CN106687579A

CN106687579A - 产生二胺的微生物和使用该微生物产生二胺的方法

Info

Publication number: CN106687579A
Application number: CN201580034464.7A
Authority: CN
Inventors: 李京珉; 朴寿真; 郑熙景; 梁荣烈; 李红仙; 严惠媛
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: AU2015250513A1; EP3135757B1; AU2018202389B2; US10626425B2; JP6526790B2; US20170044581A1; AU2018202396B2; AU2015250513B2; US10633679B2; TW201546278A; KR101732788B1; RU2016142706A3; EP3135757A4; MY178471A; AU2018202389A1; PL3135757T3; DK3135757T3; WO2015163591A1; RU2672323C2; KR20150124384A

Abstract

本发明涉及具有产生二胺能力的微生物，和使用该微生物产生二胺的方法，所述微生物具有包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或具有与其55％或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的引入的或增强的活性。

Description

产生二胺的微生物和使用该微生物产生二胺的方法

技术领域

本公开涉及用于产生二胺的微生物和使用该微生物产生二胺的方法。

背景技术

生物胺类(BAs)为含氮化合物，其主要通过氨基酸的脱羧基作用或通过醛和酮的胺化作用和转氨基作用而产生。这些生物胺类为低分子量化合物且在微生物、植物和动物的代谢中合成，且因此生物胺类被称作频繁发现于这些细胞中的组分。特别地，生物胺类为多胺，诸如精脒、精胺、腐胺或1,4-丁二胺和尸胺。

一般而言，腐胺为用于产生多胺尼龙-4,6的重要原料，多胺尼龙-4,6通过使腐胺与己二酸反应而产生。腐胺通常通过涉及将丙烯转化为丙烯腈和丁二腈的化学合成而产生。

作为使用微生物的腐胺的生产方法，已报导通过大肠杆菌(E.coli)和棒状杆菌(Corynebacterium)的转化来产生高浓度的腐胺的方法(国际专利公开第WO06/005603号；国际专利公开第WO09/125924号；Qian ZD等人，Biotechnol.Bioeng.104：4,651-662,2009；Schneider等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.88：4,859-868,2010；Schneider等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.95,169-178.,2012)。此外，已经积极地对大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞中的腐胺运载体进行了研究(K Igarashi,Plant Physiol.Biochem.48：506-512,2010)。

同时，尸胺为动物组织腐败期间通过蛋白质水解产生的恶臭味的二胺化合物。尸胺具有化学式NH₂(CH₂)₅NH₂，其类似于腐胺的化学式。

尸胺用作聚合物诸如聚酰胺或聚氨基甲酸酯、螯合剂或其它添加剂的组分。特别地，已知具有350万吨的每年全球市场的聚酰胺通过尸胺或丁二酸的缩聚而制备，且因此尸胺作为工业上有用的化合物已受到大量关注。

尸胺为发现于一些微生物中的二胺(Tabor和Tabor,MicrobiolRev.,49：81-99,1985)。在革兰氏阴性细菌大肠杆菌中，尸胺通过L-赖氨酸脱羧酶由L-赖氨酸而生物合成。大肠杆菌中尸胺的水平通过尸胺的生物合成、降解、摄取和输出而调节(Soksawatmaekhin等人，MolMicrobiol.,51：1401-1412,2004)。

公开内容

技术问题

本发明人已做出了大量的尝试来研究具有输出二胺诸如腐胺或尸胺能力的蛋白质以便提高具有二胺生产力的微生物中的二胺生产力。结果，他们发现有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)来源的蛋白质或与其具有高氨基酸序列同源性的蛋白质具有二胺输出活性，且该蛋白质被引入用于产生二胺的微生物以增强其活性，导致输出二胺诸如腐胺和尸胺的能力显著增加，从而完成本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供用于产生二胺的微生物。

本发明的另一个目的是提供产生二胺的方法，包括步骤：(i)培养用于产生二胺的微生物以获得细胞培养物；和(ii)从培养的微生物或细胞培养物回收二胺。

最佳方式

在实现以上目的的方面，本发明提供用于产生二胺的微生物，其中引入或增强具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有55％或更高的与SEQ ID NO:6的序列同源性的氨基酸序列的蛋白质的活性。

如本文所用，术语“二胺”共同地指具有两个胺基的化合物，且其特定实例可包括腐胺和尸胺。腐胺为四亚甲基二胺，其可由作为前体的鸟氨酸产生。尸胺称作1,5-戊二胺或五亚甲基二胺，其可由作为前体的赖氨酸产生。这样的二胺为工业上适用的化合物，其充当合成聚合物诸如多胺尼龙、聚酰胺或聚氨基甲酸酯的有价值的原料。

如本文所用，术语“具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白质”为在有效棒状杆菌中发现的蛋白质，且亦称作CE2495。已研究发现，该蛋白质保留与棒状杆菌的膜蛋白NCgl2522的高同源性。在本发明的实施方式中，CE2495蛋白被鉴定为推定蛋白质，其涉及在具有二胺生产力的菌株中的二胺输出，从而显著增加二胺生产力。

此处，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CE2495蛋白可以是由SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码的蛋白质。然而，在编码CE2495蛋白的多核苷酸中，可在编码区中产生各种修饰，条件是它们不改变从编码区表达的多肽的氨基酸序列，这是由于密码子简并性或考虑到其中将要表达蛋白的生物体所偏好的密码子。因此，CE2495蛋白可由多种核苷酸序列以及由SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码。

此外，本发明的CE2495蛋白可以是具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有与其55％或更高、优选75％或更高、更优选90％或更高、更优选95％或更高、甚至更优选98％或更高、和最优选99％或更高的同源性的任何蛋白质，只要该蛋白质呈现大量的二胺输出活性。显然，其中一部分被删除、修饰、替代或添加的具有该同源性的氨基酸序列亦在本发明的范围内，只要所得氨基酸序列具有实质上等于或对应于SEQ ID NO:6的蛋白质的生物学活性。

如本文所用，术语“具有与SEQ ID NO:6的氨基酸序列55％或更高的序列同源性的氨基酸序列的蛋白质”意指任何蛋白质而无限制，只要该蛋白质具有与SEQ ID NO:6的氨基酸序列55％或更高的序列同源性的氨基酸序列且其亦实质上具有二胺输出活性。例如，蛋白质可以是具有SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的蛋白质，但不限于此。

例如，具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质是发现于产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)中的蛋白质，且亦称作HMPREF0281_01446。已研究发现，该蛋白质保留与棒状杆菌的膜蛋白NCgl2522的59％同源性和与有效棒状杆菌的CE2495的61％同源性。在本发明的实施方式中，已研究发现HMPREF0281_01446蛋白在具有二胺生产力的菌株中呈现二胺输出活性，从而显著增加二胺生产力。

具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的HMPREF0281_01446蛋白可以是由SEQ ID NO:21的核苷酸序列编码的蛋白质。然而，在编码该蛋白质的多核苷酸中，可在编码区中产生各种修饰，条件是其不改变从编码区表达的多肽的氨基酸序列，这归因于密码子简并性或考虑到其中欲表达该蛋白质的生物体所偏好的密码子。因此，该蛋白质可由多种核苷酸序列以及由SEQ ID NO:21的核苷酸序列编码。

此外，具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的蛋白质为发现于亲脂黄色棒状杆菌(Corynebacterium lipophiloflavum)中的蛋白质，且亦称作HMPREF0298_0262。已研究发现，该蛋白质保留与棒状杆菌的膜蛋白NCgl2522的52％同源性和与有效棒状杆菌的CE2495的56％同源性。在本发明的实施方式中，已研究发现HMPREF0298_0262蛋白在具有二胺生产力的菌株中呈现二胺输出活性，从而显著增加二胺生产力。

具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HMPREF0298_0262蛋白可以是由SEQ ID NO:23的核苷酸序列编码的蛋白质。然而，在编码该蛋白质的多核苷酸中，可在编码区中产生各种修饰，条件是其不改变从该编码区表达的多肽的氨基酸序列，这归因于密码子简并性或考虑到其中将要表达该蛋白质的生物体所偏好的密码子。因此，该蛋白质可由多种核苷酸序列以及由SEQ ID NO:23的核苷酸序列编码。

如本文关于序列所用的术语“同源性”指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，且同源性可以表示为百分比。在本发明中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似活性的同源性序列以“％同源性”表示。例如，同源性可使用计算评分、同一性和相似性的参数的标准软件程序，具体地BLAST 2.0或通过在Southern杂交实验中在所定义的严格条件下比较序列来鉴别。定义适当杂交条件是在本领域的技能内(例如参见Sambrook等人，1989，下文)，且通过本领域技术人员已知的方法确定。

如本文所用，术语“用于产生二胺的微生物”指通过针对不具有二胺生产力的亲本株提供二胺生产力所制备的微生物或具有内源二胺生产力的微生物。具体地，具有二胺生产力的微生物可以是具有腐胺或尸胺生产力的微生物。

“具有腐胺生产力的微生物”可以是但不限于这样的微生物，其中将谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酸的乙酰谷氨酸合酶、将乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸的鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、将乙酰谷氨酸转化为N-乙酰谷氨酰磷酸的乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、将乙酰谷氨酰磷酸转化为N-乙酰谷氨酸半醛的乙酰-γ-谷氨酰-磷酸还原酶(ArgC)、或将乙酰谷氨酸半醛转化为N-乙酰鸟氨酸的乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)的活性与其内源活性相比被增强，以便增强从谷氨酸至鸟氨酸的生物合成途径，且用作腐胺生物合成的前体的鸟氨酸的生产力被增强，但不限于此。

此外，具有腐胺生产力的微生物可以是这样的微生物，其经修饰以具有比其内源活性弱的从鸟氨酸合成精氨酸所涉及的鸟氨酸氨甲酰转移酶(ArgF)、谷氨酸输出所涉及的蛋白质(NCgl1221)和/或腐胺乙酰化所涉及的蛋白质(NCgl469)的活性，和/或经修饰以引入鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性。

此处，作为非限制性实例，乙酰基γ谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)可具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列，乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)可具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列，乙酰谷氨酸激酶(ArgB)可具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，而乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)可具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列。然而，各个酶蛋白的氨基酸序列并未特定限制于此，且酶可以是具有与其80％或更高、优选90％或更高、或更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列的蛋白质，只要其具有各自酶的活性。

此外，作为非限制性实例，鸟氨酸氨甲酰转移酶(ArgF)可具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列，谷氨酸输出所涉及的蛋白质可具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列，而鸟氨酸脱羧酶(ODC)可具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列。然而，各自的酶蛋白的氨基酸序列并未受限于此，且酶可以是具有与其80％或更高、优选90％或更高、更优选95％或更高、或特别优选97％或更高的同源性的氨基酸序列的蛋白质，只要其具有各自酶的活性。

同时，“具有尸胺生产力的微生物”可以是但不限于通过在具有赖氨酸生产力的微生物中另外引入或增强赖氨酸脱羧酶(LDC)的活性而制备的微生物。例如，微生物可以是具有增强的赖氨酸生产力以便增加尸胺产生的微生物。增强赖氨酸生产力的方法可通过本领域技术人员可预知的已知方法进行。

赖氨酸脱羧酶是催化赖氨酸转化为尸胺的酶，且其活性被引入或增强，从而有效地产生尸胺。

赖氨酸脱羧酶可具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列，但未特定受限于此。酶可具有与其80％或更高、优选90％或更高、或更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列，只要其具有以上活性。

如本文所用，术语“产生”为包括二胺的胞外释放，例如二胺释放至培养基中，以及在微生物内产生二胺的概念。

同时，如本文所用的术语“蛋白质活性的引入”意指不具有内源蛋白质的微生物由外部提供该蛋白质的活性，且例如，其可通过引入外源基因来进行。此外，术语“蛋白质活性的增强”意指保留于或引入微生物中的蛋白质的活性状态与其固有活性状态相比被增强。

蛋白质活性的引入或增强的非限制性实例可包括存在于微生物中的蛋白质自身的活性由于突变而提高以便实现超过内源功能的效果，和/或存在于微生物中的蛋白质的内源基因活性的提高、内源基因由内部或外部因子扩增、基因拷贝数增加、通过外源基因的额外引入或启动子的置换或修饰增加活性，但不限于此。

基因拷贝数的增加可，但不特定限于，通过将该基因可操作地连接于载体或通过将其整合至宿主细胞基因组中来进行。具体地，宿主细胞基因组中的多核苷酸的拷贝数可通过将可操作地连接于编码本发明蛋白质的多核苷酸且独立于宿主细胞进行复制和起作用的载体引入宿主细胞，或通过将可操作地连接于多核苷酸且能够使该多核苷酸整合至宿主细胞基因组中的载体引入宿主细胞中而增加。

如本文所用，“用于增加多核苷酸表达的表达调节序列的修饰”可以，但不特定限于，通过经核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守置换或其组合引起表达调节序列上的修饰以便进一步增强表达调节序列的活性，或通过用具有较强活性的核苷酸序列替换表达调节序列来进行。表达调节序列包括，但不特定限于，启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、和调节转录和翻译的终止的序列。

如本文所用，启动子的置换或修饰，尽管未特定受限于此，可通过用比初始启动子强的启动子进行置换或修饰来进行。替代初始启动子的强异源启动子可连接于多核苷酸表达单元的上游，强启动子的实例可包括CJ7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子，且具体地，棒状杆菌来源的启动子、lysCP1启动子或CJ7启动子可操作地连接于编码该酶的多核苷酸，使得其表达率可增加。此处，lysCP1启动子为经编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的多核苷酸的启动子区域的核苷酸序列取代而改良的启动子(WO 2009/096689)。此外，CJ7启动子为源自产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)的强启动子(韩国专利第0620092号和WO 2006/065095)。

此外，染色体上的多核苷酸序列的修饰，尽管未特定受限于此，可通过经多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守置换或其组合引起表达调节序列上的突变以便进一步增强该多核苷酸序列的活性，或通过用经修饰以具有更强活性的多核苷酸序列替换该序列来进行。

如本文所用，术语“载体”指包括编码所需蛋白质的核苷酸序列的DNA构建物，其可操作地连接于适当表达调节序列以在合适的宿主细胞中表达所需蛋白质。调节序列可包括可启始转录的启动子、任选的用于调节转录的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和调节转录和翻译的终止的序列。在载体引入至合适的宿主细胞之后，其可独立于宿主基因组复制或起作用，且可整合至基因组自身中。

用于本发明的载体并未受特定限制，只要其能够在宿主细胞中复制，本领域中已知的任何载体均可使用。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌体载体或粘粒载体。pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型可用作质粒载体。适用于本发明的载体并未受特定限制，任何已知表达载体均可使用。优选，可使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体。

此外，染色体中编码期望内源蛋白质的多核苷酸可使用用于细菌染色体插入的载体由突变的多核苷酸替换。多核苷酸插入至染色体中可通过本领域已知的任何方法，例如，同源重组来进行。由于本发明的载体可通过同源重组插入至染色体中，其可进一步包括选择标记以确认染色体插入。选择标记将选择用载体转化的细胞，即，确认期望多核苷酸的插入，选择标记可包括提供可选择表型，诸如抗药性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抵抗或表面蛋白质表达的标记。仅表达选择标记的细胞能够在用选择性剂处理的环境下存活或显示不同表型，且因此可选择转化细胞。

如本文所用，术语“转化”意指包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体以使得由该多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达的方式引入至宿主细胞中。只要转化的多核苷酸可在宿主细胞中表达，它就可整合至宿主细胞的染色体中且位于其中，或在染色体外存在。此外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以任何形式引入，只要其可引入至宿主细胞中且在其中表达。例如，多核苷酸可以表达盒的形式被引入至宿主细胞中，该表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建物。典型地，表达盒包括可操作地连接于多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点或翻译终止信号。表达盒可呈可自我复制表达载体的形式。同样，多核苷酸可实际上引入至宿主细胞中且可操作地连接于在宿主细胞中表达所需的序列。

此外，如本文所用，术语“可操作地连接”意指在编码本发明的期望蛋白质的多核苷酸序列和起始且介导该多核苷酸序列转录的启动子序列之间的功能连接。

此外，具有二胺生产力的微生物可以是这样的微生物，其中二胺乙酰转移酶活性与内源活性相比减弱以便增加二胺产生。

如本文所用，术语“二胺乙酰转移酶”是催化乙酰基从乙酰-CoA转移至二胺的酶，其可由谷氨酸棒状杆菌NCgl1469或大肠杆菌SpeG示例，但其名称可根据具有二胺生产力的微生物的种类而不同。NCgl1469可具有SEQ ID NO:11或12的氨基酸序列，SpeG可具有SEQID NO:13的氨基酸序列，但该序列可根据微生物的种类而不同。蛋白质可具有与其80％或更高、优选90％或更高、或更优选95％或更高、或特别优选97％或更高的同源性的氨基酸序列，只要其具有二胺乙酰转移酶活性。

由于二胺乙酰转移酶将二胺转化为乙酰基-二胺(例如，N-Ac-腐胺或N-Ac-尸胺)，二胺生产力可通过减弱其活性——与内源活性相比——而增加。

如本文所用，术语“内源活性”指初始微生物具有的呈其天然或未变性状态的蛋白质的活性，而“经修饰以具有与内源活性相比减弱的活性”意指与初始微生物具有的呈天然或未变性状态的相应蛋白质的活性相比，蛋白质的活性进一步减弱。

蛋白质活性的减弱意指与未修饰的菌株相比蛋白质活性降低，或活性消除。有可能将本领域中熟知的方法应用于蛋白质活性的减弱。

方法的实例可包括用经突变以降低酶活性或消除蛋白质活性的基因置换染色体上编码该蛋白质的基因的方法；将突变引入至染色体上编码蛋白质的基因的表达调节序列中的方法；用具有较弱活性的序列替换编码蛋白质的基因的表达调节序列的方法；删除染色体上编码蛋白质的基因的部分或全部的方法；引入与染色体上基因的转录物互补结合的反义寡核苷酸以抑制mRNA翻译为蛋白质的方法；在编码蛋白质的基因的SD序列的上游人工添加与SD序列互补的序列以形成二级结构，从而阻止核糖体亚基进入的方法；和在相应序列的开放阅读框(ORF)的3’-端添加用于逆转录的启动子的逆转录工程(RTE)方法，和其组合，但并未特定受限于此。

详细地，编码蛋白质的基因的部分或完全删除可通过将用于染色体插入的载体引入至微生物中，从而用具有部分删除或标记基因的多核苷酸替代染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸来进行。“部分”可根据多核苷酸的类型而变化，但具体地指1至300，优选1至100，且更优选1至50个核苷酸。

同时，本发明的微生物是具有二胺生产力的微生物，包括表达具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白质的原核微生物，其实例可包括属于埃希氏菌属某种(Escherichiasp.)、志贺氏菌属某种(Shigella sp.)、柠檬酸杆菌属某种(Citrobacter sp.)、沙门氏菌属某种(Salmonella sp.)、肠杆菌属某种(Enterobacter sp.)、耶尔森氏菌属某种(Yersinia sp.)、克雷伯菌属某种(Klebsiella sp.)、欧文氏菌属某种(Erwinia sp.)、棒状杆菌属某种(Corynebacterium sp.)、短杆菌属某种(Brevibacterium sp.)、乳杆菌属某种(Lactobacillus sp.)、月形单胞菌属某种(Selenomanas sp.)、弧菌属某种(Vibriosp.)、假单胞菌属某种(Pseudomonas sp.)、链霉菌属某种(Streptomyces sp.)、隐秘杆菌属某种(Arcanobacterium sp.)、产碱杆菌属某种(Alcaligenes sp.)或其类似属种的微生物，但不限于此。本发明的微生物具体地是这样的微生物，其属于棒状杆菌属某种或埃希氏菌属某种，更具体地谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌，但不限于此。

特定实例可以是通过从基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的产腐胺菌株KCCM11240P(韩国专利公开第2013-0082478号)删除NCgl2522，且接着将CE2495引入至转座子基因中而制备的微生物，NCgl2522为具有腐胺输出活性的蛋白质。因此，此微生物KCCM11240P△NCgl2522Tn:P(cj7)-CE2495被命名为CC01-0757，且在2013年11月15日在布达佩斯条约下以登录号KCCM11475P保藏于韩国微生物培养中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms(KCCM))。

在另一个方面，本发明提供了产生二胺的方法，其包括：(i)培养具有腐胺二胺的微生物，其中引入或增强具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或具有与其55％或更高的序列同源性的氨基酸序列的蛋白质的活性，以便获得细胞培养物；和(ii)从培养的微生物或细胞培养物回收二胺。

具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白质或具有与其55％或更高的序列同源性的氨基酸序列的蛋白质、蛋白质活性的引入、蛋白质活性的增强、二胺和具有二胺生产力的微生物与上文所述相同。

在所述方法中，培养微生物的步骤可——虽然未特定限于——优选通过本领域中已知的分批培养、连续培养和补料分批培养(fed-batch culture)进行。就此而言，培养条件并未受特定限制，但最佳pH(例如pH 5至9，优选pH 6至8，且最优选pH 6.8)可通过使用碱性化学药品(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化学药品(例如，磷酸或硫酸)来维持。同样，需氧条件可通过向细胞培养物中添加氧气或含氧气体混合物来维持。培养温度可维持在20至45℃，且优选在25至40℃，且培养可进行约10至160小时。

此外，欲用于培养的培养基可包括个别地或组合作为碳源的糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜(molasse)、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、和有机酸(例如，乙酸)；个别地或组合作为氮源的含氮有机化合物(例如，胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米溶液、大豆粉和尿素)、或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)；个别地或组合作为磷源的磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其对应的含钠盐；其它必需生长刺激物，包括金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。在本发明中，培养基可用作培养液体的同义词。

如本文所用，术语“细胞培养物”是通过培养微生物获得的物质，包括培养基、培养的微生物和从培养的微生物释放的物质。例如，可包括细胞培养所需的营养物供应源，诸如矿物质、氨基酸、维生素、核酸和/或除碳源和氮源以外一般包含于培养基(或培养液体)中的其它组分。此外，可包括期望物质或由细胞产生/分泌的酶。

由于由培养物产生的二胺可分泌至培养基中或保留于细胞中，所以细胞培养物可包括通过培养微生物所产生的二胺。

回收二胺如在本发明的培养步骤中产生的腐胺或尸胺的方法可，例如，使用本领域中已知的合适方法，根据培养方法，例如分批培养、连续培养或补料分批培养来进行，从而从培养液体收集期望的氨基酸。

有益效果

在本发明中，已证明有效棒状杆菌来源的CE2495蛋白为具有二胺输出活性的蛋白质，腐胺输出活性可通过将该蛋白质活性引入至具有腐胺合成途径但低腐胺输出活性的棒状杆菌属某种微生物中来增强。也已证明，腐胺和尸胺可同时通过将该蛋白质活性引入至具有腐胺和尸胺的合成途径的大肠杆菌中来增加。因此，二胺可有效地通过将有效棒状杆菌来源的CE2495蛋白应用于具有二胺生产力的微生物来产生。

发明方式

下文中，本发明将参考实施例更详细地加以描述。然而，这些实施例仅用于说明性目的，且本发明不意欲受这些实施例限制。

参考实施例1.具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物的制备

已证实当在作为具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物的基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的产腐胺菌株KCCM11240P(韩国专利公开第2013-0082478号)和基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的产腐胺菌株DAB12-a△NCgl1469(ArgF删除、NCgl1221删除、大肠杆菌speC引入、arg操纵子启动子取代、NCgl1469删除；命名为DAB12-b，韩国专利公开第2013-0082478号)中删除NCgl2522——属于主要协助转运蛋白超家族(major facilitatorsuperfamily(MFS))的通透酶——时，腐胺产生减少。

也已证实，腐胺在通过将NCgl2522基因额外引入至KCCM11240P或DAB12-b中的转座子中或通过用CJ7启动子替代染色体上的NCgl2522启动子以增强NCgl2522活性而制备的谷氨酸棒状杆菌菌株中以高产率产生。此外，腐胺的细胞内的量在其中NCgl2522表达被增强的菌株中测量，结果，与对照组的量相比，观察到较少量的腐胺。指示NCgl2522具有输出腐胺的能力。

详细地，基于编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522的基因的核苷酸序列，一对用于获得NCgl2522的N-端区域的同源重组片段的引物SEQ ID NOS:1和2和一对用于获得NCgl2522的C-端区域的同源重组片段的引物SEQ ID NOS:3和4如下表1中使用。

[表1]

使用作为模板的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA和两对引物进行PCR以便分别扩增N-端和C-端区域的PCR片段。将这些PCR片段进行电泳以获得期望片段。此时，进行PCR反应：在95℃变性30秒，在55℃退火30秒，且在72℃延伸30秒，30个循环。将因此获得的N-端区域的片段用限制性酶BamHI和SalI处理，并将因此获得的C-端区域的片段用限制性酶SalI和XbaI处理。将因此处理的片段克隆至用限制性酶BamHI和XbaI处理的pDZ载体中，以便构建质粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)。

质粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)通过电穿孔引入至谷氨酸棒状杆菌KCCM11240P中，以便获得转化体。随后，将该转化体铺平板并在含有用于集落形成的卡那霉素(25μg/ml)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚(indolin)-D-半乳糖苷)的BHIS(37g/l脑心浸液(Braine heartinfusion)、91g/l山梨糖醇和2％琼脂)板上培养。从因此形成的菌落选择蓝色菌落作为引入质粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)的菌株。

将选择的菌株在CM培养基(10g/l葡萄糖、10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/l牛肉提取物、2.5g/l NaCl和2g/l尿素，pH 6.8)中在30℃震荡培养8小时。随后，各细胞培养物连续地从10^-4稀释至10^-10。随后，将稀释的样品铺平板并且在用于集落形成的含X-gal固体培养基上培养。从因此形成的菌落选择以相对较低频率出现的白色菌落以最终获得其中编码NCgl2522的基因被删除且腐胺生产力减弱的谷氨酸棒状杆菌菌株。将其中腐胺输出活性减弱的谷氨酸棒状杆菌菌株命名为KCCM11240P△NCgl2522。

以相同方式，使用作为模板的谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA和表1中给出的两对引物进行PCR以便通过上文所述的方法构建质粒pDZ-2’NCgl2522(K/O)。构建谷氨酸棒状杆菌菌株，其中根据上文所述的方法使用该载体使编码DAB12-b菌株的NCgl2522的基因删除以减弱腐胺生产力。将此具有减弱的腐胺输出活性的谷氨酸棒状杆菌菌株命名为DAB12-b△NCgl2522。

实施例1.有效棒状杆菌CE2495的选择

如参考实施例1中所证实，发现NCgl2522膜蛋白用于输出腐胺。因此，基于NCgl2522的氨基酸序列，本发明人使用国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information NCBI,www.ncbi.nlm.nih.gov)的BlastP程序获得与其具有同源性的基因。

从除谷氨酸棒状杆菌外的棒状杆菌某种，发现有效棒状杆菌YS-314具有CE2495，该CE2495显示与NCgl2522的氨基酸序列71％同源性。获得其核苷酸序列(SEQ ID NO:5)和氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。

以相同方式，获得源自产氨棒状杆菌DSM 20306的HMPREF0281_01446的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)和氨基酸序列(SEQ ID NO:22)，HMPREF0281_01446显示与NCgl2522的氨基酸序列59％同源性；和源自亲脂黄色棒状杆菌DSM 44291的HMPREF0298_0262的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)和氨基酸序列(SEQ ID NO:24)，HMPREF0298_0262显示与NCgl2522的氨基酸序列52％同源性。HMPREF0281_01446的氨基酸序列和HMPREF0298_0262的氨基酸序列分别显示与有效棒状杆菌YS-314的CE2495的氨基酸序列的61％和56％同源性，如下面表2中所显示。

[表2]

氨基酸序列同源性的比较

同时，具有显示与NCgl2522同源性的基因的棒状杆菌某种微生物和其同源性在下面表3中给出。

[表3]

实施例2.通过将CE2495引入至源自棒状杆菌某种的产腐胺菌株中使腐胺发酵

<2-1>将CE2495引入至基于ATCC13032的产腐胺菌株染色体中的转座子基因

为了检查CE2495基因的染色体插入是否影响在参考实施例1中制备的具有降低的腐胺输出活性的KCCM11240P△NCgl2522中的腐胺输出，通过以下方法将CE2495引入至转座子基因中。

作为允许使用棒状杆菌某种微生物的转座子基因将基因插入至染色体中的用于转化的载体，使用pDZTn(WO 2009/125992)，且CJ7(WO 2006/65095)用作启动子。

约1.44kb的CE2495基因片段使用有效棒状杆菌YS-314菌株的染色体作为模板和引物对SEQ ID NO:9和10(参见表4)来扩增。此时，进行PCR反应：在95℃变性30秒，在55℃退火30秒，和在72℃延伸1分30秒，30个循环。接着，该PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳以洗脱且纯化期望大小的带。

此外，通过使用作为模板的p117-Pcj7-gfp和一对引物SEQ ID NO:7和8(参见表4)进行PCR来获得cj7启动子区域，PCR在95℃变性30秒，在55℃退火30秒，和在72℃延伸30秒，30个循环。cj7启动子基因的片段在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳以洗脱且纯化期望大小的带。

[表4]

pDZTn载体用XhoI处理，进行以上获得的PCR产物的融合克隆。In-Fusion◎HD克隆试剂盒(Clontech)用于融合克隆。所得质粒分别指定为pDZTn-P(cj7)-CE2495。

接下来，将质粒pDZTn-P(cj7)-CE2495通过电穿孔引入至参考实施例1中所述的谷氨酸棒状杆菌KCCM11240P△NCgl2522中以获得转化体。转化体在CM培养基(10g/l葡萄糖、10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/l牛肉提取物、2.5g/l NaCl和2g/l尿素，pH 6.8)中震荡培养(30℃持续8小时)。随后，细胞培养物从10^-4连续稀释至10^-10。接着，稀释的样品铺平板并且在用于集落形成的含X-gal固体培养基上培养。

从所形成的菌落选择以相对较低频率出现的白色菌落以最终获得其中通过二次交换引入编码CE2495的基因的菌株。最终选择的菌株使用引物对SEQ ID NO:7和10进行PCR以确认编码CE2495的基因的引入。该谷氨酸棒状杆菌突变株被指定为KCCM11240P△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495。

<2-2>将CE2495引入至基于ATCC13869的产腐胺菌株染色体中的转座子基因

为了检查CE2495基因的染色体插入是否影响参考实施例1中制备的具有降低的腐胺输出活性的DAB12-b△NCgl2522中的腐胺输出，将上面制备的pDZTn-P(cj7)-CE2495引入至谷氨酸棒状杆菌DAB12-b△NCgl2522中并以与实施例<2-1>中相同的方式确认菌株的转座子基因中CE2495的引入。

因此选择的谷氨酸棒状杆菌突变株被指定为DAB12-b△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495。

<2-3>评估引入CE2495的棒状杆菌某种来源的产腐胺菌株的腐胺生产力

为了确认CE2495引入对产腐胺菌株的腐胺生产力的效果，比较在实施例<2-1>和<2-2>中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株的腐胺生产力。

详细地，将6种类型的谷氨酸棒状杆菌突变体(KCCM11240P；KCCM11240P△NCgl2522；KCCM11240P△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495；DAB12-b；DAB12-b△NCgl2522；DAB12-b△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495)分别铺平板于含1mM精氨酸的CM平板培养基(1％葡萄糖、1％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％牛肉提取物、0.25％NaCl、0.2％尿素、100μl 50％NaOH和2％琼脂，pH 6.8，基于1L)上，并在30℃培养24小时。将1铂环的因此培养的各菌株接种于25ml滴度培养基(8％葡萄糖、0.25％大豆蛋白、0.50％玉米浸渍固体、4％(NH₄)₂SO₄、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄·7H₂O、0.15％尿素、100μg生物素、3mg盐酸硫胺素、3mg泛酸钙、3mg烟酰胺和5％CaCO₃，pH 7.0，基于1L)中，随后在30℃和200rpm震荡培养98小时。将1mM精氨酸添加至用于培养菌株的所有培养基中。测量各细胞培养物中的腐胺浓度，结果显示于下面的表5中。

[表5]

菌株	腐胺(g/L)
		KCCM 11240P	12.4
KCCM 11240P△NCgl2522	1.9
		KCCM 11240P△NCgl2522Tn:P(cj7)-CE2495	17.8
DAB12-b	13.1
		DAB12-b△NCgl2522	0.5
DAB12-b△NCgl2522Tn:P(cj7)-CE2495	17.9

如表5中所显示，发现在两种类型的引入CE2495的谷氨酸棒状杆菌突变株中腐胺产生均增加。

实施例3.通过在棒状杆菌某种来源的产赖氨酸菌株中的CE2495引入和赖氨酸脱羧酶表达使尸胺发酵

<3-1>在产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P的染色体中的转座子基因中引入CE2495

为了确认CE2495蛋白的尸胺输出活性，将CE2495基因引入至产赖氨酸菌株KCCM11016P(此微生物在1995年12月18日以登录号KFCC10881保藏于韩国微生物培养中心，且随后在布达佩斯条约下以登录号KCCM11016P保藏于国际保藏机构，韩国专利第10-0159812号)的染色体中。将上面制备的pDZTn-P(cj7)-CE2495引入至谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P中且以与实施例<2-1>中相同的方式确认菌株的转座子中CE2495的引入。

因此选择的谷氨酸棒状杆菌突变株被指定为KCCM11016P Tn：P(cj7)-CE2495。

<3-2>将大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶基因引入至引入CE2495的产L-赖氨酸菌株

在实施例<3-1>中制备的引入CE2495的产L-赖氨酸菌株KCCM11016P Tn：P(cj7)-CE2495被引入呈质粒形式的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶基因用于尸胺产生。从NCBI数据库获得赖氨酸脱羧酶ldcC的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)和氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。

通过使用大肠杆菌W3110菌株的染色体作为模板和引物对SEQ ID NO:29和30(参见表6)进行PCR来获得约2.1kb的ldcC基因片段，PCR在95℃变性30秒，在52℃退火30秒，且在72℃延伸2分钟，30个循环。此产物用HindIII和XbaI处理，随后在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳以洗脱和纯化期望大小的带。

此外，通过使用p117-Pcj7-gfp作为模板和引物对SEQ ID NO:27和28(参见表6)进行PCR来获得cj7启动子区域，PCR在95℃变性30秒，在55℃退火30秒，在72℃延伸30秒，30个循环。cj7启动子基因的基因片段用KpnI和HindII处理，随后在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳以洗脱和纯化期望大小的带。

[表6]

使用T4DNA连接酶(NEB)克隆通过在0.8％琼脂糖凝胶中对KpnI和XbaI处理的pECCG117(Biotechnology letters vol 13,No.10,p.721-726(1991))载体进行电泳且随后洗脱和纯化期望大小的带所获得的基因片段、用KpnI和HindIII处理的cj7启动子基因片段和用HindIII和XbaI处理的赖氨酸脱羧酶ldcC基因片段。通过以上实验获得的编码大肠杆菌ldcC的质粒被指定为pECCG117-Pcj7-ldcC。

所制备的pECCG117-Pcj7-ldcC载体或pECCG117载体分别通过电穿孔引入至KCCM11016P和KCCM11016P Tn：P(cj7)-CE2495中。转化体铺平板于含有用于选择的25μg/ml卡那霉素的BHIS培养板上。所选择的菌株分别被指定为KCCM11016P pECCG117、KCCM11016PpECCG117-Pcj7-ldcC、KCCM11016P Tn：P(cj7)-CE2495pECCG117和KCCM11016P Tn：P(cj7)-CE2495pECCG117-Pcj7-ldcC。

<3-3>评估具有CE2495的染色体插入和作为质粒的赖氨酸脱羧酶基因的棒状杆菌某种来源的产赖氨酸菌株的尸胺生产力

为了检查将CE2495引入至产尸胺菌株中是否影响尸胺产生，在实施例<3-2>中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株之间比较尸胺生产力。

详细地，通过以下方法培养4种类型的谷氨酸棒状杆菌突变株(KCCM11016PpECCG117；KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC；KCCM11016P Tn：P(cj7)-CE2495pECCG117；和KCCM11016P Tn：P(cj7)-CE2495pECCG117-Pcj7-ldcC)，并且在其间比较尸胺生产力。

各自突变株铺平板于CM平板培养基(1％葡萄糖、1％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％牛肉提取物、0.25％NaCl、0.2％尿素、100μl 50％NaOH和2％琼脂，pH 6.8，基于1L)上，并在30℃培养24小时。所培养的菌株的每一个接种于含有25ml种子培养基(2％葡萄糖、1％胨、0.5％酵母提取物、0.15％尿素、0.4％KH₂PO₄、0.8％K₂HPO₄、0.05％MgSO₄ 7H₂O、100μg生物素、1000μg硫胺HCl、2000μg泛酸钙和2000μg烟酰胺，pH 7.0，基于1L)的250ml三角烧瓶(corner-baffled flask)中，并在30℃和200rpm震荡培养20小时。

接着，将1ml种子培养物接种于含有24ml生产培养基(4％葡萄糖、2％(NH₄)₂SO₄、2.5％大豆蛋白、5％玉米浸渍固体、0.3％尿素、0.1％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄ 7H₂O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺、0.2g亮氨酸、0.1g苏氨酸、0.1g甲硫氨酸和5％CaCO₃，pH 7.0，基于1L)的250ml三角烧瓶中，随后在30℃和200rpm震荡培养72小时。

在培养后，通过HPLC测量尸胺生产力。各菌株的细胞培养物中尸胺的浓度在下面的表7中给出。

[表7]

如表7中所显示，引入CE2495的谷氨酸棒状杆菌突变株中的尸胺产生增加。

实施例4.通过将具有二胺输出活性的蛋白质引入至大肠杆菌中使二胺发酵

<4-1>通过将CE2495、HMPREF0281_01446、或HMPREF0298_0262引入至W3110中来制备菌株

检查在大肠杆菌中除CE24952外分别显示与NCgl2522的59％和52％同源性的产氨棒状杆菌DSM 20306来源的HMPREF0281_01446蛋白和亲脂黄色棒状杆菌DSM 44291来源的HMPREF0298_0262蛋白的二胺输出活性。

以与实施例2-1的pDZTn-P(cj7)-CE2495的构建相同的方式构建用于引入HMPREF0281_01446和HMPREF0281_01446的载体。

使用产氨棒状杆菌DSM 20306菌株的染色体作为模板和引物对SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32(参见表8)扩增HMPREF0281_01446基因以获得约1.4kb的基因片段。

以相同方式，使用亲脂黄色棒状杆菌DSM 44291菌株的染色体作为模板和引物对SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34(参见表8)扩增HMPREF0298_0262基因以获得约1.36kb的基因片段。

像这样，进行PCR反应：在95℃变性30秒，在55℃退火30秒，和在72℃延伸1分30秒，30个循环。然后，将PCR产物中的每个在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳以洗脱且纯化期望大小的带。

[表8]

此外，通过使用p117-Pcj7-gfp作为模板和引物对SEQ ID NO：7和8进行PCR来获得cj7启动子区域：在95℃变性30秒，在55℃退火30秒，和在72℃延伸30秒，30个循环。cj7启动子基因的片段在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳以洗脱且纯化期望大小的带。

pDZTn载体用XhoI处理，并进行上面获得的PCR产物的融合克隆。In-Fusion◎HD克隆试剂盒(Clontech)用于融合克隆。所得质粒分别指定为pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446和pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262。

此后，为了检查有效棒状杆菌YS-314来源的CE2495、产氨棒状杆菌来源的HMPREF0281_01446或亲脂黄色棒状杆菌来源的HMPREF0298_0262蛋白的表达是否增加具有腐胺和尸胺的生物合成途径的大肠杆菌野生型菌株W3110中的腐胺和尸胺产生，分别将基于棒状杆菌和大肠杆菌穿梭载体的pDZTn-P(cj7)-CE2495、pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446、或pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262引入至W3110中。

2×TSS溶液(Epicentre)用于转化至大肠杆菌中，转化体被铺平板并且于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB平板(10g胰胨、5g酵母提取物、10g NaCl和2％琼脂，基于1L)上培养用于集落形成。因此形成的菌落分别被指定为W3110pDZTn-P(cj7)-CE2495、W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446、或W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262。

<4-2>引入CE2495、HMPREF0281_01446或HMPREF0298_0262的大肠杆菌的二胺生产力的比较

检查上面获得的菌株的腐胺和尸胺生产力。

详细地，将大肠杆菌W3110和W3110pDZTn-P(cj7)-CE2495、W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446、或W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262在37℃在LB固体培养基上培养24小时。

随后，其中每个在25ml滴度培养基(2g(NH₄)₂PO₄、6.75g KH₂PO₄、0.85g柠檬酸、0.7gMgSO₄·7H₂O、0.5％(v/v)微量元素、10g葡萄糖、3g AMS和30g CaCO₃，基于1L)中在37℃培养24小时。痕量金属溶液含有5M HCl：每1升10g FeSO₄·7H₂O、2.25g ZnSO₄·7H₂O、1g CuSO₄·5H₂O、0.5g MnSO₄·5H₂O、0.23g Na₂B₄O₇·10H₂O、2g CaCl₂·2H₂O和0.1g(NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O。

测量从各个细胞培养物产生的腐胺和尸胺的浓度，结果在下面的表9中给出。

[表9]

如表9中所显示，与亲本株W3110相比，引入CE2495的W3110pDZTn-P(cj7)-CE2495菌株显示在细胞培养物中高的腐胺和尸胺浓度。此外，分别引入HMPREF0281_01446和HMPREF0298_0262的W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446和W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262菌株中的腐胺和尸胺产生显著增加。

即，已确认细胞培养物中的二胺通过增强CE2495或具有与其55％或更高序列同源性的蛋白质的活性而显著增加，提示输出二胺诸如腐胺和尸胺的能力可通过增强CE2495或具有与其55％或更高的序列同源性的蛋白质的活性而提高。

因此，本发明人证明通过将CE2495引入至具有腐胺合成途径但具有降低的腐胺输出活性的棒状杆菌某种微生物KCCM11240P△NCgl2522的转座子中而制备的具有增强的CE2495活性的谷氨酸棒状杆菌具有增强的腐胺输出活性，从而以高产率产生腐胺。

因此，此菌株KCCM11240P△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495被指定为CC01-0757，且在2013年11月15日在布达佩斯条约下以登录号KCCM11475P保藏于韩国微生物培养中心(KCCM)。

国际保藏机构：韩国微生物培养中心(国际的)

登录号：KCCM11475P

登录日期：20131115

【工业适用性】

在本发明中，证明了有效棒状杆菌来源的CE2495蛋白是具有二胺输出活性的蛋白质，并且腐胺输出活性可通过将该蛋白活性引入至具有腐胺合成途径但低腐胺输出活性的棒状杆菌某种微生物中而增强。还证明了通过该蛋白活性引入至具有腐胺和尸胺合成途径的大肠杆菌中，腐胺和尸胺可同时增加。因此，通过将有效棒状杆菌来源的CE2495蛋白应用到具有二胺生产力的微生物，可有效地产生二胺。

国际表格

原始保藏接收证明

根据第7.1条发出

至：CJ第一制糖株式会社

330,DONGHO-RO,JUNG-GU，首尔100-400，

大韩民国

证明上述翻译与原文无误

2014年4月25日

专利代理人Son Min印

Claims

1.用于产生二胺的微生物，其中具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列或具有55％或更高的与SEQ ID NO：6的序列同源性的氨基酸序列的蛋白质的活性被引入或增强。

2.根据权利要求1所述的微生物，其中具有55％或更高的与SEQ ID NO：6的序列同源性的所述氨基酸序列为SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24。

3.根据权利要求1所述的微生物，其中二胺乙酰转移酶活性与内源活性相比被进一步减弱。

4.根据权利要求3所述的微生物，其中所述二胺乙酰转移酶具有选自SEQ ID NOS：11、12和13的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述二胺为腐胺或尸胺。

6.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物为属于棒状杆菌(Corynebacterium)属或埃希氏菌(Escherichia)属的微生物。

7.产生二胺的方法，包括：

(i)培养权利要求1至6中任一项所述的微生物以获得细胞培养物；和

(ii)从所述培养的微生物或所述细胞培养物回收二胺。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述二胺为腐胺或尸胺。