가수분해물을 추가로 함유하는 배양 배지.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, γ-글루타밀 아미노산, 피로글루타밀 아미노산, 글루타메이트-함유 또는 프롤린-함유 디펩티드, 옥소-아미노산, 호모-아미노산, N-아세틸-아미노산 및 글리실-글리신으로 구성된 아미노산 유도체; 페놀산 유도체; 선형 C₂-C₆또는 환형 C₆ 당 알코올; 피리딘산 유도체; 및 우라실, 아데닌, 아데노신 3'-모노포스페이트(3'-AMP) 및 아데노신 5'-모노포스페이트(AMP)에서 선택되는 뉴클레오염기 및/또는 뉴클레오티드, 또는 이들 화합물 그룹으로부터 선택되는 화합물들의 조합물로 구성된 그룹중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 추가로 함유하는 배양 배지.
제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 유도체가 γ-글루타밀-티로신, γ-글루타밀-페닐알라닌, 사이클로-글리실-글루타메이트, 발리닐 글루타메이트, 5-옥소프롤린 및 β-알라닌에서 선택되는 배양 배지.
제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페놀산이 페룰산((E)-3-(4-히드록시-3-메톡시-페닐)프로프-2-에노익산), 시린지산(4-히드록시-3,5-디메톡시벤조산), 바닐릭산(4-히드록시-3-메톡시벤조산), 시나핀산(3-(4-히드록시-3,5-디메톡시페닐)프로프-2-에노익산), 이들 산의 에스테르, 또는 이들 산의 염, 바람직하게는 페룰산, 시린지산, 이들 산의 에스테르, 또는 이들 산의 염, 이들 산의 염 및 이들 산의 에스테르에서 선택되는 배양 배지.
제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 카이로-이노시톨, 에리스리톨, 트레이톨, 소르비톨 및 트리고넬린에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유하는 배양 배지.