KR20220132559A - 미생물 유래 단백질 가수분해물, 그리고 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

미생물 유래 단백질 가수분해물, 그리고 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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존 에스. 리드
댄 이. 로버트슨
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에어 프로틴 인코포레이티드
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Abstract

화학독립영양성 미생물과 같은 미생물로부터 유래되는 단백질 가수분해물 조성물 및 이를 제조하고 사용하는 방법이 제공된다. 단백질 가수분해물 조성물은 생물기원 또는 대기 공급원으로부터 이산화탄소의 고정을 통해 지속 가능하게 생산될 수 있다. 단백질 가수분해물 조성물은 동물 세포의 무혈청 배양을 위한 배양 배지를 보충할 뿐만 아니라 세포 이러한 프로바이오틱스 및 유산균과 같은 다른 유형의 세포를 성장시키기 위한 용도에 이른다. 따라서, 본 개시내용은 제약 및 기능식품 적용뿐만 아니라 식품 성분 또는 제품으로서 인간 소비를 위한 세포를 배양하기 위한 지속 가능한 인도적인 방법을 제공한다.

Description

미생물 유래 단백질 가수분해물, 그리고 이의 제조 방법 및 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 1월 24일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/965,303호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
본 발명의 기술 분야
본 개시내용은 생물학적 공급원으로부터 생성된 단백질 가수분해물 및 이를 제조하는 방법의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 이산화탄소 배출을 포획하도록 설계된 생물학적 공정 및 기타 폐기물 탄소 전환 또는 전환 공정과 같은 재생 가능한 공급원으로부터의 단백질 가수분해물 생산에 관한 것이다. 본 개시내용은 프로바이오틱 미생물, 진핵생물 세포 및 바이타민 생산 세포를 포함하여 다른 미생물 또는 단일 세포의 성장을 지원하기 위한 단백질 가수분해물의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 동물 세포 배양을 포함한 육류-유사 제품의 생산, 예를 들어, 동물 성분이 없는 배지를 사용한 인공 고기의 생산을 위한 세포 배양 방법에 관한 것이다.
다양한 세포 배양 시스템이 작은 생체분자, 치료 항체 및 세포-기반 요법을 포함하는 유용한 생물학적 제품을 생산하는데 사용된다. 산업적 발효는 종종 더 높은 수준의 바이오매스 또는 발효 유래 제품을 생산할 수 있는 반 정의된(semi-defined) 배지 및 복합 배지에서 수행된다. 광범위한 영양을 제공하기 위해 펩톤, 단백질 가수분해물, 효모 추출물, 성장 인자 등과 같은 미정제 및 미확인 첨가제가 발효 배지에 첨가될 수 있다. 미생물 배지에 동물-유래 물질을 포함시키는 것은 오랜 역사를 가지고 있다. 전통적으로, 동물 세포를 배양하기 위한 배지는 세포 성장을 유지 및 촉진시키기 위해 동물 혈청 또는 동물-유래 단백질 가수분해물이 혼입되어 있다. 예를 들어, 동물 혈청은 영양, 호르몬, 성장 및 부착 인자, 미량 원소, 예컨대, 철, 완충 능력, 활성 산소 종과 기계적 전단에 대한 보호 및 기타 다양한 유익한 인자를 제공한다. 동물성 단백질 가수분해물은 질소 공급원의 역할을 하며, 펩타이드 및/또는 아미노산 및 바이타민을 제공한다.
동물 세포 배양물 또는 유산균(lactic acid bacteria: LAB) 배양물과 같은 세포 배양물의 성장에 대한 단백질 가수분해물의 유익한 효과는 잘 알려져 있으며, 이들은 수십 년 동안 유용한 세포 배양 첨가제로 사용되어 왔다. LAB는 아미노산을 합성하는 능력이 제한되어 있으며, 아미노산 및 펩타이드의 외인성 공급원에 의존한다. 결과적으로, 생화학적 질소 공급원(예를 들어, 단백질, 펩타이드 및 아미노산)의 제공은 LAB 배양물의 성장에 필수적이다. 아미노산의 전형적인 공급원은 우유 및 기타 가수분해된 단백질에서 발견되는 펩타이드이다. 다양한 기원으로부터의 단백질 가수분해물은 유기체의 성장을 지원하는 일부와 특정 유형의 아미노산 대사를 유도하는 또 다른 일부의 다양한 LAB 균주에 상이한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. LAB의 발효에 성공적으로 사용된 것으로 보고되는 다양한 상업적인 단백질 가수분해물 생성물은 N-Z 아민, Hy-Case, Hy-Soy, Edamin 및 N-Z-Case를 포함한다(Misono, H., Goto, N., & Nagasaki, S. (1985). Purification, crystallization and properties of nadp+-specific glutamate dehydrogenase from lactobacillus fermentum. Agricultural and Biological Chemistry. https://doi.org/10.1080/00021369.1985.10866676; Molskness, T. A., Lee, D. R., Sandine, W. E., & Elliker, P. R. (1973). -D-phosphogalactoside galactohydrolase of lactic streptococci. Applied Microbiology. https://doi.org/10.1128/aem.25.3.373-380.1973; Viniegra-Gonzalez, G., & Gomez, J. (1984). Lactic acid production by pure and mixed bacterial cultures. Bioconversion Systems. Boca Raton, FL; CRC Press. P, 17-39.; Vedamuthu, E. R. (1980). Method for diacetyl flavor and aroma development in creamed cottage cheese. 미국 특허 제4,191,782호; Kegel, M. A., & Wallace, D. L. (1989). Use of stabilizing agents in culture media for growing acid producing bacteria. 미국 특허 제4,806,479호).
트립톤(프로테이스 트립신에 의한 카세인의 소화 또는 카세인의 췌장 소화)은 야생형 및 유전자 변형 미생물을 성장시키기 위한 LAB 및 발효 배지에서 일반적인 성분이다. 재조합 DNA 기술의 출현과 바이오 의약품의 제조 및 생산으로의 이의 통합은 동물 유래 성분을 포함하는 배지에 대한 수요를 증가시켰다.
올리고펩타이드 및 유리 아미노산을 제공하는 단백질 가수분해물은, 예를 들어, 치료적 단백질의 생산을 위한 동물 세포 배양에서 널리 사용된다. 이들은 세포 밀도를 증가시키고, 더 높은 수율로 단백질 제품을 생성하는 것으로 보고되었다. 인간 성장 호르몬, 항생제, 인슐린 등과 같은 많은 상업적으로 제조된 제품이 소 공급원으로부터 유래된 영양 및 배지 성분에서 성장한 재조합 균주에 의해 생산된다.
야채에서 육류 및 우유에 이르기까지 다양한 공급원으로부터 생산되는 다양한 유형의 상업적으로 입수 가능한 가수분해된 단백질이 있다. 공급원의 예는 카세인, 유청 단백질, 탈지 우유, 우유 및 유청 단백질 단리물 및 농축물, 락트알부민, 육류 및 동물 조직, 콜라겐, 젤라틴, 옥수수, 면실, 대두박, 대두 단백질 단리물 및 농축물을 포함한다. 이러한 물질 중 일부는 다른 공정의 부산물이며, 매우 다양하다. 다른 경우에, 특정 단백질 공급원(예를 들어, 카세인 및 유청)은 상당히 일정한 아미노산 조성을 가질 수 있지만, 동일한 공급원으로부터의 다양한 단백질 가수분해물은 여전히 펩타이드 및 아미노산 프로파일에 상당한 변동이 있을 수 있다. 또한, 카세인, 육류, 젤라틴 및 대두 등과 같은 상이한 단백질 공급원은 총 아미노산 조성 및 단백질 구조가 서로 다르다. 유제품 가수분해물은 Glu, Ile, Leu, Val 및 Met와 같은 아미노산이 풍부한 반면, 육류/대두 가수분해물은 Arg, Cys, Gly 및 Pro가 상대적으로 더 풍부하다.
동물-유래 가수분해물은 역사적으로 락트알부민 가수분해물, 카세인 가수분해물 및 프리마톤을 포함하는 백신 및 생물학적 제제와 같은 의약품의 생산을 위한 세포 배양 영양 첨가제로서 사용된 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이러한 동물-유래 성장 보충물에는 단점이 있다. 혈청 및 단백질 가수분해물의 조성은 잘 정의되어 있지 않으며, 혈청의 공급은 배취간 변동이 있는 경향이 있다. 혈청은 동물 기원이기 때문에, 이는 프리온과 같은 외래성 인자 및 오염 물질에 의해 오염될 위험이 있다. 이는 세포 배양 공정으로부터 혈청을 제거하는 주요 동기였다. 동물-유래 성분의 사용으로 인한 전염성 해면상 뇌병증(transmissible spongiform Encephalopathy: TSE)과 같은 프리온 및 바이러스와 마이코플라스마와 같은 다른 외래성 인자에 대한 바이오 의약품 산업 및 규제 기관의 우려로 인해 배지로부터 동물-유래 성분이 제거되었다. 소 해면상 뇌병증(Bovine Spongiform Encephalopathy: BSE)의 출현 및 이에 따른 미국 식품의약국(Food and Drug Administration: FDA) 규제의 증가로 발효 배지에서 소 기원의 물질을 제거하려는 노력이 진행되고 있다. 혈청은 또한 생산하는데 비용이 많이 든다. 혈청 이용가능성, 혈청 프로테이스에 의한 표적 분자의 분해, 하류부문 제품 정제의 복잡성에 대한 영향, 잠재적 면역원성 및 기타 혈청-관련 인공물과 같은 기타 인자도 또한 우려된다. 또한, 생물학적 제품을 제조하기 위한 인도적이고 지속 가능한 방법의 사용에 대한 관심이 증가하고 있다. 예를 들어, 동물 성분이 없고, 지속 가능한 육류 제품을 배양하는 방법에 대한 관심이 증가하고 있다.
전통적으로, 포유동물 세포는 5% 내지 20%의 혈청 또는 혈청-유래 성분이 보충된 영양 혼합물(기초 배지)을 필요로 하였다. 소 태아 혈청(fetal bovine serum: FBS)이라고도 하는 송아지 태아 혈청(Fetal calf serum: FCS)은 호르몬(예를 들어, 인슐린), 성장 인자, 수송 단백질(예컨대, 트랜스페린 및 알부민), 영양소 및 부착 인자를 비롯한 배지 성분 물질의 풍부한 공급원이다. 혈청은 전통적으로 영양소, 호르몬, 성장 인자 및 프로테이스 저해제의 공급원으로서 성장 배지에 포함되었다. 이는 동물 세포의 부착 및 확산을 촉진하고, 기계적 손상 및 전단력에 대한 비특이적 보호를 제공하며, 독성 화합물과 결합하고, 배지의 완충 능력을 개선한다. 혈청 내 알부민 및 트랜스페린은 지질, 지방산, 호르몬 및 철과 같은 미량 원소의 운반체 역할을 한다.
동물 기원의 성분을 피하기 위하여, 배지, 사료 및 원료의 공급업체들은 식물 기원의 성분 또는 재조합 발현을 통해 제조된 것을 사용하는 배지를 개발하는 것으로 대응하고 있다. 단백질 가수분해물(예를 들어, 펩톤)은 수십 년 동안 다양한 포유동물 배양 공정에서 혈청 및 혈청 성분을 대체하는데 사용되었다. 개별적으로 또는 조합하여 사용되는, 예를 들어, 면실, 대두 또는 밀로부터의 식물-유래 단백질 가수분해물은 소정의 세포 배양 시스템에서 소 혈청에 대한 적절한 대안이 되는 것으로 밝혀졌다. 역사적인 제조 공정에서 인정받았던 동물 기원의 장기, 조직 및 단백질의 상대적으로 미정제인 용해물 및 추출물이 보다 재현 가능한 효모 및 식물-유래 대체물로 대체되고 있다. 많은 경우에, 우유 및 육류 가수분해물이 또한 식물 및 효모-유래 가수분해물로 대체되었다.
식물 유래 단백질 가수분해물은 올리고펩타이드, 유리 아미노산, 탄수화물, 바이타민, 미네랄, 예컨대, 포타슘, 칼슘, 철 및 미량의 미네랄, 지질, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 미량의 저분자량 성분 및 정의되지 않은 성분의 혼합물을 포함할 수 있다. 단백질 가수분해물은 세포 성장률, 재조합 단백질 분비 및 장기 세포 생존 능력을 모두 증가시킬 수 있다. 단백질 가수분해물은 영양소, 부착 성분 및/또는 성장 인자 유사체를 공급할 수 있다. 단백질 가수분해물은 치료적 재조합 단백질의 산업적 생산을 위한 무혈청 세포 배양 공정에서 핵심 배지 첨가제로 사용된다. 하이브리도마, 아프리카 녹색 원숭이 신장(VERO), 차이니즈 햄스터 난소(CHO), 인간 배아 신장(HEK), 아기 햄스터 신장(BHK) 및 배큘로바이러스-감염된 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 곤충 세포(Sf9)와 같은 산업적으로 중요한 세포 유형에 대한 식물-유래 가수분해물의 유익한 효과는 잘 문서화되어 있다. 단백질 가수분해물은 아미노산을 보다 효율적으로 사용하여 보다 효율적인 세포 대사를 자극하고, 종종 혈청으로 달성되는 것 이상으로 세포 대사를 개선하는 것으로 보고되었다.
그러나, 새로운 유형의 동물 성분이 없는 세포 배양 배지 보충물이 여전히 계속해서 필요하다. 일부 식물 유래 가수분해물은 소정의 적용에서 성능이 불량한 것으로 나타났다. 이전의 연구에서는 밀 글루텐 추출물 또는 유리 아미노산 함량이 높은 추출물이 시험관내에서 소정의 세포 유형에서 독성을 나타내거나 또는 독성 효과를 유발할 수 있으며, 동물 세포의 무세포계에서 단백질 합성을 저해할 수 있는 것으로 나타났다. 일부 식물-원천의 가수분해물에서 살충제 및 제초제 잔류물에 대한 우려가 있다. 상업적으로 성공적인 발효에 사용하기 위해서, 배지 성분은 저렴하고, 쉽게 구입할 수 있으며, 재현 가능한 품질이어야 한다. 불행하게도, 동물 및 식물 유래 단백질 가수분해물, 추출물 및 혈청을 포함한 많은 복합 영양소는 생물학적 공급원의 변화 및 지역, 기후 및 상이한 계절에 다른 이러한 물질의 변화로 인한 큰 불일치를 겪을 수 있다. 이러한 변화는 최종 발효 제품의 품질에 상당한 영향을 미쳐 결과 및 생산 손실에 상당한 변화를 초래할 수 있다. 보다 일관되고 지역적, 기후적 또는 계절적 변화에 영향을 받지 않는 용해물, 단백질 가수분해물 및 펩타이드 조성물과 같은 복합 영양소에 대한 요구가 있다. 보다 일관된 펩타이드 및 아미노산 프로파일을 갖는 단백질 가수분해물 생성물이 필요하다. 동물 유래 배지 영양 성분, 단백질 가수분해물 및 혈청을 포함하는 동물 유래 배지 성분의 대체물로서 비-동물 유래 단백질 가수분해물에 대한 요구가 있다. 배양 배지의 배취 및/또는 배양 배지 보충물 사이의 변동성을 최소화할 필요가 있다. 또한, 임의의 살충제, 제초제, 살균제, 호르몬 또는 항생제 잔류물이 없는 단백질 가수분해물에 대한 요구가 있다. 동물 유래 성분은 감염원을 포함할 수 있기 때문에, 최소한의 동물 유래 성분을 갖거나 또는 완전히 동물 성분이 없는 배지를 개발하는데 관심이 있다. 또한, 동물 유래 제품의 사용을 최소화하기 위한 윤리적 및 환경적 요구가 있다.
유기 탄소 공급원에서 발효에 의해 성장하거나 또는 화학독립영양적으로(chemoautotrophically) 성장한 미생물로부터 유래되는 단백질 가수분해물 조성물이 본 명세서에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 미생물은 다음과 같은 C1 탄소 공급원에서 성장한다: 탄소 공급원으로서 CO2에서의 화학독립영양성 성장; 탄소 공급원으로서 CO에서의 일산화탄소영양성(carboxydotrophic) 성장; 또는 탄소 공급원으로서 CH4 및/또는 CH3OH에서 메탄영양성(methanotrophic) 또는 메틸영양성(methylotrophic) 성장.
본 명세서에 기재된 단백질 가수분해물은 하나 이상의 동물-유래 세포 배양 성분, 예컨대, 아미노산, 단백질 가수분해물 또는 혈청의 부재하에 배양물에서 동물 세포의 증식, 유지, 번식 및/또는 분화를 촉진하기 위한 동물 성분 보충물의 전부 또는 일부를 대체하는 것으로서 적합하다. 예를 들어, 단백질 가수분해물은, 예를 들어, 동물 또는 무혈청 배지에서 동물 성분이 없는 보충물로 사용하기에 적합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 용해물 및/또는 가수분해물은 성장 촉진 펩타이드, 아미노산, 탄수화물, 지질, 미네랄 및/또는 바이타민을 제공할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 펩타이드는 다음 기능 중 하나 이상의 역할을 한다: 아미노산 공급원으로서(예를 들어, 유리 아미노산을 대체하거나 또는 보충함); 관심 바이오매스 및/또는 분자의 성장 및/또는 생산의 자극제로서; 전단 응력에 대한 세포의 보호. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 용해물 및/또는 가수분해물은 아미노산의 보다 효율적인 섭취 및 사용을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 메커니즘을 통해 보다 효율적인 세포 대사를 자극한다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물은 용해물 및/또는 가수분해물을 포함하지 않는 배양물과 비교하여 용해물 및/또는 가수분해물을 포함하는 배지에서 성장한 배양물에서의 성장률 및/또는 단백질 발현을 개선한다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물은 삼투-보호제 및/또는 항-세포자멸사 효과를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 효과를 통해 용해물 및/또는 가수분해물을 포함하는 배지에서 성장한 배양물의 성능을 개선한다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물은 전단 효과에 대한 보호를 돕는다. 소정의 실시형태에서. 용해물 및/또는 가수분해물은 세포의 부착 및/또는 후속 확산을 촉진한다.
본 개시내용은 배양된 동물 세포로부터 유래되는 소모성 육류 제품의 생산에 사용하기에 적합한 동물 성분이 없는 단백질 가수분해물을 포함한다. 또한, 본 개시내용은 육류-유사 및/또는 고단백 제품뿐만 아니라 다른 식품, 성분, 영양소 및 향료로 가공될 수 있는 "일반적으로 안전한 것으로 인식되는"(generally recognized as safe: GRAS) 유기체 및/또는 프로바이오틱 미생물의 성장에 적합한 동물 성분이 없는 단백질 가수분해물을 포함한다. 또한, 본 개시내용은 식물 또는 동물 마이크로바이옴의 유익한 구성원으로 간주되는 유기체의 성장에 적합한 동물 성분이 없는 단백질 가수분해물을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 식물 또는 동물이 인간이 사용하는 인간 식품 또는 동물 사료 또는 다른 식물-유래 또는 동물-유래 제품의 생산에 사용된다. 동물 성분이 없는 단백질 가수분해물은, 예를 들어, 양조장 또는 포도주 양조장에서 발효로부터 나오는 CO2 배출 가스(off gas)뿐만 아니라 대기 또는 일부 다른 천연 공급원으로부터 포획된 CO2와 같은 지속 가능하고 깨끗한 공급원으로부터의 CO2의 미생물 고정으로부터 지속 가능하게 생성될 수 있다.
본 개시내용의 단백질 가수분해물 조성물은 아미노산의 존재비, 펩타이드의 크기 분포, 상이한 펩타이드 서열의 존재비, 단백질 동일성 및 존재비, 지질 조성, 유기 중합체, 바이타민, 미네랄의 존재비 등에 의해 정의된다. 상이한 아미노산의 존재비, 펩타이드의 크기 분포, 펩타이드 서열의 존재비, 단백질 동일성 및 존재비, 지질 조성, 유기 중합체, 바이타민, 미네랄의 존재비 등 중 하나 이상을 특징으로 하는 단백질 가수분해물의 라이브러리가 본 명세서에 제공된다. 단백질 가수분해물 조성물은 가수분해물 조성물에 따라 동물 또는 미생물 세포 배양의 특정 양태(예를 들어, 증식, 번식, 발달, 분화)를 촉진하는데 적합할 수 있다.
본 개시내용은 생물촉진제(biostimulant) 성분을 포함하는 단백질 가수분해물 조성물을 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 생물촉진제는 식물 또는 진균 작물의 성능 또는 특성을 개선한다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 중합체와 같은 생물촉진제 폴리에스터를 포함한다. 일부 실시형태에서, PHA 중합체는 단백질 가수분해물 조성물이 유래되는 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 폴리하이드록시뷰티레이트(PHB)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 폴리하이드록시발레레이트(PHV)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 PHB 및/또는 PHV를 포함하는 공중합체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 PHB 또는 PHA 또는 PHV의 올리고머 또는 이들의 공중합체를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 올리고머는 각각의 PHB 또는 PHA 또는 PHV 함유 중합체의 가수분해에 의해 생성된다. 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 하이드록시뷰티레이트(HB) 또는 하이드록시발레레이트(HV) 단량체를 포함한다.
본 개시내용은 1종 이상의 바이타민을 포함하는 단백질 가수분해물 조성물을 포함한다. 바이타민은 단백질 가수분해물 조성물이 유래되는 화학독립영양성 미생물에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 1종 이상의 바이타민 B군, 예컨대, 바이타민 B1, 바이타민 B2 및/또는 바이타민 B12를 포함한다. 또한, 화학독립영양성 미생물 배양과 같은 미생물 배양으로부터 단백질 가수분해물 조성물을 생산하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 개시내용의 단백질 가수분해물의 조성은 배양에 사용되는 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물의 유형 및 균주, 성장 조건, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물을 배양하는데 사용되는 탄소 및/또는 에너지의 공급원, 단백질 가수분해물의 제조 방법, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물의 유전자 조작 등과 같은 다양한 제조 매개변수에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 화학독립영양성 미생물, 예를 들어, CO2와 같은 C1 탄소 공급원으로부터 탄소를 고정할 수 있는 임의의 적합한 화학독립영양성 미생물이다. 소정의 실시형태에서, CO2 고정은 H2 산화와 결합된다. 일부 실시형태에서, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물은 유전적으로 조작된다. 또는 다른 실시형태에서, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물은 유전적으로 조작되지 않으며, 자연 발생적 균주이거나 또는 유전 공학 이외의 하나 이상의 공지된 방법을 통해 생성된 돌연변이체 또는 변이체 균주이다.
단백질 가수분해물 조성물은 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물의 성장을 통해 생성된 바이오매스의 물리적, 화학적 및/또는 효소적 처리에 의해 제조될 수 있다. 물리적 처리는 바이오매스를 상승된 압력 및/또는 승온에 적용시키는 것을 포함한다. 화학적 처리는 바이오매스를 산성 또는 염기성 조건에 적용시키는 것을 포함한다. 효소적 처리는 엑소프로테이스 및/또는 서열-특이적 엔도프로테이스 및/또는 메탈로프로테이스를 이용한 단백질 분해를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 바이오매스를 제조 공정에 적용시킨 후 생물촉진제 성분 및/또는 바이타민을 유지한다.
또한, 배양 배지 보충물로서 본 개시내용의 단백질 가수분해물 조성물을 사용하여 동물 세포를 포함하는 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 단백질 가수분해물 조성물은 성장을 유지하고/하거나 배양에서 동물 세포의 발달 및 분화를 촉진하기에 적합한 배양 배지 영양소를 제공할 수 있다. 방법은 단백질 가수분해물을 배양 배지에 제공하는 단계 및 배양 배지에서 동물 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 단백질 가수분해물 조성물은 전형적으로 아미노산, 단백질 가수분해물 또는 혈청과 같은 동물성 공급원으로부터 유래되는 종래의 세포 배양 배지 중 하나 이상의 성분을 대체할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물이 보충된 동물 세포 배양 배지는 무혈청 배양 배지이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단백질 가수분해물 조성물이 보충된 세포 배양 배지는 비건(vegan) 배양 배지이다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물이 보충된 동물 세포 배양 배지를 포함하지만 이로 제한되지 않는 세포 배양 배지는 동물 성분이 없는 배양 배지이다. 일부 실시형태에서, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물로부터 생성된 용해물, 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물이 혈청과 함께 동물 세포 배양물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 용해물, 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 부착-의존성 세포의 성장에 사용된다. 다른 실시형태에서, 용해물, 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 부착-독립성 세포의 성장에 사용된다.
단백질 가수분해물 조성물은 치료 항체, 단백질 또는 소분자를 발현하기 위한 재조합 세포주 또는 세포-기반 요법을 위해 배양된 면역 세포를 포함하는 다양한 목적을 위한 세포를 배양하기 위한 배양 배지에서 사용하기에 적합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 인공 육류 또는 육류 대체 제품을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 육류 제품을 배양하기 위한 배양 배지에서 사용하기에 적합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 프로바이오틱 또는 바이타민 합성 미생물을 배양하기 위한 배양 배지에서 사용하기에 적합할 수 있다.
도 1은 제2 세포 배양을 위한 영양 배지 내에서 사용되는 제1 생물공정으로부터 영양소를 생산 및 추출하기 위한 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법의 개략도이다.
도 2는 CO2로부터 단백질이 풍부한 바이오매스를 화학독립영양적으로 생산한 다음, 단백질이 풍부한 바이오매스를 제2 세포 배양을 위한 영양 배지 내에서 이용되는 단백질 가수분해물로 전환시키기 위한 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법의 개략도이다.
도 3은 CO2로부터 단백질이 풍부한 바이오매스를 화학독립영양적으로 생산한 다음, 단백질이 풍부한 바이오매스를 동물 세포가 배양육(cultured meat), 즉, 전체 다세포 동물을 죽이지 않는 육류 제품을 생산하기 위해 성장하고 회수되는 동물 세포 배양을 위한 영양 배지 내에서 이용되는 단백질 가수분해물로 전환시키기 위한 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법의 개략도이다.
도 4는 CO2로부터 단백질이 풍부한 바이오매스를 화학독립영양적으로 생산한 다음, 단백질이 풍부한 바이오매스를 인간, 식물, 동물에 대한 프로바이오틱스 및/또는 유익한 미생물을 포함하는 미생물 배양을 위한 영양 배지 내에서 이용되는 단백질 가수분해물로 전환시키기 위한 본 개시내용의 실시형태에 따른 방법의 개략도이다.
도 5는 단백질 가수분해물(PH) 보충 없이 트리코데르마 아트로비리데(Trichoderma atroviride) 대조군의 성장과 비교하여, 탄소 공급원으로서 CO2에서 성장한 C. 네카토르(C. necator)로부터 생성된 PH가 보충된 배지에서 유익한 진균인 트리코데르마 아트로비리데의 성장을 보여준다.
미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물로부터 유래되는 단백질 가수분해물 조성물, 이의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 미생물-유래 단백질 가수분해물 조성물은 미생물 바이오매스로부터 생산될 수 있고, 배양에서 성장한 동물 세포에 대한 영양소 및 지원을 제공하기 위해 배지 보충물로서 사용될 수 있거나 또는 다른 진핵생물 및/또는, 예를 들어, 유산균(LAB) 및/또는 프로바이오틱스와 같은 원핵생물 세포를 위한 영양분으로 사용될 수 있다. 다른 식물-기반 또는 효모-기반 단백질 가수분해물과 마찬가지로, 본 발명의 미생물-유래 단백질 가수분해물은 혈청 또는 성장 인자와 같은 동물-유래 성분에 의존하지 않고, 진핵생물 세포(예를 들어, 동물 세포) 및/또는 원핵생물 세포(예를 들어, LAB 및/또는 프로바이오틱 세포)와 같은 세포를 증식, 분화 및/또는 발달시키기 위한 배양 배지를 보충하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학독립영양성 미생물은, 예를 들어, 양조장 또는 포도주 양조장에서 발효로부터 나오는 배출 가스, 또는 대기 또는 바다, 또는 지열 분출구 또는 온천과 같은 다른 천연 공급원으로부터 포획된 CO2와 같은 깨끗하고 지속 가능한 CO2 공급원으로부터 바이오매스를 생성하기 위해, 예를 들어, H2 산화와 결합된 CO2 고정에 의해 자가영양적으로(autotrophically) 배양될 수 있다. 화학독립영양성 미생물의 이용은 발효 배출 가스에서 천연 CO2 공급원, 산업용 연도 가스(flue gas), 바이오매스, 예를 들어, 농업 또는 임업 폐기물의 가스화에 이르기까지 생산을 위한 공급원료(feedstock)로서 탄소의 공급원을 선택할 때 광범위한 융통성을 가능하게 한다.
따라서, 본 개시내용은 동물 세포를 배양하고 동물성 단백질 및 기타 영양소로 식품을 생산하기 위한 인도적인 방법을 지원하는데 사용될 수 있는 단백질 가수분해물의 지속 가능한 공급원을 제공한다.
본 개시내용은 제1 미생물을 배양하여 바이오매스를 생산하는 단계; 제1 배양된 미생물에 의해 생성된 바이오매스를 처리하여 단백질이 풍부한 용해물 또는 단백질 가수분해물 조성물과 같지만 이들로 제한되지 않는 단백질이 풍부한 바이오매스 유래 생성물을 생산하는 단계; 및 단백질이 풍부한 영양소(예를 들어, 단백질이 풍부한 용해물 또는 단백질 가수분해물) 조성물을 제2 미생물 또는 세포를 포함하는 제2 배양을 위한 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법을 제공하되, 단백질이 풍부한 영양소(예를 들어, 단백질이 풍부한 용해물 또는 단백질 가수분해물) 조성물은 제2 미생물 또는 세포의 성장을 위한 영양 공급원의 역할을 한다. 소정의 비제한적인 실시형태에서, 제2 배양은 동물 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물은 육류 제품과 같은 식품을 배양하기 위한 배지 보충물로 사용되어 배양육과 같은 식품을 생산하는 지속 가능하고 인도적인 방법을 지원할 수 있다.
인간 소비에 적합하고, 육류의 특성을 근접하게 모방하며, 육류 대체물 또는 인공 육류 제품으로서 기능하는 신규한 단백질 조성물의 생산은, 예를 들어, 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 2020년 12월 30일자로 출원된 "HIGH PROTEIN FOOD 조성물"라는 명칭의 PCT 출원 PCT/US20/67555에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단백질 가수분해물 조성물은 일반적으로 PHA를 생성하지 않는 식물과 대조적으로, 세포 증식, 유지, 발달 및/또는 분화를 촉진하는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 중합체와 같은 생물촉진제 성분을 포함할 수 있다. 본 발명에서 생산된 PHA, PHA 올리고머 및 단량체는 영양소 및 생리활성 물질로서 작용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물은 배양 배지에 단백질 가수분해물이 보충될 때 세포 배양 성장, 발달 및/또는 분화를 촉진하고/하거나 배양된 식품의 영양가를 개선할 수 있는 바이타민 B1, B2 및/또는 바이타민 B12와 같지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 바이타민을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조된 가수분해물은 식물에 의해 합성되지 않으며 일반적으로 바이타민 B12와 같지만 이로 제한되지 않는 식물에서 상당한 양으로 존재하지 않는 고유 영양소를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물은 배양 배지에 제공될 때 배양된 식품의 풍미를 개선 또는 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물은 동물, 식물 및 효모 가수분해물 및 추출물과 비슷하거나 또는 더 우수한 영양적 이점을 갖는다.
본 개시내용은 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다수의 이점을 갖는 단백질 가수분해물, 용해물 및/또는 추출물을 제조하는 방법을 제공한다: CO2 및/또는 기타 C1 투입물의 단백질이 풍부한 바이오매스로의 화학독립영양성 전환을 시작하는 일관되고 완전히 정의된 초기 투입물; 조성의 일관성; 공간을 적게 차지하는 대규모 생산 능력; 농지 이동 없음; 식물-유래 또는 동물-유래 가수분해물과 비교하여 적은 물 사용. 본 개시내용의 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물, 용해물 및/또는 추출물의 생산에는 경작지가 필요하지 않다.
본 개시내용은 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 목적하는 분획이 풍부한 가수분해물을 생성하는 산, 염기 및 효소적 가수분해 방법을 제공한다: 이용 가능한 아미노산의 공급원으로 작용하거나, 또는 식물 또는 세포 건강에 특정한 효과를 발휘하는 펩타이드; 단백질 소화를 위한 아미노산 절단 서열-특이적 엔도프로테이스 또는 프로테이스 조합; 목적하는 길이의 펩타이드가 풍부한 가수분해물을 생성하도록 펩타이드 조성을 조절하는 것; 일부 배양된 동물 세포의 성장 및/또는 수율을 개선하는 약 2개 내지 약 10개의 아미노산 잔기의 잔기 분포를 갖는 펩타이드.
소정의 펩타이드는 식물, 동물 및 마이크로바이옴에 영향을 미치는 외부 분자 신호로 작용할 수 있다. 단백질 가수분해물은 뿌리 수준에서 식물에 영양소를 제공하거나 또는 토양 리조바이옴(rhizobiome)에서 유익한 미생물 균주를 자극하여 식물 성장 및 생산성을 간접적으로 촉진할 수 있다. 본 개시내용의 소정의 단백질 가수분해물, 용해물 및/또는 추출물은 질환 저항성 및/또는 영양소 흡수를 증가시키는 식물 또는 동물 마이크로바이옴 내의 유기체를 자극할 수 있다.
본 명세서에 개시된 단백질 가수분해물, 용해물 및/또는 추출물은 장을 통해 동물에게 영양소 및 생리활성 물질을 제공하거나 또는 장내 마이크로바이옴에서 숙주에 유익한 균주를 자극할 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 종래의 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학, 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며 일반적으로 사용되는 것들이다. 본 개시내용의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 종래의 방법에 따라, 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다.
문헌[Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second ed., John Wiley and Sons, New York (1994) 및 Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)]은 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 당업자에게 제공한다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 명세서에 기재된 방법, 시스템 및 조성물의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학 및 생화학의 종래의 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌, 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1994); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); 및 Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990)]에 충분히 설명되어 있다.
본 명세서에 제공된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여지고; 아미노산 서열은 각각 아미노에서 카복시 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다.
정의
단수는 문맥이 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함하며, 따라서 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수형은 명백하게 반대로 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
양, 시간적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하거나 또는 개시된 조성물과 관련하여 적절하기 때문에 명시된 값으로부터 ±5%, ±1% 또는 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
"아세토겐"은 혐기성 호흡의 산물로서 아세테이트 및/또는 최대 C4 사슬 길이의 기타 단쇄 유기산을 생성하는 미생물을 지칭한다.
"호산성 미생물(Acidophile)"은 고도의 산성 조건(일반적으로 pH 2.0 이하)하에서 번성하는 극한 미생물(extremophile) 유형을 지칭한다.
용어 "아미노산"은 알파-탄소로 지정된 탄소에 결합된 아민기와 카복실기를 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 적합한 아미노산은 제한 없이 자연 발생적 아미노산의 D- 및 L-이성질체뿐만 아니라 유기 합성 또는 기타 대사 경로에 의해 제조되는 비-자연 발생적 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 "아미노산"은 확장된 지방족 또는 방향족 백본 스캐폴드에 따라 이용 가능한 다중 측쇄 모이어티를 가질 수 있다. 문맥에서 달리 구체적으로 명시하지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 용어 아미노산은 아미노산 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 아미노산에 대한 표준 3-문자 약어가 본 명세서에서 사용되며, 예를 들어: Cys 시스테인; Gln 글루타민; Glu 글루탐산(글루타메이트); Gly 글리신; His 히스티딘; Ile 아이소류신; Leu 류신; Lys 라이신; Met 메티오닌; Phe 페닐알라닌; Pro 프롤린; Ser 세린; Thr 트레오닌; Trp 트립토판; Tyr 타이로신; Val 발린이다.
명세서 및 청구범위에서 사용되는 어구 "및/또는"은 결합된 요소, 즉, 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에 분리적으로 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 다른 요소는 반대로 명확하게 표시되지 않는 한 구체적으로 식별되는 요소와 관련이 있는지 여부에 관계없이 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별되는 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 한 실시형태에서, B 없이 A(선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, A 없이 B(선택적으로 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, A와 B 둘 모두(선택적으로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
용어 "바이오매스"는 세포의 성장 및/또는 번식에 의해 생성되는 물질을 지칭한다. 바이오매스는 세포 및/또는 세포내 내용물뿐만 아니라 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 세포외 물질을 포함할 수 있다.
용어 "생물반응기" 또는 "발효기"는 세포가 성장하고 유지되는 폐쇄되거나 또는 부분적으로 폐쇄된 용기를 지칭한다. 세포는 액체 현탁액에 있을 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 액체 현탁액에 유지되는 대신에, 세포는 고체 성장 지지 물질을 포함하지만 이로 제한되지 않는 또 다른 비-액체 기질과 접촉하거나, 그 위 또는 내부에서 성장하고/하거나 유지될 수 있다.
"생물촉진제" 또는 "생물-촉진제"는 배양 배지 및/또는 유기체에 제공되는 경우에 세포의 성장, 증식 및/또는 발달을 자극할 수 있는 화합물을, 접근 가능한 형태로 유기체에 섭취되거나 또는 그렇지 않으면 제공되는 경우에 유기체를 지칭한다.
용어 "탄소-고정" 반응 또는 경로는 CO2, CO 및 CH4를 포함하지만 이로 제한되지 않는 주위 조건하에 기체 형태의 탄소의 형태를 포함하는 C1 탄소 분자를 주위 조건하에서 액체 또는 고체이거나 또는 수용액에 용해되거나 또는 수용액 중 현탁액으로 유지되는 생화학적 분자를 포함하는 탄소-기반 생화학 물질로 전환하는 효소적 반응 또는 대사 경로를 지칭한다.
"탄소 공급원"은 미생물이 유기 생합성에 필요한 탄소를 취하는 분자 유형을 지칭한다.
"일산화탄소영양성 미생물(carboxydotrophic)"은 일산화탄소를 견디거나 이를 산화시킬 수 있는 미생물을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 일산화탄소영양성 미생물은 CO를 탄소 공급원 및/또는 생합성 및/또는 호흡을 위한 환원 전자의 공급원으로서 이용할 수 있다.
"화학독립영양성"은 화학적 전자 수용체(acceptor)에 의한 화학적 전자 공여체(donor)의 산화에 의해 에너지를 얻고, 유기체가 이산화탄소로부터 생존하고 성장하는데 필요한 모든 유기 화합물을 합성하는 유기체의 능력을 지칭한다.
청구범위뿐만 아니라 명세서에서, "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "보유하는(carrying)", "갖는(having)", "함유하는(containing)", "포함하는(involving)", "보유하는(holding)" 등과 같은 모든 전환 어구는 개방형, 즉, ~를 포함하지만 이로 제한되지 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 전환 어구 "~로 구성되는(consisting of)" 및 "~로 본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 만이 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 전환 어구일 것이다.
용어 "배양하는"은 액체 또는 고체 배지에서 증식, 번식, 유지, 발달 및/또는 분화에 적합한 조건하에 세포, 예를 들어, 미생물 세포 또는 동물 세포의 집단을 성장시키고 유지하는 것을 지칭한다.
용어 "~로부터 유래되는"은 "~로부터 기원하는", "~로부터 얻어지는", "~로부터 얻을 수 있는", "~로부터 단리되는" 및 "~로부터 생성되는"을 포함하며, 일반적으로 하나의 명시된 물질이 또 다른 명시된 물질에서 이의 기원을 찾거나 또는 또 다른 명시된 물질을 참조하여 설명될 수 있는 특징을 가짐을 나타낸다.
"에너지 공급원"은 호기성 호흡에서 산소에 의해 산화되는 전자 공여체 또는 혐기성 호흡에서 산화되는 전자 공여체와 환원되는 전자 수용체의 조합을 지칭한다.
"극한 미생물"은 지표면 또는 그 근처에서 발견되는 대부분의 생명체가 견딜 수 있는 지구 또는 해양 표면의 조건과 비교하여 물리적으로 또는 지구화학적으로 극한인 조건(예를 들어, 높거나 또는 낮은 온도, pH 또는 높은 염도)에서 번성하는 미생물을 지칭한다.
용어 "가스화"는 일반적으로 탄소-기반 물질을 합성 가스(synthesis gas), 합성가스(syngas) 또는 발생로 가스(producer gas)라고 하는 수소, 일산화탄소 및 이산화탄소를 포함하는 가스의 혼합물로 전환하는 고온 공정을 지칭한다. 공정은 일반적으로 탄소-기반 물질의 완전한 연소를 위해 불충분한 산소가 존재하도록 산소 및/또는 증기의 제어된 첨가와 함께 부분 연소 및/또는 외부적으로 생성된 열의 적용을 포함한다.
"호염성 미생물(halophile)"은 염 농도가 매우 높은 환경에서 번성하는 극한 미생물의 유형을 지칭한다.
"종속영양성(heterotrophic)"은 식물, 동물 또는 미생물과 같은 유기 물질을 흡수하고 대사함으로써 유기체를 성장시키고 유지하는 방식을 지칭한다. 유기체가 이산화탄소로부터 생존하고 성장하는데 필요한 모든 유기 화합물을 합성하지 않고 유기 화합물을 이용하는 경우, 성장은 종속영양성이다. 종속영양성 성장 동안, 유기체는 자신의 먹이를 생산할 수 없으며, 대신, 즉, 이산화탄소와 같은 무기 공급원으로부터 탄소를 고정하는 대신 식물 또는 동물과 같은 유기 물질을 섭취하고 대사하여 먹이와 에너지를 얻는다.
"수소-산화 미생물(Hydrogen-oxidizer)"은 세포내 환원 등가물의 생산 및/또는 호흡에서 전자 공여체로서 환원된 H2를 이용하는 미생물을 지칭한다.
"초고온성 미생물(Hyperthermophile)"은 전형적으로 약 60℃(140℉) 이상인 극도로 뜨거운 환경에서 일생 동안 번성하는 극한 미생물의 유형을 지칭한다.
용어 "크날가스(knallgas)"는 분자 수소와 산소 가스의 혼합물을 지칭한다. "크날가스 미생물"은 아데노신-5'-트라이포스페이트(ATP)와 같은 세포내 에너지 운반체의 생성을 위해 호흡에서 수소를 전자 공여체로 그리고 산소를 전자 수용체로 사용할 수 있는 미생물이다. 용어 "산수소(oxyhydrogen)" 및 "산수소 미생물"은 각각 "크날가스" 및 "크날가스 미생물"과 동의어로 사용될 수 있다. 크날가스 미생물은 일반적으로 NAD+(및/또는 기타 세포내 환원 등가물)의 환원에 이용되는 H2로부터 공여된 전자의 일부 및 호기성 호흡을 위해 사용되는 H2로부터의 전자의 일부와 함께 하이드로게네이스에 의해 분자 수소를 사용한다. 크날가스 미생물은 일반적으로 캘빈 회로(Calvin Cycle) 또는 역 시트르산 회로(reverse citric acid cycle)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 경로를 통해 자가영양적으로 CO2를 고정한다("Thermophilic bacteria", Jakob Kristjansson, Chapter 5, Section III, CRC Press, (1992)).
용어 "용해물"은 세포 용해로 인한 세포 내용물의 혼합물 및/또는 용액을 함유하는 액체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용해물은 농축된 용해물을 형성하기 위해 탈수되거나 또는 건조 고형물을 형성하기 위해 건조될 수 있다. 소정의 이러한 실시형태에서, 건조 용해물은 분말 형태이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 세포 용해물에서 화학물질 또는 화학물질의 혼합물의 정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포 용해물에서 아미노산 및/또는 단백질의 정제를 포함한다.
용어 "용해"는 상당한 양의 세포내 물질이 세포외 공간으로 탈출하도록 하는 세포의 원형질막 및 존재하는 경우 세포벽의 파열을 지칭한다. 용해는 전기화학적, 기계적, 삼투적, 열적 또는 바이러스 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 생물반응기의 내용물로부터 화학물질 또는 화학물질의 혼합물을 분리하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 또는 미생물의 용해를 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 생물반응기 또는 세포 성장 배지의 비단백질성성 내용물로부터 아미노산 또는 아미노산의 혼합물 및/또는 단백질 및/또는 펩타이드를 분리하기 위해 본 명세서에 기재된 세포 또는 미생물의 용해를 수행하는 단계를 포함한다.
"메테인생성 미생물(methanogen)"은 혐기성 호흡의 산물로서 메테인을 생성하는 미생물을 지칭한다.
"메틸영양성 미생물(Methylotroph)" 성장을 위해 탄소 공급원 및/또는 전자 공여체로서 메탄올 또는 메테인을 포함하는 환원된 1-탄소 화합물(one-carbon compound)을 사용할 수 있는 미생물을 지칭한다.
"메탄영양성 미생물(Methanotroph)"은 성장을 위해 탄소 공급원 및/또는 전자 공여체로서 메테인을 대사할 수 있는 미생물을 지칭한다.
용어 "미생물(microorganism)" 및 "미생물(microbe)"은 미시적인 단세포 생명체를 의미한다.
용어 "분자"는 하나 이상의 원자를 포함하는 임의의 별개의 또는 구별 가능한 물질의 구조적 단위를 의미하며, 예를 들어, 탄화수소, 지질, 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
"영양적으로 까다로운(nutritionally fastidious)" 균주는 복잡하거나 또는 특정한 영양적 요구사항을 갖는 유기체, 예를 들어, 특정 영양소가 존재할 때만 성장할 유기체를 지칭한다.
"올리고펩타이드"는 비교적 적은 수의 아미노산 잔기, 예를 들어, 약 2개 내지 약 20개의 아미노산을 포함하는 펩타이드를 지칭한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 "또는"은 위에서 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 구분할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것, 즉, 요소의 번호 또는 목록 중 하나 이상을 포함하지만 선택적으로 추가적인 목록에 없는 항목을 포함하는 것으로 해석될 것이다. "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같이 명확하게 반대되는 용어 또는 청구범위에서 사용되는 경우 "~로 구성되는" 만이 요소의 번호 또는 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 사용되는 용어 "또는"은 "둘 중 하나", "~중 하나", "~ 중 하나만" 또는 "~중 정확히 하나"와 같은 배타적인 용어가 앞에 오는 경우 배타적인 대안(즉 "하나 또는 다른 하나, 그러나 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로만 해석될 것이다. 청구범위에 사용되는 경우, "~로 본질적으로 구성되는"은 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 가질 것이다.
용어 "유기 화합물"은 탄소 원자를 포함하는 임의의 기체, 액체 또는 고체 화합물을 지칭하며, 무기로 간주되는 다음의 것들은 예외이다: 탄화물, 탄산염, 탄소의 단순 산화물, 사이아나이드 및 다이아몬드와 흑연과 같은 순수한 탄소의 동소체.
"펩타이드"는 사슬에 연결된 2개 이상의 아미노산으로 구성되는 화합물을 지칭하며, 각 산의 카복실기는 R-OC-NH-R' 유형의 결합에 의해 다음 아미노기에 연결되고 약 2개 내지 약 50개의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 및/또는 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 또는 이들의 유사체를 포함하는 리보뉴클레오타이드의 유사체 또는 변형된 형태를 포함하는, 임의의 길이 및 임의의 3차원 구조 및 단일-가닥 또는 다중-가닥(예를 들어, 단일-가닥, 이중-가닥, 삼중-나선 등)의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭한다. 유전자 코드가 축퇴되기 때문에, 특정 아미노산을 암호화하기 위해 하나 이상의 코돈이 사용될 수 있으며, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드가 뉴클레이스 저항성을 증가시키는 변형(예를 들어, 데옥시, 2'-O-Me, 포스포로티오에이트 등)을 비롯한 사용 조건하에서 목적하는 기능을 유지하는 한, 임의의 유형의 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 사용될 수 있다. 표지, 예를 들어, 방사성 또는 비방사성 표지 또는 앵커, 예를 들어, 바이오틴이 또한 검출 또는 포획을 목적으로 혼입될 수 있다. 용어 폴리뉴클레오타이드는 또한 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid: PNA)을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생적이거나 또는 비-자연 발생적일 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA, DNA 또는 이들 모두 및/또는 이들의 변형된 형태 및/또는 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 연결은 대안적인 연결기로 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(들)S("다이티오에이트"), (O)NR.sub.2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH.sub.2("폼아세탈")로 대체되는 실시형태를 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 여기서 각 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나, 또는 선택적으로 에터(--O--) 연결, 아릴, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 아르알딜을 포함하는 치환 또는 비치환된 알킬(1 내지 20 C)이다. 폴리뉴클레오타이드의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 폴리뉴클레오타이드는 선형 또는 원형일 수 있거나, 또는 선형 및 원형 부분의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "폴리펩타이드"는 아미노산으로 구성되고 당업자에 의해 단백질로 인식되는 조성물을 지칭한다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1-문자 또는 3-문자 코드가 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 예를 들어, 아미노산(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함)의 하나 이상의 유사체뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩타이드가 정의 내에 포함된다.
용어 "~에 대한 전구체" 또는 "~의 전구체"는 완성된 제품의 성분 중 하나 이상을 생산하기 위한 중간체이다.
용어 "프로바이오틱"은 섭취시 건강상의 이점을 제공하는 미생물, 예를 들어, 유익한 장내세균총(intestinal flora)을 지칭한다.
"발생로 가스"는 다양한 비율의 H2, CO 및 CO2를 함유하고, 표준 조건하에서 단위 부피당 천연 가스의 1/2에서 1/10 사이 범위의 열 값을 갖는 가스 혼합물을 지칭한다. 발생로 가스는 탄소-기반 공급원료의 가스화, 증기 개질 또는 자가 개질을 포함하여 다양한 공급원료에서 다양한 방식으로 생성될 수 있다. H2, CO 및 CO2 외에도, 발생로 가스는 생성 공정 및 공급원료에 따라 메테인, 황화수소, 응축성 가스, 타르 및 회분을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 혼합물에서 N2의 비율은 공기가 반응기에서 산화제로 사용되는지 여부와 반응을 위한 열이 직접 연소에 의해 또는 간접 열 교환을 통해 제공되는지 여부에 따라 높거나 낮을 수 있다.
용어 "생산하는"은 세포로부터 화합물의 분비를 포함하여 세포내 및 세포외에서의 화합물의 생산을 모두 포함한다.
"호저온성 미생물(Psychrophile)"은 차가운 온도, 전형적으로 약 10℃ 이하에서 성장하고 번식할 수 있는 극한 미생물의 유형을 지칭한다.
용어 "재조합"은 코딩 서열을 돌연변이시켜 변경된 폴리펩타이드를 생성하고, 코딩 서열을 또 다른 유전자의 코딩 서열에 융합시키고, 유전자를 상이한 프로모터의 제어하에 배치시키고, 유전자를 이종 유기체에서 발현시키고, 유전자를 감소되거나 또는 상승된 수준으로 발현시키고, 유전자를 이의 천연 발현 프로파일과 상이한 방식으로 조건부로 또는 구성적으로 발현시키는 등에 의해서와 같이 이의 서열 또는 발현 특성을 변경하도록 변형된 유전 물질(즉, 핵산, 이들이 암호화하는 폴리펩타이드 및 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 세포)을 지칭한다. 일반적으로 재조합 핵산, 폴리펩타이드 및 이에 기반한 세포는 자연에서 발견되는 관련 핵산, 폴리펩타이드 및 세포와 동일하지 않도록 인간에 의해 조작되었다. 재조합 세포는 또한 "조작된"으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "회수된", "단리된", "정제된" 및 "분리된"은 자연적으로 관련된 적어도 하나의 성분으로부터 제거되는 물질(예를 들어, 단백질, 핵산 또는 세포)을 지칭한다. 예를 들어, 이러한 용어는, 예를 들어, 온전한 생물학적 시스템과 같이 원래의 상태에서 발견되는 것과 같이 일반적으로 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭할 수 있다.
임의의 주어진 성분에 대해 어구 "실질적으로 없는"은 이러한 성분이 적어도 기능적으로 미미한 양으로만 존재, 즉, 임의의 공정 또는 제품의 의도된 성능 또는 기능에 크게 부정적인 영향을 미치지 않는 양으로만 존재한다는 것을 의미한다. 전형적으로, 실질적으로 없는은 이러한 성분의 중량을 기준으로 약 0.5% 미만을 포함하고, 약 0.1%를 포함하며, 또한 0%를 포함하는 약 1% 미만을 의미한다.
"황산화 미생물(Sulfur-oxidizer)"은 세포내 환원 등가물의 생산 및/또는 호흡에서 전자 공여체로서 H2S를 포함하지만 이로 제한되지 않는 환원된 황 함유 화합물을 이용하는 미생물을 지칭한다.
"합성가스(Synthesis gas)" 또는 "합성 가스(Synthesis gas)"는 발생로 가스와 마찬가지로 H2 및 CO를 포함하지만, 메탄올 또는 피셔-트롭쉬 디젤(fischer-tropsch diesel)과 같지만 이들로 제한되지 않는 특정 유형의 화학 제품의 합성을 위한 H2 및 CO 함량 및 불순물의 수준의 측면에서 보다 구체적으로 조정된 가스 혼합물의 유형을 지칭한다. 합성가스는 일반적으로 H2, CO 및 CO2를 주 성분으로 포함하며, 이는 메테인, 액체 석유 가스 또는 바이오가스의 증기 개질을 포함하는 확립된 방법을 통하거나; 또는 바이오매스, 폐유기물, 다양한 중합체, 토탄(peat) 및 석탄(coal)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 유기, 가연성, 탄소-기반 물질의 가스화를 통해 생성될 수 있다. 합성가스의 수소 성분은 합성가스 혼합물의 CO2 증가와 함께 가스 전환 반응에서 CO와 증기의 반응을 통해 증가될 수 있다.
"고온성 미생물(Thermophile)"은 전형적으로 약 45℃ 내지 약 122℃의 비교적 고온에서 일생 동안 번성하는 극한 미생물의 유형을 지칭한다.
"역가(Titer)"는 미생물 배양에서 단위 부피당 미생물에 의해 생성되는 물질의 양을 지칭한다. 예를 들어, 바이오매스 역가는 용액(예를 들어, 배양 배지)의 리터당 생성된 바이오매스의 그램으로 표현될 수 있다.
"바이타민"은 유기체의 성장 및/또는 영양에 필수적인 화합물, 예를 들어, 유기 화합물이며, 전형적으로 식이 또는 성장 또는 배양 배지에서 소량으로 요구된다.
본 명세서에 사용되는 "바이타머(vitamer)"는 기능적으로 서로를 대체하는데 효과적이고/이거나 바이타민의 결핍을 완화하는데 효과적인 특정 바이타민의 화학적 유사체를 지칭한다.
"야생형"은 자연에서 발생하는 미생물을 지칭한다.
"수율"은 모든 사료 물질이 제품으로 전환되는 경우 생산될 물질의 총량에 대한 사료 물질로부터 생산된 제품의 양을 지칭한다. 예를 들어, 아미노산 수율은 사료 물질의 100%가 아미노산으로 전환되는 경우 이론적인 수율에 대한 생산된 아미노산의 %로 표시될 수 있다.
단백질 가수분해물 조성물의 제조 방법
미생물 배양
소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 미생물 성장 및 이후에 단백질 가수분해물 조성물로 전환될 수 있는 바이오매스의 생성에 적합한 조건하에 생물반응기 또는 발효기에서 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 임의의 적합한 방법이 미생물을 배양하는데 사용될 수 있다. 미생물은 성장 및 바이오매스의 생산에 적합한 환경에서 임의의 적합한 조건하에 성장할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 독립영양성 배양 조건, 종속영양성 배양 조건 또는 독립영양성과 종속영양성 배양 조건의 조합에서 성장할 수 있다. 종속영양성 배양은 하나 이상의 당(예를 들어, 글루코스, 프럭토스, 수크로스 등)과 같은 탄소 및 에너지의 적합한 공급원을 포함할 수 있다. 독립영양성 배양은 일산화탄소, 이산화탄소, 메테인, 메탄올, 포메이트 및/또는 폼산과 같은 C1 화학물질 및/또는, 예를 들어, 탄소 공급원 및 에너지 공급원으로서 산수소 미생물 또는 수소-산화 미생물 또는 일산화탄소 산화 미생물에 의해 사용될 수 있는 상기 저가 탄소 공급원의 가스화, 부분적 산화, 열분해 또는 증기 개질을 통해 목질계 에너지 작물, 작물 잔류물, 버개스, 톱밥, 임업 잔류물 또는 식품과 같지만 이들로 제한되지 않는 탄소 및 에너지의 저가 공급원으로부터 생성되는 다양한 합성가스 조성물 또는 다양한 발생로 가스 조성물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 C1 화학물질을 포함하는 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 미생물을 배양하고 바이오매스를 생성하는 적합한 방법은, 예를 들어, PCT 출원 PCT/US2010/001402, PCT/US2011/034218, PCT/US2013/032362, PCT/US2014/029916, PCT/US2017/023110, PCT/US2018/016779 및 미국 특허 제9,157,058호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 일부 실시형태에서, 유기체는 생물반응기, 수경 재배 시스템(hydroponics system), 온실 또는 경작지에서 광합성에 의해서 성장할 수 있거나 또는 폐기물 또는 천연 공급원으로부터 수집될 수 있다.
미생물은 임의의 적합한 생물반응기 또는 발효기를 사용하여 배양될 수 있다. 적합한 생물반응기는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다: 공수 반응기(airlift reactor); 생물학적 스크러버 칼럼(biological scrubber column); 버블 칼럼(bubble column); 교반 탱크 반응기(stirred tank reactor); 연속 교반 탱크 반응기(continuous stirred tank reactor); 역류형, 상향류, 확장층 반응기(counter-current, upflow, expanded-bed reactor); 하수 및 폐수 처리 또는 생물적 환경 정화의 선행 기술에 공지된 것과 같은 침지기(digester) 및 특히 침지 시스템; 살수 필터(trickling filter), 회전식 생물학적 접촉기 필터(rotating biological contactor filter), 회전 디스크(rotating disc), 토양 필터(soil filter)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 필터; 유동층 반응기(fluidized bed reactor); 가스 리프트 발효기(gas lift fermenter); 고정화 균체 반응기(immobilized cell reactor); 루프 반응기(immobilized cell reactor); 막 생물막 반응기(membrane biofilm reactor); 패츄카 탱크(pachuca tank); 고정층 반응기(packed-bed reactor); 관형 반응기(plug-flow reactor); 정적 혼합기(static mixer); 세류층 반응기(trickle bed reactor); 및/또는 직립축 생물반응기(vertical shaft bioreactor).
일부 실시형태에서, 미생물은 합성가스, 발생로 가스, 테일 가스, 열분해 가스 또는 H2 및 CO2 및/또는 CO 가스 혼합물과 같지만 이들로 제한되지 않는 가스 탄소 및 에너지 공급원을 포함하는 화학독립영양성 성장에 적합한 배지에서 성장하고 유지된다. 화학독립영양성 CO2 고정에는 빛이 필요하지 않으며, 소정의 실시형태에서는 성장 환경에서 빛이 거의 없거나 또는 빛이 없다.
예시적이지만 비제한적인 실시형태에서, 영양 배지를 포함하는 생물반응기에 생산 세포가 접종된다. 일반적으로, 세포가 배가되기 시작하기 전에 유도기(lag phase)가 따를 것이다. 유도기 후, 세포 배가 시간(doubling time)은 감소하고, 배양은 대수 증식기(logarithmic phase)로 들어간다. 대수 증식기는 결국 이론에 의해 제한되지는 않지만 물질 전달 제한, 질소 또는 미네랄 공급원을 포함한 영양소의 고갈 또는 저해성 화학물질의 농도 증가 또는 미생물에 의한 쿼럼 감지(quorum sensing)로 인한 것으로 생각되는 배가 시간의 증가로 이어진다. 성장이 느려지고, 이후 배양이 정지기(stationary phase)에 들어갈 때 중단된다. 소정의 실시형태에서, 정지기 이전에 산술적 성장기(arithmetic growth phase)가 있다. 세포 덩어리(cell mass)를 수확하기 위해, 소정의 실시형태에서, 배양물은 대수 증식기 및/또는 산술기 및/또는 정지기에서 수확된다.
이산화탄소, 산소와 같은 용존 가스 및/또는 수소와 같은 다른 가스의 제어를 포함한 성장 조건뿐만 아니라 다른 용존 영양소, 미량 원소, 온도 및 pH가 생물반응기에서 제어될 수 있다. 소정의 실시형태의 경우, 단백질이 풍부한 세포 덩어리는 생물반응기 내의 액체 현탁액에서 높은 밀도로 성장하고/하거나 높은 생산성으로 성장한다.
영양 배지뿐만 아니라 가스는 배취 첨가로서, 또는 주기적으로, 또는 검출된 고갈 또는 프로그래밍된 설정점에 대응하여, 또는 배양물이 성장하고 유지되는 기간에 걸쳐 연속적으로 생물반응기에 첨가될 수 있다. 소정의 실시형태의 경우, 접종시 생물반응기는 성장 초기에 영양 배지 및/또는 1종 이상의 가스의 시작 배취로 채워지고, 접종 후 추가적인 영양 배지 및/또는 1종 이상의 가스는 첨가되지 않는다. 소정의 실시형태의 경우, 영양 배지 및/또는 1종 이상의 가스는 접종 후 주기적으로 첨가된다. 소정의 실시형태의 경우, 영양 배지 및/또는 1종 이상의 가스는 영양소 및/또는 가스의 검출된 고갈에 대응하여 접종 후 첨가된다. 소정의 실시형태의 경우, 영양 배지 및/또는 1종 이상의 가스는 접종 후 연속적으로 첨가된다.
소정의 실시형태의 경우, 첨가된 영양 배지는 임의의 유기 화합물을 포함하지 않으며, 예를 들어, 미생물에 의해 탄소 공급원으로서 대사될 수 있는 당 분자 또는 기타 유기 분자와 같은 유기 탄소 공급원을 포함하지 않는다.
소정의 실시형태에서, 소량의 미생물 세포(즉, 접종원)가 설정된 부피의 배양 배지에 첨가되고; 그런 다음 배양물이 인큐베이션되며; 세포 덩어리는 성장의 유지기, 대수 증식기, 감속기 및 정지기를 거친다.
회분식 배양(batch culture) 시스템에서, 미생물이 배양되는 조건(예를 들어, 영양 농도, pH 등)은 일반적으로 성장 기간 동안 연속적으로 변한다. 소정의 비제한적인 실시형태에서, 회분식 배양에 내재된 변동 조건을 피하고 배양 시스템의 전반적인 생산성을 개선시키기 위해, 단백질 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소의 생산에 사용되는 미생물은 케모스탯(chemostat)이라고 하는 연속 배양 시스템(예를 들어, 생물반응기 또는 다른 배양 용기에는 새로운 배지가 연속적으로 첨가되는 반면, 남은 영양소, 대사 최종 생성물 및 미생물을 포함하는 배양액은 배양 부피를 일정하게 유지하기 위해 동일한 속도로 연속적으로 제거됨)에서 성장한다. 소정의 실시형태에서, 단백질 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소의 생산에 사용되는 미생물은 터비도스탯(turbidostat)이라고 하는 연속 배양 시스템(예를 들어, 배양 용기의 탁도와 희석률 사이에 피드백이 있는 연속 미생물학적 배양 장치)에서 성장한다.
소정의 실시형태의 경우, 생물반응기는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 영양 배지의 혼합을 가능하게 하는 메커니즘을 갖는다: 회전 교반 막대, 블레이드, 임펠러 또는 터빈; 회전식(spinning), 왕복식(rocking) 또는 터닝(turning) 용기; 가스 리프트(gas lift), 스파징(sparging); 재순환 도관을 통해 용기 하단에서 상단으로 브로스의 재순환 후, 루프 및/또는 정적 혼합기를 통한 브로스의 재순환. 배양 배지는 연속적으로 또는 간헐적으로 혼합될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 미생물-함유 영양 배지는 부분적으로 또는 완전히, 주기적으로 또는 연속적으로 생물반응기로부터 제거될 수 있고, 소정의 실시형태에서, 대수 증식기 및/또는 산술적 성장기에서 세포 배양을 유지하고/하거나 성장 배지에서 고갈된 영양소를 보충하고/하거나 저해성 폐기물을 제거하기 위해 새로운 무세포 배지로 대체된다.
생물반응기에서 표준인 포트(port)는 가스, 액체, 고체 및/또는 슬러리를 및/또는 미생물을 둘러싸고 있는 생물반응기 용기 내로 및/또는 이로부터 전달 또는 회수하는데 이용될 수 있다. 많은 생물반응기가 다양한 목적을 위한 여러 포트(예를 들어, 배지 첨가, 가스 첨가, pH 및 용존 산소(DO)에 대한 프로브 및 샘플링을 위한 포트)를 가지며, 주어진 포트는 발효 실행 과정 동안 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 예로서, 포트는 한 시점에서는 생물반응기에 영양 배지를 첨가하는데 사용될 수 있고, 또 다른 시점에서는 샘플링을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플링 포트의 다중 사용은 성장 환경에 오염 또는 침입종을 도입하는 일 없이 수행될 수 있다. 샘플 흐름 또는 연속 샘플링의 제어를 가능하게 하는 밸브 또는 다른 액추에이터(actuator)가 샘플링 포트에 제공될 수 있다. 소정의 실시형태의 경우, 생물반응기에는 배지 또는 가스의 첨가를 포함하는 다른 용도를 추가적으로 제공할 수 있는 배양 접종에 적합한 적어도 하나의 포트가 장착된다. 생물반응기 포트는 배양 환경으로의 가스 조성물 및 유량을 제어할 수 있다. 예를 들어, 포트는 가스가 펌핑되는 생물반응기로의 가스 주입구로 사용될 수 있다.
일부 실시형태의 경우, 생물반응기로 펌핑될 수 있는 가스는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 합성가스, 발생로 가스, 열분해 가스, 수소 가스, CO, CO2, O2, 공기, 공기/CO2 혼합물, 천연 가스, 바이오가스, 메테인, 암모니아, 질소, 비활성 가스, 예컨대, 아르곤뿐만 아니라 기타 가스. 일부 실시형태에서, 시스템으로 펌핑되는 CO2는 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 공급원으로부터 나온 것일 수 있다: 유기물의 가스화로부터의 CO2; 생석회 CaO를 생산하기 위한 석회석 CaCO3의 소성(calcination)으로부터의 CO2; 암모니아, 메탄올 또는 수소 생산으로부터의 CO2 부산물과 같은 메테인 증기 개질로부터의 CO2; 연소(combustion), 소각 또는 연소(flaring)로부터의 CO2; 발효를 위해 사용된 당 및/또는 임의의 기타 유기 탄소 기질의 혐기성 또는 호기성 발효의 CO2 부산물; 메탄영양성 생물공정의 CO2 부산물; 일산화탄소영양성 생물공정의 CO2 부산물; 종속영양성 대사로부터의 CO2 부산물; 폐수 처리로부터의 CO2; 소듐 포스페이트 생산으로부터의 CO2 부산물; 지질학적으로 또는 지열로 생성되거나 또는 방출된 CO2; 산성 가스 또는 천연 가스로부터 제거된 CO2. 소정의 비제한적인 실시형태에서, CO2는 산업용 연도 가스로부터 제거되었거나 또는 그렇지 않으면 자연적으로 대기 중으로 방출될 지질학적 공급원으로부터 차단되었다. 소정의 실시형태에서, 탄소 공급원은 해수 또는 다른 지표수 또는 지하수에 용해된 CO2 및/또는 바이카보네이트 및/또는 카보네이트이다. 소정의 이러한 실시형태에서, 액상수(liquid water) 및/또는 고체에 용해된 무기 탄소가 생물반응기에 도입될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 탄소 공급원은 대기로부터 포획되는 CO2이다. 소정의 비제한적인 실시형태에서, CO2는, 예를 들어, 국제 우주 정거장(International Space Station: ISS)에서 이용되는 CO2 제거 어셈블리(CO2 removal assembly: CDRA)와 같지만 이로 제한되지 않는 장비를 사용하여 폐쇄-루프 생명 유지 시스템의 일부로서 폐쇄된 캐빈으로부터 포획되었다.
소정의 비제한적인 실시형태에서, 고농도의 에너지 공급원(예를 들어, H2, H2S, CO 가스) 및/또는 탄소 공급원(예를 들어, CO2, HCO3 -, CO3 2-)을 방출하는 지열 및/또는 열수 분출구와 같은 지질학적 특성 및/또는 다른 용존 미네랄이 본 명세서의 미생물에 대한 영양 공급원으로서 이용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 기체 전자 공여체 및/또는 탄소 공급원(예를 들어, 수소 및/또는 CO 및/또는 메테인 가스)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 이산화탄소 외에 또는 대안적인 탄소 공급원으로서 이산화탄소 대신에 1종 이상의 가스가 용액에 용해되어 배양 브로스에 공급되고/되거나 배양 브로스에 직접 용해된다. 소정의 실시형태에서, 주입 가스는 다른 가스 성분 및 합성가스의 불순물(예를 들어, 탄화수소); 암모니아; 하이드로겐 설파이드; 및/또는 다른 사워 가스(sour gas); 및/또는 O2; 및/또는 미네랄 함유 미립자 및 회분과 같지만 이들로 제한되지 않는 다른 전자 공여체 및/또는 전자 수용체 및/또는 탄소 공급원 및/또는 미네랄 영양소를 포함할 수 있다.
가스를 활용하는 미생물을 보유하는 반응기 시스템을 통과한 후, 소정의 실시형태에서, 잔류 가스는 생물반응기로 다시 재순환되거나, 또는 공정 열을 위해 연소되거나, 또는 타오르거나, 지하에 주입되거나 또는 대기로 방출될 수 있다. 전자 공여체로서 H2를 이용하는 본 발명의 소정의 실시형태에서, H2는 배양 배지를 통해 버블링함으로써 또는 액체 배양 배지와 접하는 당업계에 공지된 수소 투과성-물 침투 저지용 막을 통해 확산시킴으로써 배양 용기에 공급될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 이산화탄소, 일산화탄소, 메테인, 메탄올, 폼알데하이드, 포메이트 또는 폼산과 같지만 이들로 제한되지 않는 C1 분자 및/또는 다양한 가스화, 열분해 또는 증기-개질된 고정된 탄소 공급원료로부터 생성된 다양한 합성가스 조성물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 C1 분자를 포함하는 혼합물이 탄소 공급원으로서 미생물에 의해 이용되며, 다음 조건 중 하나 이상의 조건하에 더 긴 사슬 유기 분자(즉, C2 이상, 일부 실시형태에서, C5 또는 더 긴 탄소 사슬 분자)로 생화학적으로 전환된다: 호기성, 미호기성, 무산소성, 혐기성 및/또는 통성(facultative) 조건. 일부 실시형태에서, 기체 CO2는 탄소 공급원으로서 미생물에 의해 이용되며, 호기성, 미호기성, 무산소성, 혐기성 및/또는 통성 조건하에 더 긴 사슬 유기 분자(즉, C2 이상, 일부 실시형태에서, C5 또는 더 긴 탄소 사슬 분자)로 전환된다. 일부 실시형태에서, H2는 전자 공여체로 사용되고, O2는 탄소 고정 및 C1 탄소 분자를 더 긴 사슬 유기 분자로 전환하기 위한 전자 수용체로 사용된다. 일부 실시형태에서, H2는 전자 공여체로 사용되고, O2는 화학독립영양성 탄소 고정 및 CO2를 더 긴 사슬 유기 분자로 전환하기 위한 전자 수용체로 사용된다.
소정의 실시형태에서, 유기 탄소 공급원은 세포 대사에서 탄소 및/또는 환원 전자의 공급원으로 사용된다. 소정의 실시형태에서, 이러한 성장 및 대사는 종속영양성 또는 혼합영양성(mixotrophic)이다.
소정의 실시형태에서, 다음 매개변수 중 하나 이상이 생물반응기에서 모니터링되고/되거나 제어된다: 폐기물 수준; pH; 온도; 염도; 용존 산소; 용존 이산화탄소 가스; 액체 유량; 교반 속도; 가스 압력. 소정의 실시형태에서, 화학독립영양성 성장에 영향을 미치는 작동 매개변수는 센서(예를 들어, 전자 공여체/수용체 농도를 측정하기 위한 용존 산소 프로브 또는 산화-환원 프로브)로 모니터링되고/되거나 구동 밸브, 펌프 및 교반기를 포함하지만 이로 제한되지 않는 장비의 사용을 통해 센서로부터의 피드백을 기반으로 수동 또는 자동으로 제어된다. 소정의 실시형태에서, 유입되는 브로스뿐만 아니라 유입되는 가스의 온도는 냉각기, 히터 및/또는 열교환기와 같지만 이들로 제한되지 않는 시스템에 의해 조절된다.
일부 실시형태에서, 미생물에 의해 생성된 아미노산 분자의 단백질 생산 및 분포는 다음 중 하나 이상을 통해 최적화된다: 생물반응기 조건의 제어, 영양소 수준 및/또는 세포의 유전자 변형의 제어. 소정의 실시형태에서, 아미노산, 또는 단백질, 또는 기타 영양소 또는 전세포 생성물에 대한 경로는 특정 성장 조건(예를 들어, 질소, 산소, 인, 황, 미량의 미량영양소, 예컨대, 무기 이온, 및 존재하는 경우 일반적으로 영양소 또는 에너지 공급원으로 간주되지 않는 임의의 조절 분자의 수준)을 유지함으로써 화학적 생성물의 생산을 위해 제어되고 최적화된다. 소정의 실시형태에서, 용존 산소(dissolved oxygen: DO)는 미생물의 요구조건에 따라 호기성, 미호기성, 무산소성, 혐기성 또는 통성 조건에서 브로스를 유지함으로써 최적화될 수 있다. 통성 환경은 수주(water column)의 층화에 의한 호기성 상층과 혐기성 하층 또는 O2 함유 가스에 노출된 영역과 O2 함유 가스에 노출되지 않은 영역의 공간적 분리에 의한 호기성 또는 미호기성 영역과 혐기성 영역의 공간적 분리를 포함하는 것으로 여겨진다.
일부 실시형태에서, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물은 미생물에 의한 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 예를 들어, 폴리하이드록시뷰티레이트(PHB) 및/또는 폴리하이드록시발레레이트(PHV)의 축적에 도움이 되는 조건하에 성장한다. 일부 실시형태에서, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물은 PHA(예를 들어, PHB; PHV)의 축적을 야기하는 질소 또는 인의 제한하에서와 같은 1종 이상의 영양소의 제한하에 성장한다. 일부 실시형태에서, H2/CO2 및/또는 합성가스 상에서 성장한 미생물, 예컨대, 화학독립영양성 미생물은 PHB 및/또는 PHV와 같은 PHA를 세포 바이오매스에 축적한다. 일부 실시형태에서, PHA(예를 들어, PHB; PHV)는 중량 기준으로 미생물 바이오매스의 약 50% 이상, 중량 기준으로 약 60% 이상 또는 약 70% 이상으로 축적된다.
소정의 실시형태에서, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물은 미생물에 의한 바이타민 B군, 예를 들어, 바이타민 B1, 바이타민 B2 및/또는 바이타민 B12 중 하나 이상과 같지만 이들로 제한되지 않는 바이타민의 생산을 촉진하는 조건하에 성장한다. 일부 실시형태에서, 미생물은 바이타민 B1, 바이타민 B2 및/또는 바이타민 B12와 같은 1종 이상의 바이타민을 생산하기 위해 화학독립영양적으로 성장할 수 있다.
배양된 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물에 의해 생성된 바이오매스는 임의의 적합한 방법을 사용하여 수확될 수 있고, 그런 다음 단백질 가수분해물이 수확된 바이오매스로부터 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오매스는 적합한 방법을 사용하여 액체 배지로부터 분리된다. 적합한 방법은 제한 없이 원심분리; 응집; 부유; 막, 중공 섬유, 나권형 또는 세라믹 필터 시스템을 사용한 여과; 진공 여과; 접선 유동 여과; 정화; 침강; 하이드로사이클론을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 미생물 세포 덩어리가 매트릭스 상에 고정화될 수 있는 경우, 중력 침강 또는 여과를 포함하지만 이로 제한되지 않는 방법에 의해 수확되고, 스크래핑 또는 액체 전단력에 의해 성장 기질로부터 분리될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 수확된 미생물 세포는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 잘 알려진 방법을 사용하여 용해물을 제조하기 위해 파괴 개방(broken open)될 수 있다: 볼 밀링, 캐비테이션 압력, 초음파처리, 균질화 또는 기계적 전단. 일부 실시형태에서, 바이오매스의 세포는 하나 이상의 동결-해동 주기, 용해 효소, 세제, 용매 또는 항생제에 의해 용해될 수 있다.
일부 실시형태에서, 수확된 바이오매스는 공정 단계 또는 단계에서 건조될 수 있다. 바이오매스 건조는 소정의 실시형태에서, 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다: 원심분리, 드럼 건조, 증발, 동결 건조, 가열, 분무 건조, 진공 건조 및/또는 진공 여과. 소정의 실시형태에서, 폐열이 바이오매스의 건조에 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 탄소 공급원으로 사용되는 연도 가스의 산업적 공급원으로부터의 열 폐기물이 바이오매스의 건조에 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 전자 공여체 및/또는 C1 탄소 공급원의 생성으로부터의 열 부산물이 바이오매스의 건조에 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 가스화, 메테인 스트림 개질, 자가 개질 또는 부분적 산화로부터의 열 부산물이 건조 바이오매스의 건조에 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 바이오매스는 유용한 생화학 물질의 분리 및 생산을 돕기 위해 건조 후 또는 선행 건조 단계 없이 추가로 처리된다. 소정의 실시형태에서, 이러한 추가적인 처리는 미생물 바이오매스로부터 단백질 또는 지질 내용물 또는 바이타민 또는 핵산 또는 다른 표적 생화학 물질의 분리를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질의 분리는 다음 중 하나 이상과 같지만 이들로 제한되지 않는 지질을 추출하기 위한 비극성 또는 극성 용매를 사용함으로써 수행될 수 있다: 헥세인, 사이클로헥세인, 도데케인, 에틸 에터, 알코올(메탄올, 아이소프로판올, 에탄올 등), 트라이뷰틸 포스페이트, 초임계 이산화탄소, 트라이옥틸포스핀 옥사이드, 암모니아, 2차 및 3차 아민, 프로페인, 아세톤, 프로필렌 카보네이트, 다이클로로메테인 또는 클로로폼. 소정의 실시형태에서, 다른 유용한 생화학 물질이 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 용매를 사용하여 추출될 수 있다: 클로로폼, 다이클로로메테인, 아세톤, 에틸 아세테이트, 프로필렌 카보네이트 및 테트라클로로에틸렌. 소정의 실시형태에서, 세포 용해가 유용한 생화학 물질의 분리 및 생산을 위해 수행된다.
일부 실시형태에서, 미생물 바이오매스의 적어도 일부에 대해 단백질 가수분해가 수행되지 않으며, 생성물은 미생물 세포의 용해물이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물에 적용되는 분리 또는 건조 단계가 없으며, 용해물 및/또는 가수분해물은 가용성 및 불용성 성분의 미정제 혼합물이다. 소정의 이러한 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물은 투명하지 않고/않거나 탁하다. 일부 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물에 적용되는 고체-액체 분리 단계가 있어 가용성 제품 및 불용성 부산물이 생성된다. 소정의 실시형태에서, 가용성 용해물 또는 가수분해물 생성물은 투명하고/하거나 탁하지 않다. 소정의 실시형태에서, 용해물 또는 가수분해물은 한외여과를 통과한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 한외여과는 약 10,000 이하의 분자량 컷오프를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물은 다음 하류 공정 중 하나 이상을 거친다: 원심분리; 플레이트 및 프레임 여과; 미세여과; 한외여과; 나노여과; 이온 교환 크로마토그래피. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물은 하나 이상의 등급의 탄소를 포함하는 필터를 통과한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 탄소는 용해물 및/또는 가수분해물로부터 색을 제거한다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 용해물 및/또는 가수분해물의 여과액은, 예를 들어, 염 함량을 낮추기 위해 이온 교환 크로마토그래피를 통과한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 용해물 및/또는 가수분해물은 또 다른 세포 배양물의 성장을 위해 사용하기 전에 멸균 여과를 통과한다.
소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 이의 여과액은 다음 중 하나 이상을 사용하여 농축된다: 강하막 증발기(falling film evaporator); 상승막 증발기(rising film evaporator); 막 증류, 나노여과; 역삼투압.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 추출물 및/또는 농축물 및/또는 단리물 중 하나 이상이 산업적 발효 및/또는 탈수된 배양 배지 및/또는 세포 배양 적용에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 고분자량 물질을 제거하기 위해 한외여과를 거친다. 소정의 실시형태에서, 이러한 한외여과의 생성물을 포함하는 배지에서 성장한 세포 배양물은 여과되지 않은 등가물에서 성장한 세포 배양물보다 성능이 뛰어나다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 중 하나 이상이 배양에서 동물 세포의 성장에 사용된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 동물 세포는 포유동물이다. 소정의 실시형태에서, 세포 배양물은 육류-유형 제품을 형성하는데 사용되는 단백질 및/또는 조직을 생성하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물을 사용하여 성장한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 육류-유형 제품은 인간 소비를 위해 생산된다.
소정의 실시형태에서, 세포 배양은 하나 이상의 의약품을 생산하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물을 사용하여 성장한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자는 영양 및/또는 바이오 의약품의 생산을 위해 원핵생물 세포와 같은 다양한 천연 또는 재조합 세포의 성장에 사용되는 배지에서 하나 이상의 동물-유래 성분을 대체한다. 소정의 실시형태에서, 이러한 천연 또는 재조합 원핵생물은 다음 중 1종 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes); 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.); 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans). 소정의 실시형태에서, 의약품은 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 세팔로스포린 및 세파마이신과 같지만 이들로 제한되지 않는 항생제; 항응고제; 혈액 인자; 백신; 다당류 백신; 재조합 백신; 재조합 단백질; 항체; 인터류킨-11, 인간 과립구 콜로니-자극 인자(Human granulocyte colony-stimulating factor: hG-CSF)와 같지만 이들로 제한되지 않는 사이토카인; 융합 단백질; 성장 인자; 인터페론; 응고 인자; 인간 성장 호르몬, 인슐린, 고나도트로핀-방출 호르몬, 인간 부갑상선 호르몬과 같지만 이들로 제한되지 않는 호르몬; 단일클론 항체; 핵산; 인간 조직 플라스미노겐 활성인자와 같지만 이로 제한되지 않는 치료적 효소; 섬유소용해성 효소; 형질전환 성장 인자-α-슈도모나스 외독소 융합 단백질(TGF-α-PE40), 인간 표피 성장 인자(Human Epidermal Growth Factor: hEGF)와 같지만 이들로 제한되지 않는 치료적 단백질. 소정의 실시형태에서, 세포 배양물은 재조합 단백질을 생산하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물을 사용하여 성장한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 배지 성분(예를 들어, 미생물 용해물 및/또는 가수분해물)을 사용하여 생산된 단일클론 항체는 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 허셉틴; 레미케이드, 리툭산, 시나지스. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 또는 가수분해물은 소태아 혈청(FCS)을 포함하는 혈청 또는 혈청 유래 성분의 대체물에 사용된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 PHB 및/또는 하이드록시뷰티레이트 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 다음 중 1종 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 다른 유기체 또는 세포(예를 들어, 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 PHB 및/또는 하이드록시뷰티레이트 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 유래되는 미생물과 상이한 1종 이상의 유기체 또는 세포)에 공급된다: 악티노마이세테스(Actinomycetes), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 후미가테스(fumigates), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis), 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 대장균(E. coli), 대장균 균주 B, 대장균 균주 C, 대장균 균주 K, 대장균 균주 W, 스트렙토마이세스 리비단스, 스트렙토마이세스 뮤리누스(Streptomyces murinus), 트리코데르마 아트로비리데, 트리코데르마 코닌지이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 후미콜라 라누기노세(Humicola lanuginose), 뮤코르 미에헤이(Mucor miehei), 리조뮤코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 로도코커스 오파쿠스(Rhodococcus opacus), 293 세포, 3T3 세포, BHK 세포, CHO 세포, COS 세포, Cvl 세포, HeLa 세포, MDCK 세포, P12 세포, VERO 세포.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 PHB 및/또는 하이드록시뷰티레이트 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 다음 중 1종 이상의 속의 구성원을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 다른 유기체 또는 세포(예를 들어, 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 PHB 및/또는 하이드록시뷰티레이트 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 유래되는 미생물과 상이한 1종 이상의 유기체 또는 세포)에 공급된다: 아스퍼질러스, 바실러스, 크리소스포리움(Chrysosporium), 에세리키아(Escherichia), 후사리움(Fusarium), 후미콜라, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 락토바실러스(Lactobacillus), 뮤코르, 마이셀리오프토라(Myceliophtora), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 파네로카에테(Phanerochaete), 피키아(Pichia), 플레우로투스(Pleurotus), 슈도모나스, 리조뮤코르, 로도코커스, 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스테노트로파모나스(Stenotrophamonas), 스트렙토마이세스, 트라메테스(Trametes), 트리코데르마, 야로위아(Yarrowia).
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 PHB 및/또는 하이드록시뷰티레이트 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 다음 중 1종 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 식물에 유익하고/하거나 식물 마이크로바이옴 및/또는 근권의 유익한 구성원이고/이거나 유익한 토양 유기체인 1종 이상의 다른 유기체 또는 세포(예를 들어, 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 PHB 및/또는 하이드록시뷰티레이트 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 유래되는 미생물과 상이한 1종 이상의 유기체 또는 세포)에 공급된다: 트리코데르마 아트로비리데; 아조스피릴룸 브라실렌세(Azospirillum brasilense), 브라디리조비움 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum) 및/또는 수지상 균근 진균(Arbuscular mycorrhizal fungi)을 포함하는 균근 진균.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 PHB 및/또는 하이드록시뷰티레이트 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 다음 중 1종 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 다른 유기체 또는 세포(예를 들어, 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 PHB 및/또는 하이드록시뷰티레이트 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 유래되는 미생물과 상이한 1종 이상의 유기체 또는 세포)에 공급된다: 고세균 세포, 그람-음성 세균 및/또는 그람-양성 세균을 포함하는 세균 세포, 사상성 진균 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 동물 세포, 식물 세포, 효모 세포.
소정의 실시형태에서, 다음 중 하나 이상과 같지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 미생물 또는 화학 제품의 생산을 위한 영양 공급원으로서 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 PHB 및/또는 하이드록시뷰티레이트 및/또는 바이타민 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 세포 배양물에 제공된다: 다당류, 지질, 바이오디젤, 뷰탄올, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올, 프로페인, 알케인, 올레핀, 방향족, 지방 알코올, 지방산 에스터, 알코올; 1,3-프로페인다이올, 1,3-뷰타다이엔, 1,3-뷰테인다이올, 1,4-뷰테인다이올, 3-하이드록시프로피오네이트, 7-ADCA/세팔로스포린, ε-카프로락톤, γ-발레로락톤, 아크릴레이트, 아크릴산, 아디프산, 아스코르베이트, 아스파테이트, 아스코르브산, 아스파르트산, 카프로락탐, 카로티노이드, 시트레이트, 시트르산, DHA, 도세탁셀, 에리트로마이신, 에틸렌, 감마 뷰티로락톤, 글루타메이트, 글루탐산, HPA, 하이드록시뷰티레이트, 아이소펜텐올, 아이소프렌, 아이소프레노이드, 아이타코네이트, 아이타콘산, 락테이트, 락트산, 라노스테롤, 레불린산, 라이코펜, 라이신, 말레이트, 말론산, 펩타이드, 오메가-3 DHA, 오메가-3 EPA, 오메가-3 ALA, 오메가 지방산, 오메가-7 지방산, 오메가-7 풍부-오일, 파클리탁셀, PHA, PHB, 폴리케타이드, 폴리올, 프로필렌, 피롤리돈, 세린, 소르비톨, 스타틴, 스테로이드, 석시네이트, 테레프탈레이트, 테르펜, THF, 고무, 왁스 에스터, 중합체, 상품 화학물질, 산업적 화학물질, 특수 화학물질, 파라핀 대체물, 첨가제, 영양 보충물, 기능 식품, 의약품, 약제학적 중간체, 개인 위생 제품; 상업적인 효소, 항생제, 아미노산, 바이타민, 바이오 플라스틱, 글리세롤, 제트 연료, 디젤, 가솔린, 옥테인.
H2 및/또는 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4를 포함하는 가스 공급원료로부터 단백질, 아미노산 및 기타 영양소의 생산을 위한 화학독립영양성 미생물의 용도는, 예를 들어, 2017년 3월 18일자로 접수된 "MICROORGANISMS AND ARTIFICIAL ECOSY줄기S FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN, FOOD, AND USEFUL CO-PRODUCTS FROM C1 SUBSTRATES"라는 명칭의 국제 특허 출원 PCT/US17/23110에 기술되어 있다. 이 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
H2 및/또는 CO2 및/또는 CO 및/또는 CH4 를 포함하는 가스 공급원료로부터 식물, 동물 및 인간 영양소의 생산을 위한 화학독립영양성 미생물의 용도는, 예를 들어, 2018년 2월 4일자로 출원된 "VEGAN NUTRIENTS, FERTILIZERS, BIOSTIMULANTS, AND SY줄기S FOR ACCELERATED SOIL CARBON SEQUESTRATION"라는 명칭의 PCT 출원 PCT/US2018/016779호에 기술되어 있으며, 이는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
미생물 공급원으로부터 단백질 가수분해물의 생산은, 예를 들어, 2020년 9월 15일자로 출원된 "MICROBIAL PROTEIN HYDROLYSATE 조성물 AND METHODS OF MAKING SAME"라는 명칭의 PCT 출원 PCT/US20/50902에 기술되어 있으며, 이는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
소정의 비제한적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물은 약 25% 내지 약 50%의 고형물로 농축된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 건조 단계는 약 25% 내지 약 50%의 고형물로 농축된 후에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물은 펌핑 가능한 농축물 형태이다. 소정의 이러한 실시형태에서, 펌핑 가능한 용해물 및/또는 가수분해물은 약 25% 내지 약 60%의 고형물이다. 다른 이러한 실시형태에서, 펌핑 가능한 용해물 및/또는 가수분해물은 약 60% 이상의 고형물이다. 소정의 실시형태에서, 농축된 용해물 및/또는 가수분해물은 미생물학적으로 안정적이기에 충분히 낮은 수분 활성을 갖는다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 여과액 및/또는 이의 상청액 및/또는 농축물은 임의의 더 큰 입자를 제거하기 위해 카트리지 필터를 통해 펌핑된다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 여과액 및/또는 이의 상청액 및/또는 농축물은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 방법에 의해 건조된다: 분무 건조기; 롤러 드럼 건조기; 동결건조.
소정의 실시형태에서, 1회 이상의 탈지(defatting) 단계가 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 가수분해물에 대해 수행된다. 소정의 실시형태에서, 1회 이상의 탈지 단계는 제품에서 지질다당류(LPS)의 함량을 제거하거나 또는 감소시킨다. 소정의 실시형태에서, 1회 이상의 여과 또는 한외여과 단계가 용해물 및/또는 가수분해물에 대해 수행된다. 소정의 실시형태에서, 1회 이상의 여과 또는 한외여과 단계는 제품에서 LPS의 함량을 제거하거나 또는 감소시킨다. 소정의 실시형태에서, 한외여과 단계는 100킬로달톤(kD) 이하, 또는 50kD 이하, 또는 25kD 이하, 또는 20kD 이하, 또는 10kD 이하 또는 5kD 이하의 분자량 컷-오프를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 1회 이상의 탈지 단계 및/또는 1회 이상의 여과 또는 한외여과 단계에서 제거되거나 또는 감소된 LPS는 엔도톡신이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 다음 중 하나 이상을 제공할 수 있다: 성장 촉진 펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 펩타이드; 아미노산; 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및/또는 핵산; 탄수화물; 지질; 포타슘(K), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg), 철(Fe), 망가니즈(Mn) 및 미량 미네랄과 같지만 이들로 제한되지 않는 미네랄; 바이타민; 및/또는 다른 미량 저분자량 성분. 소정의 실시형태에서, 펩타이드는 세포 배양에서 성장 및/또는 생존 인자로서 기능할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 추출물은 또 다른 배양물 및/또는 컨소시엄 및/또는 마이크로바이옴을 위한 뉴클레오타이드(RNA 및 DNA 전구체)의 공급원으로서 기능하고/하거나 뉴클레오타이드는 생물반응기 내로 그리고/또는 본 명세서에 개시된 바와 같이 단백질 및/또는 바이오매스를 생산하는데 사용되는 미생물로 다시 재순환된다. 소정의 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 혼합영양성 성장 및/또는 생산에서 CO2 탄소 공급원과 함께 이용된다.
소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하지 않는 배지와 비교하여, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하는 배지에서 성장한 세포의 배양에서의 성장률 및/또는 단백질 발현을 개선한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 조성물이 포함된 배양물에서 다음 매개변수 중 하나 이상을 개선한다: 성장률; 생산성 비율; 및/또는 장기 생존 능력. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 기질 상에 세포의 부착 및 확산을 촉진시킴으로써 접착성 피브로넥틴-유사 활성을 전달하거나 또는 이를 촉진한다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 삼투-보호제 및/또는 항-세포자멸사 효과를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 효과를 통해 조성물(들)을 포함하는 배지에서 성장된 배양물의 성능을 개선한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 동물 세포를 위한 동결보존 용액에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 배아 동결 배지에 사용된다. 소정의 상기 실시형태에서, 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 동결 및/또는 해동 단계 동안 세포 및/또는 배아 생존을 개선한다.
일부 실시형태에서, 바이오매스는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 중합체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 단백질 가수분해물 조성물의 생산 이전, 도중 또는 이후에 생분해성 폴리에스터를 추출 및/또는 정제하기 위해 처리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오매스는 폴리하이드록시뷰티레이트(PHB)를 포함하는 중합체 생성물을 추출하기 위해 처리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오매스는 폴리하이드록시발레레이트(PHV)를 포함하는 중합체 생성물을 추출하기 위해 처리될 수 있다. PHA 또는 PHB 또는 PHV 중합체는 임의의 적합한 방법을 사용하여 바이오매스로부터 추출될 수 있다. 일부 실시형태에서, PHA 또는 PHB 또는 PHV 중합체는 바이오매스를 클로로폼, 메탄올, 메틸렌 클로라이드, 1,2-다이클로로에테인, 다이클로로메테인, 다이에틸 석시네이트, 아세톤, 헥세인, 프로필렌 카보네이트, 아이소프로판올 및 에탄올 중 1종 이상과 같은 용매와 혼합함으로써 먼저 추출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오매스는 용매와 혼합되기 전에 (예를 들어, 균질화에 의해) 용해된다. 추출은 임의의 적합한 온도에서 수행될 수 있고, 실온 내지 150℃ 이상의 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추출은 바이오매스를 용매와 혼합한 후 수성상 및 유기상을 분리하는 것을 포함한다. 상 분리는 원심분리와 같지만 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추출은, 예를 들어, 혼합물을 냉각시키고/시키거나 역용매(예를 들어, 헥세인)을 혼합물에 첨가하는 것에 의한 PHA 또는 PHB 또는 PHV의 침전을 포함한다. 추출은 바이오매스-용매 혼합물로부터 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추출 후, 추출된 물질은 추출된 물질을 비-극성 지질은 용해되지만 PHA 또는 PHB 또는 PHV는 용해되지 않는 헥세인과 같은 제2 용매와 혼합함으로써 추가로 정제된다. 제2 용매는 혼합 후에 제거될 수 있다. PHA 또는 PHB 또는 PHV 중합체를 추출하는데 적합한 방법은, 예를 들어, 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Fei, et al. (2016) "Effective recovery of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) biopolymer from Cupriavidus necator using a novel and environmentally friendly solvent system" Biotechnol Prog. 32(3):678-85; Ujang, et al. (2009) "Recovery of Polyhydroxyalkanoates (PHAs) from Mixed Microbial Cultures by Simple Digestion and Saponification" Malaysia: University Teknology, Institute of Environmental and Water Resource Management, 8-15]에 기술되어 있다.
단백질 가수분해물 조성물의 제조
미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 배양물로부터 생성된 바이오매스는 본 개시내용의 양태에 따라 단백질 가수분해물을 생산하기 위해 가수분해될 수 있다. 가수분해는 미생물 바이오매스에 적용되는 물리적, 화학적 및 효소적 처리(들) 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있다. 생성된 단백질 가수분해물(예를 들어, 펩톤, 펩타이드, 가수분해된 단백질)의 품질은 출발 원료, 사용된 가수분해제, 공정 매개변수 및 가수분해 정도를 포함하는 인자에 의해 정의된다. 가수분해 정도는 일반적으로 아미노 질소/총 질소(AN/TN) 비로 정의된다. 단백질 소화를 위한 다른 방법은 아미노산 및 펩타이드를 상이한 정도의 가수분해(DH%)로 방출한다. 이러한 방출된 펩타이드의 크기 및 아미노산 조성은 단백질 가수분해물을 공급받는 유기체의 성장률 및 바이오매스 수율에 영향을 미칠 수 있다. 특정 단백질 가수분해물의 생물학적 가치는 아미노산의 전체 수준뿐만 아니라 이의 형태(즉, 올리고펩타이드, 다이- 및 트라이-펩타이드 또는 유리 아미노산)에 의해 결정된다. 상이한 상업적인 단백질 가수분해물은 상이한 DH%와 총 단백질 함량을 갖는다.
소정의 비제한적인 실시형태에서, 미생물 바이오매스는 미생물(예를 들어, 세균) 단백질을 유리 아미노산 및/또는 짧은 펩타이드로 가수분해할 수 있는 적어도 하나의 효소로 가수분해된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질의 제어된 소화는 첨가된 프로테이스 및/또는 프로테이스와 펩티데이스의 혼합물을 사용하여 수행된다. 소정의 실시형태에서, 다양한 특성을 가진 여러 상업적으로 이용 가능한 단백질분해성 효소가 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질을 소화하는데 사용된다. 다른 비제한적인 실시형태에서, 외인성 효소는 가수분해 공정에 사용되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 정제된 효소로 가수분해하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 효소 및 효소가 제조된 배지의 혼합물로 가수분해하는 것을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 식물 및/또는 동물 및/또는 세균 및/또는 고세균 및/또는 진균 기원의 효소로 가수분해하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 식물, 동물, 세균, 고세균 및/또는 진균 기원 중 1종 이상의 효소(들)의 혼합물로 가수분해하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 비-동물 효소가 이용된다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해에 사용된 효소는 동물성 공급원(예를 들어, 돼지 췌장으로부터 유래된 트립신)으로부터 유래되지 않았다. 소정의 실시형태에서, 프로테이스뿐만 아니라 비단백질성분해성 하이드롤레이스가 사용되며, 이는 원료, 예를 들어, 미생물 바이오매스, 예를 들어, 화학독립영양성 바이오매스의 중합된 비단백질성 분획의 주요 성분을 유리시킬 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 세균 세포는 1종 이상의 프로테이스, 리페이스 및/또는 아밀레이스로 가수분해될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 세균, 식물, 진균, 고세균 및/또는 동물 기원의 1종 이상의 단백질분해성 효소(들)를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 방법은 가수분해를 위한 1종 이상의 알칼리성 프로테이스 및/또는 산성 프로테이스 및/또는 중성 프로테이스의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소적 가수분해는 1종 이상의 엑소프로테이스의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소적 가수분해는 서열 특이적 엔도프로테이스를 포함한 1종 이상의 엔도프로테이스의 사용을 포함한다. 적합한 엔도프로테이스는 제한 없이 세린 프로테이스, 아스파르트산 프로테이스, 메탈로프로테이스 및 시스테인 프로테이스를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 판크레아틴, 파파인, 브로멜라인, 피신, 세균 프로테이스, 진균 프로테이스, 바실러스 종 알칼레이스 2.4L, 바실러스 B. 리케니포르미스 및/또는 서브틸리신 칼스버그(Subtilisin carlesberg)에 의해 생성된 중성 프로테이스, B. 렌투스로부터의 에스퍼레이스, B. 퀘아밀로리퀴파쿠스(B. amyloliquifacus)로부터의 누트레이스, 바실러스 종으로부터의 프로타멕스, B. 써모프로테오라이티쿠스(B. thermoproteolyticus)로부터의 테롤리신/테롤레이스, 아스퍼질러스 오리자에로부터의 플라보자임, 아스퍼질러스 종 프로테이스 2A, B. 서브틸리스로부터의 프로테이스 N, B. 서브틸리스 뉴트레이스, 트립신, 키모트립신, 케라티네이스, 펩신, 서브틸리신 및/또는 렌닌으로부터 선택되는 적어도 1종의 효소로 가수분해하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소적 가수분해는 여러 프로테이스를 순차적으로 또는 동시에 사용하여 바이오매스에서 단백질을 가수분해하는 것을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 펩톤 또는 트립톤이 본 명세서에 기재된 1종 이상의 미생물로부터 단리된 바이오매스 및/또는 단백질로부터 제조된다. 소정의 실시형태에서, 췌장 소화물 또는 트립신 소화물이 본 발명의 1종 이상의 미생물로부터 단리된 바이오매스 및/또는 단백질로부터 제조된다. 소정의 실시형태에서, 재조합 프로테이스는 가수분해 처리에 이용된다. 소정의 실시형태에서, 재조합 프로테이스는 고유한 절단 특이성 및/또는 보다 균질한 가수분해물을 제공한다.
미생물 바이오매스를 효소적으로 가수분해하는 것은 효소와 미생물 바이오매스를 적합한 조건하에 적합한 양으로 배합하는 것을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해의 압력, 온도, pH 및 시간 조건은 최대 또는 적합한 수준의 효소 활성이 달성되는 조건이다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해를 수행하는 것은 바이오매스의 질소 함량 100g당 약 0.1g 내지 약 10g 범위의 중량비로 효소와 미생물 바이오매스를 배합하는 것을 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 효소적 가수분해는 아조카세인 검정을 사용하여 약 70,000 유닛의 활성을 갖는 0.05부피% 내지 0.5부피% 농도의 효소 스톡 용액을 사용하여 수행된다. 다양한 예시적 실시형태에서, 미생물 바이오매스의 효소적 가수분해의 효율을 개선하기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 효소와 미생물 바이오매스를 배합하고, 배합된 효소와 미생물 바이오매스를 임의의 적합한 방법에 의해 교반하는 것을 포함한다. 효소적 처리는, 예를 들어, 온도 제어 및 교반이 있는 반응기와 같은 임의의 적합한 장치에서 수행될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 효소는 특정 펩타이드 결합에서 단백질을 절단하는데 이용된다. 예를 들어, 펩신은 아미노산 중 적어도 하나가 방향족 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌; 트립토판; 또는 타이로신)인 단백질의 아미노산 사이의 아마이드 연결에서 소화할 것이다. 소정의 실시형태에서, 펩신은 방향족 아미노산과 관련된 아마이드 결합을 절단하는데 이용된다.
위에 나타낸 바와 같이, 가수분해는 임의의 적합한 조건하에서 수행될 수 있지만, 다양한 예시적 실시형태에서, 가수분해는 약 2 내지 약 10의 범위의 pH에서 수행될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 pH 약 4 내지 약 12의 범위 내에 속하는 pH 조건하에서 수행된다. 다른 실시형태에서, 가수분해는 약 5 내지 약 9.5, 또는 pH 약 6 내지 약 8 또는 약 pH 7의 pH 범위 내에서 수행된다. 소정의 특정 실시형태에서, pH 값은, 예를 들어, 암모니아, 암모늄 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 칼슘 옥사이드 또는 포타슘 포스페이트와 같은 염기를 첨가함으로써 효소적 가수분해 동안 일정하게 유지되며, 다른 실시형태에서, pH는 인산, 황산 또는 탄산(즉, CO2)과 같은 산을 첨가함으로써 유지된다. 다양한 예시적 실시형태에서, 가수분해는 약 15.5℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 2시간 내지 약 120시간 범위의 기간 동안 수행될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 약 10℃ 내지 약 80℃ 범위의 온도 조건하에서, 다른 실시형태에서, 약 10℃ 내지 약 65℃ 또는 약 10℃ 내지 약 55℃ 범위의 온도하에서 수행된다. 가수분해를 위해 사용되는 pH, 온도 및 기간은 사용되는 특정 효소(들) 및 목적하는 가수분해 정도(예를 들어, 펩타이드의 크기 분포)에 따라 달라질 수 있다.
소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해를 수행하는 것은 촉매의 존재하에 효소를 미생물 바이오매스와 접촉시키는 것을 포함한다. 불균일 촉매, 균일 촉매 및/또는 전기촉매와 같이 효소 또는 효소들의 효율을 개선시키는 임의의 촉매가 사용될 수 있다. 소정의 이러한 실시형태에서, 촉매는 철, 구리, 코발트, 니켈, 붕소, 마그네슘, 칼슘 및 란타넘과 같지만 이로 제한되지 않는 희토류 금속 중 적어도 하나를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 전류가 인가되는 동안 효소를 미생물 바이오매스를 접촉시키는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 미생물 바이오매스를 효소적으로 가수분해하기 전 및/또는 도중에 전류로 미생물 바이오매스를 처리하는 것을 포함한다. 전류는 임의의 적합한 방법에 의해 임의의 적합한 조건하에서 미생물 바이오매스에 인가될 수 있다. 다양한 예시적 실시형태에서, 전류는 약 1분 내지 약 60분의 기간 동안 약 2V 내지 약 120V의 양으로 인가된다.
본 발명의 방법의 다양한 예시적 실시형태는 미생물 바이오매스를 효소적으로 가수분해하기 전에 전처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 효소를 이용한 미생물 단백질 가수분해의 효율은 다양한 전처리 방법을 사용함으로써 개선될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해를 수행하는 것은 미생물 바이오매스를 효소적 가수분해 전에 산 또는 염기로 처리하는 것을 포함한다. 다양한 예시적 실시형태에서, 산성 전처리는 염산, 황산, 인산 또는 탄산(즉, CO2)과 같지만 이로 제한되지 않는 산을 사용하여 바이오매스를 포함하는 현탁액의 pH를 약 3 내지 약 5로 떨어지는 범위로 조정함으로써 수행된다. 소정의 실시형태에서, 산성 전처리는 약 0.25시간 내지 약 10시간 동안 약 100℃ 내지 약 130℃의 온도에서 수행될 수 있다. 다양한 예시적 실시형태에서, 염기성 전처리는 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 암모니아 하이드록사이드, 칼슘 옥사이드 또는 암모니아와 같지만 이로 제한되지 않는 염기를 사용하여 바이오매스 현탁액의 pH를 약 9 내지 약 14, 예를 들어, 약 11 내지 약 13을 포함하여 약 10 내지 약 13으로 조정함으로써 수행된다. 소정의 실시형태에서, 염기성 전처리는 약 0.25시간 내지 약 10시간 동안 약 100℃ 내지 약 130℃의 온도에서 수행될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 미생물 바이오매스를 효소적 가수분해 전 및/또는 동안 초음파 진동으로 처리하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 효소적 가수분해는 효소적 가수분해 전에 미생물 바이오매스를 초임계 물 및/또는 초임계 이산화탄소로 처리하는 것을 포함한다.
소정의 실시형태는 "원-포트(one-pot)" 공정을 통해 가수분해물 또는 유기 효소 추출물을 얻는 방법을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 표현 "원-포트"는 절차가 중간 분리 단계 없이 수행됨을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 미생물 바이오매스를 포함하는 세포 브로스의 물리적 처리는 상 분리 없이 초대기압 및 고온에서 발생하며, 여기서 세포 브로스는 효소적 가수분해를 거치기 전에 농축 염기로 처리된다. 소정의 실시형태에서, 바이오매스 현탁액은 소정의 비제한적인 실시형태에서, (a) 농축 염기를 미생물 세포 현탁액에 첨가하여 이의 pH를 조정하는 단계; (b) (a) 단계에서 얻어진 혼합물을 초대기압 및 고온에 적용하는 단계; 및 (c) (b) 단계에서 얻어진 혼합물을 효소적 가수분해 처리하여 유기 효소 추출물을 얻는 단계를 포함하는 일종의 "원-포트" 공정을 거친다. 소정의 실시형태에서, (a) 단계의 알칼리 처리는 암모늄 하이드록사이드, 암모니아, 포타슘 하이드록사이드 및/또는 칼슘 하이드록사이드 중 1종 이상으로부터 선택되는 염기와 같은 적합한 염기를 사용한다. 소정의 비제한적인 실시형태에서, 약 28중량%의 암모늄 하이드록사이드가 사용되며, 기타 약 10M의 포타슘 하이드록사이드가 사용된다.
소정의 실시형태에서, 브로스의 알칼리 처리 후, 혼합물의 물리적 처리는 초대기압 및/또는 고온에서 수행된다. 하나의 특정한 비제한적인 실시형태에서, 약 102㎪ 내지 약 141㎪의 압력이 (b) 단계에서 승온에서 인가된다. 일부 특정 실시형태에서, 약 90℃ 내지 약 140℃의 온도가 물리적 처리에 사용된다. 일부 특정 실시형태에서, 약 102㎪ 내지 약 141㎪의 압력이 (b) 단계에서 약 90℃ 내지 약 140℃의 온도에서 인가된다. 이러한 물리적 처리는, 예를 들어, 오토클레이브와 같은 당업자에 의해 선택되는 임의의 적합한 장치에서 수행된다.
소정의 실시형태에서, 효소적 처리는 물리적 처리 후에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 물리적 처리 후 및 효소적 처리 전, 농축 염기 및/또는 산이 첨가되어 처리되는 혼합물이 사용되는 효소에 대해 최적의 pH 값을 갖는다. 소정의 실시형태에서, (c) 단계의 효소적 가수분해에서 사용되는 1종 이상의 효소는 세균, 식물, 진균, 고세균 또는 동물 기원의 단백질분해성 효소이다. 특정 실시형태에서, (c) 단계의 효소적 가수분해는 약 2시간 내지 약 48시간 동안 약 40℃ 내지 약 70℃의 온도 및 약 8 내지 약 11의 pH에서 수행된다. 소정의 실시형태에서, 원-포트 공정은 공정 단순성을 증가시키고/시키거나 비용을 줄이고/줄이거나 다중-포트 공정보다 오염이 적다.
효소의 도움 여부에 관계없이 미생물 바이오매스의 가수분해는 충분한 열 및 압력 조건과 함께 산 또는 알칼리 가수분해의 적용을 통해 달성될 수 있다. 소정의 비제한적인 실시형태에서, 미생물 바이오매스를 가수분해하는 것은 산 가수분해를 수행하는 것을 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 산 가수분해는 미생물 세포를 포함하는 조성물의 pH를, 예를 들어, 황산, 염산, 인산, 탄산, 붕산, 아세트산, 프로피온산 및 시트르산으로부터 선택되는 적어도 하나의 작용제와 같은 산으로 조정하는 것을 포함한다. 다양한 예시적 실시형태에서, 산 가수분해는 미생물 바이오매스 크림의 pH를 약 0.5 내지 약 5의 pH로 조정함으로써 수행된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 산 가수분해는 미생물 바이오매스를 포함하는 현탁액의 pH를 조정하고, pH-조정된 현탁액을 적합한 기간, 예를 들어, 약 10분 내지 약 48시간 동안 적합한 온도, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 200℃의 온도로 가열하는 것을 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 산 가수분해는 미생물 바이오매스를 포함하는 현탁액의 pH를 조정하고, pH-조정된 현탁액을 압력하에 가열하는 것을 포함한다. 소정의 비제한적인 실시형태에서, 미생물 세포를 가수분해하는 것은 알칼리 가수분해를 수행하는 것을 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 알칼리 가수분해를 수행하는 것은 미생물 바이오매스를 포함하는 현탁액의 pH를 약 8 내지 약 14의 pH로 조정하는 것을 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 알칼리 가수분해는 미생물 바이오매스를 포함하는 조성물의 pH를 포타슘 하이드록사이드, 소듐 하이드록사이드, 칼슘 옥사이드, 마그네슘 옥사이드, 암모늄 하이드록사이드, 암모니아 및 트라이포타슘 포스페이트로부터 선택되는 염기와 같은 적어도 하나의 염기로 조정하는 것을 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 알칼리 가수분해는 미생물 바이오매스를 포함하는 조성물의 pH를 조정하고, 가열 pH-조정된 조성물을 약 10분 내지 약 48시간의 기간 동안 약 30℃ 내지 약 200℃의 온도로 가열하는 것을 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 알칼리 가수분해는 미생물 바이오매스를 포함하는 조성물의 pH를 조정하고, pH-조정된 조성물을 압력하에 가열하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 알칼리 또는 산 가수분해는 상승된 압력하에 수행된다. 소정의 실시형태에서, 미생물 바이오매스를 포함하는 현탁액은 알칼리 또는 산 가수분해 동안 약 5 psi 내지 약 40 psi의 압력을 받는다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 산 또는 알칼리 가수분해 기법은 일반적으로 가용성 물질 및 세포벽 찌꺼기를 포함하는 가수분해물 조성물을 생성한다. 소정의 실시형태에서, 상기 세포벽 찌꺼기는 원심분리와 같은 고체-액체 분리에 의해 단백질 가수분해물로부터 분리될 수 있다.
소정의 비제한적인 실시형태에서, 미생물 바이오매스를 가수분해하는 것은 산 또는 염기의 첨가를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 산 또는 염기는 각각 강산 또는 강염기이다. 소정의 실시형태에서, 산은 황산, 인산, 염산 및/또는 탄산 중 하나 이상을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 염기는 포타슘 하이드록사이드, 암모니아, 암모늄 하이드록사이드, 포타슘 포스페이트, 칼슘 옥사이드, 마그네슘 옥사이드 및/또는 소듐 하이드록사이드 중 하나 이상을 포함한다. 산 또는 염기 가수분해는 부위 특이적이지 않으므로, 일반적으로 더 균일한 펩타이드 크기 및 더 높은 수준의 저분자량(MW) 펩타이드 및/또는 유리 아미노산을 생성한다. 소정의 실시형태에서, 더 균일한 펩타이드 크기 분포 및/또는 더 높은 수준의 저분자량 펩타이드는 산 또는 염기 가수분해를 사용하여 달성된다. 충분한 처리 시간 및/또는 적용된 조건의 강도(예를 들어, pH, 온도(T), 압력(P))로, 산 또는 염기 가수분해는 모든 또는 본질적으로 모든 유리 아미노산(예를 들어, 카사미노산)을 완전히 방출할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 주입된 단백질은 산 및/또는 염기 가수분해를 통해 대체로 또는 전체적으로 유리 아미노산으로 전환된다. 유리 아미노산까지 내내 산 또는 염기 가수분해된 단백질은 전형적으로 최대 40%의 염, 예컨대, NaCl을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 예를 들어, NaCl 함량이 약 2% 미만인 경우, 대체로 또는 전체적으로 무염 유리 아미노산 조성물이 생성된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 총 염 함량은 약 20%, 약 10%, 약 5% 또는 약 2% 미만일 수 있다. 산성 가수분해에서, 소정의 아미노산(예를 들어, 시스테인(Cys), 트립토판(Trp))은 파괴될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 아미노산, 예컨대, 시스테인 및/또는 트립토판과 같은 불안정한 아미노산을 보존하기 위해 효소적 및/또는 췌장 소화물이 이용된다.
소정의 실시형태에서, 제어된 온도 및/또는 삼투압 변화를 사용하여 세포 자가분해가 수행되어 세포 용해물을 생성한다. 소정의 실시형태에서, 자가분해는 산, 염기 및/또는 열 중 하나 이상을 사용하여 촉발될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 세포 자가분해는 내인성 효소에 의한 단백질 분해가 뒤따르고/따르거나 동반되어 가수분해된 단백질 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 올리고펩타이드 및/또는 유리 아미노산을 갖는 세포 용해물을 생성한다.
소정의 실시형태에서, 출발 바이오매스, 예를 들어, 화학독립영양성 바이오매스 또는 용해물은 10,000Da 이상의 MW를 갖는 일부 단백질을 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1회 이상의 단백질 가수분해 단계의 생성물은 10,000Da 이상의 MW를 갖는 단백질 또는 펩타이드가 거의 없거나 또는 전혀 없다. 본 발명의 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1회 이상의 단백질 가수분해 단계에 의해 생성된 단백질 가수분해물 생성물 내의 펩타이드 및 아미노산의 평균 MW는 약 9,000Da 내지 약 10,000Da, 또는 약 8,000Da 내지 약 9,000Da, 또는 약 7,000Da 내지 약 8,000Da, 또는 약 6,000Da 내지 약 7,000Da, 또는 약 5,000Da 내지 약 6,000Da, 또는 약 4,000Da 내지 약 5,000Da, 또는 약 3,000Da 내지 약 4,000Da, 또는 약 2,000Da 내지 약 3,000Da, 또는 약 1,000Da 내지 약 2,000Da 또는 약 1,000Da 미만의 범위 내에 속한다. 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물(PH)은 약 700Da의 펩타이드 및 아미노산 함량에 대한 평균 MW를 갖는다.
소정의 실시형태에서, 다양한 가수분해제가 목적하는 범위의 펩타이드 분획을 갖는 PH 및 펩타이드 대 유리 아미노산의 비 및 평균 MW를 설계하는데 사용된다. 저분자량 펩타이드를 갖는 가수분해물은 유업용 유산균(LAB)의 성장을 자극하는 것으로 알려져 있다. 소정의 실시형태에서, 저분자량 펩타이드를 포함하는 PH가 생성된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 저분자량 펩타이드를 포함하는 PH가 LAB를 포함하는 배양물과 같지만 이로 제한되지 않는 또 다른 배양물에 제공된다. 소정의 상기 실시형태에서, LAB 배양물은 1종 이상의 L. 락티스(L. lactis) 균주를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 PH는 다음 유형의 단백질 가수분해물 중 하나 이상보다 더 큰 비율의 소형 펩타이드(3개 내지 7개의 아미노산 잔기) 및 유리 필수 아미노산을 포함한다: 카세인의의 파파인 소화물; 대두 펩톤; 및/또는 유청.
소정의 실시형태에서, 세포 막을 가로질러 수송되고 자유 에너지(ATP)의 최소한의 소비로 바이오매스 합성에 사용될 수 있는 올리고펩타이드와 다이- 및 트라이-펩타이드와 필수 아미노산의 조합을 포함하는 PH 및/또는 질소 공급원이 설계되었다. 소정의 실시형태에서, 아미노산, 다이- 및 트라이-펩타이드를 또 다른 세포 및/또는 유기체로 수송하는데 필요한 최소한의 ATP 요구를 위한 아미노산, 다이- 및 트라이-펩타이드의 조성물이 설계되었다.
효소적 및 산 가수분해에서, 소정의 아미노산, 예를 들어, 카세인 가수분해물의 시스테인(Cys) 및 산-소화 카세인 펩톤의 트립토판(Trp)이 파괴되는 것으로 알려져 있다. 소정의 실시형태에서, 가수분해제 및 공정은 Cys 및/또는 Trp와 같지만 이로 제한되지 않는 민감성 아미노산을 보존하기 위해 선택된다. 소정의 실시형태에서, 단백질의 췌장 소화는 Trp를 보존하기 위해 수행된다.
PH 및 배양 배지를 설계할 때 고려해야 할 몇 가지 효소 특이성이 있다. 락토바실러스 PrtB/PrtH 프로테이네이스의 생합성은 배양 배지의 펩타이드 풀에 의해 조절되고 펩타이드-풍부 배지에 의해 억제되는 것으로 보고되어 있다(Kenny, O., FitzGerald, R. J., O'Cuinn, G., Beresford, T., & Jordan, K. (2003) Growth phase and growth medium effects on the peptidase activities of Lactobacillus helveticus. International Dairy Journal. https://doi.org/10.1016/S0958-6946(03)00073-6). 마찬가지로, 락토코키(lactoccocci)의 pepX 및 pepN은 성장 배지의 펩타이드 함량에 의해 조절되는 것으로 보고되어 있다. 한편, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) CRL 1062의 pepN 아미노 펩티데이스 활성 및 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)에서의 pepX, pepI 및 pepN 활성(Morel, F., Gilbert, C., Geourjon, C., Frot-Coutaz, J., Portalier, R., & Atlan, D. (1999) The prolyl aminopeptidase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus belongs to the α/β hydrolase fold family. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. https://doi.org/10.1016/S0167-4838(98)00264-7)은 성장 배지의 펩타이드 함량과 무관한 것으로 보고되어 있다. L. 헬베티쿠스에서, 아미노펩티데이스, 다이펩티데이스, 트라이펩티데이스 및 엔도펩티데이스와 같은 효소의 활성은 균주 및 종 의존적인 것으로 보고되어 있다. 그러므로, 락토바실러스 균주가 치즈 스타터(cheese starter) 또는 부가 배양물로 적용될 경우, 세포외 및 세포내 단백질분해 시스템과 같은 중요한 대사 경로를 유도하고 유지하는 배지 성분이 사용되어야 한다. 이러한 미생물 형질은 예측 가능한 시간 내에 우유의 산성화 및/또는 치즈 숙성 동안 풍미의 발달에 필요한 효소의 방출을 가능하게 한다.
소정의 실시형태에서, 펩타이드-풍부 배지가 세포외 및 세포내 단백질분해 시스템과 같은 중요한 대사 경로를 억제하는 경우, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된(예를 들어, 화학독립영양적으로) 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 전 단백질(whole protein)(즉, 가수분해되지 않은 단백질)이 배지 성분으로 사용된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 이러한 배지가 스타터 및/또는 부가 배양물의 성장을 위해 사용될 수 있다. 일부 스타터 및 부가 배양물의 경우와 달리, 프로바이오틱 균주(예를 들어, 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri))의 생산의 주요 우선 순위는 높은 수율과 생존 가능한 세포의 수이며, 이는 배양물이 동결-건조 및 실온에서의 연장된 저장 수명에 대한 노출에서 생존할 수 있도록 할 것이다. 소정의 실시형태에서, 선행하는 성분 중 하나 이상을 포함하는 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자 추출물 및/또는 제형과 같은 영양소는 상기 영양소가 공급된 배양물의 다음 특성 중 하나 이상을 최대화하도록 선택된다: 수율; 생존 가능한 세포의 수; 동결-건조의 세포 생존; 및/또는 실온에서의 저장 수명. 소정의 이러한 실시형태에서, 배양물은 L. 아시도필루스, L. 존소니이 및/또는 L. 레우테리 중 1종 이상과 같지만 이로 제한되지 않는 프로바이오틱 균주를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 여러 종/균주로 구성된 정의되지 않은 또는 정의된 스타터 배양물이 생성된다. 소정의 실시형태에서, 복합 배지로의 단백질 가수분해물 및/또는 기타 영양소 및 이의 제형은 재현 가능한 성능을 유지하고/하거나 계대 배양 및 발효 공정 전반에 걸쳐 균주/종 사이의 적절한 및/또는 목적하는 비를 유지하도록 설계된다. 이를 달성하기 위해, 발효 성장 배지에서 탄소 및 질소 공급원의 정확한 균형을 유지하는 것과 같지만 이로 제한되지 않는 다양한 인자가 배지 제형에서 최적화된다.
일부 실시형태에서, 가수분해된 바이오매스는 정화, 농도, 건조, 저온 살균 및/또는 분리와 같은 하나 이상의 가수분해 후 공정을 거칠 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 가수분해 후 가수분해물을 농축하여 농축된 가수분해물을 얻는 하나 이상의 추가 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 농축된 가수분해물은 적어도 40중량%의 건조물, 다른 실시형태에서 적어도 50중량%의 건조물 및 다른 실시형태에서 약 50중량% 내지 약 55중량% 이상의 건조물을 갖는다. 이러한 농도는, 예를 들어, 가열 및 항온조 또는 역삼투압 또는 임의의 다른 적합한 장치가 있는 회전 증발기를 사용하는 것과 같은 당업계에 공지된 임의의 종래의 방법에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 가수분해된 바이오매스는 대부분의 또는 실질적으로 모든 수분 함량을 제거하기 위해 동결건조된다.
소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 및/또는 아미노산 조성물은 한외여과 및/또는, 예를 들어, 비단백질성성 성분을 제거하기 위한 아세톤 침전과 같지만 이로 제한되지 않는 화학적 수단에 의해 추가로 정제된다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 및/또는 아미노산 조성물은 크기-배제 크로마토그래피에 의해 분별된다. 소정의 실시형태에서, 이러한 분별로부터 생성된 분획은 별도의 제품 및/또는 부산물로 이용된다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 및/또는 아미노산 조성물은 미세 분별을 거친다. 소정의 이러한 실시형태에서, 대부분의 활성 펩타이드 또는 펩타이드가 회수되고 정제된다. 소정의 실시형태에서, 고성능 분별 절차가, 예를 들어, 균질한 펩타이드를 얻기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 및/또는 아미노산 조성물에 적용된다. 소정의 실시형태에서, 균질한 펩타이드는 시퀀싱된다.
또 다른 특정 실시형태에서, 방법은 가수분해 후 얻어진 단백질 가수분해물을 분리하여 (i) 가용성 가수분해물 분획 및 (ii) 고체상, 불용성 가수분해물 분획을 얻는 단백질 가수분해 후의 추가 단계(들)을 포함한다. 이러한 분리는, 예를 들어, 디캔터(decanter) 또는 다른 적합한 산업적 장비를 사용하는 여과 또는 원심분리와 같은 임의의 적합한 고체-액체 분리 방법에 의해 수행될 수 있다.
소정의 비제한적인 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 고체-액체 분리 단계 또는 단계들을 거친다: 원심분리; 및/또는 여과. 소정의 비제한적인 실시형태에서, 불용성 세포 막 성분은 가용성 분획으로부터 분리된다. 소정의 실시형태에서, 가용성 및/또는 불용성 분획은 분무 건조 및/또는 동결 건조를 포함하지만 이로 제한되지 않는 건조 방법을 거친다. 소정의 실시형태에서, 가용성 분획은 세포 배양 응용에서 사용된다. 소정의 실시형태에서, 불용성 분획은 식물, 동물, 진균 또는 다른 유기체에 대한 영양적 응용에서 사용된다.
소정의 실시형태에서, 단백질, 펩타이드 및 아미노산을 포함하는 것 이외에, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 바이타민; 지질; 탄수화물; 핵산; 미네랄; 및/또는 다른 미량영양소.
본 명세서에 기재된 가수분해 방법의 다양한 실시형태는 상이한 수준의 순도의 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 생산한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 다음 등급 중 하나 이상이다: 기술 등급; 식품 등급; 및/또는 비-식품 등급. 소정의 실시형태에서, 스타터 배양은 식품 등급 물질만을 사용하여 생산된다. 소정의 실시형태에서, LAB 배양물 및/또는 프로바이오틱 배양물 및/또는 단일 세포 단백질 및/또는 포유동물 세포 배양물과 같지만 이로 제한되지 않는 동물 세포 배양물 및/또는 1종 이상의 바이타민을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 또 다른 영양소가 식품 등급 물질만을 사용하여 생산된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 일반적으로 육류 및/또는 대두 및/또는 밀 및/또는 유제품 단백질로부터 생산되는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물에 대한 대체물로 이용된다.
일부 실시형태에서, 1종 이상의 상이한 미생물 또는 미생물의 공배양물 또는 컨소시엄으로부터의 바이오매스의 하나 이상의 배취는 별개의 조성을 갖는 가수분해물의 라이브러리를 생성하기 위해 다중 가수분해 프로토콜을 사용하여 처리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 라이브러리는 1종 이상의 상이한 유기체; 1종 이상의 상이한 가수분해제; 하나 이상의 상이한 공정 매개변수의 세트; 하나 이상의 상이한 가수분해 정도; 및 하나 이상의 상이한 가수분해 후 처리 및/또는 정제 단계를 사용하여 생성될 수 있다. 가수분해물의 라이브러리 내에서, 특정 가수분해물 조성물은 동물 세포 유형 및/또는 동물 세포의 성장 단계와 같지만 이로 제한되지 않는 특정 세포 유형 및/또는 세포의 성장 단계의 배양에 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 배양으로부터 얻어진 바이오매스는 미생물이 성장하는 동안 축적하는 유기 중합체를 추출하기 위해 처리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 미생물은 H2/CO2 및/또는 합성가스 상에서 성장할 수 있고, 미생물은 중량 기준으로 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 예를 들어, 폴리하이드록시뷰티레이트(PHB) 및/또는 폴리하이드록시발레레이트(PHV)를 세포 바이오매스의 약 50% 이상으로 축적할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 PHA 및/또는 PHB 및/또는 PHV 합성뿐만 아니라 아미노산을 포함한 다수의 다른 합성 경로와 함께 지방산 생합성으로 이어질 수 있는 아세틸-CoA 대사 중간체를 통해 높은 탄소의 플럭스를 유도하는 고유한 능력을 갖고 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 형질을 나타내는 미생물은 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator)(예를 들어, 쿠프리아비두스 네카토르 DSM 531 또는 DSM 541) 및/또는 쿠프리아비두스 메탈리두란스(Cupriavidus metallidurans)(예를 들어, 쿠프리아비두스 메탈리두란스 DSM 2839)이다.
소정의 실시형태에서, 화학독립영양성 미생물로부터 얻어진 바이오매스를 처리하는 것은 불용성 가수분해물 분획으로부터 PHA 및/또는 PHB 및/또는 PHV를 추출하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 화학독립영양성 미생물로부터 얻어진 바이오매스를 처리하는 것은 가용성 가수분해물 분획으로부터 PHA 또는 PHB 또는 PHV-풍부 고형물을 회수하는 것을 포함한다. PHA 또는 PHB 또는 PHV를 추출하기 위한 미생물 바이오매스의 처리와 관련하여 위에 논의된 바와 같이 PHA 또는 PHB 또는 PHV를 추출하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 배지를 영양적으로 풍부하게 하고/하거나 글루타민의 안정성을 증가시키고/시키거나 생존 가능한 세포 밀도를 향상시키기 위해 다른 인자 및/또는 펩타이드와 조합된다. 작은 올리고펩타이드, 저분자량 물질 및 유리 아미노산은 많은 다양한 세포 유형에 대해 배지의 영양가 및/또는 이러한 배지에서 성장한 배양물의 생산성에 긍정적으로 기여하는 것으로 보고되었다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바에 따라 생산된 올리고펩타이드, 저분자량 물질 및 유리 아미노산은 배지의 영양가에 기여하고/하거나 이러한 배지에서 성장한 배양물의 생산성을 증가시킨다. 소정의 실시형태에서, 올리고펩타이드, 저분자량 물질 및/또는 유리 아미노산이 배지에 첨가될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 올리고펩타이드, 저분자량 물질 및/또는 유리 아미노산은 본 명세서에 기재된 1종 이상의 미생물에 의해 배지로 분비되고/되거나 방출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 쿠프리아비두스 네카토르(예를 들어, 쿠프리아비두스 네카토르 DSM 531 또는 DSM 541) 및/또는 쿠프리아비두스 메탈리두란스(예를 들어, 쿠프리아비두스 메탈리두란스 DSM 2839)를 포함한다. 한 실시형태에서, 미생물은 쿠프리아비두스 네카토르 DSM 541을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 펩타이드는 세포 배양물에 보호 효과를 제공함으로써 무기 이온의 다른 독성 수준의 존재를 완화시킨다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 다음 중 1종 이상의 공급원이다: 바이타민; 올레산, 아라키돈산 및/또는 리놀레산; 인지질; 및/또는 스테롤을 포함하지만 이로 제한되지 않는 지방산.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 그것이 적용된 세포 배양물 또는 유기체에서 세포 기능 및 생리학에 영향을 미친다.
미생물
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 화학독립영양성 미생물이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 혼합영양성 성장을 수행할 수 있고/있거나 종속영양성 미생물이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 광합성 미생물이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 산수소 또는 크날가스 균주, 즉, 아데노신-5'-트라이포스페이트(ATP)와 같은 세포내 에너지 운반체의 생성을 위해 호흡에서 수소를 전자 공여체로, 산소를 전자 수용체로 사용할 수 있는 미생물이다. 크날가스 미생물은 일반적으로 NAD+(및/또는 다른 세포내 환원 등가물)의 환원에 이용되는 H2로부터 공여된 전자의 일부 및 호기성 호흡에 사용되는 H2로부터의 전자의 일부와 함께 하이드로게네이스에 의해 분자 수소를 사용한다. 크날가스 미생물은 일반적으로 캘빈 회로 또는 역 시트르산 회로를 포함하지만 이로 제한되지 않는 경로를 통해 화학독립영양적으로 CO2를 고정한다.
일부 실시형태에서, 미생물 또는 미생물을 포함하는 조성물은 다음 크날가스 미생물 중 1종 이상을 포함한다: 아퀴펙스 파이로필러스(Aquifex pyrophilus), 아퀴펙스 에올리쿠스(Aquifex aeolicus) 또는 다른 아퀴펙스 종; 쿠프리아비두스 네카토르 또는 쿠프리아비두스 메탈리두란스 또는 다른 쿠프리아비두스 종; 코리네박테리움 오토트로피쿰(Corynebacterium autotrophicum) 또는 다른 코리네박테리움 종; 고르도니아 데설퓨리칸스(Gordonia desulfuricans), 고르도니아 폴리아이소프레니보란스(Gordonia polyisoprenivorans), 고르도니아 루브리페르틴크타(Gordonia rubripertincta), 고르도니아 하이드로포비카(Gordonia hydrophobica), 고르도니아 웨스트팔리카(Gordonia westfalica) 또는 다른 고르도니아 종; 노카르디아 오토트로피카(Nocardia autotrophica), 노카르디아 오파카(Nocardia opaca) 또는 다른 노카르디아 종; 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도슈도모나스 캡슐라타(Rhodopseudomonas capsulata), 로도슈도모나스 비리디스(Rhodopseudomonas viridis), 로도슈도모나스 설포비리디스(Rhodopseudomonas sulfoviridis), 로도슈도모나스 블라스티카(Rhodopseudomonas blastica), 로도슈도모나스 스페로이데스(Rhodopseudomonas spheroides), 로도슈도모나스 아시도필라(Rhodopseudomonas acidophila) 또는 다른 로도슈도모나스 종을 포함하지만 이로 제한되지 않는 홍색 무유황 광합성 세균(purple non-sulfur photosynthetic bacteria); 로도박터 종; 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum) 또는 다른 로도스피릴룸 종; 로도코커스 오파쿠스 또는 다른 로도코커스 종; 리조비움 자포니쿰(Rhizobium japonicum) 또는 다른 리조비움 종; 티오캅사 로세오페르시키나(Thiocapsa roseopersicina) 또는 다른 티오캅사 종; 슈도모나스 파실리스(Pseudomonas facilis), 슈도모나스 플라바(Pseudomonas flava), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 하이드로게노보라(Pseudomonas hydrogenovora), 슈도모나스 하이드로게노써모필라(Pseudomonas hydrogenothermophila), 슈도모나스 팔레로니이(Pseudomonas palleronii), 슈도모나스 슈도플라바(Pseudomonas pseudoflava), 슈도모나스 사카로필라(Pseudomonas saccharophila), 슈도모나스 써모필레(Pseudomonas thermophile) 또는 다른 슈도모나스 종; 하이드로게노모나스 판토트로파(Hydrogenomonas pantotropha), 하이드로게노모나스 에우트로파(Hydrogenomonas eutropha), 하이드로게노모나스 파실리스(Hydrogenomonas facilis) 또는 다른 하이드로게노모나스 종; 하이드로게노박터 써모필루스(Hydrogenobacter thermophilus), 하이드로게노박터 할로필루스(Hydrogenobacter halophilus), 하이드로게노박터 하이드로게노필루스(Hydrogenobacter hydrogenophilus) 또는 다른 하이드로게노박터 종; 하이드로게노필루스 아이슬란디쿠스(Hydrogenophilus islandicus) 또는 다른 하이드로게노필루스 종; 하이드로게노비브리오 마리누스(Hydrogenovibrio marinus) 또는 다른 하이드로게노비브리오 종; 하이드로게노써무스 마리누스(Hydrogenothermus marinus) 또는 다른 하이드로게노써무스 종; 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 또는 다른 헬리코박터 종; 잔토박터 오토트로피쿠스(Xanthobacter autotrophicus), 잔토박터 플라부스(Xanthobacter flavus) 또는 다른 잔토박터 종; 하이드로게노파가 플라바(Hydrogenophaga flava), 하이드로게노파가 팔레로니이(Hydrogenophaga palleronii), 하이드로게노파가 슈도플라바(Hydrogenophaga pseudoflava) 또는 다른 하이드로게노파가 종; 브라디리조비움 자포니쿰 또는 다른 브라디리조비움 종; 랄스토니아 에우트로파(Ralstonia eutropha) 또는 다른 랄스토니아 종; 알칼리게네스 에우트로푸스(Alcaligenes eutrophus), 알칼리게네스 파실리스(Alcaligenes facilis), 알칼리게네스 하이드로게노필루스(Alcaligenes hydrogenophilus), 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus), 알칼리게네스 파라독수스(Alcaligenes paradoxus), 알칼리게네스 루흘란디이(Alcaligenes ruhlandii) 또는 다른 알칼리게네스 종; 아미콜라타 종(Amycolata sp.); 아쿠아스피릴룸 오토트로피쿰(Aquaspirillum autotrophicum) 또는 다른 아쿠아스피릴룸 종; 아스로박터(Arthrobacter) 균주 11 /X, 아스로박터 메틸로트로푸스(Arthrobacter methylotrophus) 또는 다른 아스로박터 종; 아조스피릴룸 리로페룸(Azospirillum lipoferum) 또는 다른 아조스피릴룸 종; 바리오보락스 파라독수스(Variovorax paradoxus) 또는 다른 바리오보락스 종; 아시도보락스 파실리스(Acidovorax facilis) 또는 다른 아시도보락스 종; 바실러스 슐레겔리이(Bacillus schlegelii), 바실러스 투스키아에(Bacillus tusciae), 다른 바실러스 종; 칼데로박테눔 하이드로게노필룸(Calderobactenum hydrogenophilum) 또는 다른 칼데로박테눔 종; 데르시아 굼모사(Derxia gummosa) 또는 다른 데르시아 종; 플라보박테리움 오토써모필룸(Flavobacterium autothermophilum) 또는 다른 플라보박테리움 종; 마이크로사이클러스 아쿠아티쿠스(Microcyclus aquaticus) 또는 다른 마이크로사이클러스 종; 마이코박테리움 고르도니아에(Mycobacterium gordoniae) 또는 다른 마이코박테리움 종; 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans) 또는 다른 파라코커스 종; 페르세포넬라 마리나(Persephonella marina), 페르세포넬라 구아이마센시스(Persephonella guaymasensis) 또는 다른 페르세포넬라 종; 레노박터 바쿠오락툼(Renobacter vacuolatum) 또는 다른 레노박터 종; 셀리베리아 카복시도하이드로게나(Seliberia carboxydohydrogena) 또는 다른 셀리베리아 종, 스트렙토마이세테스 코엘리코플라부스(Streptomycetes coelicoflavus), 스트렙토마이세테스 그리세우스(Streptomycetes griseus), 스트렙토마이세테스 잔토크로모게네스(Streptomycetes xanthochromogenes), 스트렙토마이세테스 서모카복시두스(Streptomycetes thermocarboxydus) 및 다른 스트렙토마이세테스 종; 써모크리니스 루베르(Thermocrinis ruber) 또는 다른 써모크리니스 종; 와우테르시아 종(Wautersia sp.); 아나바에나 오실라리오이데스(Anabaena oscillarioides), 아나바에나 스피로이데스(Anabaena spiroides), 아나바에나 실린드리카(Anabaena cylindrica) 또는 다른 아나바에나 종을 포함하지만 이로 제한되지 않는 시아노박테리아; 및 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima) 또는 다른 아르트로스피라 종; 세네데스무스 오블리쿠우스(Scenedesmus obliquus) 또는 다른 세네데스무스 종을 포함하지만 이로 제한되지 않는 녹조류; 클라미도모나스 레인하르디이(Chlamydomonas reinhardii) 또는 다른 클라미도모나스 종; 안키스트로데스무스 종(Ankistrodesmus sp.); 및 라피디움 폴리모르피움(Rhaphidium polymorphium) 또는 다른 라피디움 종; 뿐만 아니라 산수소 미생물을 포함하는 미생물의 컨소시엄.
일부 실시형태에서, 미생물 또는 미생물을 포함하는 조성물은 다음 중 1종 이상을 포함하는 절대(obligate) 및/또는 통성 화학독립영양성 미생물을 포함한다: 아세토언에어로비움 종(Acetoanaerobium sp.); 아세토박테리움 종(Acetobacterium sp.); 아세토게니움 종(Acetogenium sp.); 아크로모박터 종(Achromobacter sp.); 아시디아누스 종(Acidianus sp.); 아시네토박터 종(Acinetobacter sp.); 악티노마두라 종(Actinomadura sp.); 에어로모나스 종(Aeromonas sp.); 알칼리게네스 종; 알칼리퀘네스 종(Alcaliqenes sp.); 아쿠아스피릴룸 종; 아르코박터 종(Arcobacter sp.); 아우레오박테리움 종(Aureobacterium sp.); 바실러스 종; 베기아토아 종(Beggiatoa sp.); 부티리박테리움 종(Butyribacterium sp.); 카복시도테르무스 종(Carboxydothermus sp.); 클로스트리디움 종(Clostridium sp.); 코마모나스 종(Comamonas sp.); 데할로박터 종(Dehalobacter sp.); 데할로코코이데 종(Dehalococcoide sp.); 데할로스피릴룸 종(Dehalospirillum sp.); 데설포박테리움 종(Desulfobacterium sp.); 데설포모닐레 종(Desulfomonile sp.); 데설포토마쿨룸 종(Desulfotomaculum sp.); 데설포비브리오 종(Desulfovibrio sp.); 데설푸로사르시나 종(Desulfurosarcina sp.); 엑토티오로도스피라 종(Ectothiorhodospira sp.); 엔테로박터 종(Enterobacter sp.); 에우박테리움 종(Eubacterium sp.); 페로플라스마 종(Ferroplasma sp.); 할로티바실러스 종(Halothibacillus sp.); 하이드로게노박터 종; 하이드로게노모나스 종; 렙토스피릴룸 종(Leptospirillum sp.); 메탈로파에라 종(Metallosphaera sp.); 메타노박테리움 종(Methanobacterium sp.); 메타노브레비박터 종(Methanobrevibacter sp.); 메타노코커스 종(Methanococcus sp.); 메타노코코이데스 종(Methanococcoides sp.); 메타노게니움 종(Methanogenium sp.); 메타노로부스 종(Methanolobus sp.); 메타노마이크로비움 종(Methanomicrobium sp.); 메타노플라누스 종(Methanoplanus sp.); 메타노사르시나 종(Methanosarcina sp.); 메타노스피릴룸 종(Methanospirillum sp.); 메타노써무스 종(Methanothermus sp.); 메타노트릭스 종(Methanothrix sp.); 마이크로코커스 종(Micrococcus sp.); 니트로박터 종(Nitrobacter sp.); 니트로박테라세아에 종(Nitrobacteraceae sp.), 니트로코커스 종(Nitrococcus sp.), 니트로소코커스 종(Nitrosococcus sp.); 니트로스피나 종(Nitrospina sp.), 니트로스피라 종(Nitrospira sp.), 니트로소로부스 종(Nitrosolobus sp.); 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.); 니트로소스피라 종(Nitrosospira sp.); 니트로소비브리오 종(Nitrosovibrio sp.); 니트로스피나 종(Nitrospina sp.); 올레오모나스 종(Oleomonas sp.); 파라코커스 종; 펩토스트렙토코커스 종(Peptostreptococcus sp.); 플랑크토마이세테스 종(Planctomycetes sp.); 슈도모나스 종; 랄스토니아 종; 로도박터 종; 로도코커스 종; 로도사이클루스 종(Rhodocyclus sp.); 로도마이크로비움 종(Rhodomicrobium sp.); 로도슈도모나스 종; 로도스피릴룸 종; 쉬와넬라 종(Shewanella sp.); 시데로코커스 종(Siderococcus sp.); 스트렙토마이세스 종; 설포바실러스 종; 설포로부스 종(Sulfolobus sp.); 써모트릭스 종(Thermothrix sp.), 티오바실러스 종(Thiobacillus sp.); 티오마이크로스피라 종(Thiomicrospira sp.); 티오플로카 종(Thioploca sp.); 티오스파에라 종(Thiosphaera sp.); 티오트릭스 종(Thiothrix sp.); 티오불룸 종(Thiovulum sp.); 황산화 미생물; 수소-산화 미생물; 철-산화 미생물; 아세토겐; 및 메테인생성 미생물; 화학적독립영양생물을 포함하는 미생물의 컨소시엄; 열수 분출구, 지열 분출구, 온천, 냉침수, 지하 대수층, 염호, 염수층, 광산, 산성 광산 배수, 광산 찌꺼기, 유정, 정제소 폐수. 탄층, 깊은 지하 중 적어도 하나에 고유한 화학적독립영양생물; 폐수 및 하수 처리 식물; 지열 발전소, 설파타라 밭 및 토양; 및 고온성 미생물, 초고온성 미생물, 호산성 미생물, 호염성 미생물 및 호저온성 미생물 중 1종 이상으로부터 선택되는 극한 미생물.
일부 실시형태에서, 미생물 또는 미생물을 포함하는 조성물은 메탄영양성 미생물 및/또는 메틸영양성 미생물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미생물은 메틸로코커스(Methylococcus) 속에 속한다. 일부 실시형태에서, 미생물은 메틸로코커스 캡슐라투스(Methylococcus capsulatus)이다. 일부 실시형태에서, 미생물은 메틸영양성 미생물이다. 일부 실시형태에서, 미생물은 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속에 속한다. 일부 실시형태에서, 미생물은 다음 종 중 1종 이상으로부터 얻는다: 메틸로박테리움 자트마니이(Methylobacterium zatmanii); 메틸로박테리움 엑토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens); 메틸로박테리움 클로로메타니쿰(Methylobacterium chloromethanicum). 일부 실시형태에서, 수소-산화 화학독립영양성 미생물 및/또는 일산화탄소영양성 미생물 및/또는 메틸영양성 미생물 및/또는 메탄영양성 미생물인 조성물이 제공된다.
전자 공여체 및/또는 탄소 공급원으로서 일산화탄소 상에서 성장할 수 있는 다수의 상이한 미생물(즉, 일산화탄소영양성 미생물)이 특성화되었다. 일부 경우에, 일산화탄소영양성 미생물은 또한 전자 공여체로서 H2를 사용하고/하거나 혼합영양성으로 성장할 수 있다. 일부 경우에, 일산화탄소영양성 미생물은 통성 화학무기독립영양성 미생물(chemolithoautotroph)이다(문헌[Biology of the Prokaryotes, edited by J Lengeler, G. Drews, H. Schlegel, John Wiley & Sons, Jul 10, 2009], 이는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨). 일부 실시형태에서, 미생물 또는 미생물을 포함하는 조성물은 다음 일산화탄소영양성 미생물 중 1종 이상을 포함한다: 아시네토박터 종; 알칼리게네스 카복시두스(Alcaligenes carboxydus) 또는 다른 알칼리게네스 종; 아스로박터 종; 아조모나스 종(Azomonas sp.); 아조토박터 종(Azotobacter sp.); 바실러스 슐레겔리이 또는 다른 바실러스 종; 하이드로게노파가 슈도플라바 또는 다른 하이드로게노파가 종; 슈도모나스 카복시도하이드로게나, 슈도모나스 카복시도보란스(Pseudomonas carboxydovorans), 슈도모나스 콤프란소리스(Pseudomonas compransoris), 슈도모나스 가조트로파(Pseudomonas gazotropha), 슈도모나스 써모카복시도보란스(Pseudomonas thermocarboxydovorans) 또는 다른 슈도모나스 종; 리조비움 자포니쿰 또는 다른 리조비움 종; 및 스트렙토마이세스 G26, 스트렙토마이세스 써모오토트로피쿠스(Streptomyces thermoautotrophicus) 또는 다른 스트렙토마이세스 종. 소정의 실시형태에서, 일산화탄소영양성 미생물이 사용된다. 소정의 실시형태에서, 화학무기독립영양성일 수 있는 일산화탄소영양성 미생물이 사용된다. 소정의 실시형태에서, 호흡 및/또는 생합성에서 전자 공여체로서 H2를 이용할 수 있는 일산화탄소영양성 미생물이 사용된다.
본 개시내용의 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물은 자연 발생적 균주일 수 있거나 또는 유전적으로 조작될 수 있다. 미생물은 단백질을 포함하는 가수분해물이 배양물의 세포에, 예를 들어, 배양 배지 보충물로서 제공될 때 동물 세포에 대해 높은 영양가를 갖는 하나 이상의 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학독립영양성 미생물은 프로테이스 절단 부위가 산재된 다중 펩타이드 하위서열을 포함하는 폴리펩타이드 서열을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드 서열은 다음과 같이 개략적으로 나타낼 수 있다: H2N-X-C-[A-C]n-Y-COOH, 여기서 "H2N" 및 "COOH"는 각각 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단을 나타내고; "A"는 펩타이드 하위서열이며; "C"는 프로테이스 절단 부위이고; "X" 및 "Y"는 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있는 링커 서열이며; n은 1 이상, 예를 들어, 2 이상, 5 이상, 10 이상(20 이상을 포함)의 정수이다. 펩타이드 하위서열 (A)는 배양 배지에 제공될 때 배양물에서 동물 세포 성장에 유익한 효과를 갖는 펩타이드 서열 (A')를 포함하도록 설계될 수 있다. 유전자 변형 미생물로부터 얻어진 바이오매스가 절단 부위를 절단하기에 적절한 프로테이스를 사용하여 가수분해될 때, 생성된 단백질 가수분해물은 유익한 펩타이드가 풍부할 수 있다.
일부 실시형태에서, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물은 생합성 경로에 관련된 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 방해하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물은 폴리하이드록시알카노에이트, 예컨대, 폴리하이드록시뷰티레이트의 생합성에 관련된 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 방해하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 폴리하이드록시알카노에이트의 생합성에 관여하고 이의 발현이 중단될 수 있는 적합한 유전자(들)는 제한 없이 3-케토티올레이스, 아세토아세틸-CoA 리덕테이스 및/또는 PHB 신테이스를 암호화하는 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 미생물은 바이타민 B1, 바이타민 B2 및/또는 바이타민 B12와 같지만 이로 제한되지 않는 바이타민의 생합성에 관여하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 방해하거나 또는 증가시키도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이타민 B12의 생합성에 관여하는 유전자의 발현이 중단되거나 또는 증가된다. 하나 이상의 유전자의 발현은 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어, 미생물 게놈에서 유전자의 코딩 영역 또는 조절 영역의 전부 또는 일부를 결실 또는 돌연변이시키거나 또는 미생물 게놈 내의 유전자의 코딩 영역 또는 조절 영역을 복제함으로써 중단되거나 또는 증가될 수 있다.
미생물은 임의의 적합한 방법을 사용하여 유전적으로 조작될 수 있다. 크날가스 미생물의 유전자 조작은, 예를 들어, 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제9,879,290 B2호에 기술되어 있다.
단백질 가수분해물 조성물
본 명세서에 기재된 바와 같은 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물로부터 유래되는 단백질 가수분해물 조성물이 본 명세서에 제공된다. 단백질 가수분해물 조성물은 배양 배지, 예를 들어, 동물 세포 배양 배지에서, 예를 들어, 혈청의 전부 또는 일부를 대체하기 위해, 예를 들어, 무혈청 또는 동물 성분이 없는 세포 배양 배지를 제공하기 위해, 동물 세포를 증식, 발달 및/또는 분화시키기 위해 또는 동물 세포 배양 배지의 하나 이상의 동물-유래 성분을 대체하기 위해 보충물로 사용하기에 적합하다.
소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 단백질, 펩타이드 및/또는 유리 아미노산이 풍부한 유기 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물의 유기 함량은 유기 함량의 중량 기준으로 약 10% 이상, 예를 들어, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상(약 90% 이상 포함)의 아미노산(단백질, 펩타이드 또는 유리 아미노산으로서)의 양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물의 유기 함량은 유기 함량의 중량 기준으로 약 10% 내지 약 98%, 예를 들어, 약 20% 내지 약 98%, 약 30% 내지 약 98%, 약 40% 내지 약 98%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 약 70% 내지 약 95%(약 75% 내지 약 95%를 포함)의 범위로 아미노산(단백질, 펩타이드 또는 유리 아미노산으로서)의 양을 포함한다. 총 유기 함량은 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 개시내용의 단백질 가수분해물 조성물은 폴리펩타이드 크기의 분포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 가수분해물 조성물에서 폴리펩타이드의 평균 크기는 약 25kDa 이하, 예를 들어, 약 20kDa 이하, 약 15kDa 이하, 약 10kDa 이하, 약 5kDa 이하, 약 2kDa 이하, 약 1kDa 이하(약 0.5kDa 이하를 포함)이다. 일부 실시형태에서, 가수분해물 조성물에서 폴리펩타이드의 평균 크기는 약 0.1kDa 내지 약 100kDa, 예를 들어, 약 0.5kDa 내지 약 50kDa, 약 0.1kDa 내지 약 10kDa, 약 0.5kDa 내지 약 20kDa, 약 1kDa 내지 약 10kDa(약 1kDa 내지 약 5kDa을 포함)의 범위이다. 일부 실시형태에서, 약 10% 이상, 예를 들어, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상(약 95% 이상을 포함)의 폴리펩타이드가 약 25kDa 이하, 예를 들어, 약 20kDa 이하, 약 15kDa 이하, 약 10kDa 이하, 약 5kDa 이하, 약 2kDa 이하, 약 1kDa 이하(약 0.5kDa 이하를 포함), 예를 들어, 약 0.1kDa 내지 약 100kDa, 예를 들어, 약 0.5kDa 내지 약 50kDa, 약 0.1kDa 내지 약 10kDa, 약 0.5kDa 내지 약 20kDa, 약 1kDa 내지 약 10kDa(약 1kDa 내지 약 5kDa을 포함)이다. 소정의 실시형태에서, 펩타이드의 평균 MW는 약 600Da 내지 약 1,100Da의 범위에 속한다.
소정의 실시형태에서, 용해물, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 약 600Da 내지 약 1,100Da 범위에 속하는 MW를 갖는 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용해물, 단백질 가수분해물, 펩타이드 조성물 또는 아미노산 조성물에서 발생하는 분자량의 범위는 약 0.1kDa 내지 약 100kDa, 또는 약 0.1kDa 내지 약 10kDa 또는 약 1kDa 내지 약 10kDa이다. 일부 실시형태에서, 약 10kDa을 초과하는 분자량은 극히 적거나 또는 전혀 없다.
일부 실시형태에서, 용해물 및/또는 단백질 가수분해물은 약 1%의 유리 아미노산, 또는 약 5%의 유리 아미노산, 또는 약 30%의 유리 아미노산 또는 약 40% 이상의 유리 아미노산을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물, 단백질 가수분해물, 추출물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: 중량 기준으로 적어도 약 60%의 총 아미노산 함량(즉, 펩타이드 및/또는 단백질 및/또는 다른 생화학 물질 내에서 중합된 아미노산 포함), 또는 약 %, 약 73%, 약 75%, 약 80%의 총 아미노산 함량; 이의 약 35% 내지 약 40%, 또는 약 30% 내지 약 45%, 또는 약 20% 내지 약 50% 가 유리 아미노산이고; 약 10% 내지 약 15% 또는 약 5% 내지 약 20%가 다이- 및 트라이-펩타이드이며; 약 40% 내지 약 45%, 또는 약 30% 내지 약 50% 또는 약 20% 내지 약 60%가 MW가 약 2,000Da 내지 약 3,000Da인 올리고펩타이드임.
소정의 실시형태에서, 화학적으로 정의된 배지에는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 저분자량 펩타이드 및/또는 저분자량 펩타이드를 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 가수분해물이 제공된다. 소정의 실시형태에서, 저분자량 펩타이드는 대부분 또는 전체적으로 MW가 약 1,000Da 이상이다. 소정의 실시형태에서, 저분자량 펩타이드 및/또는 단백질 가수분해물은 락토바실러스, 예를 들어, L. 락티스 균주와 같은 1종 이상의 LAB를 포함하지만 이로 제한되지 않는 배양물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 평균 MW가 약 700Da, 약 700Da 미만 또는 약 700Da 내지 약 1000Da인 저분자량 펩타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 저분자량 펩타이드를 갖는 단백질 가수분해물이 LAB를 포함하는 배양물에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물, 단백질 가수분해물, 추출물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 소수성인 펩타이드를 포함하고/하거나 약 600Da 내지 약 1,100Da 범위의 분자 질량을 갖는 염기성 펩타이드 분획을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물, 단백질 가수분해물, 추출물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 우유 또는 우유-유래 단백질 또는 단백질 가수분해물보다 더 높은 비율 및/또는 중량%의 소수성인 펩타이드를 포함하고/하거나 약 600Da 내지 약 1,100Da 범위의 분자 질량을 갖는 염기성 펩타이드 분획을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 약 600Da 내지 약 1,100Da 범위의 분자 질량을 갖는 이러한 소수성 및/또는 염기성 펩타이드가 락토바실러스 균주, 예를 들어, L. 락티스를 포함하는 배양물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 LAB 배양물에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물, 단백질 가수분해물, 추출물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물과 같은 영양 공급원은 우유 또는 우유-유래 단백질 또는 단백질 가수분해물보다 더 낮은 비율 및/또는 중량%의 MW가 약 1,400Da 내지 약 3,200Da인 산성 포스포펩타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 비교적 낮은 함량의 MW가 약 1,400Da 내지 약 3,200Da인 산성 포스포펩타이드를 포함하는 영양 공급원이 락토바실러스 균주, 예를 들어, L. 락티스를 포함하는 배양물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 LAB 배양물에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 성장 및/또는 생산을 위해 전 단백질(즉, 가수분해되지 않은 단백질)을 이용할 수 있는 것보다 단백질 가수분해물을 더 잘 이용하는 1종 이상의 균주에 제공된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 상기 균주(들)는 락토바실러스와 같은 1종 이상의 LAB를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 가수분해물은 대두 단백질 가수분해물 및/또는 전체 대두 단백질보다 배양물에 의해 더 잘 이용된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 배양 배지에 약 3%(w/v)의 농도로 보충된다. 소정의 실시형태에서, 대략 약 3%(w/v)의 농도로 제공된 단백질 가수분해물은 약 700Da 또는 약 700Da 내지 약 1000Da의 평균 펩타이드 MW를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 질소 공급원(예를 들어, 단백질성 바이오매스, 용해물, 단백질 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물)은 배양물에 약 0.5% 내지 약 2.5%(w/v)의 양으로 보충된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 세포 배양에 의해 생성된 하나 이상의 생성물의 성장 및/또는 역가를 증가시킨다. 소정의 실시형태에서, 증가된 성장 및/또는 역가(g/ℓ)는 바이오매스 및/또는 락트산에 대한 LAB 배양에서 관찰된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물의 보충은 대두 펩타이드, 대두 단백질 가수분해물 및/또는 전체 대두 단백질의 보충보다 생성물의 더 높은 성장 및/또는 역가를 초래한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 가수분해물의 보충은 약 50g/ℓ 미만의 락트산 역가를 초래하는 단백질 가수분해물 보충 없이 동일한 배양 배지에서 성장한 동일한 배양물과 비교하여 약 50g/ℓ 이상의 락트산 역가를 초래한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물의 보충은 단백질 가수분해물 보충 없이 동일한 배양 배지에서 성장한 동일한 배양물과 비교하여 LAB 배양의 경우 pH 4.50에 도달하는 발효 시간을 감소시킨다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 추출물은 2개 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물은 2개 내지 10개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩타이드로 주로 구성되거나 또는 이를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 정제된 생성물은 2개 내지 10개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩타이드로 주로 구성되거나 또는 이를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 추출물은 다이펩타이드 내지 펜타펩타이드(2개 내지 5개의 아미노산 잔기)를 포함한다. 소정의 상기 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 추출물은 다이펩타이드 내지 펜타펩타이드로 구성되는 펩타이드로 주로 구성되거나 또는 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물은 중합도(degree of polymerization: DP)가 약 50 이하, 예를 들어, 약 40 이하, 약 30 이하, 약 20 이하, 약 10 이하(약 5 이하를 포함), 예를 들어, 약 50, 40, 30, 20, 10 또는 5 내지 약 1 중 어느 하나인 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물은 DP가 약 1 내지 약 50, 예를 들어, 약 1 내지 약 30, 약 1 내지 약 20(약 2 내지 약 10을 포함)의 범위인 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 약 10% 내지 약 30%의 AN/TN 비를 갖는다. 소정의 상기 실시형태에서, AN/TN이 약 10% 내지 약 30%인 단백질 가수분해물은 효소를 사용하여 생성된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 약 20% 내지 약 50%의 AN/TN 비를 갖는다. 소정의 실시형태에서, AN/TN이 약 20% 내지 약 50%인 단백질 가수분해물은 췌장 소화물로 생성된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 약 50% 내지 약 80%의 AN/TN 비를 갖는다. 소정의 상기 실시형태에서, AN/TN이 약 50% 내지 약 80%인 단백질 가수분해물은 산 또는 염기를 사용하여 생성된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 생성물 또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물은 약 10% 미만의 AN/TN 비를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 약 80% 초과의 AN/TN 비를 갖는다.
일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물은 전장 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물은 단백질 및 폴리펩타이드가 고갈되어 있고, 유리 아미노산이 풍부하다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물은 단백질 및 폴리펩타이드가 실질적으로 없다. 폴리펩타이드의 크기 분포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1종 이상의 효소적, 화학적 및 물리적 수단을 사용하여 달성되는 가수분해의 정도에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 세포 성장 및/또는 발달에 유익한 효과를 가질 수 있는 특정 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 펩타이드가 풍부하다. 소정의 실시형태에서, 풍부한 서열은 가수분해물 내의 폴리펩타이드의 총 수의 약 0.001% 이상, 예를 들어, 약 0.01% 이상, 약 0.1% 이상, 약 1% 이상(약 5% 이상을 포함)으로 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 풍부한 서열은 가수분해물 내의 폴리펩타이드의 총 수의 약 0.001% 내지 약 5%, 예를 들어, 약 0.001% 내지 약 1%(약 0.01% 내지 약 1%를 포함)의 범위로 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 5% 내지 약 50%, 예를 들어, 약 10% 내지 약 40%(약 10% 내지 약 35%를 포함)의 회분 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 5% 이하의 회분 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 약 3% 내지 약 20%, 예를 들어, 약 5% 내지 약 15%(약 5% 및 약 15%를 포함)의 총 질소 함량을 갖는다.
소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 1종 이상의 바이타민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 바이타민 B1, 바이타민 B2, 및/또는 바이타민 B12 및/또는 이들의 바이타머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 바이타민 B12 및/또는 이의 하나 이상의 바이타머(예를 들어, 사이아노코발라민, 하이드록소코발라민, 아데노실코발라민, 메틸코발라민)를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물의 휘발성 유기물에 대한 바이타민 B12 및/또는 이의 바이타머의 농도는 약 2㎍의 바이타민 B12 및/또는 이의 바이타머/100g 건조 휘발성 유기물 내지 약 6.5㎍/100g 휘발성 유기물, 또는 약 6.5㎍/100g 휘발성 유기물 내지 약 13㎍/100g 휘발성 유기물 또는 약 13㎍/100g 휘발성 유기물 또는 그 이상이다. 일부 실시형태에서, 바이타민 B12 및/또는 이의 바이타머(들)는 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물로부터 유래된다.
소정의 실시형태에서, 리보플라빈 및/또는 바이타민 B12(및/또는 이의 바이타머)와 같지만 이로 제한되지 않는 바이타민은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물 및/또는 기타 영양소 상에서 성장한 미생물에 의해 생산된다. 소정의 실시형태에서, 바닐린과 같지만 이로 제한되지 않는 1종 이상의 풍미 또는 향료가 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물 및/또는 기타 영양소 상에서 성장한 미생물에 의해 생산된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물은 다음 중 하나 이상을 제공한다: 영양; 부착 성분; 및/또는 또 다른 세포 배양물에 대한 성장 인자 유사체. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물은 동물-유래 아미노산 또는 단백질 가수분해물이 없는 배지에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물은 무혈청 배지에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물은 종종 인간, 동물, 설치류 및/또는 곤충 세포 배양에서 이용되는 동물 유래 아미노산, 단백질 가수분해물 및/또는 소태아/소 혈청을 감소시키거나 또는 이를 대체하는데 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물, 단백질 가수분해물 및/또는 유리 아미노산 조성물은 ITS(Insulin-Transferrin-Selenium: 인슐린-트랜스페린-셀레늄), 예를 들어, 약 1%의 ITS와 함께 세포 배양물에 첨가된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 펩타이드는 다음 중 하나 이상으로 사용된다: 직접적으로 아미노산 공급원으로; 간접적으로 자극제(예를 들어, 혈청 대체물)로; 및/또는 전단 응력(예를 들어, 세포자멸사)에 대한 배양된 세포의 보호.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 배양에서 성장하는 세포에 바이타민의 공급원을 제공한다. 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 바이타민 B1, 바이타민 B2 및/또는 바이타민 B12 및/또는 이들의 바이타머와 같지만 이로 제한되지 않는 바이타민의 공급원일 수 있다. 본 발명의 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 바이타민의 공급원일 수 있다: 바이타민 A; 베타-카로틴; 루테인; 제아잔틴; 티아민(B1); 리보플라빈(B2); 나이아신(B3); 판토텐산(B5); 바이타민 B6; 폴레이트(B9); 바이타민 B12; 콜린; 바이타민 C; 바이타민 D; 바이타민 E; 및/또는 바이타민 K; 및/또는 이들의 바이타머. 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 미네랄의 공급원일 수 있다: 칼슘; 철; 마그네슘; 망가니즈; 인; 포타슘; 소듐; 및/또는 아연.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 생성물 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소, 보조인자 또는 성분 및/또는 이들 중 하나 이상을 포함하는 제형이 다음 바이타민 중 하나 이상을 생산하는 1종 이상의 다른 유기체를 성장시키는데 사용된다: 바이타민 A; 베타-카로틴; 루테인; 제아잔틴; 티아민(B1); 리보플라빈(B2); 나이아신(B3); 판토텐산(B5); 바이타민 B6; 폴레이트(B9); 바이타민 B12; 콜린; 바이타민 C, 바이타민 D; 바이타민 E; 및/또는 바이타민 K; 및/또는 이들의 바이타머.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 생성물 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 다른 추출물은 다음 중 하나 이상의 공급원으로 작용한다: 아미노산; 올리고펩타이드를 포함하는 펩타이드; 지질; 탄수화물; 다당류; 바이타민 및/또는 또 다른 세포 배양물을 위한 철을 포함한 미네랄.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물은 수용성이다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물은 유리 형태 대 중합된 형태의 각 아미노산의 동일하거나 또는 유사한 비율과 양을 포함하는 동등한 유리 아미노산 혼합물과 비교하여 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물이 공급된 세포 배양물에서 보다 에너지 효율적인 대사를 자극한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물이 공급된 세포 배양물은 유리 형태 대 중합된 형태의 각 아미노산의 동일한 또는 유사한 비율과 양을 포함하는 동등한 유리 아미노산 혼합물과 비교하여 암모니아 및/또는 락테이트를 덜 생성하고/하거나 해당과정 및/또는 글루타민분해를 덜 겪는다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 1종 이상의 미생물 공급원으로부터 유래된다. 소정의 실시형태에서, 미생물 공급원은 1종 이상의 화학독립영양성 미생물을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 미생물 공급원은 미생물의 컨소시엄이거나 또는 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 생분해성 폴리에스터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 PHB 및/또는 PHV와 같은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA) 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, PHA 중합체는 다음 화학식으로 나타낼 수 있다: [COCH2CH(R)O]n, 여기서 R은 C1-C5 알킬이고, n은 50 이상의 정수이다. 일부 실시형태에서, 다음 화학식으로 나타낼 수 있는 PHA 올리고머가 존재한다: [COCH2CH(R)O]n, 여기서 R은 C1-C5 알킬이고, n은 50 이하의 정수이다. 일부 실시형태에서, 유리 하이드록시뷰티레이트 및/또는 다른 하이드록시알카노에이트(예를 들어, 하이드록시발레레이트) 단량체가 존재한다. 일부 실시형태에서, PHA 중합체의 평균 분자량은 약 1kDa 이상, 예를 들어, 약 10kDa 이상, 약 100kDa 이상(약 1,000kDa 이상을 포함)이다. 일부 실시형태에서, PHA 중합체의 평균 분자량은 약 1kDa 내지 약 10,000kDa, 예를 들어, 약 10kDa 내지 약 5,000kDa(약 100kDa 내지 약 2,000kDa을 포함)의 범위이다. 일부 실시형태에서, PHA 올리고머의 평균 분자량은 약 1kDa 이하이다. 소정의 실시형태에서, PHA 중합체는 폴리하이드록시뷰티레이트(PHB)를 포함하되, R은 CH3이다. 일부 실시형태에서, PHA 중합체는 블록 공중합체를 포함한 공중합체이다. 일부 실시형태에서, PHA(예를 들어, PHB 및/또는 PHV)는 화학독립영양성 미생물(들)을 포함하는 1종 이상의 미생물로부터 유래된다.
단백질 가수분해물 조성물은 생분해성 폴리에스터, 예를 들어, PHA(예를 들어, PHB 및/또는 PHV)를 약 1% w/w 이상, 예를 들어, 약 5% w/w 이상, 약 10% w/w 이상, 약 20% w/w 이상, 약 30% w/w 이상, 약 40% w/w 이상(약 50% w/w 이상을 포함)으로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 생분해성 폴리에스터, 예를 들어, PHA(예를 들어, PHB 및/또는 PHV)를 약 1% 내지 약 90% w/w, 예를 들어, 약 5% 내지 약 80% w/w, 약 10% 내지 약 70% w/w, 약 20% 내지 약 60% w/w(약 30% 내지 약 50% w/w를 포함)의 범위로 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물을 제조하는데 사용되는 용기는 동일한 처리 장비를 사용하여 생산될 수 있는 동물 기원 물질로부터 잠재적인 교차 오염을 제거하기 위해 이용되는 적절하게 살균되고 검증된 처리를 받았다. 소정의 실시형태에서, 가수분해 공정은 동물-유래가 아닌 물질을 처리하는데 사용되는 장비를 동물성 물질을 처리하는데 사용되는 장비와 분리한 시설에서 수행된다. 소정의 실시형태에서, 가수분해 공정은 동물-유래가 아닌 물질을 처리하는 데만 사용되는 시설 및/또는 장비에서 수행된다. 소정의 실시형태에서, 세균 발효 브로스 또는 동물-유래 처리 효소 내의 영양 성분과 같은 동물 기원 물질에 대한 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물의 2차 노출은 없었다. 소정의 실시형태에서, 제조 공정 전반에 걸쳐 2차 동물 기원 물질은 없다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 임의의 살충제 및/또는 제초제 및/또는 살균제 잔류물을 갖지 않고/않거나 임의의 살충제 및/또는 제초제 및/또는 살균제에 노출되지 않았다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 세팔로스포린과 같지만 이로 제한되지 않는 임의의 항생제에 노출되지 않았다.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물로부터 유래되는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물과 같은 영양 공급원을 포함하는 동물 세포 배양 배지 보충물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 세포 배양 배지 보충물이 본 명세서에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 보충적 영양 공급원은 주어진 배양 배지에서 단백질 가수분해물 및/또는 다른 영양 화합물 및 성장 인자를 보완한다.
소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 동물 세포를 배양하기에 적합한 완전 배양 배지를 제공하기 위해 기초 세포 배양 배지와 조합될 수 있다. 기초 배지는 전형적으로 아미노산, 바이타민, 유기염 및/또는 무기염, 미량 원소, 완충염 및 당을 포함한다. 기초 배지의 예는 제한 없이 DMEM(둘베코의 변형된 이글 배지), DMEM/F12, 이스코브의 변형된 둘베코 배지(IMDM), IMDM/F12, IMDM/F12/NCTC 135, MEM(최소 필수 배지 이글), 배지 199, RPM-I 1640 및 RPMI 1640/DMEM/F12를 포함한다. 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물을 기초 배지에 보충함으로써 제조된 완전 배양 배지는 임의의 추가적인 성분을 필요로 하지 않거나 또는 동물 또는 동물 유래 혈청으로부터 유래되는 아미노산 또는 단백질 가수분해물과 같은 임의의 동물-유래 성분을 필요로 하는 일 없이 배양에서 동물 세포의 성장 및/또는 발달을 지원할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기초 배지는 단백질 가수분해물 조성물 및 성장 인자 또는 식물-유래 또는 효모-유래 단백질 가수분해물 등과 같지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 추가적인 성분이 보충될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 기초 배지에서 영양 성분을 교체하거나 또는 대체하는데 사용될 수 있다: 아미노산; 바이타민; 유기염 및/또는 무기염; 미량 원소; 완충염; 및/또는 당. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 기초 배지 대신에 또는 이에 대한 대체물로 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, (예를 들어, CO2로부터의 화학독립영양성 생합성을 통해) 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 생성물 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소, 보조인자 또는 성분과 같은 영양소(들)는 복합 배지를 제공하기 위해 아미노산, 바이타민, 유기 및/또는 무기염, 미량 원소, 완충염 및/또는 당과 같지만 이로 제한되지 않는 다른 공급원으로부터의 다른 전형적인 배지 성분과 조합될 수 있다. 소정의 이러한 실시형태에서, 상기 복합 배지는 또 다른 세포 배양물을 배양하기에 적합한 완전 배양 배지이다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 생성물 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소, 보조인자 또는 성분과 같은 영양소(들)는 다음과 같지만 이로 제한되지 않는 일반적으로 사용되는 복합 배지의 배지 성분을 보충하고/하거나 대체하는데 사용된다: 엘리커 브로스(락토바실러스 브로스로도 알려져 있음); 트립톤 글루코스 효모 추출물(Tryptone Glucose Yeast Extract: TGYE) 배지; 용원성 브로스(루리아-베르타니 브로스(Luria-Bertani broth) - LB로도 알려져 있음); 시드 배지; M9 배지; M9CA; 복합 배지 M101; YT 배지; MMBL 배지; 테리픽 브로스; 슈퍼 브로스; 효모 추출물-맥아 추출물(Yeast Extract-Malt Extract: YEME) 배지. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 추출물은 트립톤; 카세인(산 및/또는 효소) 가수분해물; 펩톤; 카사미노산 중 하나 이상과 같지만 이로 제한되지 않는 전술한 복합 배지 중 하나에서 사용되는 동물, 유제품 또는 식물 유래 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물을 대체하거나 또는 보충하는데 사용되고; 그리고/또는 효모 추출물 및/또는 맥아 추출물을 대체하거나 또는 보충하는데 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 추출물은 약 5 g/ℓ 내지 약 25 g/ℓ 범위의 농도로 복합 배지에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 추출물은 약 25 g/ℓ 내지 약 32 g/ℓ, 또는 약 32 g/ℓ 내지 약 52 g/ℓ 또는 약 52 g/ℓ 초과의 범위의 농도로 복합 배지에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 예를 들어, 바이오매스 또는 생성물 수율과 같은, 예를 들어, 바람직한 배양 지표(metric)를 최대화하기 위해 복합 배지에 포함되는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 영양소(들)의 최적 농도(g/ℓ)를 결정하기 위해 반응 표면 분석법(
Figure pct00001
, T. V, BOUCHU, A., PERLOT, P., PARK, J. W., PARK, K. N., WEBER, F. J., TRAMPER, J., RINZEMA, A., D'SOUZA, F., LALI, A., & others (1999) D. LEVISAUSKAS, V. GALVANAUSKAS, R. SIMUTIS and A. L
Figure pct00002
37--42. Biotechnology Techniques, 13, 937-943)이 적용된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 LAB 균주를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 또 다른 배양물을 위한 성장 배지의 제형화에 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 영양소 수정 또는 보충은 LAB 배양물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 또 다른 배양물의 질소 요구량에 기여하거나 또는 이를 충족한다. 소정의 실시형태에서, 제형은 탄수화물(예를 들어, 락토스)의 공급원을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 탄수화물은, 예를 들어, LAB 배양에 의해 락트산과 같지만 이로 제한되지 않는 산으로 전환될 수 있으며, pH를 더 낮추어 제품을 보존하고 제품의 맛과 향미에 기여할 수 있다.
효모 세포로부터 농축된 가용성 성분인 효모 추출물이 또한 배양 성장 배지에 널리 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 제형은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자 및 효모 추출물을 포함할 수 있다(예를 들어, 효모 추출물과 조합하거나 또는 배지에서 효모 추출물의 일부를 대체). 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자는 제형에서 모든 효모 추출물을 대체하는데 사용된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물이 보충된 기초 제형의 보충은 약 100㎎/ℓ 내지 약 2.5 g/ℓ 범위의 양으로 발생한다. 소정의 실시형태에서, 배양 배지는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물이 약 0.25 g/ℓ 내지 약 4 g/ℓ, 또는 약 4 g/ℓ 내지 약 25 g/ℓ, 또는 약 25 g/ℓ 내지 약 32 g/ℓ, 또는 약 32 g/ℓ 내지 약 52 g/ℓ 또는 약 52 g/ℓ 초과의 범위의 농도로 보충된다.
소정의 실시형태에서, 우유 및/또는 육류 가수분해물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 미생물 유래 가수분해물로 대체된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 동물-유래 혈청의 양을 감소시키거나 또는 소태아 혈청과 같은 동물-유래 혈청의 제거를 가능하게 하여 완전 무혈청 배지를 제공한다. 소정의 실시형태에서, 이러한 우유 및/또는 육류 가수분해물의 대체 및/또는 혈청의 감소 또는 제거는 규제 승인을 용이하게 한다. 소정의 실시형태에서, 이러한 우유 및/또는 육류 가수분해물의 대체 및/또는 혈청의 감소 또는 제거는 의심스러운 원료로부터 잠재적 외래 인자의 공정 제거를 검증하기 위한 요건을 제거한다.
단백질 가수분해물은 일반적으로 비교적 안정적이며, 예를 들어, 냉장 온도에서 건조하게 보관될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 건조하게 보관되고/되거나 냉장 온도에서 보관된다.
종래의 볼-밀링 공정에 의한 건조 배지의 생산은 승온 및 물리적 손상(trauma)이 불안정한 가수분해물 성분을 분해할 수 있기 때문에 소정의 단백질 가수분해물을 포함시킴으로써 복잡해질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물을 이용하여, 해머 밀링 또는 유동층 과립화와 같은 체류 시간, 열 변성 및 기계적 전단을 감소시키는 배지 생산 공정이 이용된다.
사용 방법
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 또는 미생물의 컨소시엄으로부터 유래되는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 조성물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들)이 보충되거나 또는 이들을 포함하는 배양 배지에서 세포, 예를 들어, 동물 세포와 같은 진핵생물 세포 또는 유산균(LAB)과 같은 원핵생물 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들)는 또 다른 배양물을 위한 에너지 및/또는 탄소 및/또는 질소 공급원을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들)는 다음 중 하나 이상과 같지만 이로 제한되지 않는 배양 배지에서 사용되는 질소 공급원을 보충하거나 또는 대체한다: 동물 또는 식물 공급원으로부터의 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산; 및/또는 효모 추출물.
소정의 실시형태에서, 선행하는 성분 중 하나 이상을 포함하는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자 추출물 및/또는 제형은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 또 다른 미생물 및/또는 유기체의 영양 요구를 기반으로 설계되고/되거나 선택된다: 펩타이드; 아미노산; 탄소 공급원; 질소 공급원; 바이타민; 미네랄; 성장 인자; 및/또는 기타 영양소. 소정의 실시형태에서, 영양 성분 및/또는 제형은 다음 중 하나 이상을 제공하거나 또는 최적화하도록 설계되고 선택된다: 예측 가능한 발효 시간; 세포 수율; 세포 생존 능력; 다운스트림 처리; 및/또는 보관 수명.
소정의 실시형태에서, 선행하는 성분 중 하나 이상을 포함하는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자 추출물 및/또는 제형은 다음 중 하나 이상을 기반으로 설계되고/되거나 선택된다: 가수분해의 정도; 펩타이드 프로파일; 아미노 질소(AN)와 총 질소(TN) 사이의 비; 유리 아미노산의 수준; 미네랄 함량; 생산 비용; 회수 및/또는 다운스트림 처리의 용이성; 가격 대비 성능 비; 및/또는 규정 준수.
소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 필수 요소를 제공하여 또 다른 종/균주의 영양 요구성을 충족한다: 아미노산; 펩타이드; 바이타민; 미네랄; 핵산 염기; 및/또는 다른 성장 인자. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 펩톤, 단백질 가수분해물, 효모 추출물, 성장 인자 및/또는 바이타민은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 하나 이상의 영양소로 대체되거나 또는 교체된다. 소정의 실시형태에서, 지질, 다당류, 당류, PHB, PHA, PHV, 핵산, 바이타민 및/또는 미네랄 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소, 보조인자 또는 성분이 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 배지 성분을 대체하는데 사용된다: 당, 예컨대, 단당류(예를 들어 글루코스, 프럭토스), 이당류(예를 들어, 락토스, 수크로스, 말토스), 덱스트린 및/또는 말토덱스트린; 단백질 공급원, 예컨대, 무지방 분유, 유청 및/또는 유청 단백질 농축물; 단백질 가수분해물 또는 용해물, 예컨대, 펩톤, 카세인 가수분해물, 유청 단백질 가수분해물, 대두 단백질 가수분해물, 육류 단백질 가수분해물, 프리마톤, 가수분해된 곡류 고형물 및/또는 효모 추출물; 바이타민 및 미네랄의 공급원, 예컨대, 효모 추출물, 옥수수 침지액; 및/또는 Tween/올레산, 미네랄 염, 소포제 및/또는 완충액과 같은 기타 배지 성분.
소정의 실시형태에서, 지질; 다당류; 당류; PHB; PHA; PHV; 핵산; 바이타민 미네랄 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소, 보조인자 또는 성분이 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다른 배지 성분을 포함하는 배지 제형에 포함된다: 당, 예컨대, 단당류(예를 들어, 글루코스, 프럭토스), 이당류(예를 들어, 락토스, 수크로스, 말토스), 덱스트린 및/또는 말토덱스트린; 단백질 공급원, 예컨대, 무지방 분유, 유청 및/또는 유청 단백질 농축물; 단백질 가수분해물 또는 용해물, 예컨대, 펩톤, 카세인 가수분해물, 유청 단백질 가수분해물, 대두 단백질 가수분해물, 육류 단백질 가수분해물, 가수분해된 곡류 고형물 및/또는 효모 추출물; 효모 추출물 및/또는 옥수수 침지액과 같은 바이타민 및/또는 미네랄의 공급원; 및/또는 이러한 Tween/올레산, 미네랄 염, 소포제 및/또는 완충액과 같은 기타 배지 성분.
소정의 실시형태에서, 1종 이상의 화학독립영양성 미생물은 1종 이상의 종속영양성 유기체와 공배양되되, 상기 화학독립영양성 미생물은 아미노산과 같지만 이로 제한되지 않는 영양소를 배양 브로스에 분비하고, 종속영양성 유기체는 성장 및/또는 생산을 위해 아미노산과 같지만 이로 제한되지 않는 영양소를 섭취 및/또는 이용한다. 소정의 실시형태에서, 화학독립영양성 미생물은 쿠프리아비두스 미생물, 예를 들어, 쿠프리아비두스 네카토르 및/또는 쿠프리아비두스 메탈리두란스를 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 화학독립영양성 미생물은 쿠프리아비두스 네카토르 DSM 531 및/또는 DSM 541을 포함하는 쿠프리아비두스 네카토르 미생물 및/또는 쿠프리아비두스 메탈리두란스 DSM 2839를 포함하는 쿠프리아비두스 메탈리두란스를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 화학독립영양성 미생물은 용해되고/되거나 소비되고; 그리고/또는 화학독립영양적으로 합성된 단백질은 공배양에서 1종 이상의 다른 유기체에 의해 가수분해된다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 소정의 양태는 세포 배양물의 발효 및/또는 성장에서 세포 배양물의 영양 요구성 및 단백질 가수분해물 및/또는 다른 추출물의 용도에 관한 것이다. 소정의 양태는 세포 배양물의 발효 및/또는 성장에 사용되는 배지에 관한 것이다. 소정의 양태는 유산균(LAB)의 성장 및 이러한 성장에 사용되는 배지에 관한 것이다. 소정의 양태는 LAB를 포함하는 배양물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 세포 배양물의 성장 및 생존에 대한 특정 단백질 가수분해물의 긍정적인 효과에 관한 것이다.
소정의 실시형태에서, 화학적으로 정의된 배지(chemically defined medium: CDM)에는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 저분자량 펩타이드(LMWP)가 보충된다. 소정의 실시형태에서, LMWP는 분자량(MW)이 3,000Da 이하인 펩타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, LMWP의 대부분 또는 전부 또는 실질적으로 전부는 MW가 3,000Da 이하이다. 소정의 실시형태에서, 상기 LMWP가 보충된 CDM이 또 다른 균주(예를 들어, LMWP가 유래되는 미생물과 상이한 미생물 균주 또는 종)를 성장시키기 위해 제공될 때, 세포의 수는 CDM 단독(즉, LMWP 보충 없음)에 대한 다른 균주의 성장과 비교하여 적어도 1.3-배 증가한다. 소정의 실시형태에서, 상기 다른 균주는 락토바실러스 균주, 소정의 비제한적인 실시형태에서, L. 헬베티쿠스이다.
일부 실시형태에서, 배양 배지에서 단백질 가수분해물 조성물의 사용은 배양 배지에서 동물-유래 단백질 가수분해물, 아미노산 또는 혈청과 같은 일부 또는 임의의 동물-유래 성분을 포함시키지 않고 동물 세포를 배양할 수 있게 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 방법은 본 발명의 단백질 가수분해물 조성물이 첨가된 무혈청 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 세포는 배양 배지에 본 개시내용의 단백질 가수분해물을 제공함으로써 소 태아 혈청, 말 혈청, 염소 혈청 또는 임의의 다른 동물-유래 혈청 없이 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 혈청-유래 알부민, 트랜스페린, 인슐린, 성장 및/또는 기타 인자와 같은 임의의 동물-유래 성분 없이 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소, 보조인자 또는 성분은 시간이 지남에 따라 배양물의 균주 생존 능력을 개선한다. 소정의 실시형태에서, 이는 배양물에서 산화환원-전위를 유지하는데 도움이 된다. 시간 경과에 따른 균주 생존 능력은, 예를 들어, CFU/g(배양물의 그램당 콜로니 형성 단위)의 측면에서 측정될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자는 지역, 계절 또는 기후에 관계없이 일관되고 재현 가능한 방식으로 생성된다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자의 배취간 변동은 유사한 동물-기반 또는 식물-기반 가수분해물의 변동보다 적다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 다음 중 하나 이상을 생산하는데 사용된다: 스타터 배양물; 부가 배양물; 및/또는 1종 이상의 프로바이오틱. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 산업적 스타터 배양물, 예를 들어, 산업적 스타터 배양 발효물을 성장시키는데 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소는 스타터 배양물의 생산에 사용되는 발효 배지의 제형에 혼입된다. 소정의 실시형태에서, 상기 산업적 스타터 배양물은 LAB를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 스타터 배양물은 용액으로부터 회수되고, 보관, 수송 및/또는 판매를 위해 농축된 동결 또는 동결 건조된 형태로 전환된다. 소정의 실시형태에서, 스타터 배양과 관련하여 다음 다운스트림 처리 단계 중 하나 이상이 이용된다: 농축; 동결보호제의 첨가; 동결; 및/또는 동결-건조. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 영양소 상에서 성장한 프로바이오틱 균주가 발효유용 스타터 배양물의 성분 및/또는 유리 및/또는 캡슐화된 동결 건조된 물질의 형태로 제조될 수 있는 기능 식품으로 사용된다. 상업적인 스타터 배양 농축물은 때때로 "벌크식(bulk set)"(Redi식(Redi set)) 또는 "직접 접종식"(direct vat sets: DVS)으로 이용 가능하다. "벌크식"은 이후에 최종 생성물을 제조하기 위해 생산 배트(vat)에 접종되는 중간 스타터 배양물을 제조하는데 사용된다. 이러한 배양물은 동결(약 70㎖) 또는 동결 건조된 형태(약 5g 내지 10g의 패키지)로 이용 가능하며, 100ℓ 내지 1,000ℓ의 물질을 접종하도록 설계된다. DVS 배양은 최종 생산 배양에서 직접 접종원으로 작용한다. 이들은 배양 유형 및 적용에 따라 약 500g의 동결 배양물을 사용하여 2,500ℓ 내지 5,000ℓ의 물질을 접종하는 동결 또는 동결 건조된 배양물로 이용 가능하다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 스타터 배양물은 벌크식 배양 또는 DVS 배양으로 제조된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소가 1차 스타터 배양을 보완하고 및/또는 최종 발효 제품의 가치를 증가시키는데 기여하는 1종 이상의 균주를 성장시키는데 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 식품의 전통적인 발효물에 첨가된다. 소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 LAB 및/또는 프로바이오틱 배양물의 성장 및/또는 생존 능력을 위한 영양소를 제공한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 유제품 및/또는 육류 스타터 배양물의 생산에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 LAB 종의 질소 요구성을 충족한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물이 일반적으로 스타터 및/또는 풍미 및/또는 부가 배양물로 사용되는 세균 종을 포함하는 배양물에 공급된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물이 다음 중 1종 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 LAB 및/또는 다른 프로바이오틱스를 포함한 배양물에 공급된다: 락토코키(Lactococci); 락토바실러스; 스트렙토코키(Streptococci); 페디오코키(Pediococci); 및/또는 비피도박테리아(Bifidobacteria).
바이오매스 품질에 영향을 미치는 중요한 매개변수는 다운스트림 처리 동안 세포의 생존율을 결정하는 유기체의 세포벽의 조성 및 상태이다. 세포벽의 견고성은 종 및 심지어 균주에 따라 다를 수 있지만, 이는 또한 배지의 조성, 성장 조건 및 수확시 세포의 생리학적 상태에 의해서도 영향을 받을 것이다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자는 다음 중 하나 이상에 영향을 준다: 세포벽 두께; 세포의 신장; 및/또는 세포 분열.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자는 다음 미생물 중 1종 이상을 포함하는 배양물에 공급된다: 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis); 류코노스톡 종(Leuconostoc spp.); 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus); L. 불가리쿠스, L. 델브루엑키이 종 불가리쿠스(L. delbrueckii ssp. bulgaricus), L. 헬베티쿠스, L. 카세이(L. casei), L. 파라카세이(L. paracasei), L. 아시도필루스, L. 존소니이, L. 레우테리, L. 갈리나룸(L. gallinarum), L. 가세리(L. gasseri), L. 플란타룸(L. plantarum)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 락토바실러스 종; 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 페디오코커스 종(Pediococcus spp.); 및/또는 B. 아돌레센티스(B. adolescentis), B. 비피둠(B. bifidum), B. 락티스, B. 롱검(B. longum), B. 인판티스(B. infantis)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 비피도박테리움 종(Bifidobacterium spp.). 소정의 실시형태에서, 미생물은 1종 이상의 영양적으로 까다로운 균주를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 미생물은 1종 이상의 프로바이오틱을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자는 "일반적으로 안전한 것으로 인식된"(generally recognized as safe: GRAS) 그리고/또는 전통적으로(예를 들어, 역사적으로) 인간 식품 및 발효 제품을 만드는데 사용되어 온 것으로 간주되는 1종 이상의 미생물 및/또는 거대유기체에 공급된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자는 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 다른 유기체(예를 들어, 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 유래되는 미생물과 상이한 1종 이상의 유기체)에 공급된다: 효모, 예컨대, 칸디다 후밀리스(Candida humilis), 칸디다 밀레리(Candida milleri), 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii), 카자크스타니아 엑시구아(Kazachstania exigua)(사카로마이세스 엑시구오우스(Saccharomyces exiguous)), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 플로렌티누스(Saccharomyces florentinus), 토룰라스포라 델브루엑키이(Torulaspora delbrueckii), 트리코스포론 베이겔리(Trichosporon beigelli); 진균, 예컨대, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 소자에(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스 루쿠엔시스(Aspergillus luchuensis), 후사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) A3/5, 뉴로스포라 인터미디어 변이체 온코멘시스(Neurospora intermedia var. oncomensis), 리조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus), 리조푸스 오리자에; 세균, 예컨대, 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 서브틸리스, 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis)(락티스), 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검, 글루콘아세토박터 자일리누스(Gluconacetobacter xylinus)(코마가타에이박터 자일리누스(Komagataeibacter xylinus)), 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 힐가르디이(Lactobacillus hilgardii)(브레비박테리움 베르미포르메(Brevibacterium vermiforme)), 락토바실러스 케피라노파시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 레우테리, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 샌프란시스센시스(Lactobacillus sanfranciscensis), 락토코커스 락티스(스트렙토코커스 락티스; 스트렙토코커스 락티스 아종 다이아세티락티스(Streptococcus lactis subsp. diacetylactis)), 류코노스톡 종, 류코노스톡 카르노숨, 류코노스톡 크레모리스(Leuconostoc cremoris), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 페디오코커스 종, 프로피오니박테리움 프레우덴레이키이(Propionibacterium freudenreichii), 아르트로스피라(스피룰리나(Spirulina)) 플라텐시스, 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필루스, 스타필로코커스 자일로수스(aphylococcus xylosus). 소정의 실시형태에서, 유기체는 세균과 효모의 공배양물 또는 컨소시엄 또는 공생 배양물(symbiotic culture of bacteria and yeast: SCOBY)에 존재한다. 소정의 실시형태에서, 공배양, 컨소시엄 또는 SCOBY는 1종 이상의 화학독립영양성 미생물 균주를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소는 중온성 미생물(mesophilic) 또는 호열성 미생물(thermophilic) 유제품 배양물에 공급된다.
미생물은 광범위한 발효 제품의 제조에 사용된다. 발효 식품에 미생물을 사용하는 것은 미생물의 존재에 대한 지식보다 훨씬 이전부터 시작된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소는 다음 식품, 음료 또는 사료 물품 중 하나 이상을 생산하는데 사용되는 배양물에 공급된다: 요거트, 케피어, 버터밀크를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 발효유 제품; 사워 크림; 크림 치즈, 연질 치즈, 체다 치즈, 유럽식 치즈, 반경질 치즈, 경질 치즈, 체다, 스위스, 고다, 모짜렐라, 에멘탈, 파마산, 로마노, 프로볼로네, 잘스베르그, 레르담, 마스담을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 치즈; 발효된 육류, 소시지, 소시옹, 살라미; 사워도우 빵; 도사; 야채 피클, 피클, 사워크라우트, 오이, 김치, 츠케모노, 템페, 간장, 미소, 된장, 레드 온쫌(red oncom), 낫또, 올리브 및 올리브 국물(olive brine), 카카오를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 발효된 채소 및/또는 식물; 차, 콤부차, 준(jun), 진저 비어를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 발효 음료; 영양 효모; 빵; 맥주; 와인; 메스칼(mescal); 콜론체(colonche); 테킬라; 사이다; 미림; 딸기 나무 열매 주스; 사탕수수 주스; 식초; 기능 식품; 음료, 분말, 보충물 및 캡슐을 포함한 프로바이오틱스; 테쿠이틀라틀(tecuitlatl); 디헤(dihe); 사일리지(silage).
소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 LAB 미생물이 제한된 합성 능력을 갖거나 또는 합성할 수 없는 아미노산 및/또는 펩타이드를 제공한다. 소정의 실시형태에서, 아미노산은 전형적으로 우유 및/또는 우유, 동물 또는 식물로부터 유래되는 가수분해된 단백질로부터 공급되는 아미노산 또는 펩타이드를 대체하거나 또는 보충한다.
효소를 포함하지만 이로 제한되지 않는 새로운 단백질의 합성을 위한 빌딩 블록으로서 이용 가능한 단백질, 펩타이드 및/또는 유리 아미노산을 사용하기 위해서, 이들은 세포막을 가로질러 세포 내로 전위되어야 한다. 단백질 및 펩타이드가 너무 커서 세포의 흡수 시스템에서 처리할 수 없다면, 이들은 더 소형 펩타이드 또는 유리 아미노산으로 추가로 가수분해되어야 한다. 일부 LAB는 단백질을 펩타이드와 아미노산으로 분해하여 전위에 사용할 수 있도록 하는 세포외 프로테이스를 합성하고 분비할 수 있다. 예를 들어, L. 락티스는 우유 단백질을 소화하고, 세포에 필수적인 성장 자극 펩타이드 및 아미노산을 공급하기 위해 협력하여 작용하는 세포 외피에 위치한 프로테이네이스, 3개의 펩타이드 수송 시스템, 세포내 펩티데이스의 세트 및 9개의 상이한 아미노산 수송 시스템을 포함하는 단백질분해 시스템을 갖는다(Poolman, B., Juillard, V., Kunji, E. R. S., Hagting, A., & Konings, W. N. (1996) Casein-breakdown by Lactococcus lactis. In Lactic Acid Bacteria (pp. 303-326). Springer.; Kunji, E. R. S. (1996) The proteolytic systems of lactic acid bacteria. In Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology. https://doi.org/10.1007/BF00395933; Mierau, I., Venema, G., Kok, J., & Kunji, E. R. S. (1997) Casein and peptide degradation in lactic acid bacteria. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. https://doi.org/10.1080/02648725.1997.10647945). 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 바이오매스, 또는 전세포 생성물, 또는 세포 용해물, 또는 전 단백질 또는 거대 펩타이드를 포함하는 기타 조성물이 1종 이상의 세포외 프로테이스를 합성 및 분비할 수 있고/있거나 단백질을 펩타이드 및/또는 아미노산으로 가수분해할 수 있는 하나 이상의 단백질분해 시스템을 포함하는 미생물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 미생물은 락토코커스 미생물, 예를 들어, L. 락티스이다. 소정의 실시형태에서, 펩타이드 및/또는 아미노산은 세포외 프로테이스(들) 및/또는 단백질분해 시스템(들)을 제공하는 미생물과 동일하거나 또는 동일하지 않을 수 있는 유기체인 펩타이드 및/또는 아미노산의 수송 시스템을 갖는 미생물 또는 유기체에 공급된다. 소정의 실시형태에서, 그럼에도 불구하고 하나 이상의 세포외 프로테이스를 합성하고 분비할 수 있고/있거나 하나 이상의 단백질분해 시스템을 갖는 미생물이 효소 생산에 필요한 세포 에너지의 소비를 절약하여 세포 성장 및/또는 생성물의 수율을 개선하기 위해 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물에 공급된다. 또한, 최적 성장 및/또는 생산을 지원하기 위해 필수 아미노산이 미생물의 세포외 프로테이스(들) 및/또는 단백질분해 시스템(들)에 의해 단백질 영양소로부터 너무 느리게 방출되는 경우, 소정의 실시형태에서, 이러한 필수 아미노산은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 유리 아미노산의 형태로 제공되고/되거나 보충된다.
일부 LAB는 단백질분해 시스템이 부족하고, 질소 공급원으로서 아미노산 및 암모니아와 같은 염기성 빌딩 블록이 포함된 배지가 필요하다. 소정의 실시형태에서, 세포외 프로테이스를 합성 및 분비할 수 있고/있거나 단백질분해 시스템을 갖는 제1 미생물, 단백질분해 시스템이 부족하고/하거나 질소 공급원으로서 아미노산 및 암모니아와 같은 염기성 빌딩 블록이 포함된 배지를 필요로 하는 제2 상이한 미생물을 포함하는 공배양물이 제공된다. 소정의 실시형태에서, 제1 미생물은 L. 락티스와 같은 락토코커스 미생물이고/이거나 제2 미생물은 LAB이다.
LAB는 일반적으로 에너지 생성 경로를 상대적으로 비효율적으로 만드는 작용성 트라이카복실산(tricarboxylic acid: TCA) 회로를 가지고 있지 않다. 락토코커스 락티스, 스트렙토코커스 써모필루스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 헬베티쿠스 및 락토바실러스 아시도필루스와 같은 정상 발효성(Homofermentative) 유기체는 해당(엠덴-마이어호프-파르나스(Embden-Meyerhoff-Parnas) - EMP) 경로를 통해 에너지를 생성하되, 소비된 6탄당 1몰당 2몰의 ATP가 형성된다. 류코노스톡 종은 혼합 발효성(heterofermentative) 경로를 통해 에너지를 생성하고, 소비된 6탄당 1몰당 1몰의 ATP만이 형성된다. 추가적으로, ATP는 화학삼투 에너지 공정, 예를 들어, 락테이트 유출에 의해 생성될 수 있다. 또한, LAB는 일반적으로 소량의 포스포에놀 피루베이트 풀(pool)을 제외하고 글리코겐, 폴리포스페이트 및 폴리-β-하이드록시뷰티레이트와 같은 임의의 내인성 에너지 저장 화합물을 생성하지 않는다. 한 가지 예외는 비피도박테리움 비피둠으로, 이는 정지기 동안 글리코겐 및 폴리포스페이트와 같은 저장 화합물을 형성한다. 결과적으로, 동화 과정 및 LAB 배양물의 세포 성장을 지원하기 위해, 에너지 및 기타 영양소 공급원이 일반적으로 배양 배지에 공급되어야 한다.
본 명세서의 소정의 실시형태에서, 불완전 트라이카복실산(TCA) 회로를 보충하는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 LAB 배양물에 공급된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자가 LAB 배양물에 공급되며, 이는 비효율적인 LAB 대사에 의해 구동되는 동화 경로를 통해 생화학 물질(예를 들어, 유기 화합물)을 합성하는데 소비될 배양 에너지를 절약하여 락토스 또는 글루코스 및/또는 ATP와 같은 탄소 공급원을 보존하고/하거나 보다 효율적으로 이용한다. 소정의 실시형태에서, 동화 경로를 통해 합성된 생화학 물질은 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 아미노산; 펩타이드; 지질; 당류; 다당류; 핵산; 바이타민; 및/또는 보조인자.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자는 포스포에놀 피루베이트(PEP) 풀을 보충하고/하거나 LAB 배양물과 같지만 이로 제한되지 않는 미생물 배양물을 위한 풀에서 PEP의 농도를 증가시키는 역할을 한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 추출물은 LAB 배양물과 같은 배양물에 다음 중 하나 이상을 제공한다: 세포벽 성분, 예컨대, 지질, 테이코산 및/또는 펩타이도글리칸; 및/또는 퓨린 및 피리미딘 염기와 같은 RNA 및/또는 DNA 전구체. 소정의 실시형태에서, 배지에 이러한 보충물을 제공하면 생화학 물질을 합성할 때 배양물에 의해 소비되는 당 및/또는 ATP가 보존된다.
락토코키는 상당히 영양가 있는 성장 배지인 우유에 대한 오랜 적응으로 인해 강한 단백질분해 활성 특성을 상실하고 대부분 아미노산에 대한 영양요구성을 획득한 많은 경질 및 반경질 치즈, 및 발효유와 크림의 생산에 사용되는 낙농 배양물의 주요 구성성분이다(Bringel, F., & Hubert, J. C. (2003) Extent of genetic lesions of the arginine and pyrimidine biosynthetic pathways in Lactobacillus plantarum, L. paraplantarum, L. pentosus, and L. casei: Prevalence of CO2-dependent auxotrophs and characterization of deficient arg genes in L. plantarum. Applied and Environmental Microbiology. https://doi.org/10.1128/AEM.69.5.2674-2683.2003; Morishita, S., & Tarui, S. (1981. Lactic acidosis. Nihon Rinsho. Japanese Journal of Clinical Medicine, 39(11), 3459-3465). 아미노산 요구성 및 수송 시스템은 락토코키의 성장-제한 인자로 알려져 있다(Poolman and Konings 1988). 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물이 우유 기질에 대한 진화로 인해 단백질분해 활성을 상실하고/하거나 아미노산 영양요구성을 획득한 미생물을 포함하는 배양물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 단백질분해 활성을 상실하고/하거나 아미노산 영양요구성을 획득한 미생물은 락토코키 균주이다.
유제품 락토코커스 락티스 아종 락티스는 다음의 적어도 7개의 아미노산에 대해 영양요구성이다: Gln, Met, Leu, Ile, Val, Arg 및 His(Law et al. (1976)). L. 락티스 종 크레모리스 균주는 L. 락티스 종 락티스보다 훨씬 더 까다로우며 종종 추가적인 Tyr, Asn 및 Ala를 필요로 하는 것으로 보고되어 있다. 소정의 실시형태에서, Gln; Met; Leu; Ile; Val; Arg; His; Tyr; Asn; 및/또는 Ala 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산이 이들 아미노산 중 하나 이상에서 영양요구성인 또 다른 미생물 균주에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 아미노산 또는 단백질성 보충물 조성물은 다음 중 하나 이상의 형태로 영양요구성 균주에 제공된다: 유리 아미노산; 펩타이드; 단백질 가수분해물; 단백질; 용해물; 및/또는 전세포 바이오매스. 소정의 실시형태에서, 영양요구성 균주는 유제품 락토코커스 락티스 아종 락티스 및/또는 L. 락티스 종 크레모리스이다. 소정의 실시형태에서, 유리 아미노산; 펩타이드; 단백질 가수분해물; 단백질; 용해물; 및/또는 전세포 바이오매스 형태 중 하나 이상으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산이 보충된 성장 배지는 우유에서의 성장률과 비교하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 영양요구성 균주와 같은 미생물 균주의 성장률을 증가시킨다. 소정의 실시형태에서, 아미노산 또는 단백질성 보충물은 배지에 최대 약 4%(w/v) 또는 최대 약 2.5%(w/v)의 수준으로 제공된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 또는 단백질성 보충물의 사용량은 약 0.5%(w/v) 내지 약 2.5%(w/v)이다. 소정의 실시형태에서, 아미노산 보충물은 약 4%(w/v) 초과의 수준으로 제공된다. 소정의 실시형태에서, 아미노산 또는 단백질성 보충물은 다음 아미노산 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: Leu; Phe; 및/또는 Glu. 소정의 실시형태에서, 보충 배지에 대한 성장률은 우유에 대한 성장률보다 적어도 약 10%, 20% 또는 40% 더 높다.
프롤린(Pro)은 이 아미노산을 합성하는 능력에 관계없이 L. 락티스 균주의 성장을 자극하는 것으로 밝혀졌다(Smid and Konings (1990)). 우유에는 Pro가 풍부하지만, 일부 균주에는 프롤린 수송 시스템이 결여되어 있기 때문에 이 아미노산은 쉽게 이용 가능하지 않은 것으로 보고되어 있다. 프롤린은 수동 확산 또는 프롤린 함유 펩타이드의 수송에 의해서만 세포 내로 수송될 수 있다(Smid and Konings, 상기 참조). 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 Pro는 또 다른 배양물(예를 들어, Pro가 유래되는 미생물(들)과 상이한 미생물의 배양물)에 제공된다. 소정의 실시형태에서, Pro는 유리 아미노산으로 그리고/또는 Pro 함유 펩타이드 및/또는 단백질 내에서 제공된다. 소정의 실시형태에서, 상기 Pro 보충물의 형태로 제공되는 배양물은 1종 이상의 L. 락티스 균주를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 Pro가 생산되는 미생물 균주는 Pro가 제공되지 않은 동일한 배양물보다 더 높은 성장률을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 미생물 균주는, 예를 들어, 다음 중 1종 이상의 L. 락티스 균주이다: 락토코커스 락티스 아종 락티스 및/또는 락토코커스 락티스 아종 크레모리스 균주.
수많은 화학적으로 정의된 배지가 L. 락티스에 대해 개발되었다. Otto 등(1983)에 의해 개발되고 상기 문헌[Poolman and Konings (1988)]에 의해 변형된 표준 합성 배지(MCD)는 18종의 아미노산과 14종의 바이타민을 포함한 47가지 성분을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 또 다른 미생물(예를 들어, 아미노산 및/또는 바이타민이 유래되는 미생물과 상이한 미생물)에 대한 화학적 정의된 배지에 포함된 1종 이상의 아미노산 및/또는 바이타민이 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 아미노산(들) 및/또는 바이타민(들)은 유일한 탄소 공급원인 CO2로부터 생성된다. 소정의 실시형태에서, 아미노산(들) 및/또는 바이타민(들)을 섭취하는 미생물은 락토코커스 미생물, 예를 들어, L. 락티스이다. 소정의 실시형태에서, 1종 이상의 아미노산이 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 배양 배지에 제공되되, 아미노산(들)의 누락은 아미노산(들)이 포함되지 않은 배지가 제공된 배양물에 대해 적어도 약 75% 더 낮은 성장률 및/또는 적어도 약 50% 더 낮은 바이오매스 수율을 초래할 것이다.
여러 락토바실러스 종이 요거트(L. 델브루엑키이 종 불가리쿠스) 및 다양한 유형의 치즈(L. 헬베티쿠스, L. 파라카세이)의 생산을 위한 스타터 배양물의 성분으로, 그리고 발효유 및/또는 기능 식품(L. 아시도필루스, L. 존소니이, L 레우테리)의 프로바이오틱스로 사용된다. 영양 및 질소 요구성은 종마다, 심지어 동일한 종/아종의 균주 간에도 크게 다르다. 락토바실러스 종의 일반적인 영양 요구성을 설명하기 위해 여러 연구가 수행되었다. Elli 등(2000) 및 Chervaux 등(2000)은 21종의 아미노산 및 60가지 성분을 포함한 기타 영양소를 포함하는 화학적으로 정의된 배지를 사용하여 22종의 락토바실러스 균주의 영양 요구성을 설명하였다. 일반적으로, 최적의 성장과 생존 능력을 위해, 이러한 락토바실러스는 풍부한 탄소 및 질소 공급원, 바이타민, 미량 영양소와 다량 영양소 및 뉴클레오타이드 염기가 보충된 발효 배지를 필요로 한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 바이오매스; 단백질; 용해물; 단백질 가수분해물; 펩타이드 조성물; 아미노산 조성물; 및/또는 다른 추출물 중 하나 이상이 다음 중 하나 이상을 1종 이상의 락토바실러스 균주(들)를 포함하는 배양물에 제공하는데 사용된다: 탄소 공급원(들); 질소 공급원(들); 바이타민(들); 다량 영양소(들); 미량 영양소(들); 및/또는 뉴클레오타이드 염기(들).
L. 헬베티쿠스는 대부분의 다른 락토바실러스 또는 락토코커스 균주보다 더 큰 아미노산 요구성을 갖는 것으로 보고되어 있다. 상기 Morishita 등(1981)은 균주 ATCC15009가 14종의 아미노산, 4종의 바이타민 및 우라실에 대해 영양요구성인 반면, 균주 CRL 1062는 13종의 아미노산을 필요로 함을 보여주었다(Hebert, et al. 2000). 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산; 바이타민; 및/또는 우라실과 같은 RNA 및/또는 DNA 염기 중 하나 이상이 다음 아미노산 중 하나 이상에 대한 영양요구성을 포함하는 배양물에 제공된다; 바이타민; 및/또는 우라실과 같지만 이로 제한되지 않는 핵염기. 소정의 실시형태에서, 영양요구성 균주는 L. 헬베티쿠스 균주이다.
프로바이오틱 락토바실러스 아시도필루스(LA)는 성장을 위해 Pro, Arg, Glu(Morishita, et al. (1981), 상기 참조), 방향족 아미노산 및 His(Hebert, et al. (2000), 상기 참조)의 존재를 필요로 하는 것으로 보고되어 있다. 방향족 아미노산 및 His에 대한 필요성은 완전히 기능적인 5탄당 인산 경로를 갖지 않는 LA와 관련이 있는 것으로 보고되어 있다. 그러나, LA는 또한 거의 모든 18종의 아미노산 유형에 의해 크게 자극되는 것으로 보고되어 있다. 소정의 실시형태에서, Pro, Arg, Glu, 방향족 아미노산 및/또는 His 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산이 1종 이상의 다른 균주(예를 들어, 아미노산(들)이 유래되는 미생물과 상이한 미생물 균주)에 제공된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 균주(들)는 성장을 위해 다음 중 하나 이상을 필요로 한다: Pro, Arg, Glu, 방향족 아미노산 및/또는 His. 소정의 이러한 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 생산된 이들 아미노산(즉, Pro, Arg, Glu, 방향족 아미노산 및/또는 His)은 완전히 기능적인 5탄당 인산 경로를 갖지 않는 1종 이상의 미생물에 제공된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 다른 균주(들)는 LA 균주를 포함한다.
Arg는 필수적인 것으로 간주되지는 않지만, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 레우테리, 페디오코커스 펜토사세우스 및 스트렙토코커스 써모필루스 균주의 성장을 자극하는 것으로 보고되어 있다. 소정의 비제한적인 실시형태에서, Arg는 1종 이상의 다른 균주, 예를 들어, Arg에 의해 성장이 자극되는 본 명세서에 기재된 바와 같이 Arg가 생산되는 미생물과 상이한 미생물 균주에 제공된다. 소정의 실시형태에서, Arg는 다음 미생물 중 1종 이상을 포함하는 배양물에 제공된다: L. 불가리쿠스; L. 아시도필루스; L. 레우테리; 페디오코커스 펜토사세우스; 및/또는 S. 써모필루스 균주(들). 소정의 실시형태에서, 삼중항 코돈에 의해 직접 암호화되는 20종의 모든 단백질 생산성(proteogenic) 아미노산이 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산되고, 1종 이상의 다른 균주(예를 들어, 아미노산(들)이 유래되는 미생물과 상이한 미생물 균주(들))에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 1종 이상의 다른 균주의 성장은 본 개시내용에 따라 생산되고 본 명세서에 기재된 바와 같이 제공되는 20종의 아미노산 중 1종 이상의 제공에 의해 자극된다. 소정의 실시형태에서, 다른 균주(들)는 LA 균주 및/또는 락토바실러스 레우테리 균주를 포함한다.
락토바실러스 레우테리는 성장을 위해 아미노산 Met, Glu, Tyr, Trp, His, Leu, Val 및 Ala를 필요로 하며, 다른 아미노산이 유기체에 제공되지 않을 때 성장률이 감소하는 특히 까다로운 유기체로 알려져 있다. 소정의 실시형태에서, Met, Glu, Tyr, Trp, His, Leu, Val 및/또는 Ala 중 1종 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산이 1종 이상의 다른 균주, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 아미노산이 생산되는 미생물과 상이한 미생물 균주에 제공된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 상기 다른 균주(들)는 성장을 위해 다음 중 1종 이상을 필요로 한다: Met, Glu, Tyr, Trp, His, Leu, Val 및/또는 Ala. 소정의 실시형태에서, 상기 다른 균주(들)는 락토바실러스 레우테리를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 Met, Glu, Tyr, Trp, His, Leu, Val 및 Ala 이외의 추가적인 아미노산이 또한 락토바실러스 레우테리에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 유전자 코드에서 삼중항 코돈에 의해 직접 암호화되며 "표준" 아미노산으로 알려진 20종의 모든 단백질 생산성 아미노산이 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산되고, 1종 이상의 다른 균주 및/또는 유기체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 아미노산이 생산되는 미생물과 상이한 미생물 균주 및/또는 유기체에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 22종의 모든 단백질 생산성("단백질-빌딩(protein-building)") 아미노산이 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산되고, 1종 이상의 다른 균주 및/또는 유기체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 아미노산이 생산되는 미생물과 상이한 미생물 균주 및/또는 유기체에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 대략 500개의 공지된 자연 발생적 아미노산 중 1종 이상이 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산되고, 1종 이상의 다른 균주 및/또는 유기체 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 아미노산이 생산되는 미생물과 상이한 미생물 균주 및/또는 유기체에 제공된다.
스트렙토코커스 써모필루스(ST) 균주는 요거트 배양 및 일부 치즈 배양의 필수 구성요소이다. 락트산 외에도, 일부 균주는 발효유의 질감에 기여하며 일부 유형의 치즈의 수율을 개선할 수 있는 세포외다당류(exopolysaccharides: EPS)를 생산한다(Petersen, et al. (2000)). S. 써모필루스의 성장은 배지에 질소 공급원이 필요하다. 우유는 S. 써모필루스의 성장에 적합한 질소를 포함하고 있다. 그러나, 우유에 존재하는 아미노산 및 비단백질성 질소의 자연적 공급은 S. 써모필루스가 높은 세포수로 성장하는 것을 지원하는데 불충분하다. 본 명세서의 소정의 실시형태에서, 전세포 바이오매스 생성물 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소, 보조인자 또는 성분과 같은 영양소(들)가 EPS 및/또는 락트산과 같지만 이로 제한되지 않는 다당류를 생산하는 배양물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, S. 써모필루스에 제공되는 영양소(들)는 EPS 및/또는 더 큰 캡슐의 생산을 증가시킨다. 소정의 실시형태에서, 영양소(들)는 발효유의 질감을 개선하고/하거나 치즈의 수율을 개선한다. 소정의 실시형태에서, 상기 영양소(들)는 S. 써모필루스에 대한 질소 공급원 또는 S. 써모필루스에 대한 보충적 질소 공급원의 역할을 한다. 소정의 실시형태에서, 우유에 영양소(들)를 보충하거나 또는 우유를 영양소(들)로 대체하면 우유 단독에서의 성장과 비교하여 미생물 균주가 더 높은 세포수로 성장한다. 소정의 실시형태에서, 더 높은 세포수로 성장하는 균주는 S. 써모필루스이다.
S. 써모필루스는 전 단백질을 소화하기 위해 세포벽 관련 프로테이네이스에 의존하거나 또는 아미노산, 펩타이드 및 올리고펩타이드의 공급원으로서 단백질 가수분해물에서 성장한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 전 단백질과 같은 영양소가 S. 써모필루스에 제공되며, 이러한 영양소를 성장 및/또는 EPS 및/또는 락트산의 생산에 필요한 아미노산, 펩타이드 및/또는 올리고펩타이드로 전환하는데 이의 천연 프로테이네이스에 의존한다.
S. 써모필루스의 경우, Gln 및 Glu는 황-함유 아미노산과 함께 필수 아미노산으로 간주된다. 또한, 분지형 사슬 아미노산(BCAA) 생합성 경로는 기능적이지만 보충적 BCAA가 보충되지 않으면 S. 써모필루스가 최적의 성장을 하기에 불충분하다(Garault, et al. (2000)). 따라서, BCAA가 일반적으로 보충된다. 소정의 실시형태에서, Gln; Glu; 황-함유 아미노산; 및/또는 BCAA 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 펩타이드 및/또는 단백질 내에서 유리되거나 또는 결합된 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산이 1종 이상의 다른 균주 또는 유기체, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 아미노산이 생산되는 미생물과 상이한 미생물 균주 및/또는 유기체에 제공된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 균주는 S. 써모필루스이다.
효모 추출물과 조합된 단백질 가수분해물은 S. 써모필루스의 최적의 생산을 위한 적절한 질소 공급원을 제공할 수 있는 것으로 보고되어 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 S. 써모필루스와 같지만 이로 제한되지 않는 미생물에 제공되는 성장 배지에서 효모 추출물과 조합된다. 소정의 실시형태에서, 효모 추출물은 S. 써모필루스와 같지만 이로 제한되지 않는 미생물에 제공되는 배지에서 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물, 가수분해물 및/또는 다른 추출물로 대체된다. 소정의 실시형태에서, 엘리커 브로스(락토바실러스 브로스로도 알려져 있음) 중 하나 이상의 성분이 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들) 및/또는 보조인자(들)로 대체되어 변형된 엘리커 브로스를 생성한다. 소정의 실시형태에서, 변형된 엘리커 브로스에서 대체되는 성분은 카세인 가수분해물 및/또는 효모 추출물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 엘리커 브로스에 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들) 및/또는 보조인자(들)가 보충되어 보충된 엘리커 브로스가 생성된다. 소정의 실시형태에서, 변형 및/또는 보충된 엘리커 브로스는 스트렙토코키 및/또는 락토바실러스를 배양하는데 사용된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 배양 배지에 약 5 g/ℓ 내지 약 20 g/ℓ, 또는 약 5 g/ℓ 내지 약 25 g/ℓ 또는 약 20 g/ℓ 내지 약 25 g/ℓ의 농도로 제공된다. 우유에 카세인 및 유청의 가수분해물을 첨가하면 S. 써모필루스 ST-7의 성장 및 산성화 속도를 향상시켜 요거트의 발효 시간을 감소시키는 것으로 보고되어 있다(Lucas, et al.). 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 가수분해물은 또 다른 배양물의 성장 및/또는 산성화 속도를 향상시킨다. 소정의 실시형태에서, 배양물은 S. 써모필루스 ST-7을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 우유에 2%의 산 카세인 가수분해물 및 시스테인을 첨가하면 동결 유제품 디저트에서 테스트될 때 12주에 걸쳐 S. 써모필루스 WJ7의 생존 능력을 개선하는 것으로 보고되어 있다(Ravula and Shah, 1998). 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물은 배양 배지에 약 2%(w/v) 농도로 첨가된다. 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 카세인 가수분해물 및/또는 시스테인을 대체하는데 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물 및/또는 아미노산 조성물은 미생물, 예를 들어, S. 써모필루스 배양물의 생존 능력을 개선한다.
비피도박테리움 종은 발효유의 스타터 배양 성분 및 캡슐화된 동결 건조된 물질로 사용된다. 모든 비피도박테리아는 락토스를 이용할 수 있어 우유에서 성장할 수 있지만, 종종 낮은 단백질분해 활성으로 인해 성장이 약하다([Klaver, et al., 1993; Collins and Hall, 1984). 그러나, 비피도박테리움 비피둠 및 비피도박테리움 아돌레센티스와 같은 종은 세포내 및 세포외 프로테이스를 생성하는 것으로 보고되어 있다. 대부분의 균주는 류신 아미노펩티데이스를 포함하는 반면, 일부는 발린 아미노펩티데이스를 포함한다(Desjardins, et al. 1990). 대부분의 비피도박테리아는 암모늄염을 유일한 질소 공급원으로 사용할 수 있지만(Azaola, et al. 1999), 펩타이드 및 아미노산의 보충은 이들 균주의 경제적인 생산에 필요한 것으로 간주된다. 특정 질소 요구성은 균주에 따라 다르지만, 전형적인 질소 공급원은 펩타이드/아미노산, 시스테인 및 암모늄염이다. 비피도박테리아는 바이오틴 및 칼슘 판토테네이트를 포함한 성장 인자 및 바이타민에 대한 수요가 상대적으로 높은 것으로 보고되어 있다(Kurmann and Rasic, 1991). 다이설파이드/설피드릴-함유 펩타이드, 금속(Fe, Cu, Zn)과 결합된 락토페린, α-락트알부민 및 β-락토글로불린과 같은 여러 단백질 성장 촉진제가 우유에서 형성된다(Petschow and Talbott, 1991). 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 단백질분해성 소화물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들) 및/또는 보조인자(들)과 같은 영양소는 우유 및/또는 락토스를 포함하는 배양 배지와 조합된 다음, 다른 배양물, 예를 들어, 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 단백질분해성 소화물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들) 및/또는 보조인자(들)가 유래되는 미생물과 상이한 미생물의 배양물에 공급된다. 소정의 실시형태에서, 락토스와 같은 다른 배지 성분과 조합될 수 있는 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 단백질분해성 소화물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들) 및/또는 보조인자(들)가 우유 대신 사용된다. 소정의 실시형태에서, 배양물은 1종 이상의 비피도박테리움 균주를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은, 예를 들어, 낮은 단백질분해 활성으로 인해 우유와 같은 기질 상에서 느린 성장을 나타내는 미생물 배양물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 배양물은 1종 이상의 비피도박테리움 균주(들)를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 영양소, 보충물 또는 배지 제형(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함)은 1종 이상의 비피도박테리움 균주(들)를 포함하는 배양물에 제공되며, 우유 단독에서 성장한 동일한 배양물보다 더 빠른 성장이 관찰된다.
소정의 실시형태에서, 세포내 및/또는 세포외 프로테이스를 생산하는 미생물을 포함하는 배양물에, 예를 들어, 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 농축물 및/또는 단백질 단리물 및/또는 전 단백질을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 영양소가 제공되며, 프로테이스 생성 미생물은 영양소를 성장 및 바이오매스 및/또는 바이오 생성물(들)의 생산을 위해 미생물뿐만 아니라 다른 미생물에 의해 사용될 수 있는 펩타이드 및/또는 유리 아미노산으로 소화할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 프로테이스 생성 미생물은 비피도박테리움 비피둠 및/또는 비피도박테리움 아돌레센티스일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
소정의 실시형태에서, 배양물에는 배양물 및/또는 배양 생성물의 경제적인 생산을 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 펩타이드 및/또는 아미노산이 보충된다. 소정의 실시형태에서, 배양물은 1종 이상의 비피도박테리움 균주를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 시스테인을 포함하지만 이로 제한되지 않는 펩타이드 및/또는 아미노산을 포함하는 질소 공급원이 제형화된다. 소정의 실시형태에서, 질소 공급원은 또한 암모늄염을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 무기 형태의 질소를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 질소 공급원은 또 다른 배양물, 예를 들어, 1종 이상의 비피도박테리움 균주를 포함하는 배양물과 같지만 이로 제한되지 않는 질소 공급원이 유래되는 미생물과 상이한 미생물의 배양물에 제공된다.
소형 펩타이드는 소정의 비피도박테리움 균주에 대해 유리 아미노산보다 더 나은 아미노산 공급원인 것으로 보고되어 있다(Proulx, et al., 1994). 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질의 가수분해는 소형 펩타이드를 최대화하고 유리 아미노산을 최소화하도록 설계된다. 소정의 실시형태에서, 고농도의 유리 아미노산의 출현을 방지하기 위해 효소적 가수분해가 이용된다. 소정의 실시형태에서, 유리 아미노산 함량이 낮거나 또는 없거나 또는 실질적으로 없는 펩타이드가 또 다른 배양물, 예를 들어, 1종 이상의 비피도박테리움 균주를 포함하는 배양물과 같지만 이로 제한되지 않는 펩타이드가 유래되는 미생물과 상이한 미생물의 배양물에 제공된다. 프로테이네이스의 선택은 성장 촉진제로서 단백질 가수분해물의 가치에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. 트립신-분해된 카세인으로부터의 펩타이드는 Alcalase® 또는 키모트립신의 효소 소화물보다 비피도박테리움 롱검 및 비피도박테리움 인판티스에 대해 더 나은 성장 촉진 효과가 있는 것으로 보고되어 있다(Proulx et al., 1994, 상기 참조). 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물은 본 명세서에 기재된 바와 같이(예를 들어, CO2, CO 및/또는 CH4와 같은 C1 화합물로부터, 예를 들어, 화학독립영양적으로) 생산된 단백질로부터 효소적으로 생산되고, B. 롱검 및/또는 B. 인판티스 중 1종 이상을 포함하는 미생물 배양물과 같지만 이로 제한되지 않는 또 다른 배양물에 제공된다.
복합 배지에 사용된 에세리키아 콜라이 추출물은 B. 롱검에 대해 상당한 성장 촉진 효과를 가져오는 것으로 보고되어 있다(Ibrahim and Bezkorovainy, 1994). 소정의 실시형태에서, CO2, CO 및/또는 CH4와 같지만 이로 제한되지 않는 C1 기질 상에서 성장한 화학독립영양성 미생물로부터의 추출물이 또 다른 유기체에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 성장 배지에 추출물을 첨가하면 비피도박테리움 미생물, 예를 들어, B. 롱검과 같지만 이로 제한되지 않는 또 다른 유기체에서 성장 촉진 효과가 발생한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 영양소는 바이오틴 및/또는 칼슘 판토테네이트와 같지만 이로 제한되지 않는 성장 인자 및 바이타민을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 성장 인자 및/또는 바이타민은 또 다른 배양물, 예를 들어, 성장 인자 및/또는 바이타민이 유래되는 미생물과 상이한 유기체 및/또는 미생물의 배양물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 바이타민은 바이오틴 및/또는 칼슘 판토테네이트를 포함하며, 이러한 영양소가 제공되는 배양물은 1종 이상의 비피도박테리움 균주를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 영양소는 다이설파이드/설피드릴-함유 펩타이드와 같지만 이로 제한되지 않는 단백질 성장 촉진제를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 성장 촉진제는 우유와 같은 다른 기질로부터의 금속(예를 들어, Fe, Cu, Zn)과 결합된 락토페린, α-락트알부민 및/또는 β-락토글로불린과 같은 1종 이상의 성장 촉진제와 조합된다. 소정의 실시형태에서, 전술한 단백질 성장 촉진제 중 1종 이상이 또 다른 배양물, 예를 들어, 1종 이상의 비피도박테리움 균주를 포함하는 배양물과 같지만 이로 제한되지 않는 단백질 성장 촉진제가 유래되는 미생물과 상이한 유기체 및/또는 미생물의 배양물에 제공된다.
펩타이도글리칸 단위 N-아세틸글루코사민 및 뮤람산의 빌딩 블록이며 따라서 세포벽의 필수 성분인 D-글루코사민은 비피도박테리움 종에 필요하다(Poupard, et al. (1973), 상기 참조). 세포벽의 조성 및 강도는 다운스트림 처리 동안 비피도박테리아의 생존에 영향을 미친다. 우유는 올리고당류의 형태로 N-아세틸-글루코사민을 포함하며, 이는 글루코사민 공급원으로서 가장 많이 사용된다(Exterkate and Veerkamp, 1969). 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 생성물 및/또는 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 추출물은 다음 중 하나 이상과 같은 펩타이도글리칸 및/또는 펩타이도글리칸 단위를 포함한다: D-글루코사민; N-아세틸글루코사민; 및/또는 뮤람산. 소정의 실시형태에서, 펩타이도글리칸 및/또는 펩타이도글리칸 단위가 또 다른 배양물, 예를 들어, 펩타이도글리칸 및/또는 펩타이도글리칸 단위가 유래되는 미생물과 상이한 유기체 및/또는 미생물의 배양물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 펩타이도글리칸 및/또는 펩타이도글리칸 단위는 식물 동물성 공급원, 예컨대, 우유와 같은 또 다른 공급원으로부터의 N-아세틸-글루코사민과 같은 펩타이도글리칸 및/또는 펩타이도글리칸 단위를 대체 또는 보충하는데 사용된다. 소정의 실시형태에서, 배양물은 유기체, 예를 들어, 미생물의 세포벽 생산 및/또는 성장을 위해 펩타이도글리칸 및/또는 펩타이도글리칸 단위를 필요로 한다. 소정의 실시형태에서, 배지 성분 및/또는 보충물로서 펩타이도글리칸 및/또는 펩타이도글리칸 단위의 제공은 배양물에서 미생물의 조성 및 세포벽 강도를 개선하고/하거나 다운스트림 처리 동안 배양물에서 미생물의 생존을 개선한다. 소정의 실시형태에서, 배양물은 1종 이상의 비피도박테리움 균주를 포함한다.
복잡한 영양 요구성에 더하여, 비피도박테리아의 배양은 또한 산소에 대한 이러한 균주의 극도의 민감도를 처리할 필요가 있다. 이러한 문제는 일반적으로 낮은 산화환원 전위를 유지할 수 있는 물질을 첨가함으로써 극복된다. 이러한 목적을 위해 시스테인, 아스코르브산 또는 소듐 설파이트가 종종 사용된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 1종 이상의 영양소 및/또는 생화학 물질(예를 들어, 유기 화합물)은 이들이 첨가되는 배양 배지 및/또는 배양 환경 내에서 낮은 산화환원 전위를 유지하는 것을 돕는다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 산화환원 전위 저하 성분(들)은 시스테인 및/또는 아스코르브산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 산화환원 전위 저하 성분(들)은 1종 이상의 비피도박테리움 균주를 포함하는 배양물에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 1종 이상의 영양소 및/또는 배양 배지 상에서 성장한 배양물은 발효 식품, 예를 들어, 발효유와 같은 발효 제품을 위한 스타터 배양물로 사용되고/되거나 캡슐화된 동결 건조된 물질로 추가로 처리된다.
페디오코키는 전통적인 발효된 소시지를 위한 스타터 배양 성분으로 사용된다. 우유와 달리, 육류는 스타터 배양물을 접종하기 전에 저온살균되지 않으며, 여전히 많은 양의 토착 미생물총을 포함한다. 페디오코커스 종의 생산을 위해, 글루코스 또는 수크로스가 에너지 및 탄소 공급원으로 사용된다. 필수적인 것은 아니지만, 아세테이트의 첨가는 유도기를 감소시키고 유기체의 성장을 자극하는 것으로 보고되어 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 단백질분해성 소화물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들) 및/또는 보조인자(들)과 같은 영양소는 배양 배지에서 글루코스 및/또는 수크로스와 배합되고, 이후에 또 다른 배양물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 단백질분해성 소화물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들) 및/또는 보조인자(들)와 같은 영양소가 유래되는 미생물과 상이한 유기체 및/또는 미생물의 배양물에 공급된다. 소정의 실시형태에서, 배양물은 1종 이상의 페디오코커스 균주를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 배양 배지는 추가적으로 아세테이트를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 아세테이트는, 예를 들어, CO2, CO 및/또는 CH4와 같지만 이로 제한되지 않는 C1 기질로부터 화학독립영양적으로 생성된다. 소정의 실시형태에서, 1종 이상의 페디오코커스 균주는 육류와 상이한 단백질성 기질 상에서 발효된다. 소정의 실시형태에서, 단백질성 기질은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 단백질분해성 소화물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소(들) 또는 보조인자(들)를 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 기질은 1종 이상의 페디오코커스 균주와 같지만 이로 제한되지 않는 스타터 배양물을 접종하기 전 저온살균되지 않으므로 토착 미생물총을 포함할 수 있다.
페디오코커스 펜토사세우스는 Val, Ala, Met, Pro, Arg, Glu, Cys, Tyr 및 His에 대한 아미노산 요구성을 갖는 것으로 보고된 반면, 다른 아미노산은 자극 효과가 있는 것으로 보고되어 있다. Cys-하이드로클로라이드는 자극성이 있지만, 자극 효과의 일부는 산소 스캐빈저로서의 기능과 관련이 있을 수 있다. 소정의 실시형태에서, Val, Ala, Met, Pro, Arg, Glu, Cys, Tyr 및 His 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산이 펩타이드 및/또는 단백질 내에 결합된 유리 아미노산 및/또는 아미노산의 형태로 1종 이상의 다른 균주, 예를 들어, 아미노산이 유래되는 미생물과 상이한 유기체 및/또는 미생물에 제공된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 균주(들)는 성장을 위해 다음 중 하나 이상을 필요로 한다: Val, Ala, Met, Pro, Arg, Glu, Cys, Tyr 및/또는 His. 소정의 실시형태에서, 균주(들)는 페디오코커스 펜토사세우스와 같지만 이로 제한되지 않는 1종 이상의 페디오코커스 미생물을 포함한다.
페디오코커스 아시딜락티시는 육류 단백질을 가수분해할 수 있는 것으로 보고되어 있다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스, 용해물 및/또는 전 단백질이 또 다른 유기체, 예를 들어, 전세포 바이오매스, 용해물 및/또는 전 단백질이 유래되며 이들을 가수분해할 수 있는 미생물과 상이한 유기체 및/또는 미생물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 가수분해로 인해 생성된 펩타이드 및/또는 아미노산은 그 다음 유기체 자체에서 영양을 위해 사용되거나 또는 다른 유기체에 의해 영양을 위해 이용된다. 소정의 실시형태에서, 가수분해로 인해 생성된 펩타이드 및/또는 아미노산은 최종 식품 또는 사료 제품 내에 포함된다. 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해를 수행하는 유기체 또는 유기체들은 페디오코커스 아시딜락티시와 같지만 이로 제한되지 않는 1종 이상의 페디오코커스 균주를 포함한다.
미생물 균주가 주어진 단백질 기질에 대한 적절한 단백질분해 시스템을 가지고 있더라도, 카세인과 같은 특정 단백질에서의 성장은 카세인의 경우에 His, Leu, Gln, Val 및 Met과 같은 소정의 아미노산의 낮은 수준으로 인해 제한될 수 있다(Kunji, et al., 1995). 소정의 실시형태에서, 주어진 단백질성 기질에는 아미노산 공급원으로서 다음 중 하나 이상이 보충된다: 단백질성 기질에 부족한 아미노산을 제공하는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 유리 아미노산; 펩타이드; 단백질 가수분해물; 단백질; 용해물; 및/또는 전세포 바이오매스. 소정의 실시형태에서, 결핍된 아미노산을 제공하면 배양물의 성장에 대한 제한이 해제된다. 일부 실시형태에서, 보충되는 단백질성 기질은 카세인과 같은 우유 단백질이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산 공급원의 제공을 통해 보충되는 아미노산은 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: His; Leu; Gln; Val; 및/또는 Met.
몇몇 락토바실러스 종(L. 존소니이, L. 갈리나룸, L. 가세리, L. 헬베티쿠스)은 퓨린 및 피리미딘을 새로(de novo) 합성할 수 없다(Elli, et al., 2000). 우유 및 우유-유래 가수분해물은 퓨린 및 피리미딘 전구체를 포함하지 않는다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 퓨린 및/또는 피리미딘이 퓨린 및/또는 피리미딘을 새로 합성할 수 없는 1종 이상의 미생물 균주에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 균주(들)는 다음 중 1종 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 락토바실러스 종을 포함한다: L. 존소니이, L. 갈리나룸, L. 가세리 및/또는 L. 헬베티쿠스. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 퓨린 및/또는 피리미딘이 우유 또는 우유-유래 가수분해물에서 성장한 배양물에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 퓨린 및/또는 피리미딘을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 조성물이 효모 추출물과 같지만 이로 제한되지 않는 배양 배지에 사용되는 퓨린 및/또는 피리미딘의 또 다른 전형적인 공급원을 대체하는데 사용된다.
소정의 실시형태에서, 영양 배지에 보충된 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 영양 배지에서 성장한 세포의 세포 증식 및/또는 생물학적 생산 및/또는 세포 밀도를 향상시킨다. 소정의 실시형태에서, 세포는 동물 세포이다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하지 않는 동일한 배지에서 성장한 동일한 세포와 비교하여 생존 가능한 세포 밀도 및/또는 바이오매스 확장 및/또는 제품 수율을 향상시킨다. 소정의 실시형태에서, 영양 배지에 포함될 때 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 세포 밀도를 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 세포 밀도 및 생성물 수율 둘 다를 개선하고, 또 다른 실시형태에서 세포 성장을 억제하지만 하나 이상의 바이오 생성물의 수율을 향상시킨다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물은 세포 성장 및 죽음에 영향을 미치는 외부 분자 신호로 작용하는 올리고펩타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 올리고펩타이드는 세포 성장을 자극하여 더 높은 바이오매스 생산을 초래하고/하거나 분비된 단백질의 생산을 자극하고/하거나 배양물의 생존 가능한 세포 밀도를 향상시킨다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 올리고펩타이드는 세포 배양물에서 세포자멸성 죽음을 연기하는 작용제로 작용한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 펩타이드는 세포 배양물의 대사에서 장기간 지속되는 변화 및/또는 유전자 발현 및/또는 세포 증식의 변경을 유발한다. 소정의 실시형태에서, 변화 및/또는 변경은 며칠 동안 지속된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 펩타이드를 포함하는 배양 배지에서 세포-주기 단계의 분포가 변경된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 펩타이드는 배양된 동물 세포의 증식 및/또는 신호 전달 캐스케이드를 조절하고/하거나 유전자를 활성화하거나 또는 억제한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 펩타이드는 세포 배양물에 약 1mM 이상의 농도로 제공된다.
소정의 실시형태에서, 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물의 크로마토그래피 분획은 이들이 제공되는 세포 배양물에서 다양한 활성을 생성한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 이용 가능한 아미노산의 공급원뿐만 아니라 세포 성장 및/또는 생산성에 특정한 효과를 발휘하는 펩타이드의 공급원의 역할을 한다. 소정의 실시형태에서, 다음 중 하나 이상의 배양 매개변수는 용해물 및/또는 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물의 적용을 통해 개선된다: 생존 가능한 세포 밀도; 장기 생존 능력; 및/또는 하나 이상의 바이오 생성물의 수율. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 아미노산 및/또는 기타 영양소의 농축 혼합물은 아미노산 및/또는 기타 영양소가 제공되는 배양물에서 하나 이상의 바이오 생성물의 수율을 증가시킨다.
소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 배양 배지에 약 0.001% w/v 이상, 예를 들어, 약 0.01% w/v 이상, 약 0.05% w/v 이상, 약 0.1% w/v 이상(약 1% w/v 이상을 포함)(단백질 가수분해물 조성물의 건조 중량으로 측정됨)의 양으로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 배양 배지에 약 0.001% w/v 내지 약 5% w/v, 예를 들어, 약 0.01% w/v 내지 약 2% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1% w/v(약 0.1% w/v 내지 약 1% w/v를 포함)(단백질 가수분해물 조성물의 건조 중량으로 측정됨)의 범위로 첨가된다. 배양 배지에 첨가되는 단백질 가수분해물 조성물의 양은 세포 유형, 성장, 번식, 생산성, 분화 등과 같은 다수의 고려사항 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 배양 배지는 동물 세포의 배양물에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 펩타이드는 배양 배지에 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 10mM 또는 약 10mM 초과의 농도로 첨가된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 올리고펩타이드는 배양 배지에 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 7mM 내지 약 10mM 또는 약 10mM 초과의 농도로 첨가된다. 소정의 실시형태에서, 배양 배지는 동물 세포의 배양물에 제공된다.
일부 실시형태에서, 배양 배지에 첨가된 단백질 가수분해물 조성물은 생물촉진제 폴리에스터를 포함한다. 생물촉진제 폴리에스터는 PHB 및/또는 PHV와 같은 PHA 중합체일 수 있다. 생물촉진제는 하이드록시뷰티레이트(HB) 또는 올리고머와 같은 단량체일 수 있다. 단백질 가수분해물 조성물은 배양 배지에 첨가될 때 배양된 세포의 성장 및/또는 발달을 촉진시키기 위해 유효량의 생물촉진제 폴리에스터, 예를 들어, PHB 및/또는 PHV와 같은 PHA를 배양 배지에 제공한다.
일부 실시형태에서, 배양 배지에 첨가된 단백질 가수분해물 조성물은 바이타민 B1, 바이타민 B2, 및/또는 바이타민 B12 및/또는 이들의 바이타머와 같은 바이타민을 포함한다. 단백질 가수분해물 조성물은 배양 배지에 첨가될 때 배양된 세포의 성장 및/또는 발달을 촉진시키기 위해 유효량의 바이타민을 배양 배지에 제공한다. 일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물은 바이타민 B12 및/또는 하나 이상의 이의 바이타머(예를 들어, 사이아노코발라민, 하이드록소코발라민, 아데노실코발라민 및/또는 메틸코발라민)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 가수분해물은 CO2, CO 및/또는 CH4와 같은 C1 기질로부터 생성되고, 바이오매스 건조 중량에 대해 약 2㎍/100g 건조 바이오매스, 최대 약 6.5㎍/100g 건조 바이오매스의 농도로 바이타민 B12를 포함하는 바이오매스로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, C1 기질로부터 생성된 배양 배지는, 예를 들어, 바이오매스 건조 중량에 대해 약 6.5㎍/100g 건조 바이오매스, 최대 약 13㎍/100g 건조 바이오매스, 또는 약 13㎍/100g 초과의 건조 바이오매스의 농도로 바이타민 B12를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 미생물에 더하여 식물 또는 효모로부터 유래되는 하나 이상의 단백질 가수분해물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 적합한 식물-기반 단백질 가수분해물은 제한 없이 대두, 쌀, 감자 또는 옥수수로부터 유래되는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 식물-기반 단백질 가수분해물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물 조성물 및 미생물을 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 효모-기반 단백질 가수분해물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물 조성물 및 미생물을 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 효모-기반 단백질 가수분해물, 식물-기반 단백질 가수분해물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물 조성물 및 미생물을 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 적합한 식물-기반 및/또는 효모-기반 단백질 가수분해물은, 예를 들어, 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제8,093,045호 및 PCT 공개 WO1999057246호에 기술되어 있다.
식물-기반 또는 효모-기반 단백질 가수분해물은 임의의 적합한 양으로 배양 배지에 첨가될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 식물-기반 또는 효모-기반 단백질 가수분해물은 배양 배지에 약 0.001% w/v 이상, 예를 들어, 약 0.01% w/v 이상, 약 0.05% w/v 이상, 약 0.1% w/v 이상(약 1% w/v 이상을 포함)의 양으로 첨가된다. 일부 실시형태에서, 식물-기반 또는 효모-기반 단백질 가수분해물은 배양 배지에 약 0.001% w/v 내지 약 5% w/v, 예를 들어, 약 0.01% w/v 내지 약 2% w/v, 약 0.05% w/v 내지 약 1% w/v(약 0.1% w/v 내지 약 1% w/v를 포함)의 범위로 첨가된다.
세포는 임의의 적합한 시간 동안 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물-유래의 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 가수분해물 조성물과 함께 배양 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 배양 배지에서 단백질 가수분해물의 존재하에 성장 및 번식 내내 연속적으로 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물을 포함하는 배양 배지에서 약 1시간 이상, 예를 들어, 약 5시간 이상, 약 12시간 이상, 약 24시간 이상, 약 5일 이상, 약 2주 이상, 약 6주 이상, 약 3개월 이상, 약 6개월 이상(약 1년 이상을 포함) 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물을 포함하는 배양 배지에서 약 1시간 내지 약 3년, 예를 들어, 약 5시간 내지 약 1년, 약 12시간 내지 약 6개월, 약 24시간 내지 약 3개월(약 5일 내지 약 6주를 포함) 동안 배양된다.
일부 실시형태에서, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물 조성물은 세포의 배양 동안 배양 배지에 일시적으로 존재한다. 세포가 배양 배지에서 미생물-유래 단백질 가수분해물의 부재하에 성장하는 경우, 식물-유래 또는 효모-유래 단백질 가수분해물과 같은 다른 배지 보충물이 배양 배지에 존재할 수 있다.
임의의 적합한 세포가 본 발명의 방법을 사용하여 배양될 수 있다. 세포는 포유류, 새, 물고기, 곤충 또는 다른 동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 세포는 줄기 세포일 수 있다. 세포는 진균, 식물, 진핵생물 또는 원핵생물일 수 있다. 세포는 프로바이오틱일 수 있다. 배양된 세포는 1차 세포, 불멸화 세포주, 하이브리도마, 확립된 세포주, 줄기-세포 유래 세포 또는 유전적으로 조작된 세포, 예컨대, 이종 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하는 재조합 세포일 수 있다. 세포는 개별 세포, 조직, 기관일 수 있다. 적합한 비포유동물 동물 세포는 곤충 세포, 조류 세포(닭 세포 포함) 및 물고기 세포를 포함한다. 적합한 세포는 인간 또는 비인간 기원의 포유동물 세포를 포함한다. 적합한 포유동물 세포는 제한 없이 소, 돼지, 양, 토끼 또는 말 세포를 포함한다. 배양된 세포는 원숭이 신장 세포, 소 신장 세포, 개 신장 세포, 돼지 신장 세포, 토끼 신장 세포, 마우스 신장 세포, 래트 신장 세포, 양 신장 세포, 햄스터 신장 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 임의의 조직으로부터 유래되는 동물 세포일 수 있다. 적합한 포유동물 세포는 제한 없이 CHO 세포, COS 세포, VERO 세포, HeLa 세포, 293 세포, HEK-293 세포, HEK 세포, PER.C6 세포, K562 세포, MOLT-4 세포, M1 세포, NS0 세포, NS-1 세포, COS-7 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WEHI 세포, SP2/0 세포, BHK 세포, 줄기 세포 및 이들의 파생물을 포함한다. 적합한 비포유동물 세포는 제한 없이 AGE1.CR 세포, EB66 세포, Sf9 세포, 줄기 세포 및 이들의 파생물을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 배지 성분에서 성장한 배양 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되었다.
일부 실시형태에서, 방법은 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하는 배양 배지에서 근세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 배양 배지에서 세포를 배양하여 근세포를 생성하고 유지하는 단계를 포함한다. 근세포 생성에 적합한 세포는 제한 없이 배아 줄기 세포, 위성 세포 및 근아세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 지방세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 섬유아세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 근세포, 지방세포 및 섬유아세포 중 임의의 2종 이상이 미생물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는 배양 배지에서 함께 배양된다.
세포는 임의의 적합한 방법을 사용하여 배양될 수 있다. 세포는 현탁액, 롤러 병, 플라스크 등에서 성장할 수 있다. 교반 발효기에서 마이크로캐리어에 부착되어 성장하는 부착 세포를 포함한 생물반응기와 같은 대규모 접근법이 또한 포함된다. 일부 실시형태에서, 세포는 현탁액에서 성장한다. 세포가 마이크로캐리어에서 성장하는 경우, 마이크로캐리어는 덱스트란, 콜라겐, 플라스틱, 젤라틴 및 셀룰로스 등에 기초한 마이크로캐리어의 군으로부터 선택될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 마이크로캐리어는 본 명세서에 기재된 바와 같은 미생물로부터 생산된 PHA(예를 들어, PHB 및/또는 PHV)를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 마이크로캐리어 지지 시스템이 교반 탱크 생물반응기 내의 유사-현탁 배양에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 3차원 지지체 또는 스캐폴드에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 스캐폴드는 배양 배지에서 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물 조성물의 존재하에 세포의 증식, 유지, 발달 및/또는 분화를 지원하기에 적합한 미세환경을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 3차원 지지체 또는 스캐폴드는 다공성이다. 소정의 실시형태에서, 3차원 지지체 또는 스캐폴드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 미생물로부터 생산된 PHA(예를 들어, PHB 및/또는 PHV)를 포함한다.
3차원 지지체 또는 스캐폴드는 배양된 세포가 그 위에서 성장하기에 적합한 임의의 물질로 만들어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드는 생분해성이다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드는 생분해성 폴리에스터 또는 하이드로겔과 같은 생분해성 물질로 제조된다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드는 PHB와 같지만 이로 제한되지 않는 PHA 중합체로 제조된다. 일부 실시형태에서, PHA 또는 PHB와 같은 생분해성 폴리에스터는 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물에 의해 생성된다. 소정의 실시형태에서, 스캐폴드는, 예를 들어, 인간 소비에 적합한 소모성이다. 식용 지지체 또는 스캐폴드는 제한 없이 젤란검, 알기네이트, 펙틴 또는 셀룰로스로 제조될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 스캐폴드는 3D로 프린팅된다.
세포는 적절한 온도 및 pH에서 배양될 수 있다. 포유동물 세포는 전형적으로 약 37℃에서 세포 인큐베이터에서 배양되며, 배양 배지는 약 6.8 내지 7.6(7.0 내지 7.3을 포함) 범위의 최적 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 회분식 배양에서 세포는 약 2일 내지 3일마다 또는 필요한 경우 더 많거나 더 적은 빈도로 완전 배지로 교체될 수 있다. 관류 배양(예를 들어, 생물반응기 또는 발효기)에서 세포는 연속적인 재순환을 기준으로 새로운 배지로 교체될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 방법은 동물 세포를 배양하여 육류 제품과 같은 인간 소비에 적합한 제품을 생산하는 단계를 포함한다. 따라서, 다른 세포(예컨대, 지방세포 또는 섬유아세포) 유무에 관계없이 근세포를 배양하기 위해, 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하는 배양 배지를 사용하여 육류를 배양하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 배양 배지가 무혈청 또는 동물 성분이 없는 배지인 경우, 본 발명의 방법은 육류 제품을 생산하기 위한 인도적인 방법을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 동물 유래 혈청이 배지에 사용된다; 그러나, 아미노산 또는 단백질 가수분해물의 일부 분획은 본 명세서에 기재된 바와 같은 미생물로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 미생물-유래 단백질 가수분해물 조성물은 배양된 식품, 예를 들어, 배양육의 풍미를 개선하는 성분을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 단백질 가수분해물 조성물은 배양된 식품, 예를 들어, 배양육에서 풍미 증진 요소의 발달을 자극한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 식품의 풍미를 향상시키는 것은 제품을 더 맛있게 만드는 것 또는 배양된 제품의 자연적으로 생성된 대응물에서 발견되는 하나 이상의 풍미 성분을 부여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 본 명세서에 기재된 바와 같은 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하는 무혈청 배양 배지에서 근세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 본 명세서에 기재된 바와 같은 전세포 바이오매스 및/또는 추출물 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하는 무혈청 배양 배지에서 근세포 전구 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 동물-유래 혈청을 포함할 뿐만 아니라 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 전세포 바이오매스 및/또는 추출물 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하는 배양 배지에서 근세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 동물-유래 혈청을 포함할 뿐만 아니라 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 본 명세서에 기재된 바와 같은 전세포 바이오매스 및/또는 추출물 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하는 배양 배지에서 근세포 전구 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 근세포 전구 세포는 배양 배지에서 전구체 세포의 번식을 촉진하기에 충분한 조건하에 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 근세포 전구 세포는 전구체 세포의 근세포로의 분화를 유도하기에 충분한 조건하에 배양될 수 있다. 전구체 세포는 근세포를 발생시키도록 유도될 수 있는 임의의 적합한 세포일 수 있다. 적합한 전구체 세포는 제한 없이 위성 세포, 배아 줄기 세포 및 근아세포를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 유효량의 화학독립영양성 미생물-유래 단백질 가수분해물을 배양 배지에 첨가하여 근세포의 증식, 유지, 발달 및/또는 분화를 촉진하는 단계를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 근세포는 1종 이상의 다른 세포 유형과 함께 배양된다. 근세포와 함께 공배양하기에 적합한 세포는 제한 없이 지방세포 및 섬유아세포 또는 이들의 전구 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 본 명세서에 기재된 바와 같은 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 포함하는 무혈청 배양 배지 또는 동물-유래 혈청을 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하여 근육 세포, 지방 세포 및 결합 조직의 집합체를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 세포는 근육발생 또는 근섬유 형성을 유도하기에 충분한 조건하에 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 유효량의 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 배양 배지에 첨가하여 지방세포 및/또는 섬유아세포의 증식, 유지, 발달 및/또는 분화를 촉진하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 유효량의 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 배양 배지에 첨가하여 근육발생을 유도, 지속 및/또는 촉진하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 근세포(지방세포 및/또는 섬유아세포가 있거나 없는)는 3차원 지지체 또는 스캐폴드에서 배양된다. 스캐폴드는 일부 경우에 다공성일 수 있다. 스캐폴드는 세포의 성장 및/또는 근육발생을 지원하기 위한 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 스캐폴드는 생분해성 및/또는 소모성 물질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드는 생분해성 폴리에스터 또는 생분해성 하이드로겔을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 스캐폴드는 PHB 및/또는 PHV와 같은 PHA 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드는 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물로부터 유래되는 물질로 제조된다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드는 미생물의 성장, 예를 들어, 화학독립영양성 성장에 의해 지속 가능하게 생성되는 PHA, 예를 들어, PHB 및/또는 PHV와 같은 생분해성 폴리에스터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유효량의 미생물, 예를 들어, 화학독립영양성 미생물 유래의 본 명세서에 기재된 바와 같은 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은 세포를 성장시키기 위한 바이타민의 공급원을 제공하기 위해 배양 배지에 첨가된다. 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은, 예를 들어, 근세포 및/또는 기타 세포에 대한 바이타민 B1, 바이타민 B2 및/또는 바이타민 B12와 같지만 이로 제한되지 않는 바이타민의 공급원일 수 있다. 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은, 예를 들어, 근세포 및/또는 기타 세포에 대한 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1종 이상의 바이타민의 공급원일 수 있다: 바이타민 A; 베타-카로틴, 루테인, 제아잔틴, 티아민(B1), 리보플라빈(B2), 나이아신(B3), 판토텐산(B5), 바이타민 B6, 폴레이트(B9), 바이타민 B12, 콜린, 바이타민 C, 바이타민 D, 바이타민 E, 바이타민 K. 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물은, 예를 들어, 근세포 및/또는 기타 세포에 대한 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는 1종 이상의 미네랄의 공급원일 수 있다: 칼슘, 철, 마그네슘, 망가니즈, 인, 포타슘, 소듐, 아연.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물은 아미노산, 올리고펩타이드, 지질 및/또는 철이 유래되는 미생물과 상이한 세포인 세포의 배양을 위한 다음 중 하나 이상의 공급원으로서 작용한다: 아미노산; 올리고펩타이드; 지질; 및/또는 철.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 식품(예를 들어, 육류 제품 또는 육류-유사 제품이지만 이로 제한되지 않음)은 바이타민 B1, 바이타민 B2 및/또는 바이타민 B12와 같은 바이타민의 영양 공급원일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 식품은 바이타민 B1, 바이타민 B2 및/또는 바이타민 B12와 같은 바이타민을 포함한다. 소정의 상기 실시형태에서, 바이타민 B1, 바이타민 B2 및/또는 바이타민 B12는 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 다른 추출물을 통해 제공되며, 식품의 적어도 일부를 생산하는데 사용되는 배양된 세포를 위한 배양 배지에 첨가된다. 소정의 실시형태에서, 식품은 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는 1종 이상의 바이타민을 포함하며: 바이타민 A; 베타-카로틴, 루테인, 제아잔틴, 티아민(B1), 리보플라빈(B2), 나이아신(B3), 판토텐산(B5), 바이타민 B6, 폴레이트(B9), 바이타민 B12, 콜린, 바이타민 C, 바이타민 D, 바이타민 E 및/또는 바이타민 K, 이들 중 일부 또는 전부는 궁극적으로 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 추출물이 유래되는 미생물로부터 공급될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 바이타민은 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 통해 제공되며, 식품의 적어도 일부를 생산하는데 사용되는 배양된 세포를 위한 배양 배지에 첨가된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생산된 식품(예를 들어, 육류 또는 육류-유사 제품)은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는 미네랄의 영양 공급원일 수 있다: 칼슘, 철, 마그네슘, 망가니즈, 인, 포타슘, 소듐 및/또는 아연. 소정의 실시형태에서, 미네랄은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 다른 추출물을 통해 제공되며, 식품을 생산하는데 사용되는 배양된 세포를 위한 배양 배지에 첨가된다. 소정의 실시형태에서, 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물의 철 함량은 헴(heme) 형태의 철을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자를 다음 공급원 중 하나 이상으로부터의 바이오매스 및/또는 전세포 및/또는 단백질 농축물 및/또는 단백질 단리물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 추출물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다른 성분과 조합하여 포함하는 제형이 제공된다: 육류; 유제품; 달걀; 대두; 밀; 쌀; 완두콩; 다른 식물 단백질; 효모; 프로바이오틱스; LAB; 및/또는 다른 GRAS 미생물 또는 거대 유기체. 소정의 실시형태에서, 요거트 믹스에는 다음 중 하나 이상이 보충된다: 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 및/또는 기타 영양소 또는 보조인자. 소정의 실시형태에서, 제형은 육류 및/또는 대두 공급원으로부터의 단백질 또는 기타 바이오매스 성분을 포함하지 않는다. 소정의 실시형태에서, 제형은 유제품 및/또는 비대두 식물성 기원으로부터의 단백질, 단백질 가수분해물 및/또는 기타 바이오매스 성분을 포함하지 않는다. 일부 경우에, 제형은 유전자 변형 미생물을 포함하지 않는다(즉, GMO가 없음). 일부 경우에, 제형은 육류 및/또는 유제품이 없다. 소정의 실시형태에서, 제형은 식품, 사료 또는 음료 제품에 이용된다. 소정의 실시형태에서, 식품, 사료 또는 음료 제품은 채식주의(vegetarian) 또는 비건이다. 소정의 실시형태에서, 제형은 인간 소비를 위한 GRAS로 간주된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 상에서 성장한 세포의 배양물은 단백질 생성물을 분비한다. 소정의 실시형태에서, 단백질 정제 공정은 단백질 생성물을 회수 및/또는 정제하기 위해 이용된다. 당업계에 잘 알려진 임의의 적합한 단백질 정제 방법이 단백질 생성물을 회수 및/또는 정제하는데 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 배양 배지의 성분(들)으로서 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 사용하여 생성물을 생산한 후, 배양 배지 또는 발효 브로스 및/또는 생성물로부터의 전세포 바이오매스 및/또는 용해물 및/또는 추출물 및/또는 단백질 가수분해물 및/또는 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물 물질의 제거가 수행된다. 소정의 경우에, 이러한 제거된 영양소는 보다 완전한 이용을 위해 하나 이상의 업스트림 단계로 다시 재활용되고/되거나 부산물로서 사용된다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 쿠프리아비두스 네카토르 배양물로부터 생성된 단백질 가수분해물
쿠프리아비두스 네카토르 균주를 CO2를 탄소 공급원으로 그리고 H2를 전자 공여체로 포함한 미네랄염 성장 배지에서 화학독립영양적으로 배양하였다. 성장 후, 전세포 바이오매스를 원심분리에 의해 성장 배지로부터 단리하고, 동결건조에 의해 건조시켰다. 건조된 바이오매스를 다음과 같이 처리하였다.
전세포 바이오매스의 탈지: 전세포 바이오매스를 뚜껑을 꽉 닫은 용기에서 흄 후드에서 혼합물을 1시간 동안 교반시킴으로써 암모늄 하이드록사이드와 메탄올(1:1:0.4, WCB: NH4OH: MeOH)로 탈지(지질 추출)하였다. 혼합물을 Whatman 4 여과지로 진공 여과하였다. 여과액에는 추출된 지질이 포함되어 있었다. 필터 상의 잔류물은 탈지된 바이오매스였으며, 이를 인큐베이터에서 40℃에서 밤새 건조시켰다.
NH4OH를 이용한 단백질 가수분해 및 CO2를 이용한 중화: 가수분해 단계에 2%의 탈지된 건조 덩어리의 고체 로딩은 필요량의 탈이온(DI)수로 재수화하여 준비하였다. 슬러리를 터릿 스틱(Turret Stick)을 사용하여 15,000rpm에서 1분 동안 잘 혼합하였다. 반응 혼합물의 pH를 흄 후드에서 NH4OH 28% 내지 30%(사전 제조) 용액을 사용하여 10.85로 증가시켰다. 혼합물을 작업 부피가 50㎖인 압력 튜브(크기: 120㎖)로 옮겼다. 그런 다음, 혼합물을 110℃에서 10분, 느린 배기에서 오토클레이브하였다. 오토클레이브 후 용액의 pH는 10.82였다. 그런 다음, 10분 내지 20분 동안 용액에 삽입된 캐뉼라/18G 바늘을 통해 CO2를 버블링함으로써 pH를 pH 9로 감소시켰다. 그런 다음, 110rpm에서 55℃에서 밤새 세균성 알칼리 프로테이스로 pH 9에서 효소 분해를 수행하였다. 가용성의 가수분해된 단백질을 포함하는 상청액을 PHB가 풍부한 미정제 펠릿으로부터 20000xg, 20분, 5C에서 원심분리에 의해 분리하였다. 그런 다음, 상청액 단백질 가수분해물을 동결 건조시켰다. 이 단백질 가수분해물(PH)에 대해 측정된 회분 함량은 5%였다. 회분 함량은 최소 300㎎의 단백질 가수분해물 분말을 칭량된 도가니(tared crucible)에 넣고 머플로(muffle furnace)에서 회분 사이클을 실행하여 측정하였다. 또한, AOAC 방법 942.05를 사용하여 외부 실험실 분석(에스지에스(SGS), 북미 소재)에 의해 독립적으로 측정하였다. PH의 총 아미노산 함량 및 아미노산 프로파일을 또한 AOAC 방법 AOAC 994.12를 사용하여 북미 소재의 에스지에스에 의해 결정하였다. 결과는 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00003
실시예 2: 쿠프리아비두스 네카토르 배양물로부터 생성된 단백질 가수분해물
쿠프리아비두스 네카토르 PHB 음성 돌연변이체 균주(DSM 541)를 탄소 공급원으로서 CO2 및 전자 공여체로서 H2 상에서 무기 미네랄 성장 배지에서 화학독립영양적으로 배양하였다. 성장 후, 전세포 바이오매스를 원심분리에 의해 성장 배지로부터 단리하고, 동결건조에 의해 건조시켰다. 건조된 바이오매스를 다음과 같이 처리하였다.
전세포 바이오매스의 탈지: 건조 전세포 바이오매스를 암모늄 하이드록사이드 및 에탄올(1:4:0.5 w/v)을 이용한 처리를 통해 탈지하였다. 바이오매스 및 용매 슬러리를 뚜껑을 꽉 닫은 유리병에서 30분 동안 교반한 후, 흄 후드에서 Whatman 4 여과지를 통해 진공 여과하였다. 여과액에는 지질 분획이 포함되어 있었다. 필터로부터 회수된 탈지된 잔류물을 밤새 공기 건조시킨 후, 인큐베이터에서 40℃에서 4시간 내지 6시간 동안 건조시켰다.
Ca(OH)2를 이용한 탈지된 바이오매스의 단백질 가수분해 및 H3PO4를 이용한 중화: 건조된 탈지된 바이오매스를 2%의 최종 농도로 DI수에 재현탁시켰다. 바이오매스 용액을 완전히 균일하게 재현탁될 때까지 15000rpm에서 IKA Ultra-Turax로 혼합하였다. Ca(OH)2를 첨가하여 바이오매스 용액의 pH를 11로 만들었다. 용액을 유리 배지 병에 옮기고, 110℃에서 10분 동안 오토클레이브한 후, 실온으로 냉각시켰다. 용액을 H3PO4를 사용하여 pH 9로 중화하였다. 세균성 알칼리 프로테이스(시그마(Sigma) P8038)를 2.6 활성 단위/g 바이오매스의 농도로 용액에 첨가하였다. 바이오매스 용액을 55℃ 진탕 수조에 밤새 두었다. 16시간 내지 24시간 분해 후, 95℃ 수조에서 10분 동안 슬러리를 인큐베이션함으로써 효소를 불활성화하였다. 그런 다음, 바이오매스 슬러리를 실온으로 냉각시키고, 단백질 가수분해물(상청액 분획)을 26000xg에서 7℃에서 30분 동안 원심분리에 의해 분리하였다. 생성된 단백질 가수분해물 용액을 -80℃ 냉동고에서 동결시킨 후, 동결건조시켰다. 건조된 분말의 수분, 회분 및 N 함량을 결정하고, 단백질 프로파일을 SDS-PAGE 분석을 통해 분석하였다. 단백질 가수분해물에 존재하는 2000 달톤 이상의 단백질은 없었고, 생성된 회분 함량은 10.5%였다. PH의 총 아미노산 함량 및 아미노산 프로파일을 또한 AOAC 방법 AOAC 994.12를 사용하여 북미 소재의 에스지에스에 의해 결정하였다. 미네랄 프로파일은 AOAC 방법 AOAC 968.08을 사용하여 결정하였다. 결과는 표 2에 나타나 있다.
Figure pct00004
실시예 3: 단백질 가수분해물 설계.
다양한 상이한 분해 공정(산 대 알칼리 대 효소 가수분해 대 자가분해)에 대해, 상이한 효소 특이성을 갖는 효소(정제된 외인성 동물/식물/미생물 효소 및/또는 내인성 효소 또는 이들의 블렌드)의 선택 및 공정 매개변수(pH, 온도 및 인큐베이션/처리 시간), 화학독립영양성 바이오매스로부터 생성된 단백질 가수분해물의 분석을 수행하였다. 펩타이드 프로파일로 표시되는 펩타이드의 방출 및 펩타이드의 크기를 수행하였다. 펩타이드(Da)의 평균 분자량(MW)을 결정하였다. 아미노 질소 대 총 질소의 비(AN/TN 비) 및 가수분해의 정도(DH%)뿐만 아니라 유리 아미노산의 수준을 측정하였다. 다양한 가수분해제의 효과를 DH% 및 펩타이드와 아미노산 분포 프로파일에 기초하여 비교하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물의 비교를 또한 효소, 산성, 알칼리 및/또는 자가분해를 포함한 다양한 가수분해 방법을 통해 생산된 유제품, 육류 및/또는 대두 단백질 가수분해물 및/또는 효모 추출물을 포함하지만 이로 제한되지 않는 단백질 가수분해물의 일반적인 및/또는 상업적인 공급원에 대해 수행하였다. 이 비교는 총 아미노산 프로파일, AN/TN 비뿐만 아니라 위에 요약된 다른 모든 매개변수 및 특성에 기초하여 수행하였다.
주어진 단백질 가수분해물이 제공될 때 배양의 성장 성능에 기초하여 비교를 또한 수행하였다. 이 테스트 배양물은 1종 이상의 LAB를 포함할 수 있다. LAB는 L. 헬베티쿠스 균주를 포함할 수 있다. 비교할 단백질 가수분해물은 카세인의 카시톤-췌장 소화물(카시톤) - 카세인의 췌장 소화에 의해 만들어진 펩톤을 포함할 수 있다. 배양 성장 성능의 측정은 시간 경과에 따라 측정된 세포수 및 특정 성장률을 포함한다. 테스트를 위한 하나의 음성 대조군은 임의의 단백질 가수분해물 보충이 없는 기본 배양 배지일 수 있다. 또 다른 음성 대조군은 임의의 단백질 가수분해물 보충 또는 임의의 아미노산 배지 성분이 없는 배양 배지일 수 있다. 또 다른 실험적 테스트 및 비교가 단백질 가수분해물이 아미노산의 유일한 공급원(즉, 배지에 포함된 다른 아미노산 성분이 없음)을 구성하는 배지에서 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조된 것을 포함하는 상이한 단백질 가수분해물 사이에서 이루어졌다. 다른 단백질 가수분해물과의 비교 외에도, 단백질 가수분해물 보충이 없는 배지뿐만 아니라 카사미노산과 같은 유리 아미노산 조성물 또는 카세인과 같은 전 단백질이 포함된 배지에 대한 비교도 또한 이루어졌다.
실시예 4: 유익한 진균인 트리코데르마 아트로비리데에 대한 전세포 바이오매스, 용해물 및 가수분해물의 효과의 테스트.
트리코데르마 아트로비리데는 광범위한 온도 및 토양 pH 조건에서 근권 및 토양에 서식하는 부생성(saprophytic) 진균이다. 토마토, 콩, 오이, 딸기, 목화 및 포도를 포함한 수백 가지 식물 작물에 질병을 일으키는 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea)를 포함하는 식물병원성 진균에 대항하는 능력으로 인해 많은 다양한 작물에 유익하다. 또한, 이는 식물에 의한 미량영양소 섭취를 증가시키며 뿌리 성장 자극과 관련이 있다. 트리코데르마 아트로비리데는 농업 작물 시스템에서 미생물 접종제로 주로 사용된다.
이러한 시험관내 실험의 목적은 전자 공여체로서 H2를 사용하여 탄소 공급원으로서 CO2 상에서 자가영양적으로 성장한 쿠프리아비두스 네카토르 바이오매스로부터 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 7개의 상이한 용해물 및 단백질 가수분해물뿐만 아니라 전세포 바이오매스(WCB)의 자극 활성을 평가하는 것이었다. 이러한 7개의 바이오매스 생성물을 2개의 상업용 생물촉진제와 비교하였다; 하나는 식물-유래 PH를 포함하고, 하나는 다른 동물 유래 PH를 포함한다.
상이한 WCB, 용해물 및 PH 샘플을 멸균 기질에서 트리코데르마 아트로비리데 AT10의 성장을 촉진하는 능력에 대해 평가하였다. 트리코데르마 아트로비리데 AT10의 순수 배양물을 대조군으로서 감자 덱스트로스 아가(PDA) 배양 배지 및 3 ㎖/ℓ의 9개의 WCB, 용해물 및 PH 샘플이 보충된 PDA 배지에서 25℃의 암소에서 24시간 동안 성장시켰다.
필요량의 각 유기 생성물을 탈이온수에 용해시켜 용해물 및 PH 생성물이 풍부한 PDA 배지를 제조하였다. 생성된 용액을 0.25㎛ 필터를 사용하여 45℃에서 PDA가 담긴 멸균 병에 여과하였다. 기질을 부드럽게 교반한 다음, 별도의 9㎝ 페트리 접시에 부었다. 플레이트의 기질이 냉각되고 응고되면, 4일 성장 후 순수한 배양물의 가장자리로부터 채취한 트리코데르마 아트로비리데 AT10의 5㎜의 균사절편(mycelia disk)을 각 페트리 플레이트의 중심에 놓고, 25℃에서 인큐베이션하였다. 균사체의 방사상 성장을 인큐베이션 24시간 후에 측정하였다. 처리당 12개의 페트리 접시가 있었다. 모든 데이터를 SPSS v. 21(아이비엠 코포레이션(IBM Corp.), 미국 뉴욕주 아몽크 소재)을 사용하여 통계학적으로 분석하였다. 측정된 각각의 유의 변수에 대해 P = 0.05에서 덩컨의 다중 범위 검정(Duncan's multiple range test)을 수행하였다. 표 3에서, 평균값 다음에 표준 오차가 뒤따른다. 각 열 내의 다른 문자는 덩컨의 다중 범위 검정 P=0.05에 따른 유의한 차이를 나타낸다.
Figure pct00005
유기 생성물이 풍부한 PDA 기질은 24시간의 인큐베이션 후 트리코데르마 균사체의 방사상 성장에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 발견하였다. 가장 높은 트리코데르마 성장을 염기 처리 후 프로테이스 처리를 통해 C. 네카토르로부터 생산된 PH에 대해 기록하였다. 식물 유래 PH에 기반한 상업용 생물촉진제는 평균 성장이 더 낮았지만 크게 다르지는 않았다. 염기 처리 후 프로테이스 처리를 통해 C. 네카토르로부터 생산된 PH는 대조군 및 동물 유래 PH에 기반한 상업용 생물촉진제보다 훨씬 더 큰 성장을 이루었다. 시각적으로, 포자가 트리코데르마 재생산 및 번식의 수단인 대조군(도 5)과 비교하여, C. 네카토르 PH로 처리한 후 실질적으로 더 조밀한 포자 형성이 관찰되었다.
이러한 예비 시험의 결과는 염기 처리 후 프로테이스 처리를 통해 C. 네카토르로부터 생산된 PH가 시험관내 트리코데르마 성장을 향상시킬 가능성이 있음을 보여주었다. C. 네카토르로부터의 PH는 뿌리 성장 및 영양소 흡수를 자극하고 자연 발생적 또는 인공적으로 접종된 트리코데르마 종의 토양 개체수를 늘리기 위해 작물의 뿌리 영역에 적용될 수 있다.
실시예 5: 템페 발효 기질에 대한 단백질성 쿠프리아비두스 네카토르 바이오매스의 첨가 테스트
목표는 CO2에서 성장한 쿠프리아비두스 네카토르로부터의 고단백 바이오매스가 템페를 생산하는데 사용되는 식물 기질을 보충하는데 사용될 수 있는지 여부를 테스트하는 것이었다.
리조푸스 오리자에의 상업적인 스타터 배양물을 획득하였다.
병아리콩을 멸균된(끓인) 물에서 하룻밤 불린 인스턴트 팟에서 상압하에 1분 동안 조리하였다. 조리된 병아리콩은 씹을 수 있을 정도로 부드러웠다. 그런 다음, 병아리콩이 아직 뜨거울 때 빠르게 물기를 빼주었다. 그런 다음, 병아리콩을 종이 타월에 얇게 펴서 건조시켰다. 콩은 껍질을 벗겼다.
그런 다음, 병아리콩을 2개의 납작하고 입구가 넓은 플라스틱 용기에 나누었다. 용기 #1은 병아리콩만 첨가된 대조군이었고, 용기 #2에는 병아리콩을 출발 병아리콩 중량의 10% 비율인 건조된 전세포 쿠프리아비두스 네카토르 바이오매스와 함께 첨가하였다.
두 용기에 식초를 서서히 첨가하고, 출발 pH가 3.5가 되도록 잘 혼합하였다.
조리된 콩의 건조 중량 파운드당 1 티스푼의 리조푸스 오리자에 스타터 배양물을 기질 위에 뿌렸다. 그런 다음, 병아리콩 + 배양물을 주걱으로 잘 섞어 배양물이 모든 기질에 고르게 붙도록 하였다.
두 입구가 넓은 플라스틱 용기(즉, 병아리콩 대조군 및 병아리콩 + C. 네카토르 실험)에는 0.3" 내지 0.5" 간격으로 천공된 구멍이 있는 뚜껑이 있고, 뚜껑은 위에서 느슨하게 덮어두었다. 용기를 30.5℃의 인큐베이터에 옮기고, 48시간 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다.
R. 오리자에 백색 균사체 성장은 인큐베이션 20시간 내지 24 시간 후에 시작되었고, 이 발효 후 기질을 인큐베이터에서 실온으로 옮겼다. 완전한 R. 오리자에 균사체 성장은 48시간 내지 72시간 후에 관찰되었다.
R. 오리자에는 C. 네카토르 바이오매스를 첨가하거나 첨가하지 않은 병아리콩에서 백색 균사체 성장과 함께 동등하게 잘 성장하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 템페는 C. 네카토르에 의해 제공되는 단백질 및 기타 영양소(예를 들어, B 바이타민)를 보충할 수 있다.
보충된 템페와 보충되지 않은 템페 사이의 임의의 구성적 또는 영양적 차이를 조사하기 위해 추가 분석을 수행하였다.
아스퍼질러스 오리자에(NRRL 3485), 리조푸스 올리고스포루스(NRRL 2710) 및 리조푸스 오리자에(NRRL 3613)와 같은 템페, 또는 미소 또는 간장과 같은 다른 발효 제품을 생산하는데 사용되는 다른 식용 진균 균주를 테스트하는 유사한 실험을 수행할 수 있다. 백미, 보리, 녹두, 콩가루 및 대두콩과 같은 추가적인 발효 기질을 또한 테스트할 수 있다.
실시예 6: 단백질 가수분해물 및 단백질 단리물에 대한 유산균의 성장 테스트
GRAS 유산균(LAB)을 CO2로부터 생산된 쿠프리아비두스 네카토르 단백질성 바이오매스로부터 유래된 영양소에 대해 테스트하였다. 테스트할 단백질-유래 영양소는 다음을 포함한다: NH4OH로 염기 처리 후 CO2로 중화하고, 세균성 알칼리 프로테이스(BAP)를 사용하여 효소적 가수분해에 의해 생성된 알칼리성 단백질 가수분해물(PH); H3PO4로 산 처리 후 Ca(OH)2로 중화한 다음 BAP를 사용한 효소적 가수분해에 의해 생성된 산 단백질 가수분해물; 및 바이오매스의 초음파처리 후 원심분리, 펠릿의 폐기 및 단백질이 풍부한 상청액의 회수 및 건조에 의해 형성된 단백질 단리물(PI).
이들 및 다른 단백질 유래 생성물을 S. 써모필루스, L. 델브루엑키이 아종 불가리쿠스, L. 아시도필루스 및 비피도박테리움 락티스를 포함하지만 이로 제한되지 않는 LAB 균주에서 테스트하였다. LAB 균주를 공배양, 혼합 배양 및 컨소시엄뿐만 아니라 개별적으로 테스트하였다. 대조군에 사용된 성장 배지는 대조군의 한 유형에서는 일반 젖소의 우유이고, 또 다른 유형의 대조군에서는 엘리커 브로스(시그마 #17123)이다. 엘리커 브로스의 조성은 다음과 같다: 0.5 g/ℓ 아스코르브산; 20 g/ℓ 카세인 효소 가수분해물; 5 g/ℓ 덱스트로스; 2.5 g/ℓ 젤라틴; 5 g/ℓ 락토스; 5 g/ℓ 사카로스; 1.5 g/ℓ 소듐 아세테이트; 4 g/ℓ 소듐 클로라이드; 5 g/ℓ 효모 추출물.
우유로 만든 요거트의 대조 사례는 다음과 같이 생산하였다: 저온살균된 전유 1 내지 2 쿼트를 180℉로 가열한 다음 115℉로 냉각시켰다. 우유를 유리 용기에 붓고, 써모필루스, L. 델브루엑키이 아종 불가리쿠스, L. 아시도필루스 및 비피도박테리움 락티스를 포함하는 상업용 요거트 스타터 배양물을 한 패킷(packet) 첨가하고 충분히 혼합하였다. 그런 다음 우유 배양물을 덮고, 요거트 모드의 인스턴트 팟에서 105℉ 내지 112℉에서 대략 8시간 동안 인큐베이션하였다. 배양물은 병을 부드럽게 기울여 확인하였다. 요거트가 병의 측면으로 흐르지 않고 한 덩어리로 병의 측면에서 떨어지면, 배양이 완료된 것이다. 요거트가 굳으면 뚜껑을 덮고, 실온에서 2시간 동안 식힌 다음 냉장 보관하였다.
엘리커 브로스에서의 LAB 성장의 대조군 사례는 다음과 같았다: 1리터의 증류수에 48.5그램의 엘리커 브로스 분말을 현탁시켰다. 혼합하고 끓여 배지를 완전히 녹인 다음, 121℃에서 15분 동안 오토클레이브하여 멸균하였다. 배지 용액은 옅거나 중간 정도의 투명한 호박색이고, pH는 6.6 내지 7이었다. 용액을 115℉로 냉각시키고, 배지 1 내지 2 쿼트당 S. 써모필루스, L. 델브루엑키이 아종 불가리쿠스, L. 아시도필루스 및 비피도박테리움 락티스를 포함하는 상업용 요거트 스타터 배양물의 한 패킷의 배양물을 접종하였다. 그런 다음, 배지에 뚜껑을 덮고, 105℉ 내지 112℉에서 대략 24시간 내지 48시간 동안 배양하였다. 엘리커 브로스에서 LAB 배양물의 600㎚(OD600)에서의 광학 밀도는 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다.
우유 대조군에 대해 테스트한 한 실험은 C. 네카토르 유래의 PH 또는 PI를 우유에 C. 네카토르 질소(N) 대 우유 질소의 1:1 비로 혼합한 다음, 위에 기재된 바와 동일한 요거트 발효 단계를 수행하는 것을 포함한다.
엘리커 브로스 대조군에 대해 테스트한 또 다른 실험은 엘리커 브로스의 카세인 효소 가수분해물을 브로스에 20 g/ℓ의 카세인 효소 가수분해물과 동일한 N 함량을 제공하는 테스트 기질(PH/PI)의 양으로 대체하는 것을 포함한다. 나머지 배지 조성물은 동일하게 유지하였다. 실험 브로스에 대한 LAB 성장 성능을 성장률 및 최종 역가의 측면에서 엘리커 브로스 대조군과 비교하였다. 유사한 실험은 엘리커 브로스의 카세인 효소 가수분해물 및 젤라틴을 동등한 질소 기준으로 실험적 PH 및/또는 PI로 대체하고; 엘리커 브로스의 카세인 효소 가수분해물, 젤라틴 및 효모 추출물을 동등한 질소 기준으로 카세인 효소 가수분해물 및 젤라틴으로 대체하고, 효모 추출물을 동등한 B 바이타민 기준 또는 뉴클레오타이드 기준으로 대체하는 것을 포함한다.
실시예 7: 세포 생존 능력 및 다른 성능 지표에 대한 단백질 가수분해물 효과의 테스트.
용해물 및/또는 단백질 가수분해물이 제공되는 세포 배양물에 대한 생산 공정에 들어가는 탄소의 유일한 공급원으로서 CO2로부터 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조된 용해물 및/또는 단백질 가수분해물의 효과를 수행하였다. 우유 기질에 대한 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질의 산 가수분해물의 2%(w/v)의 첨가가 LA 균주의 생존 능력에 미치는 효과를 결정하였다. 콜로니 형성 단위(CFU)/그램의 측면에서 12주 후 LA 균주의 생존 능력을 실험 및 대조군 모두에 대해 결정하였다. 음성 대조군은 우유 기질 단독일 수 있다. 양성 대조군은 산 카세인 가수분해물(ACH) 및 시스테인의 2% 첨가를 포함할 수 있다. 양성 및 음성의 다른 대조군은 시스테인 단독, ACH 단독, 유청 분말(WP), 유청 단백질 농축물(WPC), 트립톤(카세인의 트립신 소화물), 상업적인 대두 PH, 예컨대, NZ 대두-BL, Hy-대두 및 Amisoy 또는 전체 대두 단백질을 포함하지만 이로 제한되지 않는 대두 단백질 가수분해물의 첨가를 포함할 수 있다. S. 써모필루스 및 비피도박테리아 종을 포함한 다른 균주를 생존 능력뿐만 아니라 다른 성능 지표에 대해 테스트하였다. 세포 생존 능력에 더하여 또는 그 대신에, 측정, 테스트 및 비교되는 다른 배양 지표는 특정 성장률, pH 4.50에 도달하는데 필요한 발효 시간 및 락트산의 역가(g/ℓ)를 포함한다.
실시예 8: 단백질 가수분해물을 사용하여 성장한 프로바이오틱 균주에 대한 성장 및 산 생산의 평가.
B. 락티스 균주에 의한 성장 및 산 생산을 1종 이상의 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물이 보충된 배지를 사용하여 평가하였다. 비교를 위한 양성 대조군은 상업용 프로테이스(예를 들어, 아스퍼질러스 종 프로테이스 2A; 아마노 파마슈티칼(Amano Pharmaceutical), 일본 나고야 소재)를 사용하여 제조된 우유 단백질 가수분해물(MPH)이 보충된 배지로서 양 및 염소 우유를 포함할 수 있다(Gomes and Malcata 1998). (예를 들어, CO2의 화학독립영양성 전환을 통해) 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 유리 아미노산을 포함한 다양한 공급원으로부터의 유리 아미노산이 또한 실험 및 대조군 사례에서 질소 농축 보충물로 사용될 수 있다. 유리 아미노산 농축물은 25 ㎖/ℓ 내지 50㎖/ℓ의 비율로 배양 배지에 첨가하였다. 실험 및 대조군 샘플에서 B. 락티스의 생존 가능한 수를 측정하고 비교하였다.
실시예 9: 단백질 가수분해물 및/또는 단백질을 사용한 스타터 배양물 생산의 평가.
P. 펜토사세우스를 기질에서 성장시켰다. 다음을 포함하는 양성 대조군을 P. 펜토사세우스의 생산을 위한 질소 공급원으로서 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 및/또는 단백질 가수분해물과 비교하였다: 카세인 펩톤(가수분해된 카세인); 프리마톤(가수분해된 육류 단백질); 및/또는 효모 페이스트. 발효 시간 및/또는 바이오매스 수율을 포함하는 성능 지표를 측정하였다. 최적 질소/탄소(N/C) 비를 결정하였다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 다양한 전세포 바이오매스, 용해물 및 전 단백질의 효과를 페디오코커스 아시딜락티시의 성장 촉진제로서 다양한 건조 및 동결된 육류 스톡(1% 내지 5%)과 비교하였다.
실시예 10: 용해물, 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물의 라이브러리에서 상이한 세포주의 성장 성능의 테스트.
상이한 공급원료 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 생산된 여러 용해물, 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물의 라이브러리를 조성 분석 및 라이브러리의 구성원을 포함하는 배지에서 다양한 모델 세포 유형의 성장 성능에 따라 평가하였다.
용해물, 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물의 조성 분석 및 특성화는 다음을 포함한다: α-아미노 질소(AN)의 %; 총 질소(TN)의 %; 비(AN/TN); 유리 아미노산(총 아미노산의 %); 펩타이드 크기 범위, 예를 들어, 100Da 내지 200Da(%); 200Da 내지 500Da(%); 500Da 내지 1000Da(%); 1000Da 초과(%); 평균 MW; 회분(%); 수분(%); pH; 소듐(%); 포타슘(%); 칼슘(㎎/g); 마그네슘(㎎/g); 클로라이드(㎎/g); 설페이트(㎎/g); 포스페이트(㎎/g); 아미노산 함량, 즉, 알라닌(㎎/g), 아르기닌(㎎/g), 아스파르트산(㎎/g), 시스테인(㎎/g), 글루탐산(㎎/g), 글리신(㎎/g), 히스티딘(㎎/g), 아이소류신(㎎/g), 류신(㎎/g), 라이신(㎎/g), 메티오닌(㎎/g), 페닐알라닌(㎎/g), 프롤린(㎎/g), 세린(㎎/g), 트레오닌(㎎/g), 트립토판(㎎/g), 타이로신(㎎/g), 발린(㎎/g), 및 총 아미노산(㎎/g).
세포 유형의 증식은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 1종 이상의 용해물, 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물이 보충된 배지에서 테스트하였다. 이러한 성장 테스트에 사용될 수 있는 세 가지 모델 세포 유형은 다음과 같다: 캐비지 루퍼(cabbage louper)로부터 유래된 High Five™ 세포 및 거염벌레(army worm)(스포돕테라 프루기페르다)로부터 유래된 Sf9 및 Sf21 세포. 각 세포주를 정량적 성능 평가 전에 테스트 용해물, 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물이 (예를 들어, 0.6% w/v의 농도로) 보충된 무혈청 배지에서 배양하였다. 보충 배지에서의 성장을 각 세포 유형에 대해 표준 배지에서의 성장과 비교하였다.
실시예 11: 동물성 단백질이 없는 세포 배양 배지의 제형화.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물, 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 기초 배지에 대한 보충물로서 검사하였다. 조성물을 기초 배지로 적정하였다. 각각의 보충된 배지를 사용한 세포 성장을 상응하는 보충되지 않은 배지(음성 대조군) 또는 FBS(양성 대조군)가 보충된 배지와 비교하였다. 성장을 3회의 계대배양에 걸쳐 25㎠ 플라스크당 평균 세포수의 측면에서 평가하였다. 실험 및 대조군 배지에서 성장한 세포주는 Vero(아프리카 그린 원숭이 신장) 세포일 수 있다. Vero 세포의 성장을 5%(v/v) FBS가 보충된 E-MEM 참조 배지에 대해 3회의 적응 계대배양 후와 비교하여 다양한 가수분해물 및 성장의 공급원이 보충된 프로토타입 무혈청 제형에서 검사하였다. 각 용해물, 가수분해물, 펩타이드 조성물 및 아미노산 조성물을 200 ㎎/ℓ로 배지에 보충하였다. 비교는 FBS-보충된 참조 물질에 대한 평균 세포수의 측면에서 이루어졌다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 무혈청 단백질 가수분해물 또는 혈청-보충된 대조군에서 유지되고 감염된 Vero 세포 배양물로부터 얻어진 표적 모델 바이러스의 비교 수율도 또한 검사하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물이 보충된 무혈청 배지에서 성장한 VERO 세포에 의해 생성된 신드비스 바이러스, 폴리오바이러스 1, 가성광견병 바이러스 및 레오바이러스의 역가를 대조군으로서 2% 혈청이 보충된 EMEM에서 성장한 VERO 세포에 의해 생성된 바이러스와 비교하였다. 비교는 플라크 형성 단위(plaque-forming unit: PFU)를 기준으로 이루어졌다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물이 보충된 무혈청 배지에서 매딘-다비 개 신장(Madin-Darby canine kidney: MDCK) 세포의 성장 및 개 아데노바이러스 또는 감염성 소 비기관염(infectious bovine rhinotracheitis: IBR) 바이러스의 생성을 5% FBS를 추가한 E-MEM에서의 성장 및 생산과 비교하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물이 보충된 무혈청 배지에서 PK-15(돼지 신장) 세포의 성장 및 가성광견병 바이러스 생산을 5% FBS를 추가한 E-MEM 테스트 배지에서의 성장 및 생산과 비교하였다. 비교는 세포수 및 50%의 조직 배양 감염 용량(TCID(Tissue Culture Infective Dose)50)을 기준으로 이루어졌다.
실시예 12: CHO 세포에 의한 재조합 단백질 생산.
재조합 CHO 세포의 비교 성장 실험을 혈청 대조군에서의 성장 및 생산과 비교하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 단백질 가수분해물이 보충된 무혈청 배지에서 수행하였다. 성장을 피크 세포 밀도 및 지속된 세포 생존 능력의 측면에서 비교하였다. 특정 단백질 생산율 및 체적 생산성을 비교하였다.
실시예 13: 모델 세포에서 테스트된 펩타이드 보충물.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 펩타이드 보충물의 활성을 IgG2a 항체를 생산하는 모델 마우스 하이브리도마 ME-750에서 테스트하였다. 단백질이 없는 배양 배지는 0.4mM HEPES 및 2.0 g/ℓ 소듐 바이카보네이트가 보충된 DMEM/F12/RPMI 1640(3:1:1)이다(Franek, et al., 1992). 대조군에는 기초 배지 이글(BME) 아미노산, 2.0mM 글루타민, 생존-촉진 아미노산(Franek and
Figure pct00006
, 1996a) 및 0.4mM 구연산철을 포함한 철-풍부 성장-촉진 혼합물(문헌[Franek, et al., 1992])을 추가로 보충하였다. 대조군과 비교되는 실험은 다음 보충물 중 하나 이상을 대체한다: 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물, 단백질 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물과 함께, 기초 배지 이글(BME) 아미노산, 2.0mM 글루타민, 생존-촉진 아미노산(Franek and
Figure pct00007
, 1996a, 상기 참조) 및/또는 0.4mM 구연산철을 포함하는 철-풍부 성장-촉진 혼합물(Franek, et al. 1992, 상기 참조). 대조군과 비교되는 또 다른 실험은 위에 열거된 바와 같이 대조군에 제공되는 보충물을 포함하는 전체 배지를 이용한 다음, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물, 단백질 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물을 추가로 이 배지에 보충하는 것이다. 접종시 용해물, 단백질 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물의 농도는 0.1%, 0.2% 또는 0.3%(w/v)이다.
또 다른 실험 세트는 유가식 배양(fed-batch culture)을 테스트한다. 대조군에는, 10x BME 아미노산, 10x BME 바이타민 및 20mM 글루타민으로 강화된 DMEM을 포함하는 0.25㎖ 부피의 공급 혼합물을 매일 첨가하였다. 대조군과 비교되는 실험은 다음 보충물 중 하나 이상을 대체한다: 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 용해물, 단백질 가수분해물, 펩타이드 조성물 및/또는 아미노산 조성물과 함께, 10x BME 아미노산; 10x BME 바이타민; 및/또는 20mM 글루타민.
회분식 및 유가식 배양물은 모두 25㎠ T-플라스크에서 5% CO2의 가습 분위기에서 37℃에서 성장시켰다. 배양 부피는 6.0㎖이다.
단일클론 항체 농도는 보정 곡선을 사용하여 면역탁도계에 의해 결정하였다. 배양물에서 세포자멸성 세포의 수는 세포자멸성 형태 - 주름진 막이 있는 수축된 세포를 나타내는 세포의 현미경 계수에 의해 결정하였다. 세포-주기 단계의 비율은 투과화 및 프로피디움 아이오다이드를 이용한 염색에 의해 결정하였다.
회분식 및 유가식 실험을 다음의 기준에 대해 각각의 대조군과 비교하였다: 생존 가능한 세포/㎖; 배양 생존 능력(%); 단일클론 항체의 농도(㎎/ℓ). 비교는 접종 6일 후 이들 매개변수의 값에 대한 것이다.
실시예 14: 단백질 가수분해물 중간체를 통한 2단계 공정으로 CO 2 로부터 오메가-7 오일의 생산
공정의 제1 단계에서, 단백질 및/또는 폴리하이드록시뷰티레이트(PHB)를 쿠프리아비두스 네카토르를 사용하여 CO2 및 H2 상에서 생산하였다. 제2 단계에서, 오메가-7 생산 미생물인 로도코커스 오파쿠스를 제1 단계에서 생산된 가수분해된 단백질 및/또는 PHB에서 성장시키고, 로도코커스 오파쿠스 바이오매스로부터 오일을 추출하였다.
이 연구는 오메가-7을 포함하는 오일을 생산하는 로도코커스 오파쿠스의 능력을 입증하기 위해 가수분해에 의해 쿠프리아비두스 네카토르 바이오매스에서 생성될 수 있는 것과 유사한 것으로 알려진 테스트 기질을 사용하는 공정의 제2 단계에 초점을 맞추었다. 예비 스크리닝을 위해 다양한 대표적인 기질을 선택하였다. 트립톤 단독 또는 하이드록시-뷰티레이트와 조합하여 로도코커스 오파쿠스의 가장 높은 역가를 생성하였다. 트립신 가수분해를 사용하여 C. 네카토르로부터 유래되는 PH에 대한 프록시 역할을 하는 트립톤을 오일 생산을 위해 선택하였다.
로도코커스 오파쿠스를 300-리터 생물반응기에서 탄소 및 질소 공급원으로서 트립톤 상에서 성장시켰으며, 560그램의 건조된 바이오매스가 생성되었다. 건조 전 바이오매스 분취량의 분석에 기초한 총 지질의 오메가-7 분획은 15.7%이었다(4% 팔미톨레산 및 9% 박센산 포함). 바이오매스의 총 지질 함량은 19%였으며, 중성 지질은 9% 내지 10%였다. 용매 혼합물을 사용하여 바이오매스로부터 오일을 추출하였다. 이 공정은 중성 지질과 극성 지질을 분리하였다. 약 100㎖의 오일이 추출되었다.
실시예 15: 미생물 배지에서 트립톤을 대체하는 화학독립영양성 공급원으로부터의 단백질 가수분해물
화학독립영양성 공급원으로부터 유래된(예를 들어, CO2, CO 및/또는 CH4와 같은 C1 탄소 공급원으로부터 생합성된 단백질로부터 유래된) 다수의 단백질 가수분해물을 평가하였다. 루리아-베르타니(LB) 브로스의 트립톤을 동일한 양의 이러한 대체 단백질 가수분해물(PH)로 대체하였다. 다양한 PH로 LB-배지에 존재하는 트립톤의 대체물을 재조합 에세리키아 콜라이 균주의 성장률 및 성장 수율로 평가하였다. 또한, 다양한 단백질 가수분해물의 존재하에 성장한 재조합 균주에서 플라스미드 안정성, 유도성 및 β-갈락토시데이스를 암호화하는 플라스미드의 활성을 평가하였다.
세균 균주
사용된 균주는 플라스미드 POP(UV-5)-3을 보유하는 에세리키아 콜라이 ATCC 39114이다. 이 플라스미드는 lacZ 유전자를 포함하고, β-갈락토시데이스를 매우 높은 수준(총 세포 단백질의 최대 15%)까지 발현한다.
배지
배양물의 일상적인 성장을 위해, LB 아가 및 LB 브로스를 사용하였다. LB 배지는 트립톤 10g, 효모 추출물 5g 및 소듐 클로라이드 10 g/ℓ의 증류수를 포함한다.
배양물은 -80℃에서 글리세린화된 LB 브로스에 보관하였다. 테트라사이클린은 20 ㎍/㎖의 농도로 사용하였다. IPTG(아이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)는 0.5mM의 농도로 사용하였다.
다양한 단백질 가수분해물이 LB 배지에서 트립톤을 대체한다. 적용된 각각의 상이한 단백질 가수분해물의 농도는 10 g/ℓ(w/v)이다.
성장 연구
시드 배양물을 37℃에서 테스트 튜브에 담긴 5㎖의 LB 브로스에서 호기성으로 성장시켰다. 1%의 접종원을 사용하여 500㎖ 사이드암 플라스크에 담긴 20㎖의 배지를 접종하고, 250rpm으로 교반하면서 37℃에서 성장시켰다. 성장은 600㎚에서 광학 밀도로 측정하였다.
β-갈락토시데이스 검정
배양물의 단일 콜로니를 테트라사이클린(20 ㎍/㎖)을 포함하는 5㎖의 각각의 배지(PH 실험 및 LB 양성 대조군)에 접종하고, 테스트 튜브에 담고, 250rpm으로 37℃에서 배양하였다. 8시간 내지 12시간 후, 1%의 접종원을 동일한 조성의 새로운 배지 5mℓ에 옮기고, 밤새 진탕시키면서 호기성으로 성장시켰다. 밤새 성장시킨 후, 1%의 접종원을 125㎖ 에를렌마이어 플라스크에 담긴 20mℓ의 새로운 배지에 옮기고, 광학 밀도가 각각 0.35 및 0.7 유닛에 도달할 때까지 계속 성장시켰다. β-갈락토시데이스는 IPTG의 첨가에 의해 0.5mM의 최종 농도로 유도되었다. 250rpm으로 진탕시키면서 37℃에서 30분 동안 배양물을 유도하였다. 위에 설명된 바와 같이 성장시킨 세포를 β-갈락토시데이스 활성에 대해 검정하고, 단위는 문헌[Miller (1992)]에 기술되어 있는 바와 같이 계산하였다.
플라스미드 안정성
다양한 배지에서 플라스미드 안정성을 결정하기 위해, 배양물의 단일 콜로니를 테스트 튜브에 담긴 5㎖의 LB 브로스에 접종하고, 250rpm 및 37℃에서 인큐베이션하였다. 밤새 성장시킨 후, 1%의 접종원을 125㎖ 에를렌마이어 플라스크에 담긴 20㎖의 다양한 배지(실험적 PH 배지 및 LB 대조군)에 옮기고, 250rpm 및 37℃에서 성장시켰다. 배양물을 1.4의 OD까지 성장시켰다. 샘플(100ML)을 회수하고, 희석하여 테트라사이클린의 존재 및 부재하에 다양한 배지에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 12시간 동안 인큐베이션하고, 콜로니를 계수하였다.
단백질 가수분해물의 특성
실험 배지 및 LB 대조군에 대해 가수분해물의 화학적 특성, 예컨대, 단백질 함량(%), 총 아미노산 조성 및 프로파일, 총 질소(TN)(%), 아미노 질소(AN)(%), 아미노 질소 대 총 질소 AN/TN의 비, pH, 회분(%) 및 수분 함량(%)을 측정하였다. Ala, Arg, Asp, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val에 대한 다양한 배지의 백분율 및 절대 아미노산 조성을 결정하였다.
본 개시내용은 설명에 기재된 구성의 세부사항 및 성분의 배열에 대한 적용에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 실시형태는 다양한 방식으로 실시되거나 또는 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용되는 어구 및 용어는 설명을 위한 것이며, 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서에서 "포함하는(including)", "포함하는(comprising)" 또는 "갖는(having)", "함유하는(containing)", "포함하는(involving)" 및 이들의 변형의 사용은 이후에 열거되는 항목 및 이들의 등가물뿐만 아니라 추가적인 항목을 포괄함을 의미한다.
전술한 발명은 이해의 명료함을 위해 예시 및 실시예의 방식으로 일부 상세하게 설명되었지만, 소정의 변경 및 수정이 첨부된 청구범위에 기술된 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 실시될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 설명이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 같은 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

Claims (42)

  1. 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법으로서,
    제1 미생물을 배양하여 바이오매스를 생산하는 단계;
    제1 배양된 미생물에 의해 생성된 바이오매스를 처리하여 단백질 가수분해물 조성물을 생산하는 단계; 및
    상기 단백질 가수분해물 조성물을 제2 미생물 또는 세포를 포함하는 제2 배양을 위한 배양 배지에 첨가하는 단계로서, 상기 단백질 가수분해물 조성물은 상기 제2 미생물 또는 세포의 성장을 위한 영양 공급원의 역할을 하는, 상기 첨가하는 단계
    를 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 처리는 승온, 상승된 압력 및 프로테이스 중 하나 이상으로 상기 바이오매스를 처리하는 것을 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 처리는 상기 바이오매스를 포함하는 현탁액의 pH를 올리는 것을 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 처리는 상기 바이오매스를 포함하는 현탁액의 pH를 낮추는 것을 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물 조성물은 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PHA는 폴리하이드록시뷰티레이트(PHB)를 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물 조성물은 바이타민을 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 바이타민은 바이타민 B1, 바이타민 B2 및 바이타민 B12 중 1종 이상을 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물 조성물의 총 유기 함량은 단백질, 펩타이드 및/또는 아미노산이 풍부한, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제2 배양물은 동물 세포를 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 동물 세포를 위한 배양 배지는 무혈청 배양 배지인, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 동물 세포를 위한 배양 배지는 동물 성분이 없는 배양 배지인, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물 조성물은 재조합 동물 세포를 배양하기 위한 보충물의 역할을 하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물 조성물은 육류를 배양하기 위한 보충물의 역할을 하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제1 미생물은 화학독립영양성(chemoautotrophic) 미생물이되, 상기 제1 미생물의 배양은 독립영양성 조건(autotrophic condition)하에 상기 화학독립영양성 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 독립영양성 조건은 상기 화학독립영양성 미생물을 성장시키기 위한 기체 기질을 제공하는 것을 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 기체 기질은 탄소 공급원으로서 CO2, CO 및 CH4 중 하나 이상을 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 기체 기질은 전자 공여체로서 H2, CO 및 CH4 중 하나 이상을 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 기체 기질은 열분해 가스(pyrolysis gas), 발생로 가스(producer gas), 합성가스(syngas), 천연 가스 또는 바이오가스를 포함하는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 화학독립영양성 미생물은 크날가스 미생물인, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 화학독립영양성 미생물은 아퀴펙스 종(Aquifex sp.); 쿠프리아비두스 종(Cupriavidus sp.); 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.); 고르도니아 종(Gordonia sp.); 노카르디아 종(Nocardia sp.); 로도슈도모나스 종(Rhodopseudomonas sp.); 로도박터 종(Rhodobacter sp.); 로도스피릴룸 종(Rhodospirillum sp.); 로도코커스 종(Rhodococcus sp.); 리조비움 종(Rhizobium sp.); 티오캅사 종(Thiocapsa sp.); 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.); 하이드로게노모나스 종(Hydrogenomonas sp.); 하이드로게노박터 종(Hydrogenobacter sp.); 하이드로게노필루스 종(Hydrogenophilus sp.); 하이드로게노비브리오 종(Hydrogenovibrio sp.); 하이드로게노써무스 종(Hydrogenothermus sp.); 헬리코박터 종(Helicobacter sp.); 잔토박터 종(Xanthobacter sp.); 하이드로게노파가 종(Hydrogenophaga sp.); 브라디리조비움 종(Bradyrhizobium sp.); 랄스토니아 종(Ralstonia sp.); 알칼리게네스 종(Alcaligenes sp.); 아미콜라타 종(Amycolata sp.); 아쿠아스피릴룸 종(Aquaspirillum sp.); 아스로박터 종(Arthrobacter sp.); 아조스피릴룸 종(Azospirillum sp.); 바리오보락스 종(Variovorax sp.); 아시도보락스 종(Acidovorax sp.); 바실러스 종(Bacillus sp.); 칼데로박테눔 종(Calderobactenum sp.); 데르시아 종(Derxia sp.); 플라보박테리움 종(Flavobacterium sp.); 마이크로사이클러스 종(Microcyclus sp.); 마이코박테리움 종(Mycobacterium sp.); 파라코커스 종(Paracoccus sp.); 페르세포넬라 종(Persephonella sp.); 레노박터 종(Renobacter sp.); 셀리베리아 종(Seliberia sp.), 스트렙토마이세테스 종(Streptomycetes sp.); 써모크리니스 종(Thermocrinis sp.); 와우테르시아 종(Wautersia sp.); 아나바에나 종(Anabaena sp.); 아르트로스피라 종(Arthrospira sp.); 세네데스무스 종(Scenedesmus sp.); 클라미도모나스 종(Chlamydomonas sp.); 안키스트로데스무스 종(Ankistrodesmus sp.); 및 라피디움 종(Rhaphidium sp.) 중 1종 이상으로부터 선택되는, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 화학독립영양성 미생물은 유전자 변형된, 미생물 또는 세포를 배양하기 위한 배양 배지를 생산하는 방법.
  23. 세포 배양 배지 보충물로서,
    미생물로부터 유래되는 단백질 가수분해물 조성물을 포함하는, 세포 배양 배지 보충물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 미생물은 화학독립영양성 미생물인, 세포 배양 배지 보충물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물 조성물은 바이타민을 포함하는, 세포 배양 배지 보충물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 바이타민은 바이타민 B1, 바이타민 B2 및 바이타민 B12 중 1종 이상을 포함하는, 세포 배양 배지 보충물.
  27. 제23항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물 조성물은 PHA를 포함하는, 세포 배양 배지 보충물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 PHA는 PHB인, 세포 배양 배지 보충물.
  29. 제23항에 있어서, 상기 보충물의 총 유기 함량은 단백질, 펩타이드 및/또는 아미노산이 풍부한, 세포 배양 배지 보충물.
  30. 동물 세포를 배양하는 방법으로서,
    제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 배지 보충물을 무혈청 배양 배지에 첨가하는 단계; 및
    상기 무혈청 배양 배지에서 동물 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 무혈청 배양 배지는 동물 성분이 없는 배양 배지인, 동물 세포를 배양하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 배양 배지는 식물-기반 및/또는 효모-기반 단백질 가수분해물 조성물인, 동물 세포를 배양하는 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 동물 세포는 재조합 세포를 포함하는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  34. 제30항에 있어서, 상기 동물 세포는 줄기 세포를 포함하는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 동물 세포는 근아세포 및/또는 근세포를 포함하는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  36. 제30항에 있어서, 상기 동물 세포는 지방세포 및/또는 섬유아세포를 포함하는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  37. 제30항에 있어서, 상기 배양은 상기 세포가 스캐폴드 상에서 성장하기에 충분한 조건하에 상기 동물 세포를 생분해성 및/또는 소모성 스캐폴드와 접촉시키는 것을 포함하는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 스캐폴드는 PHA 중합체를 포함하는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 PHA 중합체는 PHB를 포함하는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 PHA 중합체는 화학독립영양성 미생물로부터 유래되는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  41. 제10항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물 조성물은 상기 동물 세포의 성장 및/또는 분화를 위한 보충물의 역할을 하는, 동물 세포를 배양하는 방법.
  42. 제23항에 있어서, 상기 보충물은 동물 세포 배양 배지 보충물로 사용하기 위해 제형화되는, 세포 배양 배지 보충물.
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