DE102013202106A1

DE102013202106A1 - Autotrophe Kultivierung

Info

Publication number: DE102013202106A1
Application number: DE102013202106.2A
Authority: DE
Inventors: Thomas Haas; Markus Pötter; Martin Demler; Eva-Maria Eckl; Simon Przybilla
Original assignee: Evonik Industries AG
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2013-02-08
Filing date: 2013-02-08
Publication date: 2014-08-14
Also published as: MX2015009925A; CN104955945A; RU2015137939A; CA2900293A1; EP2954052A1; WO2014122005A1; BR112015019156A2; KR20150115905A

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren umfassend die Verfahrensschritte A) Vermehren von Zellen, welche derart gentechnisch verändert wurden, dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp eine verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese aufweisen, in einem Medium unter autotrophen Bedingungen bis zu einer Zelldichte X Zellen/Liter, B) Verdünnen mindestens eines Teils der Zellen auf eine Zelldichte von 0,001 X bis 0,5 X, bevorzugt 0,01 X bis 0,3 X, besonders bevorzugt 0,05 X bis 0,2 X in einem Medium und C) Vermehren des mindestens einen Teils der Zellen unter autotrophen Bedingungen.

Description

Gebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren umfassend eine autotrophe Kultivierung von Zellen.
Stand der Technik
Bei der fermentativen Herstellung von Produkten ist man stets bemüht, die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten möglichst zu vermeiden oder auf ein Minimum zu reduzieren. In der Regel kann man so die Produktausbeute erhöhen und auch die Aufreinigung des Endproduktes erleichtern.
Zellen, die als Kohlenstoffquelle anorganischen Kohlenstoff verwenden, um organische Moleküle zu synthetisieren sind insbesondere in Form von Knallgasbakterien und acetogenen Organismen bekannt.
Organismen, die Polyhydroxyalkanoat produzieren, benutzen als Vorstufe 3-Hydroxyalkanyl-CoA. Dieses Stoffwechselprodukt kann als hervorragende Ausgangssubstanz dienen, um insbesondere auch durch künstlich eingefügte Stoffwechselwege zu weiteren, hochwertigen organischen Substanzen verstoffwechselt zu werden.
Insbesondere das Knallgasbakterium Cupriavidus necator wurde in den letzten Jahren ausführlich charakterisiert und untersucht.
In Vollbrecht et al., Excretion of Metabolites by Hydrogen Bacteria I. Autotrophic and Heterotrophic Fermentations, European J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 6, 145–155 (1978) wurde die Nebenproduktbildung verschiedener Cupriavidus necator Stämme analysiert.
Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren bereitzustellen, welches die Nebenproduktbildung in Fermentationsverfahren reduziert und somit die Ausbeute an Monomereinheiten der in der Biosynthese verminderten Polyhydroxyalkanoats erhöht.
Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene Verfahren die gestellte Aufgabe zu lösen vermag.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren, bei dem bereits die Vorkultivierung, welche insbesondere der Generierung von Zellmasse dient, unter autotrophen Bedingungen durchgeführt wird, gefolgt von einer weiteren autotrophen Kultivierung, welche bevorzugt mindestens über einen Teilzeitbereich der Kultivierung hinweg der Produktbildung dient.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass unerwünschte Nebenprodukte, wie beispielweise Acetat, Lactat, Pyruvat, Succinat, Alanin, Valin, Butanol, Butyrat, Malat, Aceton, 2-Methyl-Propionsäure oder 3-Methyl-Butyrat, insbesondere Acetat, Pyruvat und Aceton, deutlich vermindert gebildet werden.
Somit erhöht die vorliegende Erfindung vorteilhaft die Raum-Zeit-Ausbeute. Noch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass das gewünschte Produkt leichter isoliert werden kann.
Noch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass man komplett unabhängig von komplexen Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Zucker agieren kann.
Noch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass Kohlendioxid gebunden wird, welches ansonsten als Klimagas problematisch sein könnte.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Verfahrensschritte

A) Vermehren von Zellen, welche derart gentechnisch verändert wurden, dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp eine verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese aufweisen, in einem Medium unter autotrophen Bedingungen bis zu einer Zelldichte X Zellen/Liter,
B) Verdünnen mindestens eines Teils der Zellen auf eine Zelldichte von 0,001 X bis 0,5 X, bevorzugt 0,01 X bis 0,3 X, besonders bevorzugt 0,1 X bis 0,2 X in einem Medium und
C) Vermehren des mindestens einen Teils der Zellen unter autotrophen Bedingungen.

Unter dem Begriff „unter autotrophen Bedingungen“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind Kultivierungsbedingungen zu verstehen, bei denen die den Zellen verfügbare Kohlenstoffquelle zu mindestens 90 Gew.-%, bezogen auf Kohlenstoffatome, anorganischen Kohlenstoff enthält.
Unter einem „Wildtyp“ einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp“ fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren
Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
Unter dem Begriff „verglichen zum Wildtyp verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist zu verstehen, dass die betrachteten Zellen, wenn unter gleichen Bedingungen kultiviert wie der Wildtyp, weniger Polyhdroxyalkanoat pro Zellen bilden als der Wildtyp.
Angegebene Prozente (%) sind, wenn nicht anders angegeben, Massenprozente.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Zellen sind gentechnisch veränderte, daher rekombinante Zellen. Sie können Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen), um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen besonders bevorzugt und Bakterien und Hefen am meisten bevorzugt sind. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die eingesetzten Zellen aus acetogene Bakterien oder Knallgasbakterien ausgewählt sind.
Unter dem Begriff „Knallgasbakterium“ ist ein Bakterium zu verstehen, das in der Lage ist chemolithoautotroph zu wachsen und aus H₂ und CO₂ in Gegenwart von Sauerstoff Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor benutzt wird. Es können erfindungsgemäß sowohl solche Bakterien eingesetzt werden, die von Natur aus Knallgasbakterien darstellen, oder aber auch Bakterien, welche durch gentechnische Modifikation zu Knallgasbakterien wurden, wie beispielsweise eine E. coli Zelle, die durch rekombinantes Einfügen der notwendigen Enzyme in die Lage versetzt wurde, aus H₂ und CO₂ in Gegenwart von Sauerstoff Kohlenstoffgerüste mit mehr als einem C-Atom aufzubauen, wobei der Wasserstoff oxidiert und der Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor benutzt wird. Bevorzugt handelt es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Knallgasbakterien um solche, welche bereits als Wildtyp Knallgasbakterien darstellen.
Erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Knallgasbakterien sind ausgewählt aus den Gattungen Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Alcaligenes, Anabena, Ancyclobacter, Aquifex, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium, Cupriavidus, Derxia, Helicobacter, Herbaspirillum, Hydrogenobacter, Hydrogenobaculum, Hydrogenophaga,, Hydrogenophilus, Hydrogenothermus, Hydrogenovibrio, Ideonella sp. O1, Kyrpidia, Metallosphaera, Mycobacterium, Nocardia, Oligotropha, Paracoccus, Pelomonas, Polaromonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Seliberia, Streptomyces, Thiocapsa, Variovorax, Xanthobacter, Wautersia, wobei Cupriavidus besonders bevorzugt ist, besonders aus den Spezies Cupriavidus necator (alias Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha, Alcaligenes eutrophus, Hydrogenomonas eutropha), Achromobacter ruhlandii, Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidovorax facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Anabena cylindrica, Anabena oscillaroides, Anabena sp., Anabena spiroides, Ancyclobacter vacuolatus, Aquifex aeolicus, Aquifex pyrophilus, Arthrobacter strain 11X, Bacillus schlegelii, Bradyrhizobium japonicum, Derxia gummosa, Escherichia coli, Heliobacter pylori, Herbaspirillum autotrophicum, Hydrogenobacter hydrogenophilus., Hydrogenobacter thermophilus, Hydrogenobaculum acidophilum, Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga palleronii, Hydrogenophaga pseudoflava, Hydrogenophaga taeniospirales, Hydrogeneophilus thermoluteolus, Hydrogenothermus marinus, Hydrogenovibrio marinus, Ideonella sp. O-1, Kyrpidia tusciae, Metallosphaera sedula, Myobacterium gordonae, Nocardia autotrophica, Oligotropha carboxidivorans, Paracoccus denitrificans, Pelomonas saccharophila, Polaromonas hydrogenivorans, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas thermophila, Rhizobium japonicum, Rhodococcus opacus, Rhodopseudomonas palustris, Seliberia carboxydohydrogena, Thiocapsa roseopersicina, Variovorax paradoxus, Xanthobacter autrophicus, Xanthobacter flavus, wobei Cupriavidus necator besonders bevorzugt ist, insbesondere aus den Stämmen Cupriavidus necator H16, Cupriavidus necator H1 oder Cupriavidus necator Z-1.
Besonders bevorzugt wird der Stamm Cupriavidus necator H 16 PHB-4, DSM 541 eingesetzt. Die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen weisen aufgrund von mindestens einer gentechnischen Veränderung eine verglichen zu ihrem Wildtyp verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese auf. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen keine nachweisbaren Mengen an Polyhydroxyalkanoat synthetisieren. Bevorzugt ist das Polyhydroxyalkanoat, dessen Synthese vermindert ist, Polyhydroxybutyrat.
Die verglichen zum Wildtyp verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese lässt sich bevorzugt durch eine gentechnische Veränderung erreichen, so dass die verglichen zum Wildtyp der Zelle verminderte Aktivität mindestens eines Enzyms, welches die Umsetzung von 3-Hydroxyalkanyl-Coenzym A zu Polyhydroxyalkanoat, bevorzugt von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu Polyhydroxybutyrat katalysiert.
Unter der verwendeten Formulierung „verminderte Aktivität eines Enzyms“ wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Formulierung „verminderte Aktivität“ beinhaltet auch keine detektierbare Aktivität („Aktivität von null“). Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms erfolgen. Verfahren zur Verminderung von enzymatischen Aktivitäten in Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt, diese umfassen Insertion von Fremd-DNA in das Gen kodierend für das Zielenzym, Deletion mindestens von Teilen des Gens kodierend für das Zielenzym, Punktmutationen in der Gensequenz kodierend für das Zielenzym, RNA-Interferenz (siRNA), antisense-RNA oder Modifikation (Insertion, Deletion oder Punktmutationen) von regulatorischen Sequenzen, wie etwa Promotoren und Terminatoren oder von Ribosomenbindestellen, welche das Gen kodierend für das Zielenzym flankieren. Unter Fremd-DNA ist in diesem Zusammenhang jegliche DNA-Sequenz zu verstehen, die dem Gen (und nicht dem Organismus) „fremd“ ist, d.h. auch endogene DNA-Sequenzen können in diesem Zusammenhang als „Fremd-DNA“ fungieren.
Bei dem Enzym, welches die Umsetzung von 3-Hydroxyalkanyl-Coenzym A zu Polyhydroxyalkanoat handelt es sich vorzugsweise um eine Polyhydroxyalkanoat Synthase, besonders bevorzugt um eine Polyhydroxybutyrat Synthase. Dieses Enzym wird insbesondere vorzugsweise von den Genen phbC oder phaC kodiert, wobei phaC besonders bevorzugt ist.
Das Verfahren wird in Verfahrensschritt A) unter autotrophen Bedingungen, somit unter Bedingungen bei denen die den Zellen verfügbare Kohlenstoffquelle zu mindestens 90 Gew.-%, bevorzugt 95 Gew.-%, insbesondere bevorzugt 99 Gew.-% bezogen auf Kohlenstoffatome, anorganischen Kohlenstoff enthält. Der anorganische Kohlenstoff, der in dem erfindungsgemäßen Verfahrensschritt A) eingesetzt wird, wird insbesondere in der Form von Substanzen zugeführt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus Carbonaten, Kohlendioxid und Kohlenmonoxid, wobei Kohlendioxid besonders bevorzugt ist. Es können in Verfahrensschritt A) auch Mischungen der Kohlenstoffquellen eingesetzt werden.
Im Fall, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren Knallgasbakterien eingesetzt werden, ist es bevorzugt, das Verfahren in Gegenwart von Wasserstoff durchzuführen. Insbesondere wird in Verfahrensschritt A) und C) das Medium, in dem die Zellen enthalten sind mit einem Gas enthaltend
H₂, CO₂ und O₂,
bevorzugt in einem Gewichtsverhältnis von 20 bis 95 zu 2 bis 45 zu 1 bis 35, insbesondere von 70 bis 95 zu 4 bis 15 zu 1 bis 10,
in Kontakt gebracht.
In Verfahrensschritt A) werden die Zellen bevorzugt um mindestens das 10-fache, besonders bevorzugt um mindestens das 100-fache, insbesondere um mindestens das 1000-fache bezogen auf die Zellanzahl pro Volumen der Gesamtkultur vermehrt.
Die Zelldichte X in Verfahrensschritt A beträgt bevorzugt mindestens 1 × 10⁵, besonders bevorzugt mindestens 1 × 10⁷, insbesondere mindestens 1 × 10⁸ Zellen/ml Gesamtkultur.
In Verfahrensschritt B) des erfindungsgemäßen Verfahrens findet eine Verdünnung der Zellen mit Medium statt. Das eingesetzte Medium kann das gleiche sein, wie in Verfahrensschritt 1 verwendet, es kann aber auch ein davon verschiedenes sein.
In Verfahrenschritt C) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen unter autotrophen Bedingungen, somit unter Bedingungen bei denen die den Zellen verfügbare Kohlenstoffquelle zu mindestens 90 Gew.-%, bevorzugt 95 Gew.-%, insbesondere bevorzugt 99 Gew.-% bezogen auf Kohlenstoffatome, anorganischen Kohlenstoff enthält, vermehrt. Der anorganische Kohlenstoff, der in dem erfindungsgemäßen Verfahrenschritt C) eingesetzt wird, wird insbesondere in der Form von Substanzen zugeführt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus Carbonaten, Kohlendioxid und Kohlenmonoxid, wobei Kohlendioxid besonders bevorzugt ist. Es können in Verfahrensschritt C) auch Mischungen der Kohlenstoffquellen eingesetzt werden.
Verfahrensschritt C) wird vorteilhaft und somit bevorzugt mindestens über einen Teilzeitbereich hinweg zur Produktproduktion genutzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Verfahrensschritt C) durch die Zellen Zielprodukte synthetisiert, dessen Bildung über das Zwischenprodukt 3-Hydroxyalkanyl-CoA, insbesondere 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, erfolgt. Der Begriff „Zwischenprodukt“ definiert in diesem Zusammenhang eine chemische Verbindung, die durch den Einsatz mindestens eines Enzymes auf enzymatischem Weg zu dem gewünschten Produkt umgesetzt werden kann, wobei als „chemische Verbindung“ solche mit oder ohne Coenzym A-Thioester-Funktionalisierung als gleichwertig betrachtet werden sollen und somit die Thioester bildenden bzw. -spaltenden Enzyme nicht mitgezählt werden.
Es kann vorteilhaft sein, wenn die Zellen entsprechend des gewünschten Zielproduktes durch genetische Modifikation derart verändert wurden, dass das Zielprodukt verstärkt durch die Zellen gebildet wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein bevorzugtes Zielprodukt 2-Hydroxyisobuttersäure. Für dieses Zielprodukt ist es bevorzugt, wenn die im erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp erhöhte Aktivität des Enzyms E₁ aufweist, welches die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert. Bei dem Enzym E₁ handelt es sich vorzugsweise um eine Hydroxyl-Isobutyryl-CoA Mutase, um eine Isobutyryl-CoA Mutase (EC 5.4.99.13) oder um eine Methylmalonyl-CoA Mutase (EC 5.4.99.2), jeweils bevorzugt um eine Coenzym B12-abhängige Mutase.
Bei dem Enzym E₁ handelt es sich bevorzugt um solche Enzyme, die sich aus den Mikroorganismen Aquincola tertiaricarbonis L108, DSM18028, DSM18512, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylibium sp. R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Nocardioides sp. JS614, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp. 217, Pyrococcus furiosus DSM 3638 isolieren lassen, besonders bevorzugt um die in PCT/EP2007/052830 beschriebenen Coenzym B12-abhängigen Mutase, sowie Enzyme, die in mindestens einer ihrer Teilsequenz eine Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz der kleinen bzw. großen Untereinheit der in PCT/EP2007/052830 beschriebenen Mutase (accession number DQ436457.1 und DQ436456.1) von mindestens 60%, vorzugsweise von mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 95%, ganz besonders bevorzugt mindestens 99% auf Aminosäureebene aufweisen, bestimmt nach dem blastp Algorithmus mit einem expect threshold von 10, einer word size von 3, einer blosum62 Matrix mit gap costs von existence: 11 und extension: 1 und einem conditional compositional score matrix adjustment.
Der Begriff „gesteigerte Aktivität eines Enzyms“, wie er vorstehend im Zusammenhang mit dem Enzym E₁ und in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit den Enzymen E₂ usw. verwendet wird, ist vorzugsweise als gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen. Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms E₁ als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann.
Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet, die Kodonnutzung des Gens verändert, auf verschiedene Art und Weise die Halbwertszeit der mRNA oder des Enzyms erhöht, die Regulation der Expression des Gens modifiziert oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Insbesondere wird somit das für das Enzym E_x kodierende Gen überexpremiert, was zu einer gesteigerten Aktivität durch Überexpresssion führt. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Promotor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999 , die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.
Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2-dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2-dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32–39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630–2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151–2155). Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989). Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624–5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277–2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816–823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712–23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32–39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630–2647 (1999) und Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151–2155 (2001) beschriebenen Methoden. Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e). Durch diese Mutationen werden veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert feedback-inhibierbar sind. Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Synthese eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sogenannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in EP-A-0 472 869 , im US 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in WO-A-96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993), in JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen.
Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weitere bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I–III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179–204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3–7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756–759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356–362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067–1070 (1989) und Tauch et al., FEMS Microbiology Let-ters 123: 343–347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross-over“-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung „eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E_x“ ist vorzugsweise stets eine um einen Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms E_x zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E_x“ aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E_x aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E_x zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression“ oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression“ auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Synthese des Enzyms E_x induziert wird.
Es kann weiterhin vorteilhaft sein, wenn die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Zellen eine verglichen zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E₂, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A katalysiert, aufweisen.
Bei dem Enzym E₂ handelt es sich vorzugsweise um ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe enthaltend:
eine 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase (EC 1.1.1.35),
eine Acetoacetyl-Coenzym A Reduktase (EC 1.1.1.36),
eine Long-Chain-3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase ((EC 1.1.1.211) und
eine 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.157).
Dieses Enzym wird vorzugsweise von den Genen kodiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus phaB, phbB, fabG, phbN1, phbB2 oder, wobei phaB, phbB besonders bevorzugt sind. Die Nukleotidsequenz dieser Gene können beispielsweise der „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes“ (KEGG-Datenbank), den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) oder der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) entnommen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist bevorzugt einen Verfahrensschritt D) Aufreinigung des Zielproduktes auf.
In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.
Beispiele:
Vergleich heterotrophe/autotrophe Kultivierung versus autotrophe/autotrophe Kultivierung von Cupriavidus necator H 16 PHB-4 DSM 541
Es wurden zwei Cupriavidus necator H 16 PHB-4 DSM 541 eingesetzt:
Cupriavidus necator H 16 PHB-4 DSM 541 und
Cupriavidus necator H16 PHB-4 pBBR1MCS-2::icmA-icmB(lac) (im Folgenden RITA genannt).
Der RITA Stamm ist mit einem Expressionvektor für icmA und icmB aus Aquincola tertiaricarbonis transformiert. Eine detaillierte Generierung des Stammes ist in Beispiel 2 der WO2009156214 beschrieben.
In dem Verfahren wurde das Medium nach Vollbrecht eingesetzt, bestehend aus 2 g/l (NH4)₂HPO₄, 2,1 g/l KH₂PO₄, 0,2 g/l MgSO₄, 0,01 g/l CaCl₂, 6 mg/l FeCl₃, 0,05 mg/l Titriplex III, 0,02 mg/l FeSO₄ × 7 H₂O, 1 µg/l ZnSO₄ × 7 H₂O, 0,3 µg/l MnCl₂ × 4 H₂O, 3 µg/l H₃BO₃, 2 µg/l CoCl₂ × 6 H2O, 0,1 µg/l CuCl₂ × 2 H₂O, 0,2 µg/l NiCl₂ × 6 H₂O und 0,3 µg/l Na₂MO4 × 2 H₂O.
Bei plasmidtragenden Stämmen wurde 1 ml Kanamycin der Konzentration 300 µg/ml in Verfahrensschritt A) und in Verfahrensschritt C) zusätzlich 120 µg/l Coenzym B12 zugegeben. Der pH wurde mit NaOH (aq) auf 6,8 eingestellt. Zu der heterotrophen Vorkultur wurden 10 g/l Fructose zugegeben.
Heterotrophe Vorkultur (Verfahrensschritt A) aber heterotroph, nicht erfindungsgemäß):
Die Vorkultur erfolgte in 500 ml Schüttelkolben mit je 50 ml Medium, pro Stamm im Doppelansatz. Die Vorkultur wurde mit einer Einzelkolonie von einer Agarplatte angeimpft. Die Inkubation erfolgte bei 30 °C und 150 rpm für 28,5 Stunden.
Die Kulturen wurden für 10 min bei 4500 × g zentrifugiert.
Die Pellets wurden in 2 ml Medium resuspendiert und der autotrophen Hauptkultur (siehe dort) zugeführt.
Autotrophe Vorkultur (Verfahrensschritt A):
Die Vorkultur erfolgte in 250 ml druckfest beschichteten Schottflaschen mit je 50 ml Medium. Der Flaschenverschluss besaß eine Begasungsfritte, einen Abluftfilter und ein Probenahmerohr. Die Flaschen wurden vor dem Animpfen 3fach mit N₂ und 3fach mit Knallgas gespült. Der Versuch fand bei 0,8 bar Überdruck, 28 °C und 150 rpm statt. Die Begasung erfolgte mit Knallgas der Zusammensetzung 4 % O₂, 6 % CO₂ und 90 % H₂. Die Vorkultur wurde mit einer Einzelkolonie von einer Agarplatte angeimpft. Die Kultivierungsdauer betrug 143 Stunden.
Die Kulturen wurden für 10 min bei 4500 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 2 ml Medium resuspendiert und der autotrophen Hauptkultur (siehe dort) zugeführt.
Autotrophe Hauptkultur (Verfahrensschritt C):

Die Hauptkultur erfolgte in druckfest beschichteten 250 ml Schottflaschen mit 50 ml Medium. Der Flaschenverschluss besaß eine Begasungsfritte, einen Abluftfilter und ein Probenahmerohr. Die Flaschen wurden vor dem Animpfen 3fach mit N₂ und 3fach mit Knallgas gespült. Der Versuch fand bei 0,8 bar Überdruck, 28 °C und 150 rpm statt, je Stamm im Doppelansatz. Es wird auf eine StartOD von 0,5 angeimpft. Die Begasung erfolgte mit Knallgas der Zusammensetzung 4% O₂, 6% CO₂ und 90% H₂. Die Probenentnahme erfolgte nach 25 Stunden. Hierzu wurden die Kulturen 10 min bei 4500 × g abzentrifugiert und der Überstand wurde mittels NMR analysiert. Messwerte:

Experiment	3HB [mg/L]	2HIB [mg/L]	Acetat [mg/L]	Aceton [mg/L]
DSM 541 heterotroph/autotroph	0	0	10	0
DSM 541 autotroph/autotroph	29	0	4	1
RITA heterotroph/autotroph	0	5	14	0
RITA autotroph/autotroph	0	18	0	0

Diese Experimente zeigen, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren die Ausbeute an 3-Hydroxybutyrat (3HB) bzw. der davon direkt abgeleiteten Substanz 2-Hydroxyisobuttersäure (2-HIB) zunimmt. Die akkumuliert reduzierte Nebenproduktsbildung geht also zu Gunsten der Zunahme von 3HB und 2-HIB.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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WO 96/15246 A [0041]
JP 10229891 A [0041]
WO 2009156214 [0052]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verfahren umfassend die Verfahrensschritte A) Vermehren von Zellen, welche derart gentechnisch verändert wurden, dass sie verglichen zu ihrem Wildtyp eine verminderte Polyhydroxyalkanoat-Synthese aufweisen, in einem Medium unter autotrophen Bedingungen bis zu einer Zelldichte X Zellen/Liter, B) Verdünnen mindestens eines Teils der Zellen auf eine Zelldichte von 0,001 X bis 0,5 X, bevorzugt 0,01 X bis 0,3 X, besonders bevorzugt 0,05 X bis 0,2 X in einem Medium und C) Vermehren des mindestens einen Teils der Zellen unter autotrophen Bedingungen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Zellen aus acetogene Bakterien oder Knallgasbakterien ausgewählt sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyhydroxyalkanoat, dessen Synthese vermindert ist, Polyhydroxybutyrat ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine verglichen um Wildtyp verminderte Aktivität Polyhydroxybutyrat Synthase kodiert von den Genen phbC oder phaC aufweist.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die den Zellen verfügbare Kohlenstoffquelle zu mindestens 90 Gew.-%, bezogen auf Kohlenstoffatome, Kohlendioxid enthält.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Knallgasbakterien eingesetzt werden, und in Verfahrensschritt A) und C) das Medium mit einem Gas enthaltend H₂, CO₂ und O₂ in einem Gewichtsverhältnis von 20 bis 95 zu 2 bis 45 zu 1 bis 35, insbesondere von 70 bis 95 zu 4 bis 15 zu 1 bis 10 n Kontakt gebracht wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in Verfahrensschritt C) Zielprodukt synthetisieren, dessen Bildung über das Zwischenprodukt 3-Hydroxyalkanyl-CoA, insbesondere 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt C) durch die Zellen 2-Hydroxyisobuttersäure synthetisiert wird und die Zelle. eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp erhöhte Aktivität des Enzyms E₁ aufweisen, welches die Umsetzung von 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 2-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Zellen eine verglichen zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E₂, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A katalysiert, aufweisen.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es den Verfahrensschritt D) Aufreinigung des Zielproduktes umfasst.