WO2022161569A1 - Herstellung von 3,4-dihydroxybenzoat aus d-xylose mit coryneformen bakterien - Google Patents

Herstellung von 3,4-dihydroxybenzoat aus d-xylose mit coryneformen bakterien Download PDF

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WO2022161569A1
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xylose
coryneform bacterial
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gene
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Stephan Noack
Mohamed Labib
Christian BRÜSSELER
Jan Marienhagen
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01005—Xylose isomerase (5.3.1.5)
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    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source

Definitions

  • the invention relates to a microbial, fermentative process for the production of
  • 3.4-Dihydroxybenzoic acid (3,4-dihydroxybenzoate, protocatechuate, PCA) is a phenolic compound that occurs naturally in plants.
  • protocatechuate is of particular interest because, as a copolymer, together with anilines, it is a sought-after starting material for a large number of new polymers and plastic compounds or new polymer fibers.
  • PCA is also in demand as a supplement in the food and feed industry.
  • PCA has great potential for cosmetic or pharmaceutical applications due to its anti-inflammatory, anti-oxidative, anti-bacterial, anti-viral, anti-aging and anti-fibrotic properties.
  • positive activities in the fight against cancer are ascribed to PCA.
  • the phenylalanine-producing strain C. glutamicum ATCC 21420 was modified to express the gene vanAB, which encodes vanillate O-demethylase.
  • the C. glutamicum ATCC 21420 pCH_vanAB strain showed the bioconversion of 16.0 mM ferulic acid, a lignin-derived phenolic compound, into 6.91 mM PCA after 12 h of fed-batch cultivation (Okai, N., et al., AMB Express, 2017. 7(1): p.130).
  • the expression of the gene ubiC which codes for the chorismate pyruvate lyase, in the strain C.
  • glutamicum ATCC 21420 enabled the formation of 1.4 mM PCA from D-glucose after 80 hours of cultivation in a 3 L shake flask.
  • the same strain C. glutamicum ATCC 21420 pCH_ubiC
  • the natural PCA catabolism in C.glutamicum was not suppressed.
  • a two-stage fermentation approach is required there, in which the cells have to be cultivated to high cell densities in a first step on complex medium. The cells then have to be concentrated and harvested in a manual centrifugation step. Only then can PCA be produced starting from D-glucose in a subsequent biotransformation to be carried out. Disadvantage remains next to that two-stage approach also the use of expensive complex media or D-glucose, so that this process is not particularly suitable for an economical and cost-effective and resource-saving production.
  • the aim of the present invention is also to do justice to a sustainable bioeconomy in the large-scale production of basic building blocks such as PCA that can be used extensively.
  • a further object is to be able to carry out a biotechnological synthesis of PCA starting from renewable, inexpensive raw materials and to provide correspondingly safe microorganisms with PCA synthesis capacities that can use such raw materials as starting material.
  • a process for the microbial production of 3,4-dihydroxybenzoic acid comprising the steps a) providing a solution containing at least water, nitrogen, mineral salts and a C5 carbon source, b) microbial conversion of the C5 carbon source into a solution according to step a) to 3,4-dihydroxybenzoic acid in the presence of a modified coryneform bacterial cell whose pyruvate kinase activity (PK) is partially or completely inactivated or whose gene coding for the pyruvate kinase (pyk) is partially or completely deleted and c) optionally isolating and/or recovering 3,4-dihydroxybenzoic acid from the solution.
  • PK pyruvate kinase activity
  • pyk gene coding for the pyruvate kinase
  • the object on which this is based is achieved according to the invention by a modified coryneform bacterial cell which has partially or completely inactivated pyruvate kinase activity and increased xylose isomerase and xylulose kinase activity or whose gene codes for pyruvate kinase (pyk ) is partially or completely deleted and whose genes coding for a xylose isomerase (xylA) and xylulose kinase (xylB) are overexpressed.
  • the present object is also achieved according to the invention by using a corynform bacterial cell modified according to the invention selected from the group containing Corynebacterium and Brevibacterium for the microbial production of 3,4-dihydroxybenzoic acid from D-xylose.
  • According to the invention includes a method for the microbial production of
  • 3.4-Dihydroxybenzoic acid containing the steps a) providing a solution containing at least water, nitrogen, mineral salts and a C5 carbon source, b) microbial conversion of the C5 carbon source in a solution according to step a).
  • PK pyruvate kinase activity
  • pyk gene encoding pyruvate kinase
  • a "modified" coryneform bacterial cell is to be understood as meaning that a coryneform bacterial cell has endogenous properties to a modified extent, such as increased or reduced, compared to the wild-type host cell or a corresponding starting strain or progenitor strain, or has additional properties through heterologous expression
  • this can be done using common methods, such as increased expression of endogenous genes by increasing the number of copies of these genes, for example by incorporating additional copies into the genome or introducing plasmids with an increased number of copies into the coryneform bacterial cell can also be used according to the invention for the increased expression of heterologous genes.
  • “partially or completely inactivated” or “partially or completely deleted” means that, for example, inactivation of pyruvate kinase (PK) by deleting the gene cg2291 or by inserting a vector or an alternative Sequence in the gene region of cg2291 can be achieved.
  • the gene coding for the pyruvate kinase can be partially or completely changed or deleted, resulting in the complete or almost complete (partial) inactivation of the enzymatic activity.
  • the gene expression of the pyruvate kinase can be weakened or reduced by genetic modification (mutation) of the signal structures of the gene expression.
  • Signal structures of gene expression are, for example, repressor genes, activator genes, Operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon and terminators.
  • the expert can find information on this, e.g. in patent application WO 96/15246, in Boyd and Murphy (J. Bacteriol. 1988. 170:5949), in Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Res. 1998. 26:3548, in Jensen and Hammer (Biotechnol. Bioeng.
  • Reduced or “switched off” in the context of the present invention means that the expression of the coding nucleic acid sequence is worse compared to the situation in a wild-type host cell or is no longer under the expression control of regulatory structures as compared to the situation in the wild-type host cell.
  • “reduced” or “switched off” is to be provided as equivalent to “deregulated” or “derepressed”.
  • the regulatory or catalytic activity of proteins or enzymes can also be “reduced” or “switched off”.
  • “enhanced” is synonymous with “increased” or “improved”, “changed” or “deregulated” and is used synonymously.
  • “Increased” within the meaning of the present invention means, for example, the increased Gene expression of a gene compared to the expression of the respective starting gene or the situation in a wild-type host cell in an unchanged, naturally non-enhanced state. The same is meant within the meaning of the invention with regard to the increased enzyme activity.
  • the wild type of a coryneform bacterial cell represents a genetically unmodified starting gene or enzyme. Coryneform wild type cells of the genus Corynbacterium or Brevibacterium are preferred, coryneform bacterial cells of the wild type Corynebacterium glutamicum are particularly preferred.
  • coryneform bacterial cells in the sense of "wild-type host cells” or as “starting strain” or “precursor strain” or as “production strain” or as “wild-type platform strain” for the corynform bacterial cells modified according to the invention also includes coryneform bacterial cells, which in turn have already changed in their properties are that they are defined and established platform strains or defined production strains of coryneform bacterial cells that are also prepared for the production of intermediates on a large technical or industrial scale and are therefore suitable.
  • the genus Corynebacterium is known in the art for its ability to produce L-amino acids and organic acids.
  • the strain Corynebacterium glutamicum DelAro 5 -C7 P O6 iolT1 is also advantageous according to the invention as “wild-type host cells” or as “starting strain” or “precursor strain” or as “production strain” or as “wild-type platform strain” within the meaning of the present invention.
  • the present invention thus also includes modified coryneform bacterial cells which represent a further development according to the invention of the starting strain Corynebacterium glutamicum DelAro 5 -C7 PO6 iolT1, this starting strain being to be regarded as a “wild-type platform strain” according to the invention.
  • modified coryneform bacterial cells were also produced according to the invention and are thus included according to the invention, which represent a further development of the strain Cornyebacterium glutamicum MB0001 (DE3) or also a further development of the strain Cornyebacterium glutamicum DelAro5, the respective starting strain for this further development then being referred to according to the invention as " wild-type host cells” or as a "parental strain” or “progenitor strain” or as a "production strain” or as a "wild-type platform strain”.
  • a variant of the present invention comprises a method in which a modified coryneform bacterial cell is used which has increased xylose isomerase and xylulose kinase activity (XylA, XylB) or whose genes encode a xylose isomerase (xylA ) and xylulose kinase (xyl B) are overexpressed.
  • a modified coryneform bacterial cell which has increased xylose isomerase and xylulose kinase activity (XylA, XylB) or whose genes encode a xylose isomerase (xylA ) and xylulose kinase (xyl B) are overexpressed.
  • increased expression of xylose isomerase (xylA) and/or xylulose kinase (xylB) can be based on changes selected from the group consisting of a) changes in the regulation or signal structures for gene expression, b) changes in the transcription activity of the coding nucleic acid sequence, or c) increasing the gene copy number of the coding nucleic acid sequence.
  • changes in the signal structures of gene expression are included, for example by changing the repressor genes, activator genes, operators, promoters; Attenuators, ribosome binding sites, the start codon, terminators. Also included is the introduction of a stronger promoter, such as the tac promoter or an IPTG-inducible promoter.
  • a stronger promoter such as B. the tac promoter (Amann et al (Gene 1988 69:301-15), or promoters from the group of promoters described by Patek et al (Microbiology 1996 142:1297) is preferred, but not limiting for the present invention.
  • An increased gene copy number of the nucleic acid sequence coding according to the invention can be chromosomally coded or vector-based, preferably plasmid-coded, in further variants of the invention.
  • the subject of the present invention is a coryneform bacterial cell which encodes the increase in copy number chromosomally or extra-chromosomally, preferably vector-encodes or plasmid-encodes.
  • suitable plasmids are those which are replicated in coryneform bacteria. Numerous known plasmid vectors such.
  • pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:549-554), pEKExI (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) or pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) are based on the cryptic plasmids pHM1519, pBL1 or pGA1. Other plasmid vectors such. B.
  • pCG4 US-A 4, 489, 160
  • pNG2 Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)
  • pAGI US-A 5, 158 , 891
  • Vectors with regulatable expression can also be used, such as pEKEx2 (B. Eikmanns, 1991 Gene 102:93-8; O. Kirchner 2003, J. Biotechnol. 104:287-99).
  • the gene can also be expressed by integration into the chromosome in single copy (P. Vasicova 1999, J. Bacteriol.
  • the transformation of the desired strain with the vector to increase the number of copies is carried out by conjugation or electroporation of the desired strain of, for example, C. glutamicum.
  • the method of conjugation is, for example, in Schwarz et al. (Applied and Environmental Microbiology (1994) 60:756-759). Methods for transformation are, for example, in Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters (1994) 123:343-347).
  • an increased activity of xylose isomerase (xylA) and/or xylulose kinase (xylB) can be based on changes selected from the group containing a) an increase in expression of the coding nucleic acid sequence, b) expression a nucleic acid sequence or fragments thereof which encodes a xylose isomerase (xylA) and/or xylulose kinase (xylB) with increased catalytic activity and/or substrate specificity, c) an increase in the stability of the mRNA derived from the coding nucleic acid sequence, or d ) a change in the catalytic activity and/or substrate specificity of a xylose isomerase (XylA) and/or xylulose kinase (XylB) for the conversion of D-xylose or a combination of a) - d).
  • the increase in mRNA stability can be achieved, for example, by mutation of the terminal positions that control transcription termination. Measures which lead to a change in the catalytic properties of enzyme proteins, in particular to a changed substrate specificity, are known from the prior art. In addition to preferred partial or complete deletions of regulatory structures according to the invention, changes such as e.g. B. transitions, transversions or insertions, as well as methods of directed evolution. Instructions for generating such changes can be found in well-known textbooks (R. Knippers "Molekulare Genetik", 8th edition, 2001, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany).
  • a corynform bacterial cell is used in the method according to the invention, which is modified in such a way that it has increased activity or overexpression of the gene coding for a heterologous xylose isomerase (XylA, xyla), preferably a heterologous xylose -Isomerase from the bacterial isomerase pathway starting from D-xylose, particularly preferably from the organism Xanthomonas campetris.
  • XylA, xyla heterologous xylose isomerase
  • XylA, xyla preferably a heterologous xylose -Isomerase from the bacterial isomerase pathway starting from D-xylose, particularly preferably from the organism Xanthomonas campetris.
  • a corynform bacterial cell which is modified in such a way that it has an increased activity or overexpression of the gene coding for an endogenous or native xylulose kinase (XylB, xylB), preferably an endogenous xylulose kinase from the bacterial isomerase pathway starting from D-xylose, particularly preferably from the organism Corynebacterium glutamicum.
  • XylB, xylB endogenous or native xylulose kinase
  • the invention also includes a method in which a modified coryneform bacterial cell is used, the catabolic metabolism of which is inactivated for aromatic compounds and which additionally has an increased activity of a DAHP synthase (AroF), preferably a feedback-deregulated DAHP synthase (AroF*).
  • a DAHP synthase preferably a feedback-deregulated DAHP synthase (AroF*).
  • a 3-dehydroshikimate dehydrogenase or whose genes coding for enzymes of the catabolic metabolism of aromatic compounds (DelAro 5 ) are deleted and an overexpression of the genes coding for a DAHP synthase (aroF), preferably a feedback-deregulated, DAHP synthase (AroF*), and a 3-dehydroshikimate dehydrogenase (qsuB).
  • the microbial conversion of a C5 carbon source is carried out using a modified coryneform bacterial cell in which the catabolic network for the degradation of aromatic compounds is switched off by deleting 27 genes (DelAro 5 ).
  • the bacterial cell according to the invention has an increased activity of 3-deoxy-D-arabinoheptulosanate-7-phosphate synthase (DAHP synthase; AroF), preferably a feedback-deregulated DAHP synthase (AroF*), particularly preferably a heterologous feedback-deregulated DAHP synthase (AroF*) from Escherichia coli, and a 3-dehydroshikimate dehydrogenase (QsuB), preferably an endogenous, native or homologous 3-dehydroshikimate dehydrogenase (QsuB) from coryneform bacteria.
  • DAHP synthase 3-deoxy-D-arabinoheptulosanate-7-phosphat
  • the coryneform bacterial cell modified according to the invention has an overexpression of the gene coding for a DAHP synthase (aroF), preferably a feedback-deregulated DAHP synthase (aroF*) from Escherichia coli, which very particularly preferably codon- is optimized, and overexpression of the gene coding for a 3-dehydroshikimate dehydrogenase (qsuB), particularly preferably a gene coding for an endogenous, native, homologous 3-dehydroshikimate dehydrogenase (QsuB) from coryneform bacteria, preferably Corynebacterium glutamicum.
  • aroF DAHP synthase
  • aroF* feedback-deregulated DAHP synthase
  • qsuB 3-dehydroshikimate dehydrogenase
  • QsuB endogenous, native, homologous 3-dehydroshikimate dehydrogenase
  • the solution containing 3,4-dihydroxybenzoic acid can be processed according to common methods of microbial or biotechnological practice and/or PCA can be isolated from the solution.
  • PCA 3,4-dihydroxybenzoic acid
  • the product of the process according to the invention can also be further purified or concentrated or, for further use, can be provided with additives which are adapted to the final end product.
  • Another variant of the present invention includes a method in which a modified coryneform bacterial cell is used, which additionally has a phosphotransferase (PTS)-independent carbon transporter system, preferably a myo-inositol/proton symporter iolT1, particularly preferably an lolR-derepressed myo-inositol/proton symporter P 6 -iolT 1 .
  • PTS phosphotransferase
  • the invention also includes a method in which a modified coryneform bacterial cell is used, selected from the group containing Corynebacterium and Brevibacterium, preferably Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum and Brevibacterium divaricatum.
  • a modified coryneform bacterial cell selected from the group containing Corynebacterium and Brevibacterium, preferably Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum and Brevibacterium divaricatum.
  • a modified coryneform bacterial cell of the genus Corynebacterium glutamicum which consists of a "wild-type host cell” or an "initial strain” or “progenitor strain” or a “production strain” or a "wild-type platform strain” of the genus Corynebacterium glutamicum emerges, preferably from the strain Corynebacterium glutamicum DelAro 5 -C7 P O6 iolT1 emerges.
  • Also included according to the invention is a method in which the microbial conversion takes place in a solution starting from a C5 carbon source selected from the group containing a) oligosaccharides or polysaccharides containing D-xylose units, b) D-xylose, c) Biomass containing lignocellulose, cellulose or hemicellulose, its hydrolyzate or extract obtained therefrom containing D-xylose units or d) a combination of a) to c).
  • the C5 carbon source used is spent sulfite liquor, corn straw, rice straw or bagasse, or their hydrolyzates or extracts obtained therefrom containing D-xylose units.
  • Variants of the process according to the invention can be run continuously or discontinuously, e.g.
  • a summary of known cultivation methods is described in the textbook by Chmiel (Bioprocess Engineering 1. Introduction to Biochemical Engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (Bioreactors and peripheral devices (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). .
  • a culture medium to be used should suitably meet the requirements of respective microorganisms. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the American Society for Bacteriology Manual of Methods for General Bacteriology (Washington DC, USA, 1981).
  • sugar and carbohydrates such as e.g. B. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such.
  • B. glycerol and ethanol and organic acids such.
  • B. acetic acid can be used.
  • the invention also includes biomass containing lignocellulose, cellulose or hemicellulose, its hydrolyzate or extract obtained therefrom containing D-xylose units or a combination of the aforementioned substrates. Furthermore, as a C5 carbon source, sulfite waste liquor, corn straw, rice straw or bagasse, or their hydrolyzates or extracts obtained therefrom containing D-xylose units are also included according to the invention.
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptone, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used.
  • the nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as a source of phosphorus.
  • the culture medium must also contain salts of metals such.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used in addition to the substances mentioned above.
  • the ingredients mentioned can be added to the culture in the form of a one-off batch or fed in in a suitable manner during the cultivation.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acidic compounds such as hydrochloric acid, phosphoric acid or sulfuric acid are used in a suitable manner to control the pH of the culture.
  • Antifoam agents such as e.g. B. fatty acid polyglycol esters can be used.
  • suitable selectively acting substances e.g. As antibiotics are added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as e.g. B. Air introduced into the culture.
  • the Temperature of the culture is normally from 20°C to 45°C and preferably from 25°C to 40°C.
  • the culture is continued until a maximum of PCA has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • the present invention also relates to a modified coryneform bacterial cell which has a partially or completely inactivated pyruvate kinase activity (PK) and an increased xylose isomerase and xylulose kinase activity (XylA, XylB) or whose gene encodes the Pyruvate kinase (pyk) is partially or completely deleted and the genes encoding a xylose isomerase (xylA) and xylulose kinase (xylB) are overexpressed.
  • PK pyruvate kinase activity
  • XylA, XylB xylulose kinase activity
  • pyk Pyruvate kinase
  • the invention includes a modified coryneform bacterial cell which has partial or complete inactivation of pyruvate kinase (PK), which can be achieved according to the invention by deleting the gene cg2291 or by inserting a vector or an alternative sequence into the gene region of cg2291 .
  • the gene coding for the pyruvate kinase (pyk) can be partially or completely modified or deleted ( ⁇ pyk), with the consequence of the complete or almost complete or partial inactivation of the enzymatic activity of the pyruvate kinase (PK).
  • the pyruvate kinase (PK) or the gene coding for the pyruvate kinase (pyk) is the endogenous enzyme or gene from the genus Cornyebacterium or Brevibacterium. It is preferably the pyruvate kinase or the gene encoding it from Corynebacterium glutamicum.
  • a modified coryneform bacterial cell of the present invention is viable without pyruvate kinase activity and is also capable of microbial production of PCA, which was unexpected.
  • a modified corynform bacterial cell which, in addition to the inactivation of the PK or deletion ⁇ pyk, has an increased activity or overexpression of the gene coding for a heterologous xylose isomerase (XylA, xyla), preferably a heterologous xylose -Isomerase from the bacterial isomerase pathway starting from D-xylose, particularly preferably from the organism Xanthomonas campestris.
  • XylA, xyla heterologous xylose isomerase
  • the invention also includes a variant of a corynform bacterial cell which, in addition to the inactivation of the PK or deletion ⁇ pyk and an increased activity of a heterologous xylose isomerase or overexpression of the gene coding for a heterologous xylose isomerase (XylA, xyla) still has an increased activity or Overexpression of the gene coding for a xylulose kinase (XylB, xylB), preferably an endogenous xylulose kinase from the bacterial isomerase pathway starting from D-xylose, particularly preferably from the organism Corynebacterium glutamicum.
  • the present invention also relates to a modified coryneform bacterial cell which a) has a partial or complete inactivation of a pyruvate kinase (PK) with an amino acid sequence of at least 70% identity to the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or fragments thereof, b) a xylose isomerase activity (XylA) with an amino acid sequence of at least 70% identity to the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or fragments thereof, c) an increased activity of a xylose isomerase activity (XylB) with an amino acid sequence of at least 70% identity to the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or fragments thereof.
  • PK pyruvate kinase
  • XylA xylose isomerase activity
  • XylB an increased activity of a xylose isomerase activity
  • a variant of a modified coryneform bacterial cell according to the invention is characterized in that it has a) a nucleic acid sequence coding for a xylose isomerase (xylA) with at least 70% identity to SEQ ID NO. 5 or fragments or alleles thereof, and b) increased expression of a nucleic acid sequence coding for a xylulose kinase (xylB) with at least 70% identity to SEQ ID NO. 6 or fragments or alleles thereof. c) a partial or complete deletion of the nucleic acid sequence coding for the pyruvate kinase according to SEQ ID NO. 4 having fragments or alleles thereof.
  • xylA xylose isomerase
  • xylB xylulose kinase
  • Also included according to the invention is a variant of a modified coryneform bacterial cell with a) a nucleic acid sequence which, under stringent conditions, binds to a complementary sequence of a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6 or fragments or alleles thereof hybridized, b) a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO. 6 or Fragments thereof, or c) a nucleic acid sequence corresponding to any of the nucleic acids according to a) or b), which, however, differs from these nucleic acid sequences by the degeneracy of the genetic code or functionally neutral mutations.
  • nucleic acid corresponding to each of the nucleic acids according to a) - c), which is adapted to the codon usage of the host strain (codon-optimized), and e) a partial or complete deletion of the nucleic acid according to SEQ ID NO: 4.
  • a variant of the present invention further comprises a modified coryneform bacterial cell whose enzymes are inactive for the catabolism of aromatic compounds and which additionally has an increased activity of a DAHP synthase (AroF), preferably a feedback-deregulated DAHP synthase (AroF*), and one 3-dehydroshikimate dehydrogenase (QsuB) or whose genes encoding enzymes of the catabolism of aromatic compounds (Delaro 5 ) are deleted and which overexpress the genes encoding a DAHP synthase (aroF), preferably a feedback-deregulated DAHP synthase (aroF *), and a 3-dehydroshikimate dehydrogenase (qsuB).
  • a DAHP synthase preferably a feedback-deregulated DAHP synthase (AroF*)
  • QsuB 3-dehydroshikimate dehydrogenase
  • a modified coryneform bacterial cell in which the catabolic network for degrading aromatic compounds is switched off by deleting 27 genes (DelAro 5 ).
  • the bacterial cell according to the invention has an increased activity of 3-deoxy-D-arabinoheptulosanate-7-phosphate synthase
  • DAHP synthase AroF
  • AroF a feedback-deregulated DAHP synthase
  • AroF* a heterologous feedback-deregulated DAHP synthase
  • QsuB 3-dehydroshikimate dehydrogenase
  • QsuB an endogenous, native or homologous 3-dehydroshikimate dehydrogenase
  • the coryneform bacterial cell modified according to the invention has an overexpression of the gene coding for a DAHP synthase (aroF), preferably a feedback-deregulated DAHP synthase (aroF*) from Escherichia coli, which very particularly preferably codon- is optimized, and an overexpression of the gene coding for a 3-dehydroshikimate dehydrogenase (qsuB), particularly preferably a gene coding for an endogenous, native, homologous 3-dehydroshikimate dehydrogenase (QsuB) from coryneforms Bacteria, preferably Corynebacterium glutamicum.
  • aroF DAHP synthase
  • aroF* feedback-deregulated DAHP synthase
  • qsuB 3-dehydroshikimate dehydrogenase
  • QsuB 3-dehydroshikimate dehydrogenase
  • the invention also includes a modified coryneform bacterial cell which, in addition to the properties explained above, has a phosphotransferase (PTS)-independent carbon transporter system, preferably a myo-inositol/proton symporter iolT1, particularly preferably an lolR-derepressed myo-inositol/proton Symporter P 6 -iolT1 .
  • PTS phosphotransferase
  • the present invention also relates to a modified coryneform bacterial cell which exhibits increased expression of xylose isomerase (xylA) and xylulose kinase (xylB) based on changes in non-coding regulatory sequences upstream or downstream of the coding region of xyl A and /or xylB including the promoter region.
  • Variants included according to the invention are also modified coryneform bacterial cells which have increased expression of xylose isomerase (xylA) and xylulose kinase (xylB) based on an increase in the number of copies of a nucleic acid coding for a xylA and/or xylB gene.
  • the subject matter of the present invention is a modified coryneform bacterial cell in which an increased number of copies of a nucleic acid sequence coding for xylose isomerase and xylulose kinase is chromosomally encoded. Also included according to the invention is a modified coryneform bacterial cell in which an increased number of copies of a nucleic acid sequence coding for xylose isomerase and xylulose kinase is extrachromosomally encoded, preferably plasmid encoded or vector encoded.
  • a particular variant of the invention includes a modified coryneform bacterial cell, a) which contains a xylose isomerase (XylA) with an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 2 or fragments thereof and/or a nucleic acid sequence encoding a xylose isomerase (xylA) as shown in SEQ ID NO. 5 or fragments or alleles thereof, b) in which the activity of a xylulose kinase (XylB) having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 3 or fragments thereof and/or the expression of a nucleic acid sequence encoding a xylulose kinase (xylB) as shown in SEQ ID NO.
  • XylA xylose isomerase
  • xylA xylose isomerase
  • xylB xylulose kinase
  • PK pyruvate kinase
  • the present invention also relates to a modified coryneform bacterial cell selected from the group containing Corynebacterium and Brevibacterium, in particular Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum and Brevibacterium divaricatum.
  • the invention thus also includes coryneform bacterial cells, which in turn are already modified in their properties in such a way that they are defined and established platform strains or defined production strains of coryneform bacterial cells, which are also prepared for the production of intermediates on a large-scale or industrial scale and are therefore suitable.
  • coryneform bacterial cells which in turn are already modified in their properties in such a way that they are defined and established platform strains or defined production strains of coryneform bacterial cells, which are also prepared for the production of intermediates on a large-scale or industrial scale and are therefore suitable.
  • the genus Corynebacterium is known in the art for its ability to produce L-amino acids and organic acids.
  • biotechnological products manufactured with coryneform bacteria enjoy the "Generally Recognized As Safe" status (GRAS), which means that coryneform bacteria enjoy an extremely high acceptance for the microbial production of metabolic intermediates.
  • GRAS Generally Recognized As Safe
  • Coryneform bacteria achieve high growth rates and biomass yields on defined media (Grünberger et al., 2012) and there is extensive experience in the industrial use of coryneform bacteria (Becker et al., 2012). This is general prior art information well known to those skilled in the art.
  • the Corynebacterium glutamicum strain for example, is suitable as a “wild-type host cell” or as a “starting strain” or “precursor strain” or as a “production strain” or as a “wild-type platform strain” for variants of a modified coryneform bacterial cell according to the invention.
  • the strain Corynebacterium glutamicum DelAro 5 -C7 PO6 iolT1 is advantageous as the starting strain for the variants of the present invention.
  • the present invention thus includes a modified coryneform bacterial cell, which is a further development according to the invention of the platform strain Corynebacterium glutamicum DelAro 5 -C7 P O6 iolT1, the aforementioned platform strain also being a type of "wild-type platform strain" to be regarded as opposed to the aforementioned Properties of the enzyme activities or gene expressions of the modified coryneform bacterial cells according to the invention are changed.
  • This inventively modified coryneform bacterial cell is particularly advantageous in that it contains an unexpectedly high level of PCA (3,4-dihydroxybenzoic acid; protocatechuate) starting from D-xylose, oligosaccharides or polysaccharides D-xylose units, D-xylose, lignocellulose -, cellulose, or hemicellulose-containing biomass whose hydrolyzate or extract obtained therefrom containing D-xylose units or produced from spent sulfite liquor, corn straw, rice straw or bagasse or their hydrolyzates or extracts obtained therefrom containing D-xylose units or combinations thereof.
  • PCA 3,4-dihydroxybenzoic acid; protocatechuate
  • the subject of the present invention is also a modified coryneform bacterial cell of the type described above for the production of 3,4-dihydroxybenzoic acid from a C5 carbon source.
  • a C5 carbon source starting from oligosaccharides or polysaccharides containing D-xylose units, D-xylose, lignocellulose, cellulose or hemicellulose-containing biomass, whose hydrolyzate or extract obtained therefrom containing D-xylose Units or starting from spent sulfite liquor, corn stalks, rice stalks or bagasse, or theirs Hydrolyzates or extracts obtained therefrom containing D-xylose units or combinations thereof.
  • the invention also includes a method of the type described above, in which a modified coryneform bacterial cell of the type described above is used.
  • the present invention also includes a use of a modified corynform bacterial cell of the type described above for the microbial production of 3,4-dihydroxybenzoic acid from D-xylose or D-xylose-containing hydrolyzates or extracts of sustainable raw materials.
  • the present invention also relates to a composition containing 3,4-dihydroxybenzoic acid produced with a modified coryneform bacterial cell of the type described above or by a method of the type described above.
  • the invention also includes the use of 3,4-dihydroxybenzoic acid, produced with a modified coryneform bacterial cell of the present invention or by a method of the type described above, and the use of a composition of the type described above for the production of plastic, plastic fibers, pharmaceuticals, cosmetics , food and/or feed.
  • Table 1 shows an overview of bacterial strains and plasmids of the present invention.
  • the starting or platform strain Corynebacterium glutamicum DelAro 5 -C7 PO6 iolT1 is to be regarded as an advantageous “wild-type starting strain” compared to which the variants of the bacterial cells or bacterial strains according to the invention are modified.
  • Table 2 shows an overview of the SEQ ID NOs of the present invention
  • Figure 1a)-e) shows the plasmids pK19mobsacB_cg0344-7 (Fig. 1a), pK19mobsacB_cg2625-40 (Fig. 1b), pK19mobsacB_0502 (Fig. 1c), pK19mobsacB_cg1226 (Fig. 1d) and pK19mobsacB_cg1226 (Fig. 1d) and pK19mobsacB_cg3349-54 (Fig.1e) with those.1e) the five gene clusters coding for enzymes involved in the degradation of aromatic compounds were deleted.
  • Figure 2 shows the plasmids pK19mobsacB-540-del ( Figure 2a) and pK19mobsacB-PgltA :: PdapA-C7 ( Figure 2b) with which the regulatory binding site in the promoter region of citrate synthase CS by nucleotide substitutions and integration into the genome coryneformer Bacterial cells have been altered.
  • the promoter region PgltA::PdapA-C7 according to the invention also has nucleotide substitutions at position 70 (a->t) and 71 (g->a) before the start codon ATG.
  • FIG. 3 shows the plasmid pK19mobsacB_P O6 iolT1 for changing the regulatory binding site in the promoter region of the /Wyo-inositol transporter lolT1 by nucleotide substitutions in C. glutamicum.
  • FIG. 4 shows plasmid pMKEX2_aroF*_qsuB for the expression of the genes aroF* from Escherichia coli and qsuB from C. glutamicum.
  • FIG. 6 shows plasmid pK19mobsacB _pyk with which the nucleic acid sequence coding for the pyruvate kinase was deleted according to the invention in the genome of Corynebacterium glutamicum.
  • FIG. 7 shows plasmid pEKEx3_xylA-xylB for the expression of the genes xylA from Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913 and xylB from C. glutamicum.
  • FIG. 8 shows the growth, substrate uptake and protocatechuate formation of different variants of coryneform bacterial cells.
  • the cultivations were carried out in shake flasks in defined CGXII medium with the addition of either 222 mM D-glucose (strains: DelAro 5 -C7 P O6 -iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt and DelAro 5 -C7 P O6 -iolT1 ⁇ pyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt) or 266 mM D-xylose (strains: DelAro 5 -C7 P O6 - iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB and DelAro 5 -C7 P O6 -i
  • Figure 9 shows PCA titers of the C. glutamicum strains DelAro 5 -C7 Po&-iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PC A GLC ), DelAro 5 -C7 P O6 -iolT1 ⁇ pyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PCA GLC ⁇ pyk), DelAro 5 -C7 P O6 -iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB (PCAXYL) and DelAro 5 -C7 P O6 -iolT1 ⁇ pyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB (PCAXYL) and DelA
  • FIG. 10 shows the growth, substrate uptake and protocatechuate formation of different variants of coryneform bacterial cells.
  • the cultivations were carried out in shake flasks in defined CGXII medium with the addition of 266 mM D-xylose as the only one Carbon and energy source performed. Mean values and standard deviations were determined from at least three independent cultures.
  • the strain C. glutamicum MB001 (DE3) is chosen as the starting strain for the construction of C. glutamicum 13032 DelAro 5 .
  • This is a prophage-free C. glutamicum ATCC13032 wild-type strain (C. glutamicum MB001 strain; Baumgart et al, 2013b), https://doi.org/10.1128/AEM.01634-13), which is described below has a chromosomally integrated T7 polymerase, which allows the use of the strong and inducible T7 promoter (strain C.
  • glutamicum MB001 (DE3); (Kortmann et al., 2015 https://doi.Org/10.1111/1751-7915.12236 This promoter is also found on the pMKEx2 plasmids used for the expression of genes of plant origin involved in the synthesis of the product concerned.
  • strain C. glutamicum DelAro 3 is constructed by deleting the gene (cluster) cg0344-47, cg2625-40 and cg1226 (Kalischeuer et al., 2016a, https://d0i.0rg /l 0.1016/j.ymben.2016.06.003).
  • cg0344-47 is the phdBCDE operon, which encodes genes involved in the catabolism of phenylpropanoids such as e.g. B. p-coumaric acid is involved.
  • the 3-dehydroshikimate dehydratase QsuB catalyzes the thermodynamically irreversible conversion of the shikimate pathway intermediate 3-dehydroshikimate to protocatechuate, leading to an unwanted loss of intermediates in the aromatic amino acid pathway.
  • the deletion of qsuB reduced the accumulation of protocatechuate.
  • the gene cg0502 (qsuB) is additionally deleted, resulting in the strain C. glutamicum DelAro 4 .
  • genes for the gentisate degradation pathway were deleted.
  • the enzymes of this catabolic pathway are encoded by genes of the gene cluster naglKL-nagR-nagT-genH (cg3349-54). To prevent any product degradation, the entire gene cluster was deleted, ultimately resulting in the C. glutamicum DelAro 5 strain.
  • the primer pair cgXXXX-XX-up-s / cgXXXX-XX-up-as was used, the downstream flank was primed with the primer pair cgXXXX-XX-down-s / cgXXXX-XX-down-as amplified.
  • the coding XXXX-XX stands for the cg numbers of the genes to be deleted.
  • the primer pair cg0344-47-up-s/ cg0344-47-up-as is used for the deletion of the gene cluster cg0344-47 and the primer pair cg2625-40-up-s/ cg2625- analogously for the deletion of the gene cluster cg2625-40. 40-up-ace.
  • the DNA fragments generated were checked for the expected base pair size by means of gel electrophoretic analysis on a 1% agarose gel.
  • nucleotide sequences of the inner primers (facing the gene to be deleted) (cgXXXX-XX-up-as / cgXXXX-XX-down-s) were chosen in such a way that the two amplified fragments up and down contain overhangs that are complementary to one another.
  • this is the primer pair cg0344-47-up-as/ cg0344-47-down-s
  • primer pair Primer pair cg2625-40-up-as/ cg2625-40-down-s is the primer pair Primer pair cg2625-40-up-as/ cg2625-40-down-s.
  • the purified fragments In a second PCR (without the addition of DNA primers), the purified fragments accumulate via the complementary sequences and serve as both primers and templates (overlap-extension PCR).
  • the deletion fragment generated in this way was amplified in a final PCR with the two outer primers (facing away from the gene) from the first PCR (cgXXXX-XX-up-s / cgXXXX-XX-down-as).
  • the gene cluster cg0344-47 this is the primer pair cg0344-47-up-s/cg0344-47-down-as and similarly for the gene cluster cg2625-40 the primer pair cg2625-40-up-s/cg2625-40-down-as .
  • the final deletion fragment was isolated from the gel using the NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) according to the attached protocol.
  • NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) according to the attached protocol.
  • both the deletion fragments and the pK19-mobsacB empty vector were linearized with the FastDigest variants (Thermo Fisher Scientific) of the restriction enzymes Xba ⁇ and EcoRI.
  • the restriction mixtures of the fragments mentioned were cleaned with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren).
  • the primer pair univ / rsp was used as DNA primer for the colony PCR, which binds specifically to the pK19mobsacB vector backbone and, if the fragments used are correctly ligated, forms a PCR product of a specific size, which was checked by gel electrophoresis.
  • Clones whose PCR product indicates correct assembly of the respective deletion plasmid pK19mobsacB-cg0344-47-del or pK19mobsacB-cg2625-40-del were cultured overnight in LB medium with kanamycin (50 pgZmL) for the isolation of the plasmids. The plasmids were then cloned using the NucleoSpin plasmid (NoLid) kit. (Macherey-Nagel, Düren) and sequenced with the stated amplification and colony PCR primers.
  • levan sucrase encoded by sacB is formed in addition to kanamycin resistance.
  • This enzyme catalyzes the polymerization of sucrose to the toxic levan, resulting in induced lethality when growing on sucrose (Bramucci & Nagarajan, 1996). Accordingly, colonies that have integrated the deletion plasmid into their genome via homologous recombination are resistant to kanamycin and sensitive to sucrose.
  • the primers used del-cgXXXX-XX-s Z del-cgXXXX-as were chosen in such a way that they bind in the chromosome outside of the deleted DNA region and also outside of the amplified flanking gene regions.
  • this is the primer pair del-cg0344-47-s/ del-cg0344-47-as and similarly for the gene cluster cg2625-40 the primer pair del-cg2625-40-s / del-cg2625-40-as.
  • C g0344-47-up-s CTCTCTAGAGCGGTGGCGATGATGATCTTCGAG cg0344-47-up-as: AAGCATATGAGCCAAGTACTATCAACCGTCAGGGCGACT
  • TTTCCATTGAGAGACATTTC cg0344-47-down-s CTGACGCGTTGATAGTACTTGGCTCATATGCTTTTCCTCAC
  • CCGCTTCTACGCTTAAAAG cg0344-47-down-as GACGAATTCGTGTGGCCACCACCTCAATCTGTG del-cg0344-47-s: AGAGATTCACCCTCGGCGATGAG del-cg0344-47-as: GACCCGCAATGGTGTCGCCAG pK19mobsacB-cg2625-40-del cg2625-40-up-s: ACATCTAGAGGTCGGCGAATCAAGCTCCATG cg2625-40-up- as: CGTCTCGAGTTCACATATGCAACGCGTGCTCAAGATGA
  • flanking fragments required for the homologous recombination event were amplified by PCR starting from isolated genomic C. glutamicum DNA.
  • the primer pair cg0502-up-s / cg0502-up-as was used, the downstream flank was amplified with the primer pair cg0502-down-s / cg0502-down-as.
  • the DNA fragments generated were checked for the expected base pair size by means of gel electrophoretic analysis on a 1% agarose gel.
  • the nucleotide sequences of the inner (facing the gene to be deleted) primers (cg0502-up-as / cg0502-down-s) were chosen so that the two amplified fragments up and down to each other contain complementary overhangs.
  • the purified fragments In a second PCR (without the addition of DNA primers), the purified fragments accumulate via the complementary sequences and serve as both primers and templates (overlap-extension PCR).
  • the deletion fragment generated in this way was amplified in a final PCR with the two outer primers (facing away from the gene) from the first PCR (cg0502-up-s / cg0502-down-as). After electrophoretic separation on a 1% TAE agarose gel, the final deletion fragment was isolated from the gel using the NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) according to the attached protocol.
  • both the deletion fragment and the pK19-mobsacB empty vector were linearized with the FastDigest variants (Thermo Fisher Scientific) of the restriction enzymes HindIII and BamHI.
  • the restriction mixtures of the fragments mentioned were cleaned with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren).
  • the deletion fragment was used in a three-fold molar excess compared to the linearized vector backbone pK19mobsacB. After the fragments had been ligated, the entire batch volume was used to transform chemically competent E.
  • coli DH5a cells by means of a heat shock at 42° C. for 90 seconds. Following the heat shock, the cells were regenerated on ice for 90 seconds before being provided with 800 pL of LB medium and regenerated at 37° C. in a thermomixer (Eppendorf, Hamburg) at 900 rpm for 60 minutes. Subsequently, 100 ⁇ l of the cell suspension were smeared onto LB agar plates with kanamycin (50 ⁇ g/ml) and incubated at 37° C. overnight. The correct assembly of the deletion plasmids in the grown transformants was checked by means of colony PCR.
  • the 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) was used for this.
  • the DNA template was added to the PCR mixture by adding cells from the grown colonies.
  • the initial denaturation step of the PCR protocol at 95°C for 3 minutes lyses the cells, releasing the DNA template and making it accessible to DNA polymerase.
  • the primer pair univ / rsp was used as the DNA primer for the colony PCR. It binds specifically to the pK19mobsacB vector backbone and, if the fragments used are correctly ligated, forms a PCR product of a specific size, which was checked by gel electrophoresis.
  • Clones whose PCR product indicates correct assembly of the deletion plasmid pK19mobsacB-cg0502-del were grown overnight in LB medium containing kanamycin (50 pg/mL) to isolate the plasmids.
  • the plasmids were then isolated using the NucleoSpin plasmid (NoLid) kit (Macherey-Nagel, Düren) and sequenced using the amplification and colony PCR primers mentioned.
  • An aliquot of electrocompetent C. glutamicum cells was transformed with the respective deletion plasmid using the protocol described and streaked onto BHIS-Kan 15 plates. Since the pK19mobsacB plasmid cannot replicate in C.
  • a total of 50 clones growing on the BHI 10% sucrose (TMV) plate were selected and streaked on BHI-Kan 25 and BHI 10% sucrose (TMV) to verify successful excision of pK19mobsacB and incubated overnight at 30°C. Should the plasmid have been completely removed, this is reflected in a sensitivity to kanamycin and a resistance to sucrose of the respective clone.
  • the second recombination event (excision) can also lead to the restoration of the wild-type situation.
  • the successful deletion in the clones obtained after excision was checked via the expected fragment size in the case of deletion of the gene or gene cluster using colony PCR of the clones obtained.
  • the primers del-cg0502-s / del-cg0502-as used were chosen in such a way that they bind outside the deleted DNA region in the chromosome and also outside the amplified flanking gene regions.
  • flanking fragments required for the homologous recombination event were amplified by PCR starting from isolated genomic C. glutamicum DNA.
  • the primer pair cg1226-up-s / cg1226-up-as was used, the downstream flank was amplified with the primer pair cg1226-down-s / cg1226-down-as.
  • the DNA fragments generated were checked for the expected base pair size by means of gel electrophoretic analysis on a 1% agarose gel.
  • the nucleotide sequences of the inner primers (facing the gene to be deleted) (cg1226-up-as/cg1226-down-s) were chosen in such a way that the two amplified fragments up and down contain mutually complementary overhangs.
  • the purified fragments In a second PCR (without the addition of DNA primers), the purified fragments accumulate via the complementary sequences and serve as both primers and templates (overlap-extension PCR).
  • the deletion fragment generated in this way was amplified in a final PCR with the two outer primers (facing away from the gene) from the first PCR (cg1226-up-s / cg1226-down-as). After electrophoretic separation on a 1% TAE agarose gel, the final deletion fragment was isolated from the gel using the NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) according to the attached protocol.
  • both the deletion fragment and the pK19mobsacB empty vector were linearized with the FastDigest variants (Thermo Fisher Scientific) of the restriction enzymes HindIII and BamHI.
  • the restriction approaches of the mentioned Fragments were cleaned with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren).
  • the deletion fragment was used in a three-fold molar excess compared to the linearized vector backbone pK19mobsacB. After the fragments had been ligated, the entire batch volume was used to transform chemically competent E.
  • coli DH5a cells by means of a heat shock at 42° C. for 90 seconds. Following the heat shock, the cells were regenerated on ice for 90 seconds before being provided with 800 pL of LB medium and regenerated at 37° C. in a thermomixer (Eppendorf, Hamburg) at 900 rpm for 60 minutes. Subsequently, 100 ⁇ l of the cell suspension were smeared onto LB agar plates with kanamycin (50 ⁇ g/ml) and incubated at 37° C. overnight. The correct assembly of the deletion plasmids in the grown transformants was checked by means of colony PCR.
  • the 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) was used for this.
  • the DNA template was added to the PCR mixture by adding cells from the grown colonies.
  • the initial denaturation step of the PCR protocol at 95°C for 3 minutes lyses the cells, releasing the DNA template and making it accessible to DNA polymerase.
  • the primer pair univ / rsp was used as the DNA primer for the colony PCR. It binds specifically to the pK19mobsacB vector backbone and, if the fragments used are correctly ligated, forms a PCR product of a specific size, which was checked by gel electrophoresis.
  • Clones whose PCR product indicates correct assembly of the deletion plasmid pK19mobsacB-cg1226-del were grown overnight in LB medium containing kanamycin (50 pg/mL) to isolate the plasmids.
  • the plasmids were then isolated using the NucleoSpin plasmid (NoLid) kit (Macherey-Nagel, Düren) and sequenced using the amplification and colony PCR primers mentioned.
  • deletion plasmid If the deletion plasmid is successfully integrated into the genome, levan sucrase encoded by sacB is formed in addition to kanamycin resistance. This enzyme catalyzes the polymerization of sucrose to the toxic levan, leading to induced lethality on growth on sucrose (Bramucci & Nagarajan, 1996). Accordingly, colonies that have integrated the deletion plasmid into their genome via homologous recombination are resistant to kanamycin and sensitive to sucrose.
  • a total of 50 of the clones grown on the BHI 10% sucrose (w/v) plate were selected and streaked on BHI-Kan 25 and BHI 10% sucrose (wZv) to check the successful excision of pK19mobsacB and incubated overnight at 30 °C . Should the plasmid have been completely removed, this is reflected in a sensitivity to kanamycin and a resistance to sucrose of the respective clone.
  • the second recombination event (excision) can also lead to the restoration of the wild-type situation.
  • the successful deletion in the clones obtained after excision was checked via the expected fragment size in the case of deletion of the gene or gene cluster using colony PCR of the clones obtained.
  • the primers del-cg1226-s / del-cg1226-as used were chosen in such a way that they bind in the chromosome outside of the deleted DNA region and also outside of the amplified flanking gene regions.
  • GCCACTGGTACGTGGTTCATG down-cg1226-s AGCTCTCGAGATATCATATGCGAGGGTACCGCAGAC
  • CTACCACGCTTCGAGGTATAAACGCTC down-cg1226-as: AGTGAATTCCAAGGAAGGCGGTTGCTACTGC del-cg01226-s: TAAATGGTGGAGATACCAAACTGTGAAGC del-cg 1226-as: CGAGTTCTTCTTCGTGTTCGCGATC univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG
  • flanking fragments required for the homologous recombination event were amplified by PCR starting from isolated genomic C. glutamicum DNA.
  • the primer pair del_cg3349-54-up-s / del_cg3349-54-up-as was used to generate the upstream fragment, the downstream flank was primed with the primer pair del_cg3349-54-down-s / del_cg3349-54-down-as amplified.
  • the DNA fragments generated were checked for the expected base pair size by means of gel electrophoretic analysis on a 1% agarose gel.
  • the nucleotide sequences of the inner primers (facing the gene to be deleted) (del_cg3349-54-up-as / del_cg3349-54-down-s) were chosen in such a way that the two amplified fragments up and down contain mutually complementary overhangs.
  • the purified fragments accumulate via the complementary sequences and serve as both primers and templates (overlap-extension PCR).
  • the deletion fragment generated in this way was amplified in a final PCR with the two outer primers (facing away from the gene) from the first PCR (del_cg3349-54-up-s / del_cg3349-54-down-as).
  • the final deletion fragment was isolated from the gel using the NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) according to the attached protocol.
  • NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) according to the attached protocol.
  • both the deletion fragment and the pK19-mosacß empty vector were linearized with the FastDigest variants (Thermo Fisher Scientific) of the restriction enzymes HindIII and BamHI.
  • the restriction mixtures of the fragments mentioned were cleaned with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren).
  • the deletion fragment was used in a three-fold molar excess compared to the linearized vector backbone pK1 SmobsacB. After the fragments had been ligated, the entire batch volume was used to transform chemically competent E. coli DH5a cells by means of a heat shock at 42° C. for 90 seconds. Following the heat shock the cells were regenerated on ice for 90 seconds before they were provided with 800 pL LB medium and regenerated at 37° C. in a thermomixer (Eppendorf, Hamburg) at 900 rpm for 60 minutes.
  • a thermomixer Eppendorf, Hamburg
  • the primer pair univ / rsp was used as the DNA primer for the colony PCR. It binds specifically to the pK19mobsacB vector backbone and, if the fragments used are correctly ligated, forms a PCR product of a specific size, which was checked by gel electrophoresis. Clones whose PCR product indicates correct assembly of the deletion plasmid pK19mobsacB-cg3349-54-del were grown overnight in LB medium containing kanamycin (50 pg/mL) to isolate the plasmids. The plasmids were then isolated using the NucleoSpin plasmid (NoLid) kit (Macherey-Nagel, Düren) and sequenced using the amplification and colony PCR primers mentioned.
  • NoLid NucleoSpin plasmid
  • levan sucrase encoded by sacB is formed in addition to kanamycin resistance.
  • This enzyme catalyzes the polymerization of sucrose to the toxic levan, resulting in induced lethality when growing on sucrose (Bramucci & Nagarajan, 1996). Accordingly, colonies that have integrated the deletion plasmid into their genome via homologous recombination are resistant to kanamycin and sensitive to sucrose.
  • check-cg3349-54-s / check-cg3349-54-as were chosen in such a way that they bind in the chromosome outside of the deleted DNA region and also outside of the amplified flanking gene regions.
  • GAGCCACCGCGCTG del_cg3349-54-down-s CGCAGCGGCTCCGTCATTCACCCCGGAAGCTGGCGCTAC
  • GCCCTCCTCGAAC del_cg3349-54-down-as ACCTCTAGATTTCTGTCTTGAGGGTTCGTGGGGGCTG check-cg3349-54-s: AAAGGCTCCATGAATTCCTCACGGAGGATCTC check-cg3349-54-as: ACATCACAAGTAGAAACCCGCATTTTCTGTAGTTTTTAC univ: CGCCAGGGGTTTTCCCAGTCACGACACATGACAG: CACAGGCAAArsp Modification of the regulatory binding site in the promoter region of citrate synthase CS by nucleotide substitutions for integration into the genome of coryneform bacterial cells
  • the plasmid pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 (FIG. 2b) was first constructed.
  • the flanking regions were chosen in such a way that a 540 base pair chromosomal fragment carrying the native g/tA promoter region with the two transcription start and operator sequences can be deleted.
  • a 20 base pair linker was inserted between the two flanks up and down, which has the interfaces Nsil and Xhol.
  • the C7 variant of the dapA promoter was then subcloned via these interfaces.
  • the upstream fragment was amplified up with the primer pair PgltA-up-s / PgltA-up-as
  • the downstream flank was amplified with the primer pair PgltA-down-s / PgltA-down-as amplified.
  • the DNA fragments generated were checked for the expected base pair size by means of gel electrophoretic analysis on a 1% agarose gel.
  • nucleotide sequences of the inner primers (PgltA-up-as / PgltA-down-s) were chosen in such a way that the two amplified fragments up and down contain complementary overhangs (including the described NsiI/XhoI linker.
  • the purified fragments accumulate via the complementary sequences and serve as both primers and templates for each other (overlap-extension PCR).
  • the A540 fragment generated in this way was used in a final PCR with the two outer ( against the gene) primers from the first PCR amplified (PgltA-up-s / PgltA-down-as) After electrophoretic separation on a 1% TAE agarose gel, the final mutation fragment was cleaned using the NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) isolated from the gel according to the attached protocol For the construction of pK19mobsacB-540-del, both the generated A540 fragment and the pK19mobsacB empty vector were isolated with the FastDigest-Va riant (Thermo Fisher Scientific) of the restriction enzymes Xba ⁇ and SmaI.
  • the restriction mixtures of the fragments mentioned were cleaned with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren).
  • the deletion fragment was used in a 3-fold molar excess over the linearized vector backbone pK19mobsacB.
  • the entire batch volume for the transformation of chemically competent E. coli DH5a cells was used used by heat shock at 42 °C for 90 seconds. Following the heat shock, the cells were regenerated on ice for 90 seconds before being provided with 800 pL of LB medium and regenerated at 37° C.
  • the initial denaturation step of the PCR protocol at 95°C for 3 minutes lyses the cells, releasing the DNA template and making it accessible to DNA polymerase.
  • the primer pair univ / rsp was used as DNA primer for the colony PCR, which binds specifically to the pK19mobsacB vector backbone and, if the fragments used are correctly ligated, forms a PCR product of a specific size, which was checked by gel electrophoresis.
  • Clones whose PCR product indicates correct assembly of pK19mobsacB-540-del were overnight. grown in LB medium with kanamycin (50 pg/mL) for isolation of the plasmids. The plasmids were then isolated using the NucleoSpin plasmid (NoLid) kit (Macherey-Nagel, Düren) and sequenced using the amplification and colony PCR primers mentioned.
  • the C7 variant of the dapA promoter was amplified with the primer pair PdapA-s / PdapA-as and the expected base pair size was checked by means of gel electrophoretic analysis on a 1% agarose gel.
  • the generated fragment was cleaned with the NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) according to the attached protocol.
  • both the generated PdapA fragment and the target vector pK19mobsacB-540-del were digested with the FastDigest variants (Thermo Fisher Scientific) of the restriction enzymes Xhol and Nsi ⁇ .
  • the restriction mixtures of the fragments mentioned were cleaned with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren).
  • the PdapA fragment was used in a three-fold molar excess over the linearized vector backbone pK19mobsacB-540-del for the ligation of the hydrolyzed DNA fragments using the Rapid DNA Ligation Kit (Thermo Fisher Scientific). After the fragments had been ligated, the entire batch volume was used to transform chemically competent E. coli DH5a cells by means of a heat shock at 42° C. for 90 seconds. Following the heat shock, the cells were regenerated on ice for 90 seconds before being provided with 800 pL of LB medium and regenerated at 37° C. in a thermomixer (Eppendorf, Hamburg) at 900 rpm for 60 minutes.
  • a thermomixer Eppendorf, Hamburg
  • the primer pair univ / rsp was used as the DNA primer for the colony PCR. It binds specifically to the pK19mobsacB vector backbone and, if the fragments used are correctly ligated, forms a PCR product of a specific size, which was checked by gel electrophoresis. Clones whose PCR product indicates correct assembly of pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 were grown overnight in LB medium containing kanamycin (50 pg/mL) to isolate the plasmids. The plasmids were then expanded with the NucleoSpin plasmid (NoLid)-Kft. (Macherey-Nagel, Düren) and sequenced with the stated amplification and colony PCR primers.
  • levan sucrase encoded by sacB is formed in addition to kanamycin resistance.
  • This enzyme catalyzes the polymerization of sucrose to the toxic levan, resulting in induced lethality when growing on sucrose (Bramucci & Nagarajan, 1996). Accordingly, colonies that have integrated the mutation plasmid into their genome via homologous recombination are resistant to kanamycin and sensitive to sucrose.
  • the corresponding genomic region was amplified by colony PCR (primer pair chk-PgltA-s / chk-PgltA-as) and checked for the expected fragment size by gel electrophoresis.
  • PCR products that indicate a promoter exchange were cleaned with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) and used the primers chk-PgltA-s and chk-PgltA-as to verify the exchange sequenced.
  • the promoter region PgltA::PdapA-C7 in addition to replacing the promoter region of gtlA with dapA, also has nucleotide substitutions at position 70 (a->t) and 71 (g->a) before the start codon ATG (FIG. 2c sequence comparison of promoter region).
  • PgltA-up-as TATGCATGTTTCTCGAGTGGGCCGAACAAATATGTTTGAAAGG
  • PgltA-down-s CCCACTCGAGAAACATGCATAGCGTTTTCAATAGTTCGGTGTC
  • PgltA-down-as CCCCCCGGGGGGCCTAGGGAAAGGATGATCTCGTAGCC
  • PdapA-s CCAATGCATTGGTTCTGCAGTTATCACACCCAAGAGCTAAAAAT
  • PdapA-as CCGCTCGAGCGGCTCCGGTCTTAGCTGTTAAACCT chk-PgltA-s: ATGAGTCCGAAGGTTGCTGCAT chk-PgltA-as: TCGAGTGGGTTCAGCTGGTCC univ: CGCCAGGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG
  • a first step two PCR products were generated that enclose the 5' region in front of the iolT1 gene (primer: PromiolT1_fw_fw / PromiolT1fw_rev) with the two nucleotides to be exchanged or the 3' region of the gene (primer: Piolt1_rev_fw / Piolt1_rev_rev ) contained.
  • Polt1_rev_fw / Piolt1_rev_rev the 3' region of the gene
  • the DNA fragments were fused together with the p19mobsacB vector, which had already been cut using the restriction endonucleases XbaI and EcoRI, using Gibson assembly (Gibson et al., 2009) (https://doi.org/10.1038/NMETH.1318).
  • This plasmid pK19mobsacB_PoeiolT1 (FIG. 3) obtained in this way was transformed into E. coli DH5a by means of heat shock. Due to the kanamycin resistance gene present on the plasmid, only those clones that had absorbed the plasmid could grow.
  • the mixture was divided into 4 mL 46 °C prewarmed BHIS medium and incubated for 6 min at 46 °C. The cells were then incubated for two hours at 30 °C with 170 rpm and the suspension was plated on BHIS-Kan15 agar. Then the function of the sacB gene was tested by transferring the clones to BHI-Kan25 agar and to BHI-Kan25 agar with 10% sucrose To select for successful excision in a second recombination event, the cells cultured on BHI-Kan25 were cultured for about 5 h were cultured in 5 ml of BHI medium and 100 ⁇ l of the culture and a 1:10 dilution were plated onto BHI agar containing 10% sucrose The clones were transferred to BHI Kan25 agar and BHI agar containing 10% sucrose A colony PCR (Prim er: checkPromiolTlfw/ checkPromiolTl
  • PromiolT1_fw_fw TGCATGCCTGCAGGTCGACTGAAAAATTGATCAGCAAACACC
  • PromiolTI fw_rev GGCAGACACGATATCCCCCGTCAATCGTACATAGGGAA
  • Piolt1_rev_fw CGGGGGATATCGTGTCTGCCACGATTAAAG
  • piolt1_rev_rev TTGTAAAACGACGGCCAGTGGAGTCCAAGAAGCACACG checkPromiolTlfw: TACGAATGCCCACTTCGCACCCTT checkPromiolTI rev: CAACTCATTACGGCCAGCCAGTGAGC
  • pMKEX2_aroF*_qsuB (FIG. 4) for the expression of the genes aroF* from Escherichia coli and qsuB from C. glutamicum, the two genes were chemically modified as gene variants codon-optimized for C. glutamicum by GeneArt Gene Synthesis (Thermo Fisher Scientific). synthesized as a string DNA fragment and used as a DNA template for amplification by PCR.
  • the genes aroF* and qsuB were amplified by PCR with the primer pair aroF*-s / aroF*-as or qsuB-s / qsuB-as, which is specific for the respective gene.
  • the DNA fragments generated were checked for the expected base pair size by means of gel electrophoretic analysis on a 1% agarose gel.
  • the plasmid pMKEX2_aroF_qsuB was linearized with the FastDigest variants (Thermo Fisher Scientific) of the restriction enzymes Nco ⁇ and BamHI.
  • the genes aroF* and qsuB amplified with the given primer pairs were hydrolyzed with the restriction enzymes Nco ⁇ and Kpn ⁇ or Kpn ⁇ and BamHI.
  • the restriction mixtures of the fragments mentioned were cleaned with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren).
  • the two inserts aroF* and qsuB were used in a three-fold molar excess compared to the linearized vector backbone pMKEx2.
  • the entire batch volume was used to transform chemically competent E. coli DH5a cells by means of a heat shock at 42° C. for 90 seconds.
  • the cells were regenerated on ice for 90 seconds before being provided with 800 pL of LB medium and regenerated at 37° C. in a thermomixer (Eppendorf, Hamburg) at 900 rpm for 60 minutes.
  • the primer pair chk_pMKEx2_s / chk_pMKEx2_as was used as the DNA primer for the colony PCR, which specifically binds to the pMKEx2 vector backbone binds and, if the inserted fragments are correctly ligated, forms a PCR product of a specific size, which was checked by gel electrophoresis.
  • Clones whose PCR product indicates correct assembly of the plasmid pMKEX2_aroF*_qsuB were grown overnight in LB medium containing kanamycin (50 pg/mL) to isolate the plasmids. The plasmids were then isolated using the NucleoSpin plasmid (NoLid) kit (Macherey-Nagel, Düren) and sequenced using the amplification and colony PCR primers mentioned.
  • the gene was amplified by PCR.
  • genomic DNA from C. glutamicum is isolated and specifically amplified with the primer pair tkt'-s / 'tkt-as.
  • the generated DNA fragment is checked for the expected base pair size by means of gel electrophoretic analysis on a 1% agarose gel.
  • the plasmid pEKEx3-tkt is linearized with the FastDigest variants (Thermo Fisher Scientific) of the restriction enzymes BamHI and EcoRI.
  • the amplified tkt gene is hydrolyzed with the restriction enzymes BamHI and EcoRI.
  • the restriction mixtures of the fragments mentioned are cleaned with the NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren).
  • the tkt insert is in a three-fold molar excess over the linearized one Vector backbone pEKEx3 used.
  • the entire batch volume is used to transform chemically competent E. coli DH5a cells by means of a heat shock at 42° C. for 90 seconds.
  • the cells are regenerated on ice for 90 seconds before they are provided with 800 pL LB medium and regenerated at 37° C. in a thermomixer (Eppendorf, Hamburg) at 900 rpm for 60 minutes. Subsequently, 100 ⁇ L of the cell suspension were smeared onto LB agar plates with spectinomycin (100 pg/ml) and incubated at 37 °C overnight. The correct assembly of the fragments used in the grown transformants is checked by means of colony PCR. The 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) is used for this. The DNA template was added to the PCR mixture by adding cells from the grown colonies.
  • the initial denaturation step of the PCR protocol at 95°C for 3 minutes lyses the cells, releasing the DNA template and making it accessible to DNA polymerase.
  • the primer pair chk_pEKEx3_s / chk_pEKEx3_as is used as DNA primer for the colony PCR. It binds specifically to the pEKEx3 vector backbone and, if the fragments used are correctly ligated, forms a PCR product of a specific size, which is checked by gel electrophoresis. Clones whose PCR product indicates correct assembly of the plasmid pEKEx3-tkt were grown overnight in LB medium containing spectinomycin (100 pg/mL) to isolate the plasmids.
  • the plasmids are then isolated using the NucleoSpin plasmid (NoLid) kit (Macherey-Nagel, Düren) and sequenced using the amplification and colony PCR primers mentioned.
  • the plasmid is shown in Figure 5.
  • PK Pyruvate kinase
  • C. glutamicum DelAro 5 -C7 P O6 iolT1 ⁇ pyk was constructed according to Niebisch and Bott (2001) with the vector pK19mobsacB (Schäfer et al., 1994).
  • two PCR products were generated containing the 5' region in front of the pyk gene with the two deleted nucleotides (primers K0115_p9 and K0115_p2) and the 3' region of the gene (primers K0115_p3 and K0115_p4). In doing so, homologous for the later Recombination each amplified 500 base pairs of the flanking regions.
  • the respective primers contained homologies to the other PCR products.
  • the DNA fragments were blunt-end cloned together with the previously digested pk19mobsacB vector.
  • the plasmid pK19mobsacB_pyk obtained in this way (FIG. 6) was transformed into E. coli DH5a by means of heat shock. Due to the kanamycin resistance gene present on the plasmid, only those clones that had absorbed the plasmid could grow. These were checked for the presence of the cloned insert by means of colony PCR and subsequent gel electrophoresis, and its sequence was sequenced (primer dpyk_proof_fwd and dpyk_proof_rev).
  • a 150 ⁇ L aliquot of electrocompetent C. glutamicum cells was thawed on ice, mixed with 1-4.5 ⁇ g of the plasmid and transferred to a 0.2 cm electroporation cuvette pre-cooled on ice.
  • the mixture was covered with 800 pL, 4 °C cold, 10% glycerol (v/v) and electroporated in an electroporator (2500 V, 25 pF, 200 ⁇ , 2 mm). After electroporation, the mixture was transferred to 4 mL of BHIS medium prewarmed to 46 °C and incubated for 6 min at 46 °C. The cells were then incubated at 30° C. and 170 rpm for two hours.
  • the suspension was then plated onto BHIS-Kan15 agar.
  • the function of the sacB gene was then tested by transferring the clones to BHI-Kan25 agar and to BHI-Kan25 agar with 10% sucrose.
  • the excision, in which the plasmid was to be removed from the genome the clones that had grown on BHI-Kan25 were cultivated for about 5 h in 5 ml of BHI medium and 100 ⁇ l of the culture and a 1: 10-dilution plated onto BHI agar containing 10% sucrose.
  • the grown clones were transferred to BHI-Kan25 agar and BHI agar with 10% sucrose.
  • a colony PCR with subsequent sequencing was carried out on the sucrose-resistant and kanamycin-sensitive clones in order to check the successful deletion.
  • the genomic DNA of C. glutamicum was obtained as a PCR template for the amplification of xylB by dissolving cells in 50 pL 2% DMSO and then heating at 95° C. for 5 min.
  • the cell suspension was for
  • xylB_fw_Cgl and xylB_rv_Cgl genomic DNA from Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913 was used as template in the PCR reaction and the primers xylA_fw_Xcc xylA_rv_Xcc were used.
  • the amplicons were ligated together with the previously cut pEKEx3 vector by means of restriction cloning (pEKEx3_xylA-xylB; FIG. 7).
  • This plasmid obtained in this way was transformed into E. coli DH5a by means of heat shock. Due to the spectinomycin resistance gene present on the plasmid, only those clones that had absorbed the plasmid could grow. These were checked for the presence of the cloned insert by means of colony PCR and subsequent gel electrophoresis, and its sequence was sequenced (primer: pEKEx-for2 and pEKEx-rv2).
  • C. glutamicum was cultured for 6 - 8 h in 100 mL shake flasks with 15 mL BHI medium on a rotary shaker at 250 rpm (first preculture) and then in 50 mL defined CGXII medium with 4% D-glucose in 500 mL Erlenmeyer flasks inoculated with baffles (second preculture). The cell suspensions were cultured overnight on a rotary shaker at 250 rpm.
  • the microbial growth during the cultivations was monitored by measuring the optical density at 600 nm ( OD 600).
  • the main culture was inoculated with 4% (222 mM) D-glucose or 4% (266 mM) D-xylose in defined CGXII medium to an ODeoo of 5.0.
  • Heterologous gene expression was induced immediately after inoculation with 1mM IPTG.
  • the cell-containing samples taken during the cultivation were then centrifuged (10,000 ⁇ g, 4° C., 10 min) and the resulting supernatants analyzed with regard to the concentrations of D-glucose, D-xylose and PCA.
  • the corresponding HPLC analysis was carried out on an Agilent 1200 system (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) using a CS Organic Acid Resin (CS Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Germany). The separation took place isocratically at 55° C. with 0.1 MH 2 SO 4 as the mobile phase and a flow rate of 0.6 ml min -1 .
  • D-glucose and D-xylose were detected using an RI detector.
  • PCA was detected using a UV detector at an absorbance of 254 nm.
  • the quantifications were carried out using external calibrations in suitable standard solutions.
  • PCA 3,4 Dihydroxybenzoate
  • the two strains PCA GLC and PCA GLC ⁇ pyk show comparable growth at 0.21 h -1 and 0.20 h -1 on D-glucose as the carbon and energy source.
  • the substrate uptake rate is also comparable with 15.6 C-mmolGLc g CDW -1 h -1 and 17.4 C-mmol GLC g CDW -1 h -1 .
  • the strain PCA GLC ⁇ pyk with deletion of the gene for pyruvate kinase with 1.22 C-mmolpcA g CDW -1 h -1 shows a greatly increased PCA formation rate compared to the precursor strain with 0.78 C-mmolpcA g CDW -1 h -1 .
  • the PCAXYL strain has a lower growth rate of 0.11 h -1 than the D-glucose-based strains.
  • the substrate uptake is comparatively high at 13.0 C-mmolxYL g CDW -1 h -1 and the product formation rate at 1.43 C-mmolpcA g CDW -1 h -1 at a significantly higher level than the D-glucose-based strains.
  • the PCAXYL ⁇ pyk strain shows a greatly reduced growth and substrate uptake rate with 0.04 h -1 and 6.5 C-mmolxYL g CDW -1 h -1 .
  • the resulting C-molar yields are 0.02, 0.04, 0.06 and 0.33 C-mol product per C-mol substrate for the strains PCA GLC , PCA GLC ⁇ pyk, PCAXYL and PCAXYL ⁇ pyk.
  • FIG. 9 shows the maximum PCA titers after a cultivation time of 98 hours.
  • the PCA GLC strain has a maximum PCA titer of 3.5 ⁇ 1.2 mM.
  • the strain PCA GLC ⁇ pyk with deletion of the gene for pyruvate kinase shows a significantly increased PCA titer of 7.8 ⁇ 1.6 mM.
  • the PCAXYL strain has an even higher PCA titer of 12.0 ⁇ 1.1 mM.
  • the PCAXYL ⁇ pyk strain with an additional deletion of the gene for pyruvate kinase shows by far the highest PCA titer of 62.1 ⁇ 12.1 mM.
  • the PCA XYL ⁇ pyk strain according to the invention with an additional deletion of the gene for pyruvate kinase according to the invention, an inactive catabolism and an additional increased activity of XylA and XylB according to the invention shows by far the highest PCA titer of 62.1 ⁇ 12.1 mM.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure ausgehend von einer C5-Kohlenstoffquelle in Anwesenheit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle, die eine teilweise oder komplett inaktivierte Pyruvat-Kinase-Aktivität (PK) aufweist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) partiell oder komplett deletiert ist. Ferner umfasst die vorliegende Erfindung eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine partiell oder komplett inaktivierte Pyruvat-Kinase-Aktivität und eine gesteigerte Xylose-Isomerase- und Xylulose-Kinase-Aktivität aufweist sowie deren Verwendung zur Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Zusammensetzung enthaltend 3,4-Dihydroxybenzoesäure sowie die Verwendung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure oder einer Zusammensetzung enthaltend 3,4-Dihydroxybenzoesäure zur Herstellung von Plastik, Plastikfasern, Pharmazeutika, Kosmetika, Lebensmitteln und/oder Futtermitteln.

Description

Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoat aus D-Xylose mit coryneformen Bakterien
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles, fermentatives Verfahren zur Herstellung von
3.4-Dihydroxybenzoat ausgehend von D-Xylose-Einheiten mit coryneformen Bakterien.
3.4-Dihydroxybenzoesäure (3,4-Dihydroxybenzoat, Protocatechuat, PCA) ist eine phenolische Verbindung, die natürlicherweise in Pflanzen vorkommt. In der chemischen Industrie ist Protocatechuat von besonderem Interesse, da es als Copolymer zusammen mit Anilinen ein begehrtes Ausgangsmaterial für eine Vielzahl neuer Polymere und Plastikverbindungen bzw. von neuen Polymer-Fasern darstellt. Auch als Supplement in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie ist PCA begehrt. Darüber hinaus birgt PCA aufgrund seiner entzündungshemmenden, anti-oxidativen, anti-bakteriellen, anti-viralen, anti-aging bzw. anti-fibrotischen Eigenschaften ein großes Potential für kosmetische oder pharmazeutische Anwendungen. Außerdem werden PCA positive Aktivitäten in der Bekämpfung von Krebs zugeschrieben.
Aufgrund der chemischen Synthese aus Erdöl, mit den bekannten Nachteilen einer Zeit-, Material-, Kosten- und Ressourcen-intensiven Herstellung, die zudem besonders umweltbelastend ist, ist die Notwendigkeit der Bereitstellung eines Systems bzw. Verfahrens zur Herstellung von Protocatechuat, das die zuvor genannten Nachteile nicht mehr aufweist, von enormer ökonomischer Relevanz. Gleichzeitig stellt sich die Herausforderung zu gewährleisten, dass mit einem neuen Verfahren Ausbeuten und Produkttitern erreicht werden, die eine Herstellung im industriellen Maßstab attraktiv machen.
Verschiedene Mikroorganismen zeigen ein natives Potenzial zur Biosynthese von PCA. Zum Beispiel exkretiert das Bodenbakterium Bacillus thuringiensis PCA ins Medium unter Eisen- limitierten Bedingungen (Garner, B.L., et al., Curr Microbiol, 2004. 49(2): p. 89-94). Azotobacter paspali akkumuliert PCA bei der Kultivierung in definiertem Medium mit Acetat und D-Glucose oder Saccharose als Kohlenstoff- und Energiequellen (Collinson, S.K., et al., Canadian Journal of Microbiology, 1987. 33(2): p. 169-175). In diesen Fällen sind die resultierenden Titer jedoch sehr gering und beide Organismen haben bisher keine industrielle Bedeutung.
Der industriell bedeutsame Organismus Corynebacterium glutamicum ist sowohl in der Lage PCA nativ zu synthetisieren (Kallscheuer, N. et al., Microb Cell Fact, 2018. 17(1): p. 70) als auch umgekehrt PCA als Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen (Shen, X.H. et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2012. 95(1): p. 77-89). Die
Bestätigungskopie natürliche PCA-Produktionsleistung von C. glutamicum ist allerdings aufgrund dessen auch in diesem Stamm sehr gering.
Aus diesem Grund wurde in verschiedenen Ansätzen versucht, die PCA Produktion mit coryneformen Bakterien zu steigern. Der Phenylalanin-produzierende Stamm C. glutamicum ATCC 21420 wurde modifiziert, um das Gen vanAB zu exprimieren, welches für die Vanillat- O-Demethylase kodiert. Der Stamm C. glutamicum ATCC 21420 pCH_vanAB zeigte die Biokonversion von 16.0 mM Ferulasäure, einer von Lignin abgeleiteten phenolischen Verbindung, in 6.91 mM PCA nach 12 h Fed-Batch-Kultivierung (Okai, N., et al., AMB Express, 2017. 7(1): p. 130). Die Expression des Gens ubiC, welches für die Chorismat-Pyruvat-Lyase kodiert, im Stamm C. glutamicum ATCC 21420, ermöglichte die Bildung von 1 .4 mM PCA aus D-Glucose nach 80 h Kultivierung in einem 3 L Schüttelkolben. Derselbe Stamm (C. glutamicum ATCC 21420 pCH_ubiC) zeigte eine maximale Produktion von 7.4 mM PCA aus D-Glucose nach 96 h Fed-Batch-Fermentation im Bioreaktor-Maßstab (Okai, N., et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2016. 100(1 ): p. 135-45). In beiden Ansätzen wurde der natürliche PCA-Katabolismus in C.glutamicum nicht unterbunden.
Weiterführende Arbeiten zielten daher zunächst auf die gezielte Unterbindung des PCA-Katabolismus und Bereitstellung des neuen Plattformstammes C. glutamicum DelAro5 ab (Kalischeuer, N. et al., Microb Cell Fact, 2018. 17(1): p. 70). Dieser Stamm wurde weiter modifiziert durch Mutagenese der lolR-Operatorsequenz in der iolT1-Promotorregion zur Verbesserung des Zuckerimports sowie durch Überexpression der Gene aroF*, qsub und tkt, welche für die 3-Desoxy-D-arabinoheptulosonate-7-Phosphat-Synthase, die Dehydroshikimat-Dehydratase bzw. die Transketolase kodieren und der Verstärkung der PCA-Biosynthese dienten. Der resultierende Stamm
C. glutamicum DelAro5 C7 P06-iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt zeigte eine Produktion von 13 mM PCA in Schüttelkolben ausgehend von D-Glucose als einziger Kohlenstoff und Energiequelle (Kallscheuer, N. et al., Microb Cell Fact, 2018. 17(1): p. 70). Diese Ausbeute ist für die industrielle Herstellung von PCA zu gering und somit unattraktiv. Auch jüngste Arbeiten von Kogure et al (2020, Metabolie Engineering), die zunächst den Anschein erwecken, dass die Produktion von PCA mit einem Titer von 82,7 g L-1 möglich erscheint, weisen für eine wirtschaftlich relevante Produktion von PCA nach wie vor deutliche Nachteile auf. So ist dort ein zweistufiger Fermentationsansatz erforderlich bei dem die Zellen in einem ersten Schritt auf Komplexmedium zu hohen Zelldichten kultiviert werden müssen. Danach müssen die Zellen in einem manuellen Zentrifugationsschritt aufkonzentriert und geerntet werden. Erst dann kann in einer anschließend durchzuführenden Biotransformation die Herstellung von PCA ausgehend von D-Glukose erfolgen. Nachteilig bleibt neben dem zweistufigen Ansatz außerdem der Einsatz von kostspieligen Komplexmedien bzw. D-Glukose, so dass auch dieser Prozess für eine wirtschaftliche sowie Kosten- und Ressourcen-schonende Produktion nicht besonders geeignet ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der eine PCA-Synthese durch biotechnologische Fermentation im industriellen Maßstab ermöglicht. Aufgrund des gesteigerten Umweltbewusstseins ist es auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Mikroorganismus bereitzustellen, der eine sichere und gleichzeitig umweltverträgliche PCA-Synthese ermöglicht, die Zeit, Material, Kosten und Ressourcen schont. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es überdies einer nachhaltigen Bioökonomie bei der großtechnischen Herstellung von umfangreich einsetzbaren Grundbausteinen wie PCA gerecht zu werden. Eine weitere Aufgabe ist dabei, eine biotechnologische Synthese von PCA ausgehend von nachwachsenden, preiswerten Rohstoffen vornehmen zu können und entsprechend sichere Mikroorganismen mit PCA-Synthesekapazitäten bereitzustellen, die solche Rohstoffe als Ausgangsmaterial nutzen können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure, enthaltend die Schritte a) Bereitstellen einer Lösung enthaltend wenigstens Wasser, Stickstoff, Mineralsalze und eine C5-Kohlenstoff-Quelle, b) mikrobielle Umsetzung der C5-Kohlenstoffquelle in einer Lösung gemäß Schritt a) zu 3,4-Dihydroxybenzoesäure in Anwesenheit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle, deren Pyruvat-Kinase-Aktivität (PK) teilweise oder komplett inaktiviert ist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) partiell oder komplett deletiert ist sowie c) optional die Isolierung und/oder Aufbereitung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus der Lösung.
Ferner wird die hier zugrundeliegende Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine teilweise oder komplett inaktivierte Pyruvat-Kinase-Aktivität und eine gesteigerte Xylose-Isomerase- und Xylulose-Kinase-Aktivität aufweist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett deletiert ist und deren Gene kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) überexprimiert sind.
Die vorliegende Aufgabe wird ferner erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer erfindungsgemäß modifizierten corynformen Bakterienzelle ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium zur mikrobiellen Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus D-Xylose.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den darauf rückbezogenen Unteransprüchen.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sowie der modifizierten coryneformen Bakterienzelle und deren Verwendung ergeben sich ebenfalls aus den jeweils hierauf rückbezogenen Patentansprüchen.
Erfindungsgemäß umfasst ist ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von
3.4-Dihydroxybenzoesäure, enthaltend die Schritte a) Bereitstellen einer Lösung enthaltend wenigstens Wasser, Stickstoff, Mineralsalze und eine C5-Kohlenstoff-Quelle, b) mikrobielle Umsetzung der C5-Kohlenstoffquelle in einer Lösung gemäß Schritt a) zu
3.4-Dihydroxybenzoesäure in Anwesenheit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle, deren Pyruvat-Kinase-Aktivität (PK) teilweise oder komplett inaktiviert ist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett deletiert ist und c) eine optionale Isolierung und/oder Aufbereitung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus der Lösung.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist unter einer „modifizierten" coryneformen Bakterienzelle zu verstehen, dass eine coryneforme Bakterienzelle gegenüber der Wildtyp-Wirtszelle oder einem entsprechenden Ausgangsstamm oder Vorläuferstamm endogene Eigenschaften in verändertem Maße, wie z.B. verstärkt oder reduziert, aufweist oder zusätzliche Eigenschaften durch heterologe Expression erworben hat. Dies kann im Sinne der Erfindung durch gebräuchliche Methoden erfolgen, wie beispielsweise eine verstärkte Expression endogener Gene durch Erhöhung der Kopienzahl dieser Gene z.B. durch Einbau weiterer Kopien in das Genom oder das Einbringen von Plasmiden mit erhöhter Kopienzahl in die coryneforme Bakterienzelle. Diese Methoden kann erfindungsgemäß auch für die verstärkte Expression heterologer Gene angewandt werden. Das gleich gilt analog auch für die Reduktion, Abschwächung oder teilweise bzw. kompletten Inaktivierung von endogenen oder heterolog erworbenen Eigenschaften einer coryneformen Bakterienzelle.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist unter „teilweise oder komplett inaktiviert“ oder „teilweise oder komplett deletiert“ zu verstehen, dass beispielsweise eine Inaktivierung der Pyruvat-Kinase (PK) durch eine Deletion des Gens cg2291 bzw. durch das Einfügen eines Vektors oder einer alternativen Sequenz in den Genbereich von cg2291 erreicht werden kann. Dabei kann das Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase teilweise oder komplett verändert oder deletiert sein mit der Folge der vollkommenen oder fast vollkommenen (teilweisen) Inaktivierung der enzymatischen Aktivität.
Alternativ kann eine Abschwächung oder Reduktion der Genexpression der Pyruvat-Kinase durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (J. Bacteriol. 1988. 170: 5949), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Res. 1998. 26: 3548, bei Jensen und Hammer (Biotechnol. Bioeng. 1998 58: 191), bei Patek et al. (Microbiology 1996. 142: 1297 und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik“, 8. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2001) oder dem von Winnacker („Gene und Klone“, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung der funktionellen Eigenschaften von PK führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Yano et al. 1998 Proc Natl Acad Sci U S A. 95:5511-5, Oue S. et al. J. Biol. Chem. 1999, 274:2344-9. und Onuffer et al. Protein Sei. 1995 4:1750-7 genannt. Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen und Proteine gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers „Molekulare Genetik“, 8. Auflage, 2001 , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland), oder Übersichtsartikeln (N. Pokala 2001 , J. Struct. Biol. 134:269-81 ; A. Tramontano 2004, Angew. Chem. Int. Ed Engi. 43:3222-3; N. V. Dokholyan 2004, Proteins. 54:622-8; J. Pei 2003, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 100:11361-6; H. Lilie 2003, EMBO Rep. 4:346-51; R. Jaenicke Angew. Chem. Int. Ed. Engi. 42:140-2) entnommen werden.
„Vermindert“ oder „ausgeschaltet“ im Sinne der vorliegenden Erfindung meint, dass die Expression der kodierenden Nukleinsäuresequenz im Vergleich zur Situation in einer Wildtyp-Wirtszelle schlechter ist oder nicht mehr unter der Expressionskontrolle regulatorischer Strukturen wie im Vergleich zur Situation im Wildtyp-Wirtszelle steht. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist „vermindert“ oder „ausgeschaltet“, gleichbedeutend für „dereguliert“ oder „dereprimiert“ zu versehen. Im Sinne der Erfindung kann analog auch die regulatorische oder katalytische Aktivität von Proteinen oder Enzymen „vermindert“ oder „ausgeschaltet“ sein.
Gleiches gilt für analog für die „Steigerung“ oder „Erhöhung“ von regulatorischen oder katalytischen Aktivitäten von Proteinen oder Enzymen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist „gesteigert“ gleichbedeutend mit „erhöht“, oder „verbessert“, „verändert“ oder „dereguliert“ zu verstehen und wird synonym verwendet. „Gesteigert“ im Sinne der vorliegenden Erfindung meint beispielsweise die gesteigerte Genexpression eines Gens im Vergleich zu der Expression des jeweiligen Ausgangsgens oder der Situation in einer Wildtyp-Wirtszelle im unveränderten, natürlicherweise nicht gesteigerten Zustand. Gleiches ist im Sinne der Erfindung bezüglich der erhöhten Enzymaktivität gemeint. Beispielsweise stellt der Wildtyp einer coryneformen Bakterienzelle ein genetisch nicht verändertes Ausgangsgen oder -enzym dar. Bevorzugt sind coryneforme Wildtypzellen der Gattung Corynbacterium oder Brevibacterium, besonders bevorzugt sind coryneforme Bakterienzellen des Wildtyps Corynebacterium glutamicum.
Erfindungsgemäß umfasst im Sinne von „Wildtyp-Wirtszellen“ oder als „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder als „Produktionsstamm“ oder als „Wildtyp-Plattformstamm“ für die erfindunsgemäß modifizierten corynformen Bakterienzellen sind auch coryneforme Bakterienzellen, die ihrerseits bereits derart in ihren Eigenschaften verändert sind, dass sie definierte und etablierte Plattformstämme oder definierte Produktionsstämme coryneformer Bakterienzellen sind, die für eine Produktion von Intermediaten auch im großtechnischen oder industriellen Maßstab vorbereitet und somit geeignet sind. Die Gattung Corynebacterium ist beispielsweise in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt L-Aminosäuren und organische Säuren zu produzieren. Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum MB0001 (DE3), Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020, sowie daraus hergestellte, überproduzierende Mutanten bzw. Stämme, sogenannte Produktionsstämme oder Plattformstämme. Erfindungsgemäß vorteilhaft als „Wildtyp-Wirtszellen“ oder als „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder als „Produktionsstamm“ oder als „Wildtyp-Plattformstamm“ im Sinne der vorliegenden Erfindung ist auch der Stamm Corynebacterium glutamicum DelAro5-C7 PO6iolT1. Die vorliegende Erfindung umfasst somit auch modifizierte coryneforme Bakterienzellen, die eine erfindungsgemäße Weiterentwicklung des Ausgangstammes Corynebacterium glutamicum DelAro5-C7 PO6iolT1 darstellen, wobei dieser Ausgangstamm erfindungsgemäß als „Wildtyp-Plattformstamm“ anzusehen ist. Zu weiteren Experimenten wurden erfindungsgemäß auch modifizierte coryneforme Bakterienzellen hergestellt und sind somit erfindungsgemäß umfasst, die eine Weiterentwicklung des Stammes Cornyebacterium glutamicum MB0001 (DE3) darstellen oder auch eine Weiterentwicklung des Stammes Cornyebacterium glutamicum DelAro5 darstellen, wobei dann der jeweilige Ausgangsstamm für diese Weiterentwicklung erfindungsgemäß als „Wildtyp-Wirtszellen“ oder als „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder als „Produktionsstamm“ oder als „Wildtyp-Plattformstamm“ anzusehen ist. In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren umfasst, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, die eine gesteigerte Xylose-Isomerase- und Xylulose-Kinase-Aktivität (XylA, XylB) aufweist oder deren Gene kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xyl B) überexprimiert sind.
Erfindungsgemäß kann eine gesteigerte Expression der Xylose-Isomerase (xylA) und/oder Xylulose-Kinase (xylB) auf Veränderungen beruhen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) Veränderung der Regulation oder von Signalstrukturen zur Genexpression, b) Veränderung der Transkriptionsaktivität der kodierenden Nukleinsäuresequenz, oder c) Erhöhung der Genkopienzahl der kodierenden Nukleinsäuresequenz. Erfindungsgemäß umfasst sind dabei Veränderung der Signalstrukturen der Genexpression, wie beispielsweise durch Veränderung der Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren; Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, des Startkodons, Terminatoren. Ebenso umfasst sind das Einführen eines stärkeren Promoters, wie beispielsweise des tac-Promotors oder einen IPTG-induzierbaren Promotors. Das Einführen eines stärkeren Promoters, wie z. B. den tac-Promoter (Amann et al (Gene 1988 69:301-15), oder Promotoren aus der Gruppe der bei Patek et al (Microbiology 1996 142:1297) beschriebenen Promotoren ist bevorzugt, aber nicht limitierend für die vorliegende Erfindung. Weitere Beispiele finden sich in der WO 96/15246 oder in Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), in Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), in Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), in Pätek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), in Knippers ("Molekulare Genetik", 6th Edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) oder auch bei Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990). Eine erhöhte Genkopienzahl der erfindungsgemäß kodierenden Nukleinsäuresequenz kann in weiteren Varianten der Erfindung chromosomal-kodiert oder Vektor-basiert, bevorzugt Plasmid-kodiert, vorliegen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine coryneforme Bakterienzelle bei der die Erhöhung der Kopienzahl chromosomal-kodiert oder extra-chromosomal-kodiert, bevorzugt Vektor-kodiert oder Plasmid-kodiert, vorliegt. Erfindungsgemäß eignen sich als Plasmide solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKExI (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4, 489, 160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAGI (US-A 5, 158, 891 ) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden (O. Kirchner 2003, J. Biotechnol. 104:287-99). Ebenso können Vektoren mit regulierbarer Expression benutzt werden, wie zum Beispiel pEKEx2 (B. Eikmanns, 1991 Gene 102:93-8; O. Kirchner 2003, J. Biotechnol. 104:287-99). Auch kann das Gen durch Integration in das Chromosom in einfacher Kopie (P. Vasicova 1999, J. Bacteriol. 181 :6188-91), oder mehrfacher Kopie (D. Reinscheid 1994 Appl. Environ Microbiol 60: 126-132) exprimiert werden. Die Transformation des gewünschten Stammes mit dem Vektor zur Erhöhung der Kopienzahl erfolgt durch Konjugation oder Elektroporation des gewünschten Stammes von beispielsweise C. glutamicum. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology (1994) 60:756-759) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters (1994)123:343-347) beschrieben.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung kann eine erhöhte Aktivität der Xylose-Isomerase (xylA) und/oder Xylulose-Kinase (xylB) auf Veränderungen beruhen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) eine Erhöhung der Expression der kodierenden Nukleinsäuresequenz, b) eine Expression einer Nukleinsäuresequenz oder Fragmenten davon, die für eine Xylose-Isomerase (xylA) und/oder Xylulose-Kinase (xylB) mit erhöhter katalytischer Aktivität und/oder Substratspezifität kodiert, c) eine Erhöhung der Stabilität der mRNA abgeleitet von der kodierenden Nukleinsäuresequenz, oder d) eine Veränderung der katalytischen Aktivität und/oder Substratspezifität einer Xylose-Isomerase (XylA) und/oder Xylulose-Kinase (XylB) für den Umsatz von D-Xylose oder eine Kombination von a) - d). Die Erhöhung der mRNA-Stabilität kann beispielsweise durch Mutation der terminalen Positionen erreicht werden, welche den Abbruch der Transkription steuern. Maßnahmen, die zu einer Veränderung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, insbesondere zu einer veränderten Substratspezifität sind aus dem Stand der Technik bekannt. Neben erfindungsgemäß bevorzugten partiellen oder kompletten Deletionen regulatorischer Strukturen sind erfindungsgemäß auch Veränderungen, wie z. B. Transitionen, Transversionen oder Insertionen umfasst, sowie Methoden der gerichteten Evolution. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Veränderungen können bekannten Lehrbüchern (R. Knippers „Molekulare Genetik“, 8. Auflage, 2001 , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland) entnommen werden.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung kommt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine corynforme Bakterienzelle zum Einsatz, die derart modifiziert ist, dass sie eine erhöhte Aktivität oder Überexpression des Gens kodierend für eine heterologe Xylose-Isomerase (XylA, xyla) aufweist, bevorzugt eine heterologe Xylose-Isomerase aus dem bakteriellen Isomerase-Stoffwechselweg ausgehend von D-Xylose, besonders bevorzugt aus dem Organismus Xanthomonas campetris. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Variante eines Verfahrens bei dem eine corynforme Bakterienzelle zum Einsatz kommt, die derart modifiziert ist, dass sie eine erhöhte Aktivität oder Überexpression des Gens kodierend für eine endogene bzw. native Xylulose-Kinase (XylB, xylB) aufweist, bevorzugt eine endogene Xylulose-Kinase aus dem bakteriellen Isomerase-Stoffwechselweg ausgehend von D-Xylose, besonders bevorzugt aus dem Organismus Corynebacterium glutamicum.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Verfahren, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, deren kataboler Stoffwechsel für aromatische Verbindungen inaktiviert ist und die zusätzlich eine erhöhte Aktivität einer DAHP-Synthase (AroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten, DAHP-Synthase (AroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aufweist oder deren Gene kodierend für Enzyme des katabolen Stoffwechsels aromatischer Verbindungen (DelAro5) deletiert sind und eine Überexpression der Gene kodierend für eine DAHP-Synthase (aroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten, DAHP-Synthase (AroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB) aufweist.
Erfindungsgemäß wird bei dem vorliegenden Verfahren die mikrobielle Umsetzung eine C5-Kohlenstoffquelle mittels einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle durchgeführt, in der das katabole Netzwerk zum Abbau aromatischer Verbindungen durch Deletion von 27 Genen, ausgeschaltet ist (DelAro5). Zusätzlich weist die erfindungsgemäße Bakterienzelle eine erhöhte Aktivität 3-Desoxy-D-Arabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase (DAHP-Synthase; AroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*), besonders bevorzugt einer heterologen feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*) aus Escherichia coli, sowie einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB), bevorzugt einer endogenen, nativen oder homologen 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aus coryneformen Bakterien auf. Oder die erfindungsgemäß modifizierte coryneforme Bakterienzelle weist eine Überexpression des Gens kodierend für eine DAHP-Synthase (aroF), bevorzugt eine feedback-deregulierte DAHP-Synthase (aroF*) aus Escherichia coli, die ganz besonders bevorzugt hinsichtlich des genetischen Codes für coryneforme Bakterien Codon-optimiert ist, sowie eine Überexpression des Gens kodierend für eine 3- Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB), besonders bevorzugt ein Gen kodierend für eine endogene, native, homologe 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aus coryneformen Bakterien, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, auf.
Optional kann die Lösung enthaltend 3,4-Dihydroxybenzoesäure (PCA) nach gängigen Methoden der mikrobiellen bzw. biotechnologischen Praxis aufbereitet werden und/oder PCA aus der Lösung isoliert werden. Gegebenenfalls kann das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens auch weiter gereinigt oder aufkonzentriert werden oder zur weiteren Verwendung mit Zusatzstoffen versehen werden, die dem finalen Endprodukt angepasst sind.
Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, die zusätzlich ein Phosphotransferase-(PTS)-unabhängiges Kohlenstofftransportersystem aufweist, bevorzugt einen myo-lnositol/Proton-Symporter iolT1 , besonders bevorzugt eine lolR-dereprimierten myo-lnositol/Proton-Symporter P6-iolT 1 .
Weiter ist im Sinne der Erfindung ein Verfahren umfasst, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium divaricatum.
In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle der Gattung Corynebacterium glutamicum eingesetzt, die aus einer „Wildtyp-Wirtszelle“ oder einem „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder einem „Produktionsstamm“ oder einem „Wildtyp-Plattformstamm“ der Gattung Corynebacterium glutamicum hervorgeht, bevorzugt aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum DelAro5-C7 PO6iolT1 hervorgeht.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Verfahren, bei dem die mikrobielle Umsetzung in einer Lösung ausgehend von einer C5-Kohlenstoff-Quelle erfolgt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend a) Oligosaccharide oder Polysaccharide, enthaltend D-Xylose-Einheiten, b) D-Xylose, c) Lignocellulose-, Cellulose-, oder Hemicellulose-haltige Biomasse, deren Hydrolysat oder daraus gewonnener Extrakt enthaltend D-Xylose-Einheiten oder d) eine Kombination von a) bis c). In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als C5-Kohlenstoffquelle Sulfitablauge, Maisstroh, Reisstroh oder Bagasse, oder deren Hydrolysate oder daraus gewonnene Extrakte enthaltend D-Xylose-Einheiten eingesetzt.
Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens können kontinuierlich oder diskontinuierlich, z.B. im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch- (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) gefahren werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Ein zu verwendendes Kulturmedium sollte in geeigneterWeise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind im Handbuch ''Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Neben D-Xylose als Ausgangssubstrat der PCA-Bildung können als Kohlenstoffquelle Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch Lignocellulose-, Cellulose-, oder Hemicellulose-haltige Biomasse, deren Hydrolysat oder daraus gewonnener Extrakt enthaltend D-Xylose-Einheiten oder eine Kombination der zuvor genannten Substrate. Darüber hinaus sind als C5-Kohlenstoffquelle auch Sulfitablauge, Maisstroh, Reisstroh oder Bagasse, oder deren Hydrolysate oder daraus gewonnene Extrakte enthaltend D-Xylose-Einheiten erfindungsgemäß umfasst.
Diese zuvor genannten Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH - Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen wie Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an PCA gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine teilweise oder komplett inaktivierte Pyruvat-Kinase-Aktivität (PK) und eine gesteigerte Xylose-Isomerase- und Xylulose-Kinase-Aktivität (XylA, XylB) aufweist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett deletiert ist und deren Gene kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) überexprimiert sind.
Erfindungsgemäß umfasst ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine teilweise oder komplette Inaktivierung der Pyruvat-Kinase (PK) aufweist, die erfindungsgemäß durch eine Deletion des Gens cg2291 bzw. durch das Einfügen eines Vektors oder einer alternativen Sequenz in den Genbereich von cg2291 erreicht werden kann. Dabei kann das Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett verändert oder deletiert sein (Δpyk), mit der Folge der vollkommenen oder fast vollkommenen bzw. teilweisen Inaktivierung der enzymatischen Aktivität der Pyruvat-Kinase (PK). Erfindungsgemäß handelt es sich bei der Pyruvat-Kinase (PK) oder dem Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) um das endogene Enzym bzw. Gen aus der Gattung Cornyebacterium oder Brevibacterium. Bevorzugt handelt es sich um die Pyruvat-Kinase bzw. das sie kodierende Gen aus Corynebacterium glutamicum. Interessanterweise ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle der vorliegenden Erfindung auch ohne Pyruvat-Kinase-Aktivität lebensfähig und zudem zur mikrobiellen Herstellung von PCA fähig ist, was nicht zu erwarten war.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung kommt eine modifizierte corynforme Bakterienzelle zum Einsatz, die zusätzlich zur Inaktivierung der PK bzw. Deletion Δpyk eine erhöhte Aktivität oder Überexpression des Gens kodierend für eine heterologe Xylose-Isomerase (XylA, xyla) aufweist, bevorzugt eine heterologe Xylose-Isomerase aus dem bakteriellen Isomerase-Stoffwechselweg ausgehend von D-Xylose, besonders bevorzugt aus dem Organismus Xanthomonas campestris. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Variante einer corynforme Bakterienzelle, die zusätzlich zur Inaktivierung der PK bzw. Deletion Δpyk und einer erhöhten Aktivität einer heterologen Xylose-Isomerase oder Überexpression des Gens kodierend für eine heterologe Xylose-Isomerase (XylA, xyla) noch eine erhöhte Aktivität oder Überexpression des Gens kodierend für eine Xylulose-Kinase (XylB, xylB), bevorzugt eine endogene Xylulose-Kinase aus dem bakteriellen Isomerase-Stoffwechselweg ausgehend von D-Xylose, besonders bevorzugt aus dem Organismus Corynebacterium glutamicum, aufweist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die a) eine teilweise oder komplette Inaktivierung einer Pyruvat-Kinase (PK) mit einer Aminosäuresequenz von wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder Fragmente davon aufweist, b) eine Xylose-Isomerase-Aktivität (XylA) mit einer Aminosäuresequenz von wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder Fragmente davon aufweist, c) eine gesteigerte Aktivität einer Xylose-Isomerase-Aktivität (XylB) mit einer Aminosäuresequenz von wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder Fragmente davon aufweist.
Eine Variante einer erfindungsgemäßen modifizierte coryneforme Bakterienzelle zeichnet sich dadurch aus, dass sie a) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) mit wenigstens 70% Identität zu SEQ ID NO. 5 oder Fragmente oder Allele davon aufweist, und b) eine gesteigerte Expression einer Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylulose-Kinase (xylB) mit wenigstens 70% Identität zu SEQ ID NO. 6 oder Fragmente oder Allele davon aufweist. c) eine teilweise oder komplette Deletion der Nukleinsäuresequenz kodierend für die Pyruvat-Kinase gemäß SEQ ID NO. 4 der Fragmente oder Allele davon aufweist.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine Variante einer modifizierte coryneforme Bakterienzelle mit a) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer komplementären Sequenz einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6 oder Fragmente oder Allele davon hybridisiert, b) einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 5 und SEQ ID NO. 6 oder Fragmente davon, oder c) einer Nukleinsäuresequenz entsprechend jeder der Nukleinsäuren gemäß a) oder b), die sich jedoch von diesen Nukleinsäuresequenzen durch die Degeneriertheit des genetischen Codes oder funktionsneutrale Mutationen unterscheidet. d) einer Nukleinsäure entsprechend jeder der Nukleinsäuren gemäß a) - c), die an die Codon-Usage des Wirts-Stammes angepasst (Codon-optimiert) ist, und e) einer teilweisen oder kompletten Deletion der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 4.
Eine Variante der vorliegenden Erfindung umfasst ferner eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, deren Enzyme für den Katabolismus aromatischer Verbindungen inaktiv sind und die zusätzlich eine erhöhte Aktivität einer DAHP-Synthase (AroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aufweist oder deren Gene kodierend für Enzyme des Katabolismus aromatischer Verbindungen (Delaro5) deletiert sind und die eine Überexpression der Gene kodierend für eine DAHP-Synthase (aroF), bevorzugt eine feedback-deregulierte DAHP-Synthase (aroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB) aufweist.
Erfindungsgemäß umfasst ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, in der das katabole Netzwerk zum Abbau aromatischer Verbindungen durch Deletion von 27 Genen, ausgeschaltet ist (DelAro5). Zusätzlich weist die erfindungsgemäße Bakterienzelle eine erhöhte Aktivität 3-Desoxy-D-Arabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase
(DAHP-Synthase; AroF), bevorzugt einer feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*), besonders bevorzugt einer heterologen feedback-deregulierten DAHP-Synthase (AroF*) aus Escherichia coli, sowie einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB), bevorzugt einer endogenen, nativen oder homologen 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aus coryneformen Bakterien auf. Oder die erfindungsgemäß modifizierte coryneforme Bakterienzelle weist eine Überexpression des Gens kodierend für eine DAHP-Synthase (aroF), bevorzugt eine feedback-deregulierte DAHP-Synthase (aroF*) aus Escherichia coli, die ganz besonders bevorzugt hinsichtlich des genetischen Codes für coryneforme Bakterien Codon-optimiert ist, sowie eine Überexpression des Gens kodierend für eine 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB), besonders bevorzugt ein Gen kodierend für eine endogene, native, homologe 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aus coryneformen Bakterien, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, auf.
Erfindungsgemäß umfasst ist weiter eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die zusätzlich zu den zuvor erläuterten Eigenschaften ein Phosphotransferase-(PTS)- unabhängiges Kohlenstofftransportersystem aufweist, bevorzugt einen myo-lnositol/Proton-Symporter iolT1 , besonders bevorzugt eine lolR-dereprimierten myo-lnositol/Proton-Symporter P6-iolT1 .
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine gesteigerte Expression der Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) aufweist, beruhend auf Veränderungen in nicht-kodierenden regulatorischen Sequenzen vor oder hinter dem kodierenden Bereich von xyl A und/oder xylB, einschließlich der Promotor- Region. Erfindungsgemäß umfasste Varianten sind auch modifizierte coryneforme Bakterienzellen, die eine gesteigerte Expression der Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) aufweisen beruhend auf einer Erhöhung der Kopienzahl einer Nukleinsäure kodierend für ein xylA- und/oder xylB-Gen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle bei der eine erhöhte Kopienzahl einer Xylose-Isomerase und Xylulose-Kinase kodierenden Nukleinsäuresequenz chromosomal-kodiert vorliegt. Erfindungsgemäß umfasst ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, bei der eine erhöhte Kopienzahl einer Xylose-Isomerase und Xylulose-Kinase kodierenden Nukleinsäuresequenz extrachromosomal-kodiert, bevorzugt Plasmid-kodiert oder Vektor-kodiert, vorliegt.
In einer besonderen Variante der Erfindung ist eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle umfasst, a) die eine Xylose-Isomerase (XylA) mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder Fragmente davon und/oder eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) gemäß SEQ ID NO. 5 oder Fragmente oder Allele davon aufweist, b) bei der die Aktivität einer Xylulose-Kinase (XylB) mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 oder Fragmente davon und/oder die Expression einer Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylulose-Kinase (xylB) gemäß SEQ ID NO. 6 oder Fragmente oder Allele davon gesteigert ist, c) bei der die Pyruvat-Kinase (PK) mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 teilweise oder komplett inaktiviert ist und/oder eine Nukleinsäuresequenz kodierend für die Nukleinsäuresequenz (pyk) gemäß SEQ ID NO. 4 teilweise oder komplett deletiert ist, d) die eine gesteigerte Aktivität und/oder Expression der Gene kodierend für eine feedback deregulierte DAHP-Synthase (AroF*) und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aufweist, e) die eine gesteigerte Aktivität und/oder Expression der Gene kodierend für Phosphotransferase-(PTS)-unabhängiges Kohlenstofftransportersystem aufweist, bevorzugt einen myo-lnositol/Proton-Sym porter iolT1 , besonders bevorzugt eine lolR-dereprimierten myo-lnositol/Proton-Symporter P6-iolT1 , und f) bei der die Aktivität der Enzyme verantwortlich für den Abbau von aromatischen Verbindungen teilweise oder komplett inaktiviert ist und/oder die Nukleinsäuresequenzen kodierend für Enzyme verantwortlich für den Abbau von aromatischen Verbindungen teilweise oder komplett deletiert sind, sowie g) eine Kombination aus a) - f).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium divaricatum.
Erfindungsgemäß besonders geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme Corynebacteriumglutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020, sowie daraus hergestellte, überproduzierende Mutanten bzw. Stämme, sogenannte Produktionsstämme oder Plattformstämme.
Erfindungsgemäß umfasst sich somit auch coryneforme Bakterienzellen, die ihrerseits bereits derart in ihren Eigenschaften verändert sind, dass sie definierte und etablierte Plattformstämme oder definierte Produktionsstämme coryneformer Bakterienzellen sind, die für eine Produktion von Intermediaten auch im großtechnischen oder industriellen Maßstab vorbereitet und somit geeignet sind. Die Gattung Corynebacterium ist beispielsweise in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt L-Aminosäuren und organische Säuren zu produzieren. Darüber hinaus sei bemerkt, dass die biotechnologischen Produkte, die mit coryneformen Bakterien hergestellt werden, den „Generally Recognized As Safe“-Status (GRAS) genießen, wodurch coryneforme Baktieren eine überaus hohe Akzeptanz für die mikrobielle Herstellung von Stoffwechselintermediaten genießen. Coryneforme Bakterien erreichen auf definierten Medien hohe Wachstumsraten und Biomasseerträge (Grünberger et al., 2012) und es existiert umfangreiche Erfahrung im industriellen Einsatz coryneformer Bakterien (Becker et al., 2012). Dies ist eine allgemeine Information aus dem Stand der Technik, die dem Fachmann wohlbekannt ist.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung eignet sich als „Wildtyp-Wirtszellen“ oder als „Ausgangsstamm“ oder „Vorläuferstamm“ oder als „Produktionsstamm“ oder als „Wildtyp-Plattformstamm“ für erfindungsgemäße Varianten einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle beispielsweise bevorzugt der Stamm Corynebacterium glutamicum. Erfindungsgemäß vorteilhaft als Ausgangsstamm für die Varianten der vorliegenden Erfindung ist der Stamm Corynebacterium glutamicum DelAro5-C7 PO6iolT1.
Die vorliegende Erfindung umfasst somit eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine erfindungsgemäße Weiterentwicklung des Plattformstammes Corynebacterium glutamicum DelAro5-C7 PO6iolT1 darstellt, wobei der zuvor genannte Plattform stamm auch als eine Art „Wildtyp-Plattformstamm“ anzusehen ist, gegenüber dem die zuvor genannten Eigenschaften der Enzymaktivitäten oder Genexpressionen der erfindungsgemäß modifizierten coryneformen Bakterienzellen verändert sind.
Diese erfindungsgemäß modifizierte coryneforme Bakterienzelle zeichnet sich besonders vorteilhaft dadurch aus, dass sie in einem unerwartet hohen Maße PCA (3,4- Dihydroxybenzoesäure; Protocatechuat) ausgehend von D-Xylose, Oligosacchariden oder Polysacchariden enthaltend D-Xylose-Einheiten, D-Xylose, Lignocellulose-, Cellulose-, oder Hemicellulose-haltige Biomasse deren Hydrolysat oder daraus gewonnener Extrakt enthaltend D-Xylose-Einheiten oder ausgehend von Sulfitablauge, Maisstroh, Reisstroh oder Bagasse oder deren Hydrolysate oder daraus gewonnene Extrakte enthaltend D-Xylose-Einheiten oder Kombinationen davon produziert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art zur Herstellung von 3.4-Dihydroxybenzoesäure aus einer C5-Kohlenstoffquelle. Bevorzugt wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine C5-Kohlenstoffquelle ausgehend von Oligosacchariden oder Polysacchariden enthaltend D-Xylose-Einheiten, D-Xylose, Lignocellulose-, Cellulose-, oder Hemicellulose-haltige Biomasse, deren Hydrolysat oder daraus gewonnener Extrakt enthaltend D-Xylose-Einheiten oder ausgehend von Sulfitablauge, Maisstroh, Reisstroh oder Bagasse, oder deren Hydrolysate oder daraus gewonnene Extrakte enthaltend D-Xylose-Einheiten oder Kombinationen davon.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch ein Verfahren der zuvor beschriebenen Art, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art eingesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner eine Verwendung einer modifizierten corynformen Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art zur mikrobiellen Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus D-Xylose oder D-Xylose-haltigen Hydrolysaten oder Extrakten nachhaltiger Rohstoffe.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Zusammensetzung enthaltend 3,4-Dihydroxybenzoesäure herstellt mit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle der zuvor beschriebenen Art oder nach einem Verfahren der zuvor beschriebenen Art.
Erfindungsgemäß umfasst ist auch die Verwendung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure, hergestellt mit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle der vorliegenden Erfindung oder nach einem Verfahren der zuvor beschriebenen Art, sowie die Verwendung einer Zusammensetzung der zuvor beschriebenen Art zur Herstellung von Plastik, Plastikfasern, Pharmazeutika, Kosmetika, Lebensmitteln und/oder Futtermitteln.
Tabellen und Figuren:
Tabelle 1 zeigt eine Übersicht an Bakterienstämmen und Plasmiden der vorliegenden Erfindung. Der Ausgangs- oder Plattformstamm Corynebacterium glutamicum DelAro5-C7 PO6iolT1 ist dabei als ein vorteilhafter „Wildtyp-Ausgangsstamm“ anzusehen, gegenüber dem die Varianten der erfindungsgemäßen Bakterienzellen bzw. Bakterienstämmen modifiziert sind.
Tabelle 2 zeigt eine Übersicht der SEQ ID NO‘s der vorliegenden Erfindung
Figur 1a)-e) zeigt die Plasmide pK19mobsacB_cg0344-7 (Fig. 1a), pK19mobsacB_cg2625- 40 (Fig 1 b), pK19mobsacB_0502 (Fig 1c), pK19mobsacB_cg1226 (Fig. 1d) und pK19mobsacB_cg3349-54 (Fig. 1e) mit denen die fünf Gen-Cluster kodierend für Enzyme beteiligt am Abbau aromatischer Verbindungen deletiert wurden.
Figur 2 zeigt die Plasmide pK19mobsacB-540-del (Figur 2a) und pK19mobsacB- PgltA::PdapA-C7 (Figur 2b) mit denen die regulatorische Bindestelle im Promotorbereich der Citratsynthase CS durch Nukleotidsubstitutionen und Integration in das Genom coryneformer Bakterienzellen verändert wurde. Die erfindungsgemäße Promotorregion PgltA::PdapA-C7 weist neben dem Austausch der Promotorregion von gtlA gegen dapA zusätzlich Nukleotidsubstitutionen an Position 70 (a->t) und 71 (g->a) vor dem Startcodon ATG auf.
Figur 3 zeigt das Plasmid pK19mobsacB_PO6iolT1 zur Veränderung der regulatorischen Bindestelle im Promotorbereich des /Wyo-Inositol-Transporters lolT1 durch Nukleotidsubstitutionen in C. glutamicum.
Figur 4 zeigt Plasmid pMKEX2_aroF*_qsuB für die Expression der Gene aroF* aus Escherichia coli und qsuB aus C. glutamicum.
Figur 5 zeigt Plasmid pEKEx3-tkt für die Expression des tkt Gens aus C. glutamicum
Figur 6 zeigt Plasmid pK19mobsacB _pyk mit dem die Nukleinsäuresequenz kodierend für die Pyruvat-Kinase erfindungsgemäß im Genom von Corynebacterium glutamicum deletiert wurde.
Figur 7 zeigt Plasmid pEKEx3_xylA-xylB für die Expression der Gene xylA aus Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913 und xylB aus C. glutamicum.
Figur 8 zeigt das Wachstum, die Substrataufnahme und die Protocatechuat-Bildung unterschiedlicher Varianten coryneformer Bakterienzellen. Die Kultivierungen wurden in Schüttelkolben in definiertem CGXII-Medium unter Zugabe von entweder 222 mM D-Glucose (Stämme: DelAro5-C7 PO6-iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt und DelAro5-C7 PO6-iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt) oder 266 mM D-Xylose (Stämme: DelAro5-C7 PO6- iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB und DelAro5-C7 PO6-iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle durchgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden von mindestens drei unabhängigen Kulturen ermittelt.
Figur 9 zeigt PCA-Titer der C. glutamicum-Stämme DelAro5-C7 Po&-iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PC AGLC), DelAro5-C7 PO6-iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PCAGLC Δpyk), DelAro5-C7 PO6-iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB (PCAXYL) und DelAro5-C7 PO6-iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB (PCAXYL Δpyk) nach 98 h Kultivierung. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden von mindestens drei unabhängigen Kulturen ermittelt.
Figur 10 zeigt das Wachstum, die Substrataufnahme und die Protocatechuat-Bildung unterschiedlicher Varianten coryneformer Bakterienzellen. Die Kultivierungen wurden in Schüttelkolben in definiertem CGXII-Medium unter Zugabe von 266 mM D-Xylose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle durchgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden von mindestens drei unabhängigen Kulturen ermittelt.
Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung, die in den Tabellen und Figuren dargestellt sind. Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung anhand von Tabellen und Figuren näher erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung dadurch beschränkt wird.
Stammkonstruktion C. glutamicum 13032 DelAro5
Die nachfolgend beschriebene Methodik wurde für die Konstruktion von C. glutamicum 13032 DelAro5 verwendet.
Als Ausgangsstamm für die Konstruktion von C. glutamicum 13032 DelAro5 wird der Stamm C. glutamicum MB001 (DE3) gewählt. Hierbei handelt sich um einen Prophagen-freien C. glutamicum ATCC13032 Wildtyp-Stamm (Stamm C. glutamicum MB001 ; Baumgart et al, 2013b), https://doi.org/10.1128/AEM.01634-13), der im Weiteren über eine chromosomal-integrierte T7-Polymerase verfügt, welche die Nutzung des starken und induzierbaren T7-Promotors erlaubt (Stamm C. glutamicum MB001 (DE3); (Kortmann et al., 2015 https://doi.Org/10.1111/1751-7915.12236). Dieser Promotor befindet sich auch auf den pMKEx2-Plasmiden, die für die Expression an der Synthese des jeweiligen Produkts beteiligter Gene pflanzlichen Ursprungs genutzt werden.
Ausgehend von C. glutamicum MB001 (DE3) wird durch Deletion der Gen(-cluster) cg0344-47, cg2625-40 und cg1226 der Stamm C. glutamicum DelAro3 konstruiert (Kalischeuer et al., 2016a, https://d0i.0rg/l 0.1016/j.ymben.2016.06.003).
Bei cg0344-47 handelt es sich um das phdBCDE-Operon, welches für Gene codiert, die am Katabolismus von Phenylpropanoiden, wie z. B. p-Cumarsäure beteiligt ist.
Um die unspezifische Umwandlung von Phenylpropanoiden durch Enzym-katalysierte Ring-Hydroxylierung oder Ring-spaltende Reaktionen zu verhindern (die natürlichen Substrate der jeweiligen Enzyme 4-Hydroxybenzoate-3-Hydroxylase PobA bzw. Protocatechuat Di-oxygenase PcaGH zeigen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu Phenylpropanoiden) werden die entsprechenden Gen(-cluster) cg1226 (poM) und cg2625-40 (cat, ben und pca Gene, die essentiell für den Abbau von 4-Hydroxybenzoat, Catechol, Benzoat und Protocatechuat sind) deletiert.
Die 3-Dehydroshikimat Dehydratase QsuB katalysiert die thermodynamisch irreversible Umwandlung des Shikimat-Weg-Intermediates 3-Dehydroshikimat zu Protocatechuat und führt so zu einem ungewünschten Verlust von Intermediaten des Syntheseweges aromatischer Aminosäuren. Die Deletion von qsuB reduzierte die Akkumulation von Protocatechuat. Somit wird in dem konstruierten Stamm C. glutamicum DelAro3 zusätzlich das Gen cg0502 (qsuB) deletiert, resultierend in dem Stamm C. glutamicum DelAro4.
Darüber hinaus wurden die Gene für den Gentisatabbauweg deletiert. Die Enzyme dieses katabolen Weges werden von Genen des Genclusters naglKL-nagR-nagT-genH kodiert (cg3349-54). Um jeglichen Produktabbau zu verhindern wurde das gesamte Gencluster deletiert, woraus letztendlich der Stamm C. glutamicum DelAro5 resultiert.
Konstruktion pK19mobsacB-cg0344-47-del und pK19mobsacB-cg2625-40-del
Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg0344-47-del (Figur 1a) und pK19mobsacB- cg2625-40-del (Figur 1 b) zwecks Deletion der Gencluster cg0344-47 und cg2625-40 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankierenden Fragmente des jeweils zu deletierenden Genclusters per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar cgXXXX- XX-up-s / cgXXXX-XX-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar cgXXXX-XX-down-s / cgXXXX-XX-down-as amplifiziert. Die Codierung XXXX-XX steht hierbei jeweils für die cg-Nummern der zu deletierenden Gene. Beispielsweise wird für die Deletion der Genclusters cg0344-47 das Primerpaar cg0344-47-up-s/ cg0344-47-up-as benutzt und analog für die Deletion der Genclusters cg2625-40 das Primerpaar cg2625-40-up-s/ cg2625-40-up-as. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (cgXXXX-XX-up-as / cgXXXX-XX-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten. Für das Gencluster cg0344-47 ist dies das Primerpaar cg0344-47-up-as/ cg0344-47-down-s und analog für das Gencluster cg2625-40 das Primerpaar cg2625-40-up-as/ cg2625-40-down-s. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (cgXXXX-XX-up-s / cgXXXX-XX-down-as). Für das Gencluster cg0344-47 ist dies das Primerpaar cg0344-47-up-s/ cg0344-47-down-as und analog für das Gencluster cg2625-40 das Primerpaar cg2625-40-up-s/ cg2625-40-down-as. Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion der Deletionsplasmide wurden sowohl die Deletionfragmente als auch der pK19-mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Xba\ und EcoRI linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-K\t (Thermo Fisher Scientific) wurde jeweils eines der beiden Deletionsfragmente in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des jeweiligen Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg0344-47-del bzw. pK19mobsacB-cg2625-40-del hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pgZmL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit. (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 pl einer 1 :10- Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (wZv)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und % Saccharose (wZv) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cgXXXX-XX-s Z del-cgXXXX-XX-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden. Für das Gencluster cg0344-47 ist dies das Primerpaar del-cg0344-47-s/ del-cg0344-47-as und analog für das Gencluster cg2625-40 das Primerpaar del-cg2625-40-s / del-cg2625-40-as.
Verwendete Primer univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG pK19mobsacB-cg0344-47-del
Cg0344-47-up-s: CTCTCTAGAGCGGTGGCGATGATGATCTTCGAG cg0344-47-up-as: AAGCATATGAGCCAAGTACTATCAACGCGTCAGGGCGACT
TTTCCATTGAGAGACATTTC cg0344-47-down-s: CTGACGCGTTGATAGTACTTGGCTCATATGCTTTTCCTCAC
CCGCTTCTACGCTTAAAAG cg0344-47-down-as: GACGAATTCGTGTGGCCACCACCTCAATCTGTG del-cg0344-47-s: AGAGATTCACCCTCGGCGATGAG del-cg0344-47-as: GACCCGCAATGGTGTCGCCAG pK19mobsacB-cg2625-40-del cg2625-40-up-s: ACATCTAGAGGTCGGCGAATCAAGCTCCATG cg2625-40-up-as: CGTCTCGAGTTCACATATGCAACGCGTGCTCAAGATGA
CAATATCTTGAGGGTTCATTTTTTGATCCTTAATTTAG cg2625-40-down-s: TTGAGCACGCGTTGCATATGTGAACTCGAGACGGTC
GGTGGAGGCGACCAGGGATAAC cg2625-40-down-as: TCTGAATTCATCAAGGCCAATCATGATGAGTGCGAAAC del-cg2625-40-s: AAGAGGAGTTGATGGGATGGTCGAACAATC del-cg2625-40-as: GTTGGCATGCCAGCTTTGTGGGATG
Konstruktion pK19mobsacB-cg0502-del
Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg0502-del (Figur 1c) für die Deletion des Gens cg0502 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankierenden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar cg0502-up-s / cg0502-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar cg0502-down-s / cg0502-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (cg0502-up-as / cg0502-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (cg0502-up-s / cg0502-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion des Deletionsplasmids wurden sowohl das Deletionfragment als auch der pK19-mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-V arianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme HindIII und BamHI linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB- Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg0502-del hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert. Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-ZeWen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (wZv)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 μl einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (wZv)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (wZv)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (wZv) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cg0502-s / del-cg0502-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.
Verwendete Primer cg0502-up-s: ACGAAGCTTTGTCCGGCATGCTGGCTGAC cg0502-up-as: TGCGCATATGTGGCCGTCTAGATACGCGTACGTCAAA CAAACAGTGGCAATGGATGTACGCATG cg0502-down-s: ACGTACGCGTATCTAGACGGCCACATATGCGCAATCG AGCGGGGAATCCCAAACTAGCATC cg0502-down-as: TATGGATCCTACGCCTGTACACCGTCGCACGTC del-cg0502-s: GTGAACATTGTGTTTACTGTGTGGGCACTGTC del-cg0502-as: TGATGTTCAGGCCGTTGAAGCCAAGGTAGAG univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG
Konstruktion pK19mobsacB-cg1226-del
Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg1226-del (Figur 1d) für die Deletion des Gens cg1226 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankierenden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar cg1226-up-s / cg1226-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar cg1226-down-s / cg1226-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (cg1226-up-as / cg1226-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (cg1226-up-s / cg1226-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion des Deletionsplasmids wurden sowohl das Deletionfragment als auch der pK19mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme HindIII und BamHI linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg1226-del hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR- Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-ZeWen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 μl einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (wZv)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (wZv) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer del-cg1226-s / del-cg1226-as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.
Verwendete Primer up-cg1226-s: CACAAGCTTCCACACGATGAAAATCAATCCGCAG up-cg1226-as: TGCGGTACCCTCGCATATGATATCTCGAGAGCTAATT
GCCACTGGTACGTGGTTCATG down-cg1226-s: AGCTCTCGAGATATCATATGCGAGGGTACCGCAGAC
CTACCACGCTTCGAGGTATAAACGCTC down-cg1226-as: AGTGAATTCCAAGGAAGGCGGTTGCTACTGC del-cg01226-s: TAAATGGTGGAGATACCAAACTGTGAAGC del-cg 1226-as: CGAGTTCTTCTTCGTGTTCGCGATC univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG
Konstruktion pK19mobsacB-cg3349-54-del
Zur Konstruktion des Plasmides pK19mobsacB-cg3349-54-del (Figur 1e) für die Deletion des Gencluster cg3349-54 in C. glutamicum wurden die für das homologe Rekombinationsereignis benötigten flankierenden Fragmente per PCR ausgehend von isolierter genomischer C. glutamicum DNA amplifiziert.
Für die Generierung des stromaufwärts gelegenen Fragments wurde das Primerpaar del_cg3349-54-up-s / del_cg3349-54-up-as verwendet, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar del_cg3349-54-down-s / del_cg3349-54-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren (dem zu deletierenden Gen zugewandten) Primer (del_cg3349-54-up-as / del_cg3349-54-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte Deletionsfragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (del_cg3349-54-up-s / del_cg3349-54-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Deletionsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion des Deletionsplasmids wurden sowohl das Deletionfragment als auch der pK19-moösacß-Leervektor mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme HindIII und BamHI linearisiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK1 SmobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der Deletionsplasmide in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Deletionsplasmides pK19mobsacB-cg3349-54-del hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit dem jeweiligen Deletionsplasmid transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Deletionsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Deletionsplasmids wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Deletionsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu deletierende Gen aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Deletionsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 μl einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (wZv) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Gendeletion auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Die erfolgreiche Deletion in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde über die erwartete Fragmentgröße bei Deletion des Gens oder Genclusters mittels Kolonie-PCR der erhaltenen Klone überprüft. Die verwendeten Primer check-cg3349-54-s / check-cg3349-54- as wurden hierbei so gewählt, dass sie im Chromosom außerhalb des deletierten DNA-Bereiches und auch außerhalb der amplifizierten flankierenden Genbereiche binden.
Verwendete Primer: del_cg3349-54-up-s: ACCAAGCTTCATTTTCTAGTTGAGATTCATTATCATAACG
CTTGACAGTACAACTATGTC del_cg3349-54-up-as: GCTTCCGGGGTGAATGACGGAGCCGCTGCGGAGGTTCCA
GAGCCACCGCGCTG del_cg3349-54-down-s: CGCAGCGGCTCCGTCATTCACCCCGGAAGCTGGCGCTAC
GCCCTCCTCGAAC del_cg3349-54-down-as: ACCTCTAGATTTCTGTCTTGAGGGTTCGTGGGGGCTG check-cg3349-54-s: AAAGGCTCCATGAATTCCTCACGGAGGATCTC check-cg3349-54-as: ACATCACAAGTAGAAACCCGCATTTTCTGTAGTTTTTAC univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG Veränderung der regulatorischen Bindestelle im Promotorbereich der Citratsynthase CS durch Nukleotidsubstitutionen zur Integration in das Genom coryneformer Bakterienzellen
Klonierung pK19mobsacB-540-del und pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7
Zur Konstruktion des Plasmids pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 (Figur 2b) wurde zunächst das Plasmid pK19mobsacB-540-del (Figur 2a) konstruiert. Hier wurden die flankierenden Bereiche so gewählt, dass ein 540 Basenpaar großes chromosomales Fragment, welches die native g/tA Promotorregion mit den zwei Transkriptionsstart- und Operatorsequenzen trägt, deletiert werden kann. Zwischen die beiden Flanken up und down wurde ein 20 Basenpaar großer Linker eingefügt, der über die Schnittstellen Nsil und Xhol verfügt. Über diese Schnittstellen wurde anschließend die C7-Variante des dapA-Promotors subkloniert.
Für die Klonierung von pK19mobsacB-540-del wurde das stromaufwärts gelegenen Fragment up mit dem Primerpaar PgltA-up-s / PgltA-up-as amplifiziert, die stromabwärts gelegene Flanke wurde mit dem Primerpaar PgltA-down-s / PgltA-down-as amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der inneren Primer (PgltA-up-as / PgltA-down-s) wurden dabei so gewählt, dass die beiden amplifizierten Fragmente up und down zueinander komplementäre Überhänge enthalten (inklusive des beschriebenen NsiI/Xhol-Linkers. In einer zweiten PCR (ohne Zugabe von DNA-Primern) lagern sich die gereinigten Fragmente über die komplementären Sequenzen an und dienen sich gegenseitig sowohl als Primer als auch als Matrize (overlap-extension PCR). Das so generierte A540-fragment wurde in einer finalen PCR mit den beiden äußeren (dem Gen abgewandten) Primern aus der ersten PCR amplifiziert (PgltA-up-s / PgltA-down-as). Nach elektrophoretischer Trennung auf einem 1 % TAE-Agarosegel wurde das finale Mutationsfragment mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll aus dem Gel isoliert. Für die Konstruktion von pK19mobsacB-540-del wurden sowohl das generierte A540-Fragment als auch der pK19mobsacB-Leervektor mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Xba\ und Smal verdaut. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit. (Thermo Fisher Scientific) wurde das Deletionsfragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung von pK19mobsacB-540-del in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung von pK19mobsacB-540-del hindeutet, wurden über Nacht . in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Für die Konstruktion von pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 wurde die C7-Variante des dapA-Promotors mit dem Primerpaar PdapA-s / PdapA-as amplifiziert und auf die erwartete Basenpaargröße mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel überprüft. Das generierte Fragment wurde mit dem NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach dem beiliegenden Protokoll gereinigt. Für die Konstruktion von pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 wurden sowohl das generierte PdapA-Fragment als auch der Zielvektor pK19mobsacB-540-del mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Xhol und Nsi\ verdaut. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurde das PdapA-Fragment in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pK19mobsacB-540-del eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycip (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung von pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie- PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar univ / rsp verwendet, welches spezifisch an das pK19mobsacB-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung von pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kft. (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Ein Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen wurde mit dem beschriebenen Protokoll mit pK19mobsacB-PgltA::PdapA-C7 transformiert und auf BHIS-Kan15-Platten ausgestrichen. Da das pK19mobsacB-Plasmid in C. glutamicum nicht replizieren kann, konnte bei der anschließenden Selektion der vermittelten Kanamycin-Resistenz davon ausgegangen werden, dass diese nur ausgebildet wird, falls das Mutationsplasmid erfolgreich über die homologen Sequenzen in das Genom von C. glutamicum integriert werden konnte. Die erhaltenen Integranten wurden in einer ersten Selektionsrunde auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI 10 % Saccharose (w/v)-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Genomintegration des Mutationsplasmides wird neben der Kanamycin-Resistenz die von sacB codierte Levan-Sucrase gebildet. Dieses Enzym katalysiert die Polymerisierung von Saccharose zum toxischen Levan, sodass es zu einer induzierten Letalität bei Wachstum auf Saccharose kommt (Bramucci & Nagarajan, 1996). Demnach sind Kolonien, die das Mutationsplasmid über homologe Rekombination in ihr Genom integriert haben, resistent gegenüber Kanamycin und sensitiv gegenüber Saccharose.
Die Exzision von pK19mobsacB fand in einem zweiten Rekombinationsereignis über die nun doppelt vorliegenden DNA-Bereiche statt, bei dem das zu mutierende Codon aus dem Chromosom letztendlich gegen das eingebrachte Mutationsfragment ausgetauscht wurde. Dazu wurden Zellen, die den beschriebenen Phänotyp (kanamycinresistent, saccharosesensitiv) zeigten, in einem Reagenzglas mit 3 ml BHI-Medium (ohne Zugabe von Kanamycin) für 3 Stunden bei 30 °C und 170 RPM inkubiert. Im Anschluss wurden je 100 μl einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Kan25-Platten sowie BHI-10 % Saccharose (w/v)-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden 50 der auf der BHI 10 % Saccharose (wZv)-Platte gewachsenen Klone ausgewählt und zur Überprüfung der erfolgreichen Exzision von pK19mobsacB auf BHI-Kan25 sowie BHI 10 % Saccharose (w /v) ausgestrichen und über Nacht bei 30 °C inkubiert. Sollte das Plasmid vollständig entfernt worden sein, so zeigt sich dies in einer Sensitivität gegenüber Kanamycin und einer Resistenz gegenüber Saccharose des jeweiligen Klons. Das zweite Rekombinationsereignis (Exzision) kann neben der gewünschten Mutation auch zur Wiederherstellung der Wildtyp-Situation führen. Für den Nachweis des erfolgreichen Austausches in den erhaltenen Klonen nach Exzision wurde der entsprechende genomische Bereich per Kolonie-PCR amplifiziert (Primerpaar chk-PgltA-s / chk-PgltA-as) und auf die erwartete Fragmentgröße mittels Gelektrophorese überprüft. PCR-Produkte, die einen Promotor-Austausch anzeigen, wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt und zur Verifikation des Austausches mit den Primern chk- PgltA-s und chk-PgltA-as sequenziert.
Die erfindungsgemäße Promotorregion PgltA::PdapA-C7 weist neben dem Austausch der Promotorregion von gtlA gegen dapA zusätzlich Nukleotidsubstitutionen an Position 70 (a->t) und 71 (g->a) vor dem Startcodon ATG auf (Figur 2c Sequenzvergleich Promotorregion).
Verwendete Primer
PgltA-up-s: TGCTCTAGAGCATGAACTGGGACTTGAAG
PgltA-up-as: TATGCATGTTTCTCGAGTGGGCCGAACAAATATGTTTGAAAGG
PgltA-down-s: CCCACTCGAGAAACATGCATAGCGTTTTCAATAGTTCGGTGTC
PgltA-down-as: CCCCCCGGGGGGCCTAGGGAAAGGATGATCTCGTAGCC
PdapA-s: CCAATGCATTGGTTCTGCAGTTATCACACCCAAGAGCTAAAAAT
TCA
PdapA-as: CCGCTCGAGCGGCTCCGGTCTTAGCTGTTAAACCT chk-PgltA-s: ATGAGTCCGAAGGTTGCTGCAT chk-PgltA-as: TCGAGTGGGTTCAGCTGGTCC univ: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC rsp: CACAGGAAACAGCTATGACCATG
Veränderung der regulatorischen Bindestelle im Promotorbereich des /Wyo-Inositol- Trans porters lolT1 durch Nukleotidsubstitutionen in C. qlutamicum
Konstruktion des Vektors pM mobsacB PoeiolTI C. glutamicum ATCC13032 Poe iolT1 wurden nach Niebisch und Bott (2001) (https://doi.org/10.1007/s002030100262) mit dem Vektor pK19mobsacB über doppelt homologe Rekombination (Schäfer et al., 1994) (https.//doi.orq/10.1016/0378-1119(94)90324-7) konstruiert. Dazu wurden in einem ersten Schritt zwei PCR-Produkte generiert, die die 5’- Region vor dem iolT1 -Gens (Primer: PromiolT1_fw_fw / PromiolT1fw_rev) mit den zwei auszutauschenden Nucleotiden bzw. die 3’-Region des Gens (Primer: Piolt1_rev_fw / Piolt1_rev_rev) enthielten. Für die spätere homologe Rekombination wurden jeweils 500 Basenpaare der flankierenden Regionen amplifiziert. Im zweiten Schritt wurden die DNA-Fragmente zusammen mit dem bereits über die Restriktionsendonucleasen Xbal und EcoRI geschnittenen p19mobsacB- Vektor mittels Gibson Assembly fusioniert (Gibson et al., 2009) (https://doi.org/10.1038/NMETH.1318). Dieses so erhaltene Plasmid pK19mobsacB_PoeiolT1 (Fig. 3) wurde mittels Hitzeschock in E. coli DH5a transformiert. Durch das auf dem Plasmid vorliegenden Kanamycinresistenzgen, konnten nur solche Klone wachsen, die das Plasmid aufgenommen hatten. Diese wurden mittels Kolonie-PCR und anschließender Gelelektrophorese auf Vorhandensein des klonierten Inserts überprüft, und dessen DNA-Sequenz bestimmt. Nach Isolierung des Plasmids wurde ein 150 pL Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum Zellen auf Eis aufgetaut, dieses mit 1-4,5 pg des Plasmids vermischt und in eine auf Eis vorgekühlte 0,2 cm Elektroporationsküvette überführt. Die Mixtur wurde mit 800 pL, 4 °C kaltem, 10 %igem Glycerin (v/v) überschichtet und im Elektroporator (2500 V, 25 pF, 200 Ω, 2 mm elektroporiert. Nach der Elektroporation wurde die Mixtur in 4 mL, auf 46 °C vorgewärmtem, BHIS Medium überführt und für 6 min bei 46 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für zwei Stunden bei 30 °C mit 170 Upm inkubiert und die Suspension auf BHIS-Kan15-Agar ausplattiert. Anschließend wurde die Funktion des sacB-Gens getestet, indem die Klone auf BHI-Kan25-Agar und auf BHI-Kan25-Agar mit 10%- Saccharose übertragen wurden. Zur Selektion auf erfolgreiche Exzision bei einem zweiten Rekombinationsereignis, wurden die auf BHI-Kan25 kultivierten Zellen für ca. 5 h in 5 ml BHI-Medium kultiviert und 100 pl der Kultur und einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Agar mit 10 % Saccharose ausplattiert. Die Klone wurden auf BHI-Kan25-Agar und BHI-Agar mit 10 % Saccharose übertragen. Von den Saccharoseresistenten und Kanamycin-sensitiven Klonen wurde eine Kolonie-PCR (Primer: checkPromiolTlfw/ checkPromiolTlrev) mit anschließender DNA-Sequenzierung durchgeführt, um die erfolgreiche Nukelotidsubstitutionen zu bestätigen.
Verwendete Primer:
PromiolT1_fw_fw : TGCATGCCTGCAGGTCGACTGAAAAATTGATCAGCAAACACC PromiolTI fw_rev: GGCAGACACGATATCCCCCGTCAATCGTACATAGGGAA Piolt1_rev_fw: CGGGGGATATCGTGTCTGCCACGATTAAAG piolt1_rev_rev: TTGTAAAACGACGGCCAGTGGAGTCCAAGAAGCACACG checkPromiolTlfw: TACGAATGCCCACTTCGCACCCTT checkPromiolTI rev: CAACTCATTACGGCCAGCCAGTGAGC
Konstruktion des Expressionsplasmids pMKEX2 aroF* qsuB
Zur Konstruktion des Plasmides pMKEX2_aroF*_qsuB (Figur 4) für die Expression der Gene aroF* aus Escherichia coli und qsuB aus C. glutamicum wurden die beiden Gene als für C. glutamicum codon-optimierte Genvarianten von GeneArt Gene Synthesis (Thermo Fisher Scientific) chemisch als String DNA Fragment synthetisiert und als DNA-Template für die Amplifikation per PCR verwendet. Die Gene aroF* und qsuB wurden per PCR mit dem Primerpaar aroF*-s / aroF*-as bzw. qsuB-s / qsuB-as, welches spezifisch für das jeweilige Gen ist, amplifiziert. Die Überprüfung der generierten DNA-Fragmente auf die erwartete Basenpaargröße wurde mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Für die Konstruktion des Plasmides pMKEX2_aroF_qsuB wurde das Plasmid pMKEx2 mit den FastDigest-Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme Nco\ und BamHI linearisiert. Die mit den gegebenen Primerpaaren amplifizierten Gene aroF* und qsuB wurden mit den Restriktionsenzymen Nco\ und Kpn\ bzw. Kpn\ und BamHI hydrolysiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente wurden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wurden die beiden Inserts aroF* und qsuB in einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pMKEx2 eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente wurden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock wurden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen worden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert worden sind. Im Anschluss wurden 100 pL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (50 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der eingesetzten Fragmente in den gewachsenen Transformanden wurde mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wurde der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wurde und für die DNA-Polymerase zugänglich war. Als DNA-Primer für die Kolonie-PCR wurde das Primerpaar chk_pMKEx2_s / chk_pMKEx2_as verwendet, welches spezifisch an das pMKEx2-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wurde. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Plasmides pMKEX2_aroF*_qsuB hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Kanamycin (50 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide wurden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert.
Verwendete PrimeraroF*-s
TTCGCTCTTCAAAGCTGCTTAAGGAGGCTATCTATGACCGATGA ACAGGTGCTGATGACCCCAG aroF*-as TACGCTCTTCTGATTTATGCCACGCGTGCGGTCAGCTG qsuB-s TTCGCTCTTCAATCTCTATCAAGGAGGATCGGCATGCGTACATC
CATTGCCACTGTTTGTTTGTC qsuB-as TACGCTCTTCTTCGTTAGTTTGGGATTCCCCGCTCGAGGTC chk_pMKEx2-s: CCCTCAAGACCCGTTTAGAGGC chk_pMKEx2-as: TTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGC
Konstruktion des Expressionsplasmids pEKEX3 tkt
Zur Konstruktion des Plasmides pEKEx3- tkt (Figur 5) für die Expression des tkt Gens aus C. glutamicum wurde das Gen per PCR amplifiziert. Für die tkt-Amplifikation per PCR wird genomische DNA von C. glutamicum isoliert und mit dem Primerpaar tkt’-s / ‘tkt-as spezifisch amplifiziert. Die Überprüfung des generierten DNA-Fragmentes auf die erwartete Basenpaargröße wird mittels gelelektrophoretischer Analyse auf einem 1 % Agarosegel durchgeführt. Für die Konstruktion des Plasmides pEKEx3-tkt wird das Plasmid pEKEx3 mit den FastDigest- Varianten (Thermo Fisher Scientific) der Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI linearisiert. Das amplifizierte tkt-Gen wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI hydrolysiert. Die Restriktionsansätze der genannten Fragmente werden mit dem NucleoSpin Gel and PCR Clean-up-Kit (Macherey-Nagel, Düren) gereinigt. Für die Ligation der hydrolysierten DNA-Fragmente mittels Rapid DNA Ligation-Kit (Thermo Fisher Scientific) wird das tkt-insert einem dreifachen molaren Überschuss gegenüber dem linearisierten Vektorrückgrat pEKEx3 eingesetzt. Nach erfolgter Ligation der Fragmente werden das gesamte Ansatzvolumen für die Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen mittels Hitzeschock bei 42 °C für 90 Sekunden verwendet. Im Anschluss an den Hitzeschock werden die Zellen 90 Sekunden auf Eis regeneriert bevor diese mit 800 pL LB-Medium versehen werden und bei 37 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) bei 900 RPM für 60 Minuten regeneriert werden. Im Anschluss wurden 100 μL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit Spectinomycin (100 pg/ml) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die korrekte Assemblierung der eingesetzten Fragmente in den gewachsenen Transformanden wird mittels Kolonie-PCR überprüft. Hierfür wird der 2x DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) verwendet. Die DNA-Matrize wurde dem PCR-Ansatz hierbei durch das Hinzufügen von Zellen der gewachsenen Kolonien beigesetzt. Durch den initialen Denaturierungsschritt des PCR-Protokolls bei 95 °C für 3 Minuten werden die Zellen lysiert, sodass die DNA-Matrize freigesetzt wird und für die DNA-Polymerase zugänglich ist. Als DNA-Primer für die Kolonie- PCR wird das Primerpaar chk_pEKEx3_s / chk_pEKEx3_as verwendet, welches spezifisch an das pEKEx3-Vektorrückgrat bindet und im Falle einer korrekten Ligation der eingesetzten Fragmente ein PCR-Produkt spezifischer Größe bildet, welches per Gelelektrophorese überprüft wird. Klone, deren PCR-Produkt auf eine korrekte Assemblierung des Plasmides pEKEx3-tkt hindeutet, wurden über Nacht in LB-Medium mit Spectinomycin (100 pg/mL) für die Isolierung der Plasmide angezogen. Die Plasmide werden anschließend mit dem NucleoSpin Plasmid (NoLid)-Kit (Macherey-Nagel, Düren) isoliert und mit den genannten Amplifizierungs-und Kolonie-PCR-Primern sequenziert. Das Plasmid ist in Figur 5 dargestellt.
Verwendete Primer: tkt'-s: CATGGATCCAAGGAGGTTCAGCATGACCACCTTGACGCTGTC
ACCTGAACTTCAG
‘tkt-as: TCTGAATTCTTAACCGTTAATGGAGTCCTTGGCCGCTGCCAC chk_pEKEx3_s: GCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATC chk_pEKEx3_as: CGTTCTGATTTAATCTGTATCAGGCTGAAAATCTTCTC
Deletion der Pyruvat-Kinase (PK) in Corynebacterium glutamicum
C. glutamicum DelAro5-C7 PO6iolT1 Δpyk wurde nach Niebisch und Bott (2001) mit dem Vektor pK19mobsacB (Schäfer et al., 1994) konstruiert. Im ersten Schritt wurden zwei PCR-Produkte generiert, die die 5’- Region vor dem pyk-Gen mit den zwei deletierten Nucleotiden (Primer K0115_p9 und K0115_p2) bzw. die 3’-Region des Gens (Primer K0115_p3 und K0115_p4) enthielten. Dabei wurden für die spätere homologe Rekombination jeweils 500 Basenpaare der flankierenden Regionen amplifiziert. Zusätzlich enthielten die jeweiligen Primer Homologien zu den weiteren PCR-Produkten. Im zweiten Schritt wurden die DNA-Fragmente zusammen mit dem bereits zuvor verdauten pk19mobsacB-Vektor blunt-end kloniert. Dieses so erhaltene Plasmid pK19mobsacB_ pyk (Fig. 6) wurde mittels Hitzeschock in E. coli DH5a transformiert. Durch das auf dem Plasmid vorliegende Kanamycinresistenz-Gen, konnten nur solche Klone wachsen, die das Plasmid aufgenommen hatten. Diese wurden mittels Kolonie-PCR und anschließender Gelelektrophorese auf Vorhandensein des Monierten Inserts überprüft, und dessen Sequenz sequenziert (Primer dpyk_proof_fwd und dpyk_proof_rev). Nach Isolierung des Plasmids wurde ein 150 pL Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum Zellen auf Eis aufgetaut, dieses mit 1-4,5 pg des Plasmids vermischt und in eine auf Eis vorgekühlte 0,2 cm Elektroporationsküvetten überführt. Die Mixtur wurde mit 800 pL, 4 °C kaltem, 10 %igem Glycerin (v/v) überschichtet und im Elektroporator (2500 V, 25 pF, 200 Ω, 2 mm) elektroporiert. Nach der Elektroporation wurde die Mixtur in 4 mL, auf 46 °C vorgewärmtem, BHIS Medium überführt und für 6 min bei 46 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für zwei Stunden bei 30 °C mit 170 Upm inkubiert. Die Suspension wurde anschließend auf BHIS-Kan15-Agar ausplattiert. Anschließend wurde die Funktion des sacB-Gens getestet, indem die Klone auf BHI-Kan25-Agar und auf BHI-Kan25-Agar mit 10%- Saccharose übertragen wurden. Zur Selektion auf ein zweites Rekombinationsereignis, die Exzision, bei der das Plasmid aus dem Genom entfernt werden sollte, wurden die auf BHI-Kan25 gewachsenen Klone für ca. 5 h in 5 ml BHI-Medium kultiviert und 100 pl der Kultur und einer 1 :10-Verdünnung auf BHI-Agar mit 10% Saccharose ausplattiert. Die gewachsenen Klone wurden auf BHI-Kan25-Agar und BHI-Agar mit 10% Saccharose übertragen. Von den Saccharose-resistenten und Kanamycin-sensitiven Klonen wurde eine Kolonie-PCR mit anschließender Sequenzierung durchgeführt, um die erfolgreiche Deletion zu überprüfen.
K0115_p9 CGACGCGAAGGCTAACTGCATCCATG
K0115_p2 AGACGGCATGGATTCACGTCCACCTTCTTG
K0115_p3 ACGTGAATCCATGCCGTCTTCTACCAAAC
K0115_p4 GGCATCCGAATCAACACCATC dpyk_proof_fwd GAAGAGTAGTAACTAGTCATAC dpyk_proof_rev ACAAATGCGCGTTGATGAAGC Plasmid-basierte Expression der Xylose-Isomerase (XylA) und Xylulose-Kinase (XylB) in C. qlutamicum
Im ersten Schritt wurde die genomische DNA von C. glutamicum als PCR-Vorlage für die Amplifikation von xylB durch Lösen von Zellen in 50 pL 2 %igem DMSO und anschließendem erhitzen auf 95 °C für 5 min gewonnen. Die Zellsuspension wurde für
1 min bei 11.000 Upm zentrifugiert und 3 pL des Überstandes als Template zur Amplifikation von xylB (Primer xylB_fw_Cgl und xylB_rv_Cgl) verwendet. Für die Amplifikation von xylA wurde genomische DNA aus Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913 als Vorlage in die PCR-Reaktion eingesetzt und die Primer xylA_fw_Xcc xylA_rv_Xcc verwendet. Die Amplifikate wurde zusammen mit dem bereits zuvor geschnittenen pEKEx3 Vektor mittels Restriktionsklonierung ligiert (pEKEx3_xylA-xylB; Fig. 7). Dieses so erhaltene Plasmid wurde mittels Hitzeschock in E. coli DH5a transformiert. Durch das auf dem Plasmid vorliegenden Spectinomycinresistenzgen, konnten nur solche Klone wachsen, die das Plasmid aufgenommen hatten. Diese wurden mittels Kolonie-PCR und anschließender Gelelektrophorese auf Vorhandensein des Monierten Inserts überprüft, und dessen Sequenz sequenziert (Primer: pEKEx-for2 und pEKEx-rv2). Nach Isolierung des Plasmids wurde ein 150 pL Aliquot elektrokompetenter C. glutamicum Zellen auf Eis aufgetaut, dieses mit 1-4,5 pg des Plasmids vermischt und in eine auf Eis vorgekühlte 0,2 cm Elektroporationsküvetten überführt. Die Mixtur wurde mit 800 pL, 4 °C kaltem, 10 %igem Glycerin (v/v) überschichtet und im Elektroporator (2500 V, 25 pF, 200 Ω,
2 mm) elektroporiert. Nach der Elektroporation wurde die Mixtur in 4 mL, auf 46 °C vorgewärmtem, BHIS Medium überführt und für 6 min bei 46 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für zwei Stunden bei 30 °C mit 170 Upm inkubiert. Die Suspension wurde anschließend auf BHI-Spc100-Agar ausplattiert. xylB_fw_Cgl GAGAAAGGAGGCCCTTCAGATGGCTTTGGTTCTTGGAATCG xylB_rv_Cgl GATCTAGACTAGTACCAACCCTGCGTTG xylA_fw_Xcc
GATCTAGAGAAAGGAGGCCCTTCAGATGAGCAACACCGTTTTCATCG xylA_rv_Xcc GAGAGCTCTCAACGCGTCAGGTACTGATT pEKEx-for2 CGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGC pEKEx-rv2 GATATGACCATGATTACGCCAAGC Medium und Kultivierunqsbedinqunqen
Alle Stämme wurden aerob bei 30°C in BHI-Medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) oder definiertem CGXII-Medium mit 4% D-Glucose als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert (Keilhauer et al., 1993). C. glutamicum wurde für 6 - 8 h in 100 mL Schüttelkolben mit 15 mL BHI-Medium auf einem Rotationsschüttler bei 250 U min-1 kultiviert (erste Vorkultur) und anschließend in 50 mL definiertes CGXII-Medium mit 4% D-Glucose in 500 mL Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft (zweite Vorkultur). Die Zellsuspensionen wurden über Nacht auf einem Rotationsschüttler bei 250 U min-1 kultiviert. Das mikrobielle Wachstum während der Kultivierungen wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD6oo) verfolgt. Die Hauptkultur wurde mit 4% (222 mM) D-Glukose oder 4% (266 mM) D-Xylose in definiertem CGXII-Medium auf eine ODeoo von 5.0 inokuliert. Die heterologe Genexpression wurde direkt nach der Inokulation mit 1 mM IPTG induziert.
Die während der Kultivierung gezogenen zellhaltigen Proben wurden anschließend zentrifugiert (10.000 x g, 4°C, 10 min) und die resultierenden Überstände hinsichtlich der Konzentrationen an D-Glucose, D-Xylose und PCA analysiert. Die entsprechende HPLC-Analytik wurde auf einem Agilent 1200-System (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) unter Verwendung einer CS Organic Acid Resin (CS Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Deutschland) durchgeführt. Die Trennung erfolgte isokratisch bei 55°C mit 0.1 M H2SO4 als mobiler Phase und einer Flussrate von 0.6 ml min-1. D-Glucose und D-Xylose wurden mittels Rl-Detektor nachgewiesen. PCA wurde mittels UV-Detektor bei einer Absorption von 254 nm erfasst. Die Quantifizierungen erfolgten mittels externer Kalibrationen in geeigneten Standardlösungen.
3,4 Dihydroxybenzoat (PCA)-Bildunq im Wirtssvstem erfindunqsqemäß modifizierter coryneformer Bakterienzellen
Die nachfolgenden C. glutamicum-Stämme wurden konstruiert und hinsichtlich ihrer Wachstums- und PCA-Produktionsleistung vergleichend untersucht:
DelAro5-C7 PO6-iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PCAGLC;
Figure imgf000045_0001
)
DelAro5-C7 PO6-iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_tkt (PCAGLC Δpyk;
Figure imgf000045_0002
)
DelAro5-C7 PO6-iolT1 pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B (PCAXYLJ -
Figure imgf000045_0003
DelAro5-C7 PO6-iolT1 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xylA_xylB (PCAXYL Δpyk;
Figure imgf000045_0004
Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B ( ) DelAro5 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B
Figure imgf000046_0001
Die nachfolgenden Ausführungen zeigen eindeutig, dass die erfindungsgemäße Expression der Gene xylA und xylB zur Nutzung von D-Xylose als Kohlenstoff- und Energiequelle in Kombination mit der Inaktivierung der Pyruvatkinase zu einer erhöhten Bildung von PCA führen (Figuren 8 und 9).
Wie Figur 8 zu entnehmen ist, zeigen die beiden Stämme PCAGLC und PCAGLC Δpyk mit 0.21 h-1 bzw. 0.20 h-1 ein vergleichbares Wachstum auf D-Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Substrataufnahmerate ist mit 15.6 C-mmolGLc gCDW -1 h-1 bzw. 17.4 C-mmolGLC gCDW -1 h-1 ebenfalls vergleichbar. Hingegen zeigt der Stamm PCAGLC Δpyk mit Deletion des Gens für die Pyruvatkinase mit 1.22 C-mmolpcA gCDW -1 h-1 eine stark erhöhte PCA-Bildungsrate im Vergleich zum Vorläuferstamm mit 0.78 C-mmolpcA gCDW -1 h-1. Der Stamm PCAXYL weist mit 0.11 h-1 eine niedrigere Wachstumsrate wie die D-Glucose-basierten Stämme auf. Die Substrataufnahme ist mit 13.0 C-mmolxYL gCDW -1 h-1 vergleichsweise hoch und die Produktbildungsrate mit 1.43 C-mmolpcA gCDW -1 h-1 auf einem deutlich höherem Niveau als die D-Glucose-basierten Stämme. Der Stamm PCAXYL Δpyk zeigt hingegen mit 0.04 h-1 und 6.5 C-mmolxYL gCDW -1 h-1 eine stark verminderte Wachstums- und Substrataufnahmerate. Demgegenüber bleibt die PCA-Bildungsrate mit 1 .47 C-mmolpcA gCDW -1 h-1 auf dem höchsten Niveau erhalten. Insgesamt wird dadurch in diesem Stamm der aufgenommene Kohlenstoff in Form von D-Xylose zu einem Großteil in das Produkt PCA umgewandelt, wodurch sich der Produktertrag (Yield) signifikant erhöht.
Die resultierenden C-molaren Yields unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Substrate ergeben sich damit für die Stämme PCAGLC, PCAGLC Δpyk, PCAXYL und PCAXYL Δpykzu 0.02, 0.04, 0.06 und 0.33 C-mol Produkt pro C-mol Substrat.
Figur 9 zeigt die maximalen PCA-Titer nach 98 h Kultivierungszeit. Der Stamm PCAGLC weist einen maximalen PCA-Titer von 3.5 ± 1.2 mM auf. Der Stamm PCAGLC Δpyk mit Deletion des Gens für die Pyruvatkinase zeigt einen signifikant erhöhten PCA-Titer von 7.8 ± 1.6 mM. Der Stamm PCAXYL weist einen noch höheren PCA-Titer von 12.0 ± 1.1 mM auf. Der Stamm PCAXYL Δpyk mit zusätzlicher Deletion des Gens für die Pyruvatkinase zeigt den mit Abstand höchsten PCA-Titer von 62.1 ± 12.1 mM.
Figur 10 ist zu entnehmen, dass der Vorläuferstamm Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B mit intaktem Katabolismus aromatischer Verbindungen nicht in der Lage ist, PCA zu akkumulieren. Hingegen zeigt der Stamm DelAro5 Δpyk pMKEx2_aroF*_qsuB pEKEx3_xy/A_xy/B mit entsprechender Inaktivierung des Katabolismus aromatischer Verbindungen bereits eine moderate PCA-Akkumulation mit einem finalen Titer von 26.6 mM. Dieser Effekt ist eindeutig auf die erfindungsgemäße Deletion des Gens für die Pyruvatkinase Δpyk zurückzuführen. Der erfindungsgemäße Stamm PCAXYL Δpyk mit erfindungsgemäß zusätzlicher Deletion des Gens für die Pyruvatkinase, einem inaktiven Katabolismus sowie zusätzlich einer erfindungsgemäß erhöhten Aktivität von XylA und XylB zeigt den mit Abstand höchsten PCA-Titer von 62.1 ± 12.1 mM.
Stamm Referenz
Figure imgf000048_0001
Ersatzblatt] Tabelle 2:
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Ersatzblatt
Figure imgf000051_0001
Ersatzblatt SEQ
Figure imgf000052_0001

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure, enthaltend die Schritte: a) Bereitstellen einer Lösung enthaltend wenigstens Wasser, Stickstoff, Mineralsalze und eine C5-Kohlenstoff-Quelle, b) mikrobielle Umsetzung der C5-Kohlenstoffquelle in einer Lösung gemäß Schritt a) zu 3,4-Dihydroxybenzoesäure in Anwesenheit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle, deren Pyruvat-Kinase-Aktivität (PK) teilweise oder komplett inaktiviert ist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett deletiert ist, c) optionale Isolierung und/oder Aufbereitung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus der Lösung. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, die eine gesteigerte Xylose-Isomerase- und Xylulose-Kinase-Aktivität (XylA, XylB) aufweist oder deren Gene kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) überexprimiert sind. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, deren kataboler Stoffwechsel für aromatische Verbindungen inaktiviert ist und die zusätzlich eine erhöhte Aktivität einer DAHP-Synthase (AroF) und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) oder deren Gene kodierend für Enzyme des katabolen Stoffwechsels aromatischer Verbindungen (DelAro5) deletiert sind und eine Überexpression der Gene kodierend für eine DAHP-Synthase (aroF) und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB) aufweist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, die zusätzlich ein Phosphotransferase-(PTS)- unabhängiges Kohlenstofftransportersystem aufweist, bevorzugt einen myo-lnositol/Proton-Symporter iolT1 , besonders bevorzugt eine lolR-dereprimierten myo-lnositol/Proton-Symporter P6-iolT 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle eingesetzt wird, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend
Ersatzblatt Corynebacterium und Brevibacterium, bevorzugt Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium divaricatum.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrobielle Umsetzung in einer Lösung ausgehend von einer C5-Kohlenstoff-Quelle erfolgt ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: a) Oligosaccharide oder Polysaccharide, enthaltend D-Xylose-Einheiten b) D-Xylose, c) Lignocellulose-, Cellulose-, oder Hemicellulose-haltige Biomasse, deren Hydrolysat oder daraus gewonnener Extrakt enthaltend D-Xylose-Einheiten, d) eine Kombination von a) bis c).
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 6, bei dem als C5-Kohlenstoffquelle Sulfitablauge, Maisstroh, Reisstroh oder Bagasse, oder deren Hydrolysate oder daraus gewonnene Extrakte enthaltend D-Xylose-Einheiten eingesetzt wird.
8. Modifizierte coryneforme Bakterienzelle, die eine teilweise oder komplett inaktivierte Pyruvat-Kinase-Aktivität und eine gesteigerte Xylose-Isomerase- und Xylulose-Kinase-Aktivität aufweist oder deren Gen kodierend für die Pyruvat-Kinase (pyk) teilweise oder komplett deletiert ist und deren Gene kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) und Xylulose-Kinase (xylB) überexprimiert sind.
9. Modifizierte coryneforme Bakterienzelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie d) eine teilweise oder komplette Inaktivierung der Pyruvat-Kinase (PK) mit einer Aminosäuresequenz von wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder Fragmente davon aufweist, e) eine Xylose-Isomerase-Aktivität (XylA) mit einer Aminosäuresequenz von wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder Fragmente davon aufweist, f) eine gesteigerte Aktivität einer Xylose-Isomerase-Aktivität (XylB) mit einer Aminosäuresequenz von wenigstens 70% Identität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder Fragmente davon aufweist. Modifizierte coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie a) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylose-Isomerase (xylA) mit wenigstens 70% Identität zu SEQ ID NO. 5 oder Fragmente oder Allele davon aufweist, und b) eine gesteigerte Expression einer Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Xylulose-Kinase (xylB) mit wenigstens 70% Identität zu SEQ ID NO. 6 oder Fragmente oder Allele davon aufweist, und c) eine teilweise oder komplette Deletion der Nukleinsäuresequenz kodierend für die Pyruvat-Kinase gemäß SEQ ID NO. 4 oder Fragmente oder Allele davon aufweist. Modifizierte coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 8 - 10, deren Enzyme für den Katabolismus aromatischer Verbindungen inaktiv sind und die zusätzlich eine erhöhte Aktivität einer DAHP-Synthase (AroF), bevorzugt feedback deregulierten DAHP-Synthase (AroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (QsuB) aufweist oder deren Gene kodierend für Enzyme des Katabolismus aromatischer Verbindungen deletiert sind und die eine Überexpression der Gene kodierend für DAHP-Synthase (AroF), bevorzugt feedback deregulierten DAHP-Synthase (AroF*), und einer 3-Dehydroshikimate Dehydrogenase (qsuB) aufweist. Modifizierte coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 8 - 11 , die zusätzlich ein Phosphotransferase-(PTS)-unabhängiges Kohlenstofftransportersystem aufweist, bevorzugt einen myo-lnositol/Proton-Symporter iolT1 , besonders bevorzugt eine lolR-dereprimierten myo-lnositol/Proton-Symporter Pe-iolTI . Modifizierte coryneforme Bakterienzelle nach einem der Ansprüche 8 - 12, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Corynebacterium und Brevibacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetogiutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium divaricatum. Modifizierte coryneforme Bakterienzelle gemäß einem der Ansprüche 8 - 13 zur Herstellung von 3.4-Dihydroxybenzoesäure aus einer C5-Kohlenstoffquelle. Verfahren nach Anspruch 1 bei dem eine modifizierte coryneforme Bakterienzelle nach
Ersatzblatt einem der Ansprüche 8 - 14 eingesetzt wird.
16. Verwendung einer modifizierten corynformen Bakterienzelle gemäß einem der Ansprüche 8 - 14 zur mikrobiellen Herstellung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure aus D-Xylose oder D-Xylose-haltigen Extrakten oder Hydrolysaten nachhaltiger Rohstoffe. 17. Zusammensetzung enthaltend 3,4-Dihydroxybenzoesäure herstellt mit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle gemäß einem der Ansprüche 8 - 14 oder einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7.
18. Verwendung von 3,4-Dihydroxybenzoesäure hergestellt mit einer modifizierten coryneformen Bakterienzelle gemäß einem der Ansprüche 8 - 14 oder nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 - 7, oder die Verwendung einer
Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Herstellung von Plastik, Plastikfasern, Pharmazeutika, Kosmetika, Lebensmitteln und/oder Futtermitteln.
Ersatzblatt
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