CN104271734A - 用于真核细胞的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸和三羟基丁酸以及它们的组合的C2-C6α-羟基酸在用于培养真核细胞的培养基中作为生长和生产促进成分的用途。本发明另外涉及包含在至少0.001mg/l的水平的这些α-羟基酸衍生物的培养基。

Description

用于真核细胞的培养基
技术领域
本发明涉及用于培养真核、具体地动物细胞的培养基的生产，以及因此生产的细胞培养基，和其用于真核、具体地动物细胞的体外培养的的用途。
背景技术
通过培养哺乳动物、植物或昆虫细胞，有价值的生物化学品和生物医药品，例如抗体和抗生素的生产需要适当的培养基。已经用包含未定义的成分(如胎牛血清(FCS)，几种动物来源的蛋白质和/或牛来源的蛋白质水解产物)的一系列添加物补充细胞培养基成分。
在动物细胞培养中使用的血清或血清来源的物质，如白蛋白、转铁蛋白或胰岛素，可以包含可能污染培养物以及由这些所获得的生物医药产品的不需要的试剂。此外，像牛肉或胶原水解产物的牛来源蛋白产品承受BSE污染的风险。而且，必须对所有已知的病毒，包括可以通过血清传输的肝炎和HIV，测试来源于人类血清中的添加剂。
总之，通过未知的试剂可以污染所有血清衍生的产品。在细胞培养中，在血清或蛋白质添加剂来源于人类或其它动物来源的情况下，无数的问题(例如，不同批次的质量和组成变化，以及病毒、支原体或BSE污染的风险)可以发生。因此，植物蛋白质水解产物或植物蛋白胨普遍使用于应当不含动物组分的培养基。
然而，在没有动物来源的细胞培养添加剂的培养基中，动物细胞的生长和产率总是无法令人满意的。频繁地观察到，体外培养的动物细胞成团(in lump)生长。这被认为是欠佳的条件，因为剥夺了在团的核心的细胞的营养物，并且细胞将会死亡。在下游处理过程中，还存在堵塞管路或过滤器的风险。通过它们的外观也可以评估细胞下降的活力。具有下降的活力的细胞显示出不规则的形状，即不圆的外形，并且还具有不同于具有完全明亮的和透明的细胞内含物的健康细胞的“成粒”细胞内含物。
WO2006/123926涉及在至少一种植物蛋白来源(优选地，来自油菜、小麦或香菜)的基础上的一种用于生长和/或培养微生物和/或细胞的肽组合物。在实施例中介绍了小麦水解产物的效果。
WO2006/128764公开了用于培养生产复合蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其中，向细胞培养物中进料一种或多种植物来源的蛋白胨。举例证明了植物来源大豆、棉籽和豌豆。在伴随实施例中显示了大豆水解产物对CHO细胞培养的影响。
WO2009/020389公开了向日葵属(向日葵)物质的蛋白质水解产物作为用于培养真核、具体地动物细胞的培养基组分的用途。
US2003/0203448A1描述了用于细胞培养的无蛋白质的和无血清的培养基，包含大豆水解产物和可选地添加的游离氨基酸。
Nicoll等人,Connective Tissue Research,第42卷,第1期,第59-69页公开了乳酸在人类皮肤的成纤维细胞中对于软骨形成(软骨发展)的诱导的影响的研究。其中，细胞在包含用10％胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素以及80mM乳酸补充的最小必需培养基(MEM)的培养基中生长。
Morishima等人,Neuroscience Research,第61卷,第1期,第18-26页研究了在培养的大鼠星形胶质细胞中，乳酸对水通道蛋白质水通道蛋白(AQP4)的表达和定位的影响。对于这种影响，在包含达尔贝科改进的伊格尔培养基(DMED)、10％胎牛血清(FBS)以及15-45mM乳酸或乳酸盐的培养基中培养星形胶质细胞。
Lampe等人,Biotechnology and Bioengineering,第103卷,第6期,第1214-1223页公开了乳酸对于神经前体细胞的影响的调查研究。其中，在包括DMEM、青霉素、链霉素、N2、L-谷氨酰胺、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及至多达10mg/ml的乳酸的培养基中培养细胞。
Kromenaker等人,J.Biotechnol.,第34卷,1994,第13-34页描述了乳酸浓度对于杂交瘤细胞生长和抗体生产的细胞周期动力学的影响。在包括DMEM、青霉素、链霉素、热灭活的马血清以及至多达140mM的乳酸的培养基中培养细胞。
Ballez等人公开了一种用于细胞培养的无蛋白质的培养基，包含用0.1％普朗尼克(pluronic)F68、0.04pM亚硒酸钠和500μM柠檬酸铁补充的基础确定的培养基(BDM)(第105页，顶部)，以及稻谷或小麦蛋白质水解产物。
US2002/0039787公开了用于在体外培养微血管内皮细胞的方法，所述方法包括，在存在有效量的人类血清下，培养微血管内皮细胞的富集群。
植物蛋白质水解产物的功能性是它的化学成分的直接结果。它受到如原料、加工因素、过程控制和储存条件的几个因素的影响。因此，它导致一种持久的仍很少研究的定义为“批次间偏差”的现象。
生物制药工业对其表示了重要的关注，其是这些水解产物的消费者，因为它可以意味着在产品收率上10％至25％的偏差以及它具有直接的财政后果。本发明旨在解决这些忧虑。
发明内容
已发现特定C2-C6α-羟基酸、这些酸的盐、这些酸的酯以及它们的组合对于真核细胞、特别是动物细胞的体外细胞培养具有强的生长和生产促进效果。这些化合物的最低水平的存在导致一致的并且因此商业上有吸引力的产品性能。包含这些衍生物的培养基极其适用于培养真核、具体地动物细胞。因此本发明提供了一种包含这些特定α-羟基酸、它们的盐或它们的酯的细胞培养基，以及生产这些培养基的方法和使用包含作为培养基组分的这些α-羟基酸、它们的盐或它们的酯的组合物用于在体外培养动物细胞的方法。
具体实施方式
本发明涉及一种生产用于培养真核细胞、具体地动物细胞的培养基的方法，涉及选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸以及三羟基丁酸(赤酮酸，erythronic acid)的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐，这些酸的酯以及它们的组合作为生长促进或生产改进成分的用途。本发明也涉及用于培养真核、具体地动物细胞的培养基，基于干重，包含至少0.02ppm(0.02mg/kg)，优选地至少0.2mg/kg，更优选地至少2mg/kg，甚至更优选地至少20mg/kg，最优选地至少50ppm(50mg/kg)的一种或多种上述的α-羟基酸或它们的衍生物。
在本文描述的任何地方，给定的本发明的细胞培养基的成分的量都是基于干重，通过任意地取5％(50g/l)的干固体含量可以得出在液体培养基中的最终浓度，并且反之亦然。因此，为了得到优选的水平，100mg/kg干物质的量对应5mg/l的最终的液体培养基。这决不意味着液体培养基的干固体含量应当是5％。取决于特定细胞培养浓度，干固体的水平可以选择为例如0.5wt％至30wt％，优选地0.5wt％至15wt％，更优选地1wt％至15wt％，最优选地1wt％至5wt％。
根据本发明供使用的C2-C6α-羟基酸在C2-C6主链处可以可选地被取代。适合的取代基包括卤素、酯、醚、羟基、氨基以及芳香族基团。
优选的盐是本发明的C2-C6α-羟基酸的钠、钾、钙、镁或铵盐。
优选的酯是本发明的C2-C6α-羟基酸的直链或支链的C1-C4酯。
具体地，根据本发明供使用的优选的化合物是粘酸和甲基-L-3-苯基乳酸酯。
根据本发明使用的α-羟基酸、它们的盐以及它们的酯可以像这样使用。大部分组分是商购的。或者，它们可以通过通常已知的合成或半合成过程产生。大部分的衍生物也可以从适合的蛋白质部分或水解产物，特别地植物来源的蛋白质如从大豆、豌豆、扁豆、小麦(麸质)、棉籽(棉子)、稻谷、向日葵、红花等中分离得到。从蛋白质部分、或更方便地从蛋白质水解产物中提取或富集它们。这些方法在本领域中是已知的。
本发明因此涉及一种通过向培养基的另外的组分添加以下物质生产细胞培养基的方法：一定量的选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸以及三羟基丁酸的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐，这些酸的酯以及它们的组合，使得根据本发明并且在下面详细描述的每种单独的α-羟基酸或衍生物在培养基中的最终浓度为至少0.001mg/l，优选地至少0.01mg/l，更优选地至少0.1mg/l，最优选地至少1mg/l。优选地，每种单独的α-羟基酸、这种酸的盐或这种酸的酯在培养基中最终浓度为至多50g/l，优选地至多1g/l，更优选地至多100mg/l。可以像这样添加衍生物，例如纯化的和/或合成的产品。优选地，这样的纯化和/或合成的组分具有至少80％，更优选地至少90％，最优选地至少95％的纯度。或者，可以作为浓缩物添加化合物，即通过浓缩或富集根据本发明的一种或多种α-羟基酸或其衍生物的溶液至按重量计至少0.01％，优选地至少0.1％，更优选地至少1％，最优选地至少10％，或者甚至至少25％，和优选地按重量计至多80％，更优选地至多70％的水平，或者具有优选地至少0.1mg，更优选地至少1mg，甚至更优选地至少10mg，甚至更优选地至少1g，还更优选地至少10g，最优选地至少100g每kg的干物质的浓度可获得的产品。
在本发明范围内，术语“培养基的另外的组分”和“另外的常规培养基组分”是指本领域通常已知的作为细胞培养基的组分的化合物，如植物或动物细胞因子和/或生长因子(条件是这些不是动物来源的)、维生素、矿物质、氨基酸、缓冲盐、微量元素(痕量元素，trace element)、核苷、核苷酸、植物激素、包括葡萄糖的糖，抗生素等。植物激素包括生长激素、赤霉素、脱落酸以及它们的组合。取决于设想的细胞系和细胞方面，技术人员能够选择期望的或需要的另外的培养基组分的类型和数量。
本发明另外涉及通过这种方法可获得的细胞培养基。更具体地，本发明涉及一种用于培养真核细胞的培养基，包含至少0.001mg/l，优选地至少0.01mg/l，更优选地至少0.1mg/l，甚至更优选地至少每1mg/l，最优选地至少5mg/l的最终液体培养基的选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸以及三羟基丁酸的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐，这些酸的酯或它们的组合，其中，浓度是每种单独的组分。优选地，每种所述单独的组分在培养基中的最终浓度为至多50g/l，优选地至多1g/l，更优选地至多100mg/l。就本发明的细胞培养基的干重而言，它包含至少0.02mg/kg，优选地至少0.2mg/kg，更优选地至少2mg/kg，甚至更优选地至少20mg/kg，最优选地至少250mg/kg的干物质，以及至多1000g，优选地至多20g，更优选地至多2g每kg的干物质的选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸以及三羟基丁酸的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐、这些酸的酯或它们的组合，其中，浓度是每种单独的组分。
在本发明的优选的实施方式中，细胞培养基包含5mg/l至30g/l每种单独的组分，或者100mg至600g，优选地250mg至150g每kg干物质的浓度的一种或多种上述α-羟基酸或它们的酯或盐。更优选的水平是10mg/l至1g/l或者200mg至100g，优选地500mg至50g每kg的干物质，甚至更优选地20mg/l至500mg/l或者1g至25g每kg干物质。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明的α-羟基酸、它们的盐或它们的酯用作一种或多种植物蛋白质水解产物的部分。
在本发明特别优选的实施方式中，一种或多种α-羟基酸、它们的盐或它们的酯、或它们的组合与一种或多种植物蛋白质水解产物组合使用或添加至一种或多种植物蛋白质水解产物。
在液体培养基中(基本上水可溶性的)水解产物的量可以由技术人员确定，但是包含优选地0.001-10.0wt/vol％，更优选地0.01-10.0wt/vol％，更优选地0.01-4.0wt/vol％，甚至更优选地0.05-2.0wt/vol％，或0.05-1.0wt/vol％，甚至更优选地0.1-1.0wt/vol％，并且最优选地0.2-0.6wt/vol％。
通过本领域已知的方法，例如通过压制、磨制、剥壳和/或粉碎，通过处理豆、豆荚、种子等，若需要紧接着脱脂，例如使用如己烷的有机溶剂，可以产生蛋白质水解产物。优选地，脱脂的种子材料包含至少20wt％的蛋白质。脱脂的种子材料优选地具有不到10wt％的脂肪含量。
通常，通过酶促蛋白水解作用获得蛋白质水解产物，也可以将其称为蛋白水解产物(proteolysate)。(脱脂的)植物种子材料(可选地粉碎的)经受使用来自于细菌、真菌、植物或动物来源的内切和/或外切蛋白酶或它们的混合物的水解作用；然而，优选地，酶不来自于动物来源。使用重组DNA技术可以生产酶。优选的酶是内切蛋白酶。更优选地，酶包含碱性蛋白酶。适合的蛋白酶包含枯草杆菌蛋白酶(Alcalase)，丝氨酸内切蛋白酶。特别适合的酶包含来自Novozymes的枯草杆菌蛋白酶，和/或来自于Merck的木瓜蛋白酶。其它适合的酶包含，例如中性蛋白酶(Neutrase)。
水解作用的条件包括30分钟至30小时；优选地1-6小时，最优选地2-4小时的反应时间；温度是20至65℃，优选地40℃至60℃，全部取决于特定的蛋白质来源和期望的水解程度。pH值可以调整为6.0至8.5，优选地6.6至8.0，最优选地为7.0-8.0。在溶液中待水解的蛋白质的浓度是1至10％，优选地2-8，最优选地3-6wt％的蛋白质。基于底物，使用的酶的量为0.5-10wt％，优选地1-5wt％，最优选地1.5-3.5wt％。
优选地，进行水解作用直至获得5至50％，优选地10至40％，最优选地10至30％的水解程度。使用热处理停止水解反应。优选地，热处理包括80至100℃15至90分钟的加热时间(批量热处理)，或在100-120℃1-5分钟的加热时间。采用常规的甲醛滴定可以确定水解的程度，如在实施例中所确定的。在水解反应终止之后，可以可选地精炼(polish)反应混合物以去除不可溶的部分，例如使用离心作用或者诸如硅藻土(例如)的在本领域中已知的过滤助剂。优选地，基于干物质，水解产物包含不到10wt％的不可溶于水的材料，更优选地不到5wt％，最优选地不到2wt％。例如，通过喷雾干燥或冷冻干燥可以干燥水解产物。可以像这样使用或者可以进一步分馏水解产物。
基于总蛋白质，优选地，水解产物包含20至80wt％，特别地20至60wt％的具有100-500Da的分子量的肽和/或10至30wt％的500至1000Da的分子量的肽。就肽长度而言，基于总蛋白质，水解产物优选地包含至少15wt％，更优选地至少25wt％，最优选地至少35wt％，至多达例如85wt％，更优选地至多达65wt％，最优选地至多达55wt％的二肽至五肽，8至30wt％的六肽至九肽，至少8wt％，特别地，15至60wt％的高级肽(higher peptide)和0.1至30wt％，优选地0.5至10wt％的游离氨基酸。在优选的实施方式中，可以超滤水解产物，优选地，使用5或10kDa分子量的截留(cut-off)。水解产物可以包含另外的组分，如碳水化合物、可溶纤维、多价金属盐等。优选地，蛋白质的含量(所有蛋白质类材料，包括游离氨基酸)是30至90wt％，更优选地45至85wt％。这些量是基于干重的。
水解产物可以与培养基的其它常规组分组合，如植物或动物细胞因子和/或生长因子(条件是这些不是动物来源的)、维生素、矿物质、氨基酸、缓冲盐、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、包括葡萄糖的糖、抗生素等等。植物激素包含生长激素、赤霉素、脱落酸以及它们的组合。
根据本发明的细胞培养基可以进一步包含选自氨基酸衍生物；酚酸衍生物；直链C2-C6或环状C6糖醇；吡啶酸(pyridinic acid)衍生物；以及选自尿嘧啶、腺嘌呤、3’-单磷酸腺苷(3’-AMP)和5’-单磷酸腺苷的核碱基和/或核苷酸的一种或多种化合物；以及来自这些化合物组的化合物的组合。这些化合物的浓度为至少0.001mg/l，优选地至少0.01mg/l，更优选地至少0.1mg/l，甚至更优选地至少1mg/l，最优选地至少5mg/l的最终的液体培养基，其中浓度是每种单独的组分。优选地，在培养基中的最终浓度为至多50g/l，优选地至多1g/l，更优选地至多100mg/l每种所述单独的组分。
在优选的实施方式中，细胞培养基进一步包含选自γ-谷氨酰基氨基酸、焦谷氨酰基氨基酸、包含谷氨酸(glutamate-containing)或包含脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸(homo-amino acid)、N-乙酰基-氨基酸以及甘氨酰基-甘氨酸的一种或多种氨基酸衍生物。在特别优选的实施方式中，细胞培养基进一步包含选自N-乙酰基-甲硫氨酸、N-乙酰基-苯丙氨酸、N-乙酰基-鸟氨酸、γ-谷氨酰基酪氨酸、γ-谷氨酰基苯丙氨酸、焦谷氨酰基谷氨酰胺、焦谷氨酰基甘氨酸、缬氨酰基谷氨酸(缬氨酰基谷氨酸酯，valinyl glutamate)、甘氨酰基脯氨酸、环甘氨酰基-谷氨酰胺、5-氧代脯氨酸，以及S-氧代-甲硫氨酸、和β-丙氨酸、2-氨基丁酸、甘氨酰基-甘氨酸和高丝氨酸的一种或多种氨基酸衍生物。
在另外的优选的实施方式中，细胞培养基进一步包含一种或多酚酸衍生物、这些酚酸衍生物的酯或这些酚酸衍生物的盐。应理解术语“酚酸衍生物”包括含有酚环和有机羧酸官能的具有C1-C6骨架(主链，skeleton)的所有有机化合物，并且这些有机化合物可以被例如卤素、酯、醚、羟基、氨基和/或芳香族基团在C1-C6骨架和/或酚环进一步取代。在特别优选的实施方式中，细胞培养基进一步包含选自阿魏酸((E)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)丙-2-烯酸)、丁香酸(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸)、香草酸(4-羟基-3-甲氧基苯甲酸)、芥子酸(3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)丙-2-烯酸)的一种或多种酚酸衍生物，这些酸的C1-C4酯，或这些酸的盐。最优选的酚酸衍生物是阿魏酸、丁香酸，这些酸的C1-C4酯或这些酸的盐。
在另外的优选的实施方式中，细胞培养基进一步包含一种或多种酚酸衍生物。应理解术语“酚酸衍生物”包括含有吡啶环(C5H4N)和有机羧酸官能的具有C1-C6骨架所有有机化合物，并且这些有机化合物可以被例如卤素、酯、醚、羟基、氨基和/或芳香族基团在C1-C6骨架和/或吡啶环进一步取代。吡啶氮也可以是季铵化的，即用直链、支链、饱和的或不饱和的脂肪族或芳香烃烷基化。
优选的盐是本发明的吡啶酸衍生物的钠、钾、钙、镁或铵盐。
优选的酯是本发明的吡啶酸衍生物的直链或支链C1-C4酯。
根据本发明的供使用的特别优选的吡啶酸衍生物是葫芦巴碱(1-甲基吡啶-3-羧酸盐)。
在另外的优选的实施方式中，细胞培养基进一步包含一种或多种直链C2-C6糖醇或环状C6糖醇。在本发明的范围内，术语“C2-C6糖醇”是指具有通式H(HCHO)n+1H的直链化合物，其中n是1、3、4或5，以及环状C6化合物环己烷-1,2,3,4,5,6-六醇。这些化合物的典型的实例分别是木糖醇、苏糖醇、甘露醇和肌醇、异肌醇、L-手性-肌醇和D-手性-肌醇。在特别优选的实施方式中，细胞培养基进一步包含一种或多种糖醇，这些糖醇选自手性肌醇、赤藓醇、苏糖醇以及山梨醇，最优选地手性肌醇。
在又一个优选的实施方式中，细胞培养基进一步包含选自尿嘧啶、腺嘌呤、3’-单磷酸腺苷(3’-AMP)以及5’-单磷酸腺苷(AMP)的一种或多种核碱基和/或核苷酸。
在本发明典型的实施方式中，细胞培养基包含选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸以及三羟基丁酸的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐、这些酸的酯；以及选自γ-谷氨酰基氨基酸、焦谷氨酰基氨基酸、包括谷氨酸盐/酯或包括脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸、N-乙酰基-氨基酸以及甘氨酰基-甘氨酸的一种或多种氨基酸衍生物，其中这些化合物的浓度为至少0.001mg/l，优选地至少0.01mg/l，更优选地至少0.1mg/l，甚至更优选地至少1mg/l，最优选地至少5mg/l的最终液体细胞培养基，其中浓度是每种单独的组分。优选地，在培养基中的最终浓度为至多50g/l，优选地至多1g/l，更优选地至多100mg/l每种所述单独的组分。
在本发明的另一个实施方式中，细胞培养基包含选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸以及三羟基丁酸的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐，这些酸的酯；以及选自γ-谷氨酰基氨基酸、焦谷氨酰基氨基酸、包括谷氨酸盐/酯或包括脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸、N-乙酰基-氨基酸以及甘氨酰基-甘氨酸的一种或多种氨基酸衍生物；一种或多种酚酸衍生物、这些酚酸衍生物的酯或这些酚酸衍生物的盐；一种或多种直链C2-C6糖醇或环状C6糖醇；选自尿嘧啶、腺嘌呤、3’-单磷酸腺苷(3’-AMP)以及5’-单磷酸腺苷(AMP)的一种或多种核碱基和/或核苷酸；葫芦巴碱(1-甲基吡啶-3-羧酸盐)，其中这些化合物的浓度为至少0.001mg/l，优选地至少0.01mg/l，更优选地至少0.1mg/l，甚至更优选地至少1mg/l，最优选地至少5mg/l的最终液体细胞培养基，其中浓度是每种单独的组分。优选地，在培养基中的终浓度为至多50g/l，优选地至多1g/l，更优选地至多100mg/l每种所述单独的组分。
商购的基础培养基也可以与本发明的α-羟基酸和可选的蛋白质水解产物组合使用。可以使用的动物细胞系如来自于Lonza的CHO-1、CD-CHO、PowerCHO，来自于Irvine Scientific的ISCHO-CD，或者来自于SAFC的Excell 325PF CHO。对于植物细胞，可以使用从SAFC可获得的Murashige和Skoog基础培养基。水解产物也可以是来自于不同的蛋白质来源的水解产物，如来自小麦和大豆、大豆和豌豆、稻谷和棉籽的水解产物。优选地，细胞培养基不包含诸如胎牛血清的血清或血清来源的组分，以使得是完全可复制的和/或避免污染。优选地，细胞培养基不含动物组分，如动物来源的蛋白质和/或动物(例如牛来源)的蛋白质水解产物。因此，在优选的实施方式中，本发明涉及在本文中所定义的用于培养真核细胞的无血清的培养基，和制备这样的无血清培养基的方法。
根据本发明的细胞培养基和培养方法能够支持真核、具体地动物细胞的培养，其中能力指的是在体外通过细胞能够至少生存、增殖和/或分化，并且优选地进行产物的表达。在分批、补料、连续或灌注的反应器中培养均是设想到的。
在细胞倍增和生长的实际生长阶段和生产阶段中，细胞生长曲线可以是分离的，在生产阶段中，细胞或多或少处于一种稳定的状态，只是开始产生感兴趣的代谢物，例如抗体。本发明的α-羟基酸能够支持动物或其它真核细胞的生长阶段和生产阶段。
可以以液体或以粉末的、干燥的形式提供细胞培养基。在液体培养基中(基本上水可溶性的)粉末的或干燥的细胞培养组分的量可以通过技术人员确定，但是包含优选地0.01-10.0wt/vol％，更优选地0.01-4.0wt/vol％，甚至更优选地0.05-2.0wt/vol％，或0.05-1.0wt/vol％，甚至更优选地0.1-1.0wt/vol％，并且最优选地0.2-0.6wt/vol％。
在可以用水重建的干燥细胞培养基中水解产物的量取决于培养基组分，但是典型地在2-80％w/w，优选地5-50％w/w的范围之内。优选地，细胞培养基也包含糖、具体地葡萄糖，优选地10至0.1、更优选地2.5至0.4的葡萄糖和水解产物的干重比率，以及上述的另外的成分。
而且，本发明涉及用于培养真核细胞的细胞培养基的用途。真核生物包括真菌(包括酵母)、原生生物、色藻界、植物界以及后生动物(动物)。本发明特别涉及用于培养植物细胞(例如稻谷、烟草和玉米)，并且尤其是动物细胞，优选地，体外培养的用途。所要培养的细胞可以是自然来源的或者可以是遗传改变的。动物细胞特别包含脊椎动物和无脊椎动物细胞，包含诸如人类细胞(例如，PER C6)的哺乳动物细胞，啮齿类动物细胞，具体地，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、鸟、鱼、爬行动物、两栖动物或昆虫细胞。
通过本发明的方法培养的细胞特别适用于在生物制药业中可以进一步纯化的蛋白质产品的表达。在非限制的实施例中，在本发明的培养基中，可以有利地生产包含促红细胞生成素(用于治疗血液障碍)，依那西普(用于治疗风湿病和痛风的TNF-α抑制剂)，α链球菌(用于治疗囊肿性纤维化的脱氧核糖核酸酶)、β-干扰素(对于治疗多发性硬化)以及大范围的治疗性单克隆抗体的蛋白质产品。可以通过本领域已知的方法回收蛋白质产品，如通过分馏、亲和色谱法(吸附-脱附)等，或者它们的组合从培养基中分离细胞和从无细胞液体(上清液)中分离蛋白质产品。
而且，本发明涉及一种试剂盒，包括含有选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸以及三羟基丁酸的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐、这些酸的酯以及它们的组合的部分，以及选自植物水解产物、植物或动物细胞因子和/或生长因子、维生素、矿物质、氨基酸、缓冲盐、微量元素、核苷、植物激素、核苷酸、糖以及抗生素的一种或多种培养基的组分。在试剂盒中的组分可以作为一种或多种组合存在。例如，本发明的α-羟基酸可以单独地以干燥的或溶解的形式存在，并且部分或全部的培养基的另外的组分，如植物水解产物、植物或动物细胞因子和/或生长因子、维生素、矿物质、氨基酸、缓冲盐、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、糖以及抗生素，可以作为单独的组合存在。或者，α-羟基酸可以与例如氨基酸和/或肽和/或糖预先混合，并且任何剩余的组分可以单独地或以一种或多种组合存在。优选地，至少一种组合物是液体，液体可以有利地是灭菌的。在使用培养基之前混合试剂盒的组分。
因而发现，根据本发明的特定C2-C6α-羟基酸、这些酸的盐、这些酸的酯，以及它们的用途具有几个重要的优势。它们具有生长促进的效果，其超过由常见蛋白质组分提供的生长。它们导致提高的生产，生产和/或生长较低的差异，并且是成本有效的。
在体外培养的动物细胞不是成团或成簇生长的，而是作为单个细胞存在。其次，如通过完好的圆形和明亮的透明细胞内含物所判断的，细胞的活力极好。第三，在没有损害期望的细胞产物的表达水平的情况下，相比于如那些基于无血清蛋白质、具体地大豆蛋白质的现有技术细胞培养基，可以获得高得多的细胞密度。第四，根据本发明的C2-C6α-羟基酸、它们的酯和它们的盐可以与任何用于动物细胞体外培养的基础培养基组合，使得能够生产具有上面提及的优势的多种细胞培养基。此外，培养可以延伸延长的时间段，致使更高的产品收率。
实施例
实施例1：包含要求保护的α-羟基酸、这些酸的酯和这些酸的盐的蛋白质水解产物的分析，以及生长刺激的证据
通过使用Waters Acquity UPLC和由电喷射离子化(ESI)来源和线性离子阱(LIT)质谱仪组成的Thermo-Finnigan LTQ质谱仪，通过液相色谱/质谱法(LC/MS，LC/MS2)分析从FrieslandCampina Domo,USA获得的如SE50MAF-UF、WGE80M-UF、CNE80M-UF、PCE80B的商用植物蛋白质水解产物。把样品提取物分成两个等分部分，干燥，然后在酸性或碱性LC-相容性溶剂中重建。使用分离专用柱在两次单独注射中，使用酸性阳离子优化的条件分析一个等分部分，并且使用碱性负离子优化的条件分析另一等分部分。使用均含有0.1％甲酸的水和甲醇梯度洗脱在酸性条件中重建的提取物，而也使用水/甲醇的碱性提取物包含6.5mM碳酸氢铵。MS分析在MS和使用动态排除的数据依赖MS2扫描之间交替。通过比较纯化标准品的代谢物组学库登记项(库体，library entry)或重现的未知实体确定生物化学品。对于特定化合物或同重元素的实体，色谱的特性和质谱的组合给出了匹配的指示。因此，产生了存在于植物蛋白质水解产物中的生物化学组分和它们的相对浓度的概述。而且，在细胞培养试验中测试的所有水解产物用于细胞生长和抗体生产。在细胞生长和化合物分析数据中进行线性回归分析，以确定显著影响细胞生长和抗体生产的生物化学组分。使用Microsoft Excel 2003的SLOPE功能，计算抗体生产和组分相对浓度之间的关系，其结果示出于下表1中。正斜率越高，在细胞培养中生物化学组分的重要性越高。也使用MS Excel的关联回归函数计算p-值，其代表值的显著性，越低的p-值(全部在0到1之间)，测定值越显著。
表1：抗体产量和α-羟基酸衍生物的相对浓度的关系
实施例2：细胞培养基的制备
在商购的IS CHO-CD培养基(Irvine Scientific,Cat.No.91119)中进行细胞培养试验。在这个培养基中添加L-谷氨酰胺(2mM)、普朗尼克酸(pluronic acid)、次黄嘌呤(100μM)以及胸苷(15μM)。在生长测试期间，添加青霉素和链霉素以防止任何细菌的生长。用甲基-L-3-苯基乳酸酯或粘酸(两者均购自德国Sigma Aldrich)以变化的浓度(1×10-3至1×10-1％(w/v)，参见表2)补充培养基。使用涡旋混合器混合补充的培养基，使用0.22μm过滤器过滤以及随后用于生长试验。
实施例3：IgG生产和细胞生长：CHO细胞的体外培养
细胞系
使用表达IgG的CHO细胞系(CHO-2:ATCC CRL 11397，生产IgG4)。在用于几个传代的粘附条件中培养细胞系，并且一旦汇合，转移它们至在实施例2中描述的补充培养基中的不含动物成分的条件。
生长和生产曲线
为了测量生长和生产曲线，在带有挡板的烧瓶中，在悬浮培养物中培养中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在25ml培养基中将20×106个细胞转移至带有挡板的瓶中。测试含有和不含添加的α-羟基酸衍生物的化学定义的培养基。在生长测试期间，不添加新鲜的培养基。使用CEDEX HiRes细胞计数器(Innovatis,Germany)计算细胞。使用细胞计数计算在生长曲线下的面积并且表示为在Ling,C.X,Huang,J.和Zhang,H.(2003),Internationaljoint conferences on artificial intelligence,第329-341页中详细描述的无因次(无维，dimensionless)曲线下面积(AUC)值。每隔一天取上清液样品用于IgG产量的测量。使用夹心ELISA法测定IgG产量。通过取累积的IgG产量(以mg/ml)与在生长测试的第11天测量的AUG的比率计算特定IgG产量。使用相差显微镜(Zeiss Axiovert 25,400倍放大)视觉上观察细胞。当在培养基中存在足够水平的α-羟基酸衍生物时，细胞的外观显著改善。只观察到单个细胞，并且没有看见细胞的聚集(团聚，aggregation)。细胞形状也受到积极的影响。当在包含足够水平的α-羟基酸衍生物的培养基中培养时，细胞具有圆得多和明亮得多的外观。与该观察相反，大量细胞聚集体存在于在没有α-羟基酸衍生物的化学定义的培养基中生长的CHO细胞培养物中。在表2中概述了细胞生长和产量数据。
表2.在具有以不同浓度添加的本发明的α-羟基酸衍生物的化学定义的细胞培养基(细节参见实施例5)中的CHO细胞的具体IgG产量和细胞生长。在不添加α-羟基酸衍生物的化学定义的细胞培养基中，以及补充有大豆蛋白质水解产物(0.4％w/v)和胎牛血清(Gibco-Invitrogen；5％v/v)的化学定义的细胞培养基中，提供产量和生长数据用于比较。

Claims (17)

1.一种生产用于培养真核细胞的培养基的方法，包括向另外的常规培养基成分添加选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸和三羟基丁酸的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐，这些酸的酯以及它们的组合作为生长促进和/或生产改进成分的步骤，
使得每种单独的α-羟基酸、其酯或其盐在所述培养基中的最终浓度为至少0.001mg/l，其中所述一种或多种C2-C6α-羟基酸、这些酸的盐或这些酸的酯作为纯物质或作为浓缩物添加。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述培养基中的所述最终浓度为至少0.01mg/l，更优选地至少0.1mg/l，最优选地至少1mg/l。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述C2-C6α-羟基酸选自L-3-苯基乳酸和粘酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，另外向所述培养基添加植物蛋白质水解产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述植物蛋白质水解产物是小麦、大豆、棉花或豌豆蛋白质水解产物，或者这些水解产物的两种或更多种的混合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，向所述培养基添加选自以下各项的另外的一种或多种化合物：选自γ-谷氨酰基氨基酸、焦谷氨酰基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸、N-乙酰基-氨基酸以及甘氨酰基-甘氨酸的氨基酸衍生物；酚酸衍生物；直链C2-C6或环状C6糖醇；吡啶酸衍生物；以及选自尿嘧啶、腺嘌呤、3’-单磷酸腺苷(3’-AMP)和5’-单磷酸腺苷(AMP)的核碱基和/或核苷酸，或来自这些化合物组的化合物的组合，使得每种单独的化合物在所述培养基中的最终浓度为至少0.001mg/l，优选地至少0.01mg/l，更优选地至少0.1mg/l，最优选地至少1mg/l。
7.一种通过根据权利要求1-6中任一项所述的方法可获得的细胞培养基。
8.一种用于培养真核细胞的培养基，包含至少0.001mg/l，或至少0.02mg/kg的干物质的选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸和三羟基丁酸的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐，这些酸的酯以及它们的组合。
9.根据权利要求7或8所述的培养基，包含至少0.01mg/l，更优选地至少0.1mg/l，甚至更优选地至少1mg/l，最优选地至少5mg/l，或者至少0.2mg/kg，更优选地至少2mg/kg，甚至更优选地至少20mg/kg，最优选地至少250mg/kg的干物质的选自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、α-羟基异己酸和三羟基丁酸的一种或多种C2-C6α-羟基酸，这些酸的盐，这些酸的酯以及它们的组合。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的培养基，包含至多50g/l，优选地至多1g/l，更优选地至多100mg/l每种所述单独的组分，或者至多1000g，优选地至多20g，更优选地至多2g/kg的干物质的一种或多种所述C2-C6α-羟基酸、它们的酯、它们的盐或它们的组合，其中所述浓度是每种单独的组分。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的细胞培养基，以5mg/l至30g/l或100mg至600g/kg干物质，优选地5mg/l至3g/l或100mg至150g，更优选地250mg至60g/kg干物质的浓度的每种单独的组分，包含一种或多种所述C2-C6α-羟基酸、这些酸的盐、这些酸的酯以及它们的组合。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的培养基，所述培养基进一步包含选自维生素、矿物质、氨基酸、缓冲盐、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、糖、抗生素和蛋白质水解产物的培养基的一种或多种常规组分。
13.根据权利要求7-12中任一项所述的培养基，所述培养基进一步包含选自小麦、大豆、棉花或豌豆蛋白质的一种或多种水解产物。
14.根据权利要求7-13中任一项所述的培养基，所述培养基进一步包含选自以下各项的一种或多种化合物：由γ-谷氨酰基氨基酸、焦谷氨酰基氨基酸、包含谷氨酸或包含脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸、N-乙酰基-氨基酸和甘氨酰基-甘氨酸组成的氨基酸衍生物的组；酚酸衍生物；直链C2-C6或环状C6糖醇；吡啶酸衍生物；以及选自尿嘧啶、腺嘌呤、3’-单磷酸腺苷(3’-AMP)和5’-单磷酸腺苷(AMP)的核碱基和/或核苷酸，或来自这些化合物组的化合物的组合。
15.根据权利要求7-14中任一项所述的培养基，其中，所述氨基酸衍生物选自γ-谷氨酰基-酪氨酸、γ-谷氨酰基苯丙氨酸、环甘氨酰基-谷氨酸、缬氨酰基谷氨酸、5-氧代脯氨酸和β-丙氨酸。
16.根据权利要求7-15中任一项所述的培养基，其中，所述酚酸选自阿魏酸((E)-3-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)丙-2-烯酸)、丁香酸(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸)、香草酸(4-羟基-3-甲氧基苯甲酸)、芥子酸(3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)丙-2-烯酸)，这些酸的酯，或这些酸的盐，优选地，阿魏酸、丁香酸，这些酸的酯或这些酸的盐，这些酸的盐和这些酸的酯。
17.根据权利要求7-16中任一项所述的培养基，所述培养基包含选自手性肌醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨醇和葫芦巴碱的一种或多种化合物。
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