CN105492593B - 用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法 - Google Patents

用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105492593B
CN105492593B CN201480017057.0A CN201480017057A CN105492593B CN 105492593 B CN105492593 B CN 105492593B CN 201480017057 A CN201480017057 A CN 201480017057A CN 105492593 B CN105492593 B CN 105492593B
Authority
CN
China
Prior art keywords
putrescine
ncgl2522
microorganism
seq
productivity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480017057.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105492593A (zh
Inventor
李京珉
郑熙景
梁荣烈
严惠媛
金昌谦
李红仙
朴寿真
尹钟铉
李白硕
李善英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Publication of CN105492593A publication Critical patent/CN105492593A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105492593B publication Critical patent/CN105492593B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1018—Carboxy- and carbamoyl transferases (2.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01038—N-Acetyl-gamma-glutamyl-phosphate reductase (1.2.1.38)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/03—Carboxy- and carbamoyltransferases (2.1.3)
    • C12Y201/03003—Ornithine carbamoyltransferase (2.1.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01035—Glutamate N-acetyltransferase (2.3.1.35)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01011—Acetylornithine transaminase (2.6.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02008—Acetylglutamate kinase (2.7.2.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01007—Benzoylformate decarboxylase (4.1.1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及以高产率生产腐胺的重组微生物和使用该微生物生产腐胺的方法，其中在微生物中NCgl2522活性增加，所述微生物以使得腐胺生产是可能的方式被修饰。

Description

用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法
背景技术
1.发明领域
本发明涉及具有改进的腐胺生产力的重组微生物和使用其以高产率生产腐胺的方法。
2.相关技术的描述
多胺比如亚精胺、精胺等等存在于大多数活细胞中，并且腐胺(或1,4-丁二胺)用作亚精胺和精胺代谢中的前体。腐胺在革兰氏阴性菌或真菌中发现，并且其在各种物种中以高浓度存在，这表明其在微生物的代谢途径中具有重要作用。
一般而言，腐胺是聚胺尼龙-4、6——其通过与己二酸反应产生——合成中的重要原料。腐胺主要通过自丙烯通过丙烯腈和琥珀腈的化学合成产生。该化学合成是三步法，其包括催化氧化反应、使用氰化物化合物的反应和使用高压氢的加氢反应。因为该化学合成不是环境友好的并且也消耗大量的能量，导致石油耗竭，所以存在问题。因此，需要开发涉及生物质利用的更环境友好的和能量有效的方法用于腐胺生产。
在微生物体内，腐胺的生物合成途径与从谷氨酸到鸟氨酸合成的精氨酸合成路线相同。腐胺可以自微生物通过两条途径生物合成。在一条途径中，作为中间体的鸟氨酸脱羧基以合成腐胺。在另一条途径中，通过自鸟氨酸合成的精氨酸脱羧反应产生胍基丁胺，然后自胍基丁胺合成腐胺(Morris等，J Biol.Chem.241:13,3129-3135,1996)。这两条途径产生代谢所需要的能量或者使细胞具有对氧化应激的抗性。
作为使用微生物生产腐胺的方法，通过转化大肠杆菌和棒状杆菌以高浓度生产腐胺的方法已经被报道(国际专利公开号WO06/005603；国际专利公开号WO09/125924；QianZD等，Biotechnol.Bioeng.104:4,651-662,2009；Schneider等，Appl.Microbiol.Biotechnol.88:4,859-868,2010；Schneider等，Appl.Microbiol.Biotechnol.91:17-30,2011)。例如，WO09/125924公开了通过增强鸟氨酸生物合成途径而不是失活参与在大肠杆菌中存在的腐胺的降解和利用的途径和失活作为腐胺的前体的鸟氨酸到精氨酸的转化，来以高产率生产腐胺的方法。此外，Schneider(2010)公开了通过将能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质引入不具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种菌株和增强能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质进入不具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种菌株，以高浓度生产腐胺的方法。
而且，对在大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞中腐胺运载体的研究已经积极地进行(K Igarashi，Plant Physiol.Biochem.48:506-512,2010)。大肠杆菌的腐胺摄取经由4种途径发生；由ATP水解作用驱动的potABCD或potFGHI，和作为H+同向转运体(symporter)的potE和puu途径的puuP。关于参与腐胺摄取的这些复合体的Km值，PotFGHI、potABCD、potE和puuP的Km值分别为0.5mM、1.5mM、1.8mM和3.7mM。在这四种腐胺摄取途径中，potFGHI复合体被认为是最合适的。此外，potE运载体具有摄取和分泌腐胺二者的功能。腐胺在中性pH下与质子一起被输入细胞中。然而，由于腐胺合酶(speF)在酸性pH条件下表达，所以细胞外鸟氨酸的细胞内摄取和在细胞内合成的腐胺的细胞外分泌同时发生(Kurihara等，J.Bacteriology 191:8,2776-2782,2009)。
酵母中已知的腐胺输出蛋白(exporter)是TPO1和TPO4。这些氨基酸序列与芽孢杆菌多药运载体Blt的氨基酸序列非常相似。
这两种输出蛋白与大肠杆菌中的potE共享特征，并且它们在碱性条件下具有输入腐胺、亚精胺和精胺的功能并且在酸性条件下输出它们。此外，过表达TPO5基因的酵母细胞对120mM腐胺具有抗性，反之破坏TPO5基因的突变体对90mM腐胺敏感(Tachihara等，J.Biological Chemistry,280(13):12637-12642,2005)。
动物细胞中腐胺的合成和降解，以及摄取和分泌以不同的方式调控。虽然对聚胺分泌的研究还没有在动物细胞以及大肠杆菌或酵母中进行，但是有报道SLC3A2(精氨酸/二胺输出蛋白)在结肠上皮细胞中起将精氨酸输入细胞并输出腐胺、乙酰基亚精胺和乙酰基精胺的作用。然而，没有关于在植物细胞中摄取和输出腐胺的报道(Igarashi等，PlantPhysiol.&Biochem.48:506-512,2010)。
另一方面，由于棒状杆菌属某种微生物不具有腐胺生物合成途径，所以还没有进行关于腐胺输出的研究。根据最近的报道，通过在产生尸胺的菌株中过表达cg2983膜蛋白恢复细胞生长和增强尸胺生产力(Kind等，Metabolic Engineering 13:617-627,2011)。
然而，还没有关于腐胺输出蛋白和腐胺生产力或生产腐胺的微生物的生长之间的关联的报道。在以上的文献中，没有提及关于cg2983膜蛋白和腐胺的输出能力之间的关联。
在该背景下，本发明人已经进行了许多努力以开发能够以更高产率生产腐胺的菌株。结果，NCgl2522功能揭示为腐胺生产菌株——棒状杆菌属某种微生物——中的腐胺输出蛋白，并且可以通过与NCgl2522内源活性相比增强其活性以高产率生产腐胺。此外，培养基中腐胺的量可以通过在具有腐胺合成途径的大肠杆菌中表达NCgl2522增加，并且因此本发明人表明NCgl2522在大肠杆菌中也起腐胺输出蛋白的作用，从而完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供被修饰以具有增强的NCgl2522活性从而以高产率生产腐胺的重组微生物。
本发明的另一目的是提供使用该微生物以高产率生产腐胺的方法。
附图说明
图1是表明NCgl2522包含在根据本发明的克隆(B19)中的图，所述克隆(B19)最终选自引入有棒状杆菌属染色体文库的转化的菌落；和
图2是评估根据本发明的NCgl2522缺失的或增强的重组菌株的腐胺抗性的结果。
1：KCCM11240P
2：KCCM11240P△NCgl2522
3：KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522
具体实施方式
在实现以上目标的一方面中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其被修饰以增强具有由SEQ ID NO:21或23表示的氨基酸序列的蛋白质的活性。
在一个具体的实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中该微生物被进一步修饰以与其内源活性相比，具有减弱活性的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgl1221)，并且所述微生物被引入具有鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性。
在另一具体的实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)具有由SEQ ID NO:29表示的氨基酸序列，参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgl1221)具有由SEQ ID NO:30表示的氨基酸序列，并且鸟氨酸脱羧酶(ODC)具有由SEQID NO:33表示的氨基酸序列。
在仍另一具体实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中该微生物进一步修饰为与其内源活性相比，具有增强活性的乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)。
在仍另一具体的实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)分别具有由SEQ ID NO:25、26、27和28表示的氨基酸序列。
在仍另一具体实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中微生物的乙酰转移酶(NCgl1469)活性进一步被减弱。
在仍另一具体实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中乙酰转移酶具有由SEQ ID NO:31或32表示的氨基酸序列。
在仍另一具体实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中微生物是埃希式杆菌属某种或棒状杆菌属某种。
在仍另一具体实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中该微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
在另一方面，本发明提供生产腐胺的方法，其包括以下步骤：培养具有腐胺生产力的微生物以获得细胞培养物和从培养的微生物或细胞培养物回收腐胺。
在下文中，将详细地描述本发明。
本发明提供重组棒状杆菌属某种微生物，其中具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物被修饰为与其内源活性相比，具有增强的NCgl2522活性，并因此其具有提高的腐胺生产力。
如本文所使用，术语“NCgl2522”指的是属于MFS(主要协同转运蛋白超家族)的通透酶，其是从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032分离的膜蛋白。NCgl2522已知自谷氨酸棒状杆菌输出二氨基戊烷。在本发明中，NCgl2522被确认起用于将细胞内产生的腐胺细胞外输出的运载体的作用。基于此事实，本发明提供显示高产率腐胺生产力的重组微生物，其中NCgl2522被修饰为与其内源活性相比，具有增强的活性，并且因此，增加细胞内产生的腐胺的输出。
如本文所使用，术语“内源活性”指的是微生物在其天然状态即没有修饰的状态中具有的酶的活性，并且“修饰为与内源活性相比具有增强的活性”的意思是与修饰前的相应酶的活性相比，酶的活性被新引入或进一步提高。
在本发明中，“酶活性的增强”包括通过内源基因活性的提高造成的酶活性的提高、通过内部或外部因素造成的内源基因的扩增、抑制基因表达的调节因子的缺失、基因拷贝数的增加、通过引入外源基因或修饰表达调控序列——具体而言，基因内的启动子的置换或修饰以及突变——造成的活性的增加，以及其本身酶活性的引入或提高以实现超越内源功能的效果。
在本发明中，“修饰为与内源活性相比具有增强的活性”意思是与操纵前的微生物的活性相比，操纵后微生物的活性增加，所述操纵比如引入显示活性的基因，或增加基因拷贝数，缺失抑制基因表达的调控因子或修饰表达调控序列，例如，使用改进的启动子。
其活性通过本发明增加的NCgl2522可以是但不具体地限于如此蛋白质，所述蛋白质具有SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列或具有70％或更多与其同源性、优选地80％或更多与其同源性、更优选地90％或更多与其同源性、更优选地95％或更多与其同源性、更优选地98％或更多与其同源性和最优选地99％或更多与其同源性的氨基酸序列。进一步，因为显示活性的蛋白质的氨基酸序列可以根据微生物的种类或菌株而不同，所以蛋白质不限于此。即，蛋白质可以是蛋白突变体或人造变体，其氨基酸序列包括在SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列的一个或多个位置处的一个或数个氨基酸的替换、缺失、插入或添加，只要该蛋白质通过增强其活性有助于提高腐胺生产力。如本文所使用，术语“数个”氨基酸具体指2到20、优选地2到10、和更优选地2到5个氨基酸，但是它可以根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或类型而不同。而且，氨基酸的替换、缺失、插入、添加或倒位可包括自然发生的突变，其由于具有多肽或人造变体的活性的微生物的个体或物种的差异而发生。
在棒状杆菌属某种微生物中不存在腐胺生物合成途径。然而，当引入外来鸟氨酸脱羧酶(DOC)时，腐胺被合成并细胞外分泌，这表明存在运载体，即起棒状杆菌属某种微生物的许多膜蛋白之中的腐胺通道作用的输出蛋白。因此，为了分离棒状杆菌属某种微生物中的腐胺输出蛋白，本发明人制备了野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体文库，并且他们利用该文库转化生产腐胺的菌株——谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，并且选择在包含腐胺的基本培养基中生长的菌株。通过三次(tertiary)菌落选择，最终选择具有腐胺抗性的克隆(B19)并且进行碱基序列分析以确认该克隆包含NCgl2522(参见图1)。作为腐胺输出蛋白，衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522具有由SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列，并且衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的、与以上氨基酸序列具有98％同源性的NCgl2522具有由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列。
编码本发明的NCgl2522的多核苷酸可包括编码以下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有：SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列，或具有70％或更多与其同源性、优选地80％或更多与其同源性、更优选地90％或更多与其同源性、更优选地95％或更多与其同源性、更优选地98％或更多与其同源性和最优选地99％或更多与其同源性的氨基酸序列，只要该蛋白质的活性与NCgl2522蛋白质的活性相似，并且最优选地，其可包括SEQ ID NO:20或22的核苷酸序列。
如本文所使用的，术语“同源性”指的是两个氨基酸序列之间的相似性，并且可以使用利用BLAST 2.0的公知方法测定，BLAST 2.0计算参数比如得分、同一性和相似性。
进一步，编码本发明的NCgl2522的多核苷酸可以是在严格条件下与SEQ ID NO:20或22的核苷酸序列杂交的变体，或衍生自以上核苷酸序列的探针，条件是其编码功能性的NCgl2522。如本文所使用的，术语“严格条件”指的是使多核苷酸之间特异性杂交的条件。例如，这样的严格条件在文献(J.Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press,ColdSpring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NewYork)中详细描述。
在本发明中，“修饰为与内源活性相比具有增强的NCgl2522活性”可以通过选自以下的方法执行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、修饰表达调控序列以增加多核苷酸的表达、修饰染色体上的多核苷酸序列以增强酶的活性、使抑制基因表达的调控因子缺失和其组合。
多核苷酸的拷贝数可以，但是不具体地限于，通过可操作地将多核苷酸连接至载体或通过将其整合入宿主细胞基因组而增加。具体而言，宿主细胞基因组中多核苷酸的拷贝数可以通过将可操作地连接至编码本发明的蛋白质的多核苷酸和独立于宿主细胞复制和起作用的载体引入宿主细胞而增加，或通过将可操作地连接至多核苷酸和能够将多核苷酸整合入宿主细胞基因组的载体引入宿主细胞而增加。
如本文所使用的，术语“载体”指的是包含编码期望蛋白质的核苷酸序列的DNA构建体，其可操作地连接至适当的表达调控序列以在适合的宿主细胞中表达期望的蛋白质。该调控序列包括可以引发转录的启动子、调控转录的任选的操纵基因(operator)序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列、和调控转录和翻译终止的序列。在载体被转化入适当的宿主细胞之后，其可以独立于宿主基因组复制或起作用，并且可以将载体整合入基因组本身。
在本发明中使用的载体不具体地限制，只要它能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域中任何已知的载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、卡隆4A和卡隆21A可以用作噬菌体载体或黏粒载体。作为质粒载体，可使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型。本发明中可使用的载体不具体地限制，并且可以使用任何已知的表达载体。优选地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体，并且更优选地，可以使用pDZ载体。
进一步，染色体中编码期望蛋白的多核苷酸可以使用用于染色体插入的载体由突变的多核苷酸置换。将多核苷酸插入染色体可以通过本领域中任何已知的方法执行，例如，同源重组。由于本发明的载体可以通过同源重组插入染色体，所以它可以进一步包括选择标记以确认染色体插入。选择标记是为了选择转化有载体的细胞，即，为了确认期望的多核苷酸的插入，并且选择标记可包括提供可选择表型的标记，所述表型比如抗药性、辅源营养、对细胞毒素剂的抗性或表面蛋白表达。仅表达选择标记的细胞能够在利用选择剂处理的环境下生存或显示不同的表型，并因而可以选择转化的细胞。
如本文所使用的，术语“转化”指的是将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体以由该多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达的方式引入宿主细胞。只要转化的多核苷酸在宿主细胞中可以表达，它可以被整合入或放置在宿主细胞的染色体中，或者可以染色体外地存在。进一步，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。该多核苷酸可以以任何形式引入，只要它可以被引入宿主细胞中并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒为包含其自主表达所需要的所有元件的基因构建体。通常，表达盒包括可操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点或翻译终止信号。该表达盒可以是自身可复制的表达载体的形式。多核苷酸也可以被引入宿主细胞并且可操作地连接至在宿主细胞中表达所需要的序列。
进一步，如本文所使用的，术语“可操作地连接”指的是编码期望蛋白质的多核苷酸序列与引发和介导多核苷酸序列转录的启动子序列之间的功能性连接。
同样，用于增加多核苷酸表达的表达调控序列的修饰可以，但不限于，通过在表达调控序列上通过核苷酸序列的缺失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导修饰以便进一步增强表达调控序列的活性而进行，或通过利用具有更强活性的核苷酸序列置换表达调控序列而进行。该表达调控序列包括，但不具体地限于，启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列。
强异源启动子代替原始启动子可以在多核苷酸表达单位的上游连接，并且强启动子的实例可包括CJ7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子，并且更优选地，作为棒状杆菌属衍生的启动子的lysCP1启动子或CJ7启动子，并且编码该酶的多核苷酸可操作地与其连接使得其表达率可以增加。在此，lysCP1启动子是通过核苷酸序列替换编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的多核苷酸的启动子区域的改进的启动子，并且与野生型相比，是增加天冬氨酸激酶基因表达的强启动子，导致相应酶活性5倍增加(WO2009/096689)。进一步，CJ7启动子是这样的启动子，其在产氨短杆菌中探查(exploration)强启动子序列期间被发现并且确认在产氨短杆菌和埃希氏杆菌属中表达并且具有强启动子活性。CJ7启动子是也在谷氨酸棒状杆菌中显示高表达活性的启动子(韩国专利号0620092和WO2006/065095)。
而且，染色体上的多核苷酸序列的修饰可以，但不具体限于，通过在表达调控序列上通过多核苷酸序列的缺失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导突变以便进一步增强表达多核苷酸序列的活性而进行，或通过利用修饰为具有更强活性的多核苷酸序列置换该序列而进行。
在本发明的一个优选的实施方式中，为了提供具有提高的腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物，基因拷贝数可以通过将具有编码参与腐胺分泌的NCgl2522的SEQ ID NO:20或22的核苷酸序列的多核苷酸引入染色体而增加，或NCgl2522的自身启动子可以用具有提高活性的启动子，优选地，具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的CJ7启动子替换。
如本文所使用的，术语“具有腐胺生产力的微生物”或“生产腐胺的微生物”指的是通过为不具有腐胺生产力的亲本菌株提供腐胺生产力而制备的微生物。提供有腐胺生产力或生产腐胺的微生物可以是，但不具体限于，具有被用作腐胺生物合成的原料的鸟氨酸的提高生产力的微生物，其中为了增强从谷氨酸到鸟氨酸的生物合成途径，该微生物被修饰为具有比内源活性更高活性的转化谷氨酸至乙酰谷氨酸(N-乙酰谷氨酸)的乙酰谷氨酸合酶或转化乙酰鸟氨酸至鸟氨酸的鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、转化乙酰谷氨酸至乙酰谷氨酰基磷酸盐(N-乙酰谷氨酰基磷酸盐)的乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、转化乙酰谷氨酰基磷酸盐至乙酰谷氨酸半醛(N-乙酰谷氨酸半醛)的乙酰基-γ-谷氨酰基磷酸还原酶(ArgC)、或转化乙酰谷氨酸半醛至乙酰鸟氨酸(N-乙酰鸟氨酸)的乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)。进一步，该微生物是被修饰为具有比内源活性更弱活性的参与从鸟氨酸合成精氨酸的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)、参与谷氨酸分泌的蛋白质(NCgl1221)、和/或乙酰化腐胺的蛋白质(NCgl469)的微生物，和/或被修饰为具有鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性的微生物。
就这一点而言，乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)、参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgl1221)和鸟氨酸脱羧酶(ODC)可以具有，但是不具体地限于，优选地分别由SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30和33表示的氨基酸序列，或分别具有70％或更多与其同源性，更优选80％或更多与其同源性，或更优选90％或更多与其同源性的氨基酸序列。此外，乙酰化腐胺的蛋白质(NCgl469)可具有，但是不具体地限于，优选地由SEQ ID NO:31或32表示的氨基酸序列，或具有70％或更多与其同源性，更优选80％或更多与其同源性，或更优选90％或更多与其同源性的氨基酸序列。
在这些蛋白质中，乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)和鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性的增加可以通过以上描述的增加NCgl2522活性的方法实现，例如，选自以下方法的方法：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、修饰表达调控序列以增加多核苷酸的表达、修饰染色体上的多核苷酸序列以增强酶的活性、使抑制酶的多核苷酸表达的调控因子缺失、和其组合。
进一步，鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)、参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgl1221)和乙酰化腐胺的蛋白质(NCgl469)的活性可以通过选自以下的方法减弱：编码该蛋白质的多核苷酸的部分或全部缺失、修饰表达调控序列用于抑制多核苷酸表达、修饰染色体上的多核苷酸序列用于减弱蛋白质活性和其组合。
具体地，编码蛋白质的多核苷酸的部分或全部缺失可以通过将用于染色体插入的载体引入微生物，从而利用部分去除的多核苷酸或标记基因替换染色体上编码内源靶蛋白的多核苷酸而进行。所述“部分”可根据多核苷酸的类型而变化，但是具体指1到300，优选地1到100，并且更优选地1到50个核苷酸。
而且，表达调控序列的修饰可以通过在表达调控序列上通过核苷酸序列的缺失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导修饰以便减弱表达调控序列的活性而进行，或通过利用具有更弱活性的核苷酸序列置换表达调控序列而进行。该表达调控序列包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列。
此外，染色体上多核苷酸序列的修饰可以通过在序列上通过多核苷酸序列的缺失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导突变以便进一步减弱酶活性而进行，或通过利用被修饰为具有更弱活性的多核苷酸序列置换该序列而进行。
而且，抑制酶的多核苷酸表达的调控因子可以通过利用部分去除的多核苷酸或标记基因替换表达抑制因子的多核苷酸而缺失。所述“部分”可以根据多核苷酸的类型变化，但是具体指1到300，优选地1到100，并且更优选地1到50个核苷酸。
同时，本发明的微生物是具有腐胺生产力的微生物，并包括表达具有由SEQ IDNO:21或23表示的氨基酸序列的蛋白质的原核微生物，并且其实例可包括属于以下菌属的微生物：埃希氏杆菌属某种、志贺氏杆菌属某种、柠檬酸杆菌属某种、沙门氏菌属某种、肠杆菌属某种、耶尔森菌属某种、克雷白氏杆菌属某种、欧文氏菌属某种、棒状杆菌属某种、短杆菌属某种、乳酸菌属某种、月形单胞菌属某种(Selenomanas sp.)、弧菌属某种、假单胞菌属某种、链霉菌属某种、隐秘杆菌属某种、产碱杆菌属某种等。本发明的微生物优选为属于埃希氏杆菌属某种的微生物或属于棒状杆菌属某种的微生物，和更优选地，大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
在本发明的具体的实施方式中，具有登录号KCCM11138P的棒状杆菌属某种微生物(韩国专利公开号2012-0064046)和具有登录号KCCM11240P的棒状杆菌属某种微生物(韩国专利申请号2012-0003634)被用作具有从谷氨酸到腐胺的增强的合成途径的菌株，从而以高浓度生产腐胺。
在本发明的仍另一实施方式中，使用基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的腐胺生产菌株——KCCM11138P和KCCM11240P，和具有相同基因型的基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的腐胺生产菌株——DAB12-a和DAB12-b。ATCC13869菌株可以从美国菌种保藏中心(ATCC)获得。即，对于每个菌株，在给予的ATCC的目录中列出唯一的登录号，并且该菌株可以使用该登录号订购。具体而言，腐胺生产菌株DAB12-a的特征在于：缺失编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的基因和编码谷氨酸输出蛋白NCgl1221的基因，引入编码鸟氨酸脱羧酶(OCD)的基因，和由谷氨酸棒状杆菌ATCC13869中的改进的启动子置换鸟氨酸生物合成基因操纵子(argCJBD)的启动子。进一步，腐胺生产菌株DAB12-b的特征在于，其通过修饰DAB12-a菌株而制备以具有与内源活性相比减弱活性的乙酰化腐胺的蛋白质(NCgl1469)。
根据一个优选的实例，通过缺失编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的基因和编码谷氨酸输出蛋白NCgl1221的基因，由改进的启动子置换编码参与从谷氨酸合成鸟氨酸的酶的ArgCJBD基因簇的自身启动子，和将编码鸟氨酸脱羧酶(ODC)的基因引入野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中的染色体而制备谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，并且通过另外地使在微生物中编码乙酰转移酶NCgl1469的基因减弱而制备的谷氨酸棒状杆菌KCCM11240P被制备为腐胺生产菌株。
同时，为了制备衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522缺失菌株，基于衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522的氨基酸序列，制备质粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)。
将质粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)转化入制备的腐胺生产菌株KCCM11138P和KCCM11240P内，并选择作为NCgl2522缺失菌株，并且这些菌株分别命名为KCCM11138PΔNCgl2522和KCCM11240PΔNCgl2522。以相同的方式，制备衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl2522缺失菌株并命名为DAB12-aΔNCgl2522和DAB12-bΔNCgl2522。
将如此制备的4种类型的NCgl2522缺失的菌株的腐胺生产力与亲本菌株的腐胺生产力进行比较，结果，与亲本菌株相比，所有NCgl2522缺失的KCCM11138PΔNCgl2522、KCCM11240PΔNCgl2522、DAB12-aΔNCgl2522和DAB12-bΔNCgl2522中的腐胺生产力降低(参见表3)。基于此结果，本发明人确认腐胺生产菌株中NCgl2522活性与腐胺生产力密切相关，并且为了通过增强活性增加腐胺生产力，他们制备了NCgl2522增强菌株。
为此，在本发明的一个优选的实例中，NCgl2522被另外地引入到谷氨酸棒状杆菌菌株的转座子内，或者染色体内的自身NCgl2522启动子被由本发明人最近开发的CJ7启动子(KCCM10617，韩国专利号10-0620092)置换。
将如此制备的6种类型的NCgl2522增强菌株的腐胺生产力与亲本菌株的腐胺生产力进行比较，结果，与亲本菌株相比，通过将NCgl2522另外引入到转座子内制备的所有菌株的腐胺生产力增加(参见表8)。在显示腐胺生产力提高的NCgl2522增强菌株中测量细胞内腐胺浓度，结果，与亲本菌株相比，它们显示细胞内腐胺浓度的降低(参见表9)。基于这些结果，本发明人确认细胞内生产的腐胺的细胞外输出通过增强腐胺生产菌株中的NCgl2522活性而增加，从而提高腐胺生产力。
因此，具有增强的腐胺生产力——其中腐胺生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P被修饰为与内源活性相比，具有增强的NCgl2522活性，并因此显示增强的输出腐胺的能力——的棒状杆菌属某种微生物命名为谷氨酸棒状杆菌CC01-0510，并在2013年3月8日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11401P。
根据本发明的另一方面，本发明提供了生产腐胺的方法，包括以下步骤：
(i)培养具有腐胺生产力的微生物以获得细胞培养物；和
(ii)从培养的微生物或细胞培养物回收腐胺。
在该方法中，培养微生物的步骤可以，但是不具体地限于，优选地通过本领域已知的分批培养、连续培养和补料分批培养进行。就这一点而言，培养条件不具体地限制，但是最佳的pH(例如，pH 5到9，优选地pH 6到8，和最优选地pH 6.8)可以通过使用碱性化学品(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化学品(例如，磷酸或硫酸)保持。而且，需氧条件可以通过将氧或含氧气体混合物加入到细胞培养物保持。培养温度可以保持在20到45℃，并优选地在25到40℃。此外，培养优选地进行大约10到160小时。通过以上培养产生的腐胺可排出至培养基或保留在细胞内。
而且，待使用的培养基可包括糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油脂(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，软脂酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，丙三醇和乙醇)和有机酸(例如，乙酸)单独地或结合作为碳源；含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米溶液、大豆粉和尿素)、或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)单独地或结合作为氮源；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其相应的含钠盐单独地或结合作为磷源；其它必需的生长刺激物质包括金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。
回收在本发明的培养步骤中生产的腐胺的方法可以，例如，根据分批培养、连续培养或补料分批培养使用本领域中已知的合适方法执行，从而从培养物中收集期望的氨基酸。
在下文中，将参考实施例更详细的描述本发明。然而，这些实施例仅是说明性的目的，并且本发明不意欲由这些实施例限制。
参考实施例1：制备具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物
为了制备具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物，阻断自鸟氨酸的精氨酸生物合成途径，增强自谷氨酸的鸟氨酸生物合成途径，并且引入外来的鸟氨酸脱羧酶(OCD)以制备提供有腐胺生产力的微生物，如韩国专利公开号10-2012-0064046中描述的。
具体而言，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，将菌株染色体中编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的基因和编码NCgl1221——其是参与谷氨酸输出的蛋白质——的基因通过同源重组缺失，从而增加为鸟氨酸前体的谷氨酸的细胞内含量。进一步，将衍生自野生型大肠杆菌W3110的编码鸟氨酸脱羧酶(ODC)——其参与从鸟氨酸合成腐胺——的基因引入菌株的染色体中。此外，编码参与从谷氨酸合成鸟氨酸的酶的argCJBD基因簇的自身启动子由改进的启动子CJ7启动子置换以制备具有腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株。此时，argCJBD编码乙酰基-γ-谷氨酰基磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)，其参与自谷氨酸的鸟氨酸生物合成途径。如此制备的具有腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株在2010年11月24日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11138P。关于具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物的制备的详细描述在韩国专利公开号10-2012-0064046中描述，其公开内容以其全部通过引用并入。
参考实施例2：制备具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物
编码参考实施例1中制备的谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P中的乙酰转移酶NCgl1469的基因被减弱以不产生N-乙酰基腐胺，从而制备具有提高的腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株为另一种具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物。
具体而言，基于编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl1469的基因的核苷酸序列，用于获得NCgl1469的N-末端区域的同源重组片段的SEQ ID NO:1和2的引物对和用于获得NCgl1469的C-末端区域的同源重组片段的SEQ ID NO:3和4的引物对如下表1构建。
[表1]
使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板和两个引物对进行PCR，从而分别获得N-末端区域和C-末端区域的PCR片段。将这些PCR片段电泳以获得期望的片段。此时，进行PCR反应30个循环：95℃下变性30秒、55℃下退火30秒和72℃下延伸30秒。如此获得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和SalI处理，并且如此获得的C-末端区域的片段用限制性内切酶SalI和XbaI处理。将如此处理的片段克隆入用限制性内切酶BamHI和XbaI处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-NCgl1469(K/O)。
将质粒pDZ-NCgl1469(K/O)通过电穿孔转化入谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P内以获得转化体。然后，将该转化体铺板(plate)并在包含卡那霉素(25μg/ml)和X-gal(5-溴-4-氯-3-二氢吲哚-D-半乳糖苷)的BHIS平板(37g/l Braine心浸液，91g/l山梨醇，2％琼脂)上培养，用于菌落形成。从平板上形成的菌落，选择蓝色菌落作为引入有质粒pDZ-NCgl1469(K/O)的菌株。
将选择的菌株接种在CM培养基(10g/l葡萄糖，10g/l聚胨，5g/l酵母提取物，5g/l牛肉膏，2.5g/l NaCl，2g/l尿素，pH 6.8)中在30℃下摇动培养8小时。随后，将每个细胞培养物从10-4连续地稀释到10-10。然后，将稀释的样品铺板并在包含X-gal的固体培养基上培养，用于菌落形成。
从形成的菌落，选择以相对低频率出现的白色菌落以制备通过缺失编码NCgl1469的基因而具有提高的腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株。如此制备的具有提高的腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株被命名为KCCM11138PΔNCgl1469并且在2011年12月26日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11240P。关于具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物的制备的详细描述在韩国专利申请号10-2012-0003634中给出，其公开内容以其全部通过引用并入。
实施例1：腐胺输出蛋白的探查和具有腐胺抗性的文库克隆的选择
谷氨酸棒状杆菌不具有腐胺生物合成途径。然而，当将外部鸟氨酸脱羧酶引入谷氨酸棒状杆菌以具有生产腐胺的能力时，它产生和细胞外地分泌腐胺。这表明在棒状杆菌属某种微生物的许多膜蛋白之中起腐胺通道作用的运载体的存在。
为了从棒状杆菌属某种微生物分离和隔离腐胺输出蛋白，制备野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体文库。具体而言，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体用限制性内切酶Sau3AI处理，进行不完全切割。分离3～5kb的基因片段，并将其克隆入用BamHI处理的pECCG122载体(大肠杆菌和棒状杆菌属的穿梭载体；韩国专利公开号10-1992-0000933)。
将如此获得的棒状杆菌染色体文库转化入腐胺生产菌株——根据参考实施例1的谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，然后选择在0.35M包含腐胺的基本培养基(在1升蒸馏水的基础上，其包含10g葡萄糖，0.4g MgSO4·7H2O，4g NH4Cl，1g KH2PO4，1g K2HPO4，2g尿素，10mgFeSO4·7H2O，1mg MnSO4·5H2O，5mg烟酰胺，5mg盐酸硫胺素，0.1mg生物素，1mM精氨酸，25mg卡那霉素，0.35M腐胺，pH 7.0)中生长的菌株。从引入有棒状杆菌染色体文库的大约5.5×105种转化体，选择413个菌落，然后每个文库克隆——其腐胺抗性也通过二次检测确定——被重新引入腐胺生产菌株。最终，选择一个克隆(B19)，其腐胺抗性通过三次检测确定。使该克隆经受核苷酸序列分析。结果，发现在B19克隆中具有NCgl2522(图1)。
从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中作为腐胺输出蛋白分离的NCgl2522具有由SEQ IDNO:21表示的氨基酸序列，其由具有由SEQID NO:20表示的核苷酸序列的多核苷酸编码。
实施例2：NCgl2522缺失菌株的制备和其腐胺生产力的检测
<2-1>从基于ATCC13032的腐胺生产菌株制备NCgl2522缺失菌株
为了检测谷氨酸棒状杆菌ATCC13032衍生的NCgl2522是否参与腐胺输出，构建缺失编码NCgl2522的基因的载体。
具体而言，基于编码NCgl2522的基因的核苷酸序列——其由SEQID NO:20表示，用于获得NCgl1469的N-末端区域的同源重组片段的SEQ ID NO:5和6的引物对和用于获得NCgl1469的C-末端区域的同源重组片段的SEQ ID NO:7和8的引物对如下表2中构建。
[表2]
使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板和两个引物对进行PCR，从而扩增NCgl2522基因的N-末端区域和C-末端区域的PCR片段。电泳这些PCR片段以获得期望的片段。此时，进行PCR反应30个循环：95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒。如此获得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和SalI处理，和如此获得的C-末端区域的片段用限制性内切酶SalI和XbaI处理。将如此处理的片段克隆入用限制性内切酶BamHI和XbaI处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)。
将质粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)通过电穿孔分别转化入参考实施例1和2的谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P和KCCM11240P中，从而获得转化体。然后，将该转化体铺板并在包含卡那霉素(25μg/ml)和X-gal(5-溴-4-氯-3-二氢吲哚-D-半乳糖苷)的BHIS平板(37g/l Braine心浸液，91g/l山梨醇，2％琼脂)上培养，用于菌落形成。从平板上形成的菌落，选择蓝色菌落作为引入有质粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)的菌株。
将选择的菌株在CM培养基(10g/l葡萄糖，10g/l聚胨，5g/l酵母提取物，5g/l牛肉膏，2.5g/l NaCl，2g/l尿素，pH 6.8)中在30℃下摇动培养8小时。随后，将每个细胞培养物从10-4连续地稀释到10-10。然后，将稀释的样品铺板并在包含X-gal的固体培养基上培养，用于菌落形成。从形成的菌落，选择以相对低频率出现的白色菌落以最终获得菌株，在该菌株中编码NCgl2522的基因通过二次交换缺失。最终选择的菌株使用SEQ ID NO:5和8的引物对经历PCR以确定编码NCgl2522的基因的缺失。谷氨酸棒状杆菌突变菌株分别被命名为KCCM11138PΔNCgl2522和KCCM11240PΔNCgl2522。
<2-2>从基于ATCC13869的腐胺生产菌株制备NCgl2522缺失菌株
NCgl2522缺失菌株从基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的腐胺生产菌株制备，所述菌株为具有与KCCM11138P和KCCM11240P相同基因型的DAB12-a(argF缺失，NCgl1221缺失，大肠杆菌speC引入，arg操纵子启动子替换；参见参考实施例1)和DAB12-b(argF缺失，NCgl1221缺失，大肠杆菌speC引入，arg操纵子启动子替换，NCgl1469缺失，参见参考实施例2)，KCCM11138P和KCCM11240P为基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的腐胺生产菌株。
具体而言，为了检测编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因序列和由其表达的蛋白质，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:5和8的引物对进行PCR。此时，进行PCR反应30个循环：95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下延伸2分钟。将如此获得的PCR产物通过电泳分离，并进行测序。结果，发现编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因的核苷酸序列由SEQ ID NO:22表示，和由此编码的蛋白质的氨基酸序列由SEQ ID NO:23表示。当谷氨酸棒状杆菌ATCC13032衍生的NCgl2522的氨基酸序列与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的氨基酸序列相比较时，发现它们具有98％的序列同源性。
为了缺失编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因，以与实施例<2-1>相同的方式，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板和表2的两个引物对进行PCR，从而分别扩增NCgl2522基因的N-末端区域和C-末端区域的PCR片段。将这些PCR片段电泳以获得期望的片段。此时，进行PCR反应30个循环：95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒。如此获得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和SalI处理，并且如此获得的C-末端区域的片段用限制性内切酶SalI和XbaI处理。将如此处理的片段克隆入用限制性内切酶BamHI和XbaI处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-2’NCgl2522(K/O)。
以与实施例<2-1>中相同的方式，将质粒pDZ-2’NCgl2522(K/O)分别转化入谷氨酸棒状杆菌DAB12-a和DAB12-b。选择其中编码NCgl2522的基因被缺失的菌株。如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株分别被命名为DAB12-aΔNCgl2522和DAB12-bΔNCgl2522。
<2-3>NCgl2522缺失菌株的腐胺生产力的评估
为了确定腐胺生产菌株中NCgl2522缺失对腐胺生产力的影响，将实施例<2-1>和<2-2>中制备的谷氨酸棒状杆菌突变菌株的腐胺生产力进行比较。
具体而言，将4种类型的谷氨酸棒状杆菌突变体(KCCM11138PΔNCgl2522、KCCM11240PΔNCgl2522、DAB12-aΔNCgl2522和DAB12-bΔNCgl2522)和4种类型的亲本菌株(KCCM11138P、KCCM11240P、DAB12-a和DAB12-b)分别在包含1mM精氨酸的CM平板培养基(1升基础上，1％葡萄糖，1％聚胨，0.5％酵母提取物，0.5％牛肉膏，0.25％NaCl，0.2％尿素，100μl 50％NaOH，2％琼脂，pH 6.8)上铺板，并在30℃下培养24小时。将1个接种环(platinumloop)的如此培养的每种菌株接种在25ml效价培养基(1升基础上，8％葡萄糖，0.25％大豆蛋白，0.50％固体玉米浆，4％(NH4)2SO4，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.15％尿素，100g生物素，3mg盐酸硫胺素，3mg泛酸钙，3mg烟酰胺，5％CaCO3)中，然后在30℃和200rpm下摇动培养98小时。将1mM精氨酸加入到培养基中，用于培养所有菌株。测量每个培养物中的腐胺浓度，结果在下面的表3中显示。
[表3]
如表3中所示，在4种类型的NCgl2522缺失的谷氨酸棒状杆菌突变菌株中观察到腐胺产量的显著降低。
实施例3：NCgl2522增强菌株的制备和其腐胺生产力的检测
<3-1>将NCgl2522引入到ATCC13032染色体中的转座子基因中
为了确认通过具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物KCCM11138P中的NCgl2522基因(包含自身启动子区域)的另外的染色体插入引起腐胺的高产，将NCgl2522引入到转座子基因。使用用于转化的载体pDZTn(韩国专利公开号10-2008-0033054)，其允许将基因引入使用的棒状杆菌属某种微生物的染色体上的转座子基因。
包含自身启动子的NCgl2522基因使用ATCC13032菌株的染色体作为模板以及SEQID NO:9和10的引物对进行扩增(表4)。此时，进行PCR反应30个循环：95℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒或2分钟。通过PCR，获得具有1.88kb大小的基因片段。将该PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳以洗脱和纯化期望大小的带。pDZTn载体用XhoI处理，并进行ATCC13032菌株的NCgl2522PCR产物的融合克隆。在融合克隆中使用In-FusionHDCloning Kit(Clontech)。得到的质粒命名为pDZTn-1’NCgl2522。
[表4]
将质粒pDZTn-1’NCgl2522通过电穿孔转化入参考实施例1中描述的谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P中以获得转化体。从转化体，以与实施例2中相同的方式选择其中NCgl2522被引入转座子的菌株。
使用选择的菌株的基因组DNA和SEQ ID NO:9和10的引物对进行PCR，从而确认NCgl2522通过引入质粒pDZTn-1’NCgl2522被引入到转座子中。此时，进行PCR反应30个循环：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下延伸2分钟。
如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为KCCM11138PTn:1’NCgl2522。
<3-2>从基于ATCC13032的腐胺生产菌株制备NCgl2522启动子替换的菌株
为了增强腐胺生产菌株中NCgl2522活性，在染色体上NCgl2522起始密码子前面引入CJ7启动子(WO 2006/65095)。
首先，获得包含在启动子两端具有由SEQ ID NO:24表示的核苷酸序列和具有原始NCgl2522序列的CJ7启动子的同源重组片段。具体而言，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板和SEQID NO:11和12的引物对进行PCR以获得CJ7启动子的5’-末端区域。此时，进行PCR反应30个循环：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒。进一步，在相同的条件下使用SEQ ID NO:13和14的引物对进行PCR以获得CJ7启动子区域。此外，在相同的条件下使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组作为模板和SEQ IDNO:15和16的引物对进行PCR以获得CJ7启动子的3’-末端区域。启动子替换中使用的引物与下面的表5中的相同。
[表5]
将如此获得的每种PCR产物融合-克隆入用BamHI和XbaI处理的pDZ载体。在融合克隆中使用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)。所得质粒命名为pDZ-P(CJ7)-1’NCgl2522。
将如此制备的质粒pDZ-P(CJ7)-1’NCgl2522通过电穿孔转化入根据参考实施例1和2的谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P和KCCM11240P从而制备转化体。将如此制备的转化体接种在CM培养基中并且在30℃下摇动培养8小时。将由此获得的每个细胞培养物从10-4稀释到10-10，并在包含25μg/ml卡那霉素和X-gal的BHIS平板上铺板和培养，用于菌落形成。
与大多数具有蓝色的菌落相比，白色菌落以相对低频率出现，并且选择其以最终获得菌株，在该菌株中NCgl2522启动子用CJ7启动子通过二次交换替换。使用选择的菌株的基因组DNA作为模板和SEQ IDNO:13和16的引物对进行PCR以确定通过引入质粒pDZ-1’CJ7(NCgl2522)将CJ7启动子引入到染色体上的NCgl2522起始密码子的前面。此时，进行PCR反应30个循环：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下延伸1分钟。
如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株分别命名为KCCM11138PP(CJ7)-NCgl2522和KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522。
<3-3>将NCgl2522基因引入ATCC13869染色体上的转座子基因中
为了确认通过谷氨酸棒状杆菌微生物ATCC13869衍生的腐胺菌株中NCgl2522基因的另外的染色体插入引起腐胺的高产，确定将NCgl2522(包含启动子区域)引入到转座子基因。使用ATCC13869菌株的染色体作为模板和SEQ ID NO:17和10的引物对(参见表6)扩增NCgl2522基因。此时，进行PCR反应30个循环：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒或2分钟。通过PCR，获得具有1.97kb大小的基因片段。将如此制备的NCgl2522PCR片段融合-克隆入用XhoI处理的pDZTn载体。在融合克隆中使用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)。所得质粒命名为pDZTn-2’NCgl2522。
[表6]
以与实施例<3-1>相同的方式将质粒pDZTn-2’NCgl2522转化入谷氨酸棒状杆菌DAB12-a以确定NCgl2522引入转座子。
如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为DAB12-aTn:2’NCgl2522。
<3-4>从基于ATCC13869的腐胺生产菌株制备NCgl2522启动子替换的菌株
为了在谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl2522起始密码子前面引入CJ7启动子，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板和下面表7中给出的三个引物对以与实施例<3-2>中相同的方式分别进行PCR。结果，CJ7启动子区域、其N-末端区域和C-末端区域的PCR片段被扩增然后电泳以获得期望的片段。此时，进行PCR反应30个循环：94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，和72℃下延伸30秒。将如此获得的CJ7启动子区域、其N-末端区域和C-末端区域的PCR片段融合-克隆入用BamHI和XbaI处理的pDZ载体。在融合克隆中使用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)。所得的质粒命名为pDZ-P(CJ7)-2’NCgl2522。
[表7]
以与实施例<3-2>中相同的方式将质粒pDZ-’P(CJ7)-2’NCgl2522转化入谷氨酸棒状杆菌DAB12-a和DAB12-b的每个中以选择菌株，在该菌株中将CJ7启动子引入NCgl2522起始密码子的前面。如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522和DAB12-bP(CJ7)-NCgl2522。
<3-5>NCgl2522增强菌株的腐胺生产力的评估
为了确定在腐胺生产菌株中通过启动子替换NCgl2522活性增强对腐胺生产力的影响，将实施例<3-1>到<3-4>中制备的6种类型的谷氨酸棒状杆菌突变菌株(KCCM11138PTn:1’NCgl2522、KCCM11138PP(CJ7)-NCgl2522、KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522、DAB12-aTn:2’NCgl2522、DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522和DAB12-bP(CJ7)-NCgl2522)和4种类型的亲本菌株(KCCM11138P、KCCM11240P、DAB12-a和DAB12-b)的腐胺生产力进行比较。将每种菌株以与实施例2-3中相同的方式培养，并且测量每种培养物中的腐胺浓度，结果在下面的表8中显示。
[表8]
如表8中所显示的，在其中NCgl2522活性通过将NCgl2522另外的引入到转座子或通过启动子替换而增强的所有6种类型的谷氨酸棒状杆菌突变菌株中观察到腐胺产量的增加。
实施例4：NCgl2522增强菌株的细胞内腐胺浓度的测量
为了确认在具有增强的NCgl2522活性的谷氨酸棒状杆菌突变菌株中细胞内腐胺浓度通过增强的输出腐胺的能力而降低，将谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Tn:1’NCgl2522和亲本菌株KCCM11138P中的细胞内腐胺浓度通过使用有机溶剂提取进行测量。细胞内代谢物分析根据文献(Nakamura J等，Appl.Environ.Microbiol.73(14):4491-4498,2007)中描述的方法进行。
首先，将谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Tn:1’NCgl2522和亲本菌株KCCM11138P接种在包含1mM精氨酸的25ml的CM液体培养基(在1升的基础上，1％葡萄糖，1％聚胨，0.5％酵母提取物，0.5％牛肉膏，0.25％NaCl，0.2％尿素，100μl 50％NaOH，pH 6.8，)中，并在30℃和200rpm下摇动培养。当细胞生长在培养期间达到指数期时，将细胞从培养基中通过快速真空过滤(Durapore HV，0.45μm；Millipore，Billerica，MA)分离。将吸附细胞的过滤器用10ml冷水洗涤两次，然后在包含5M吗啉乙磺酸和5M蛋氨酸砜的乙醇中浸泡10分钟。
将由此获得的提取液与等体积的氯仿和0.4倍体积的水混合均匀，并且仅将水相施加于吸附柱(spin column)以去除蛋白污染物。通过毛细管电泳质谱分析过滤的提取液，结果在下面的表9中显示。
[表9]
菌株 腐胺(mM)
KCCM11138P 7
KCCM11138P Tn:1’NCgl2522 2
如表9中所显示的，与亲本菌株KCCM11138P相比，在具有增强的NCgl2522活性的谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138PTn:1’NCgl2522中观察到细胞内腐胺浓度的降低。这表明通过谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Tn:1’NCgl2522中NCgl2522活性的增强引起的提高的输出腐胺的能力导致细胞内腐胺的有效的细胞外输出。
实施例5：NCgl2522缺失或增强菌株的腐胺抗性的评估
为了检测NCgl2522对腐胺抗性的影响，评估了KCCM11240P、KCCM11240P△NCgl2522和KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522菌株的腐胺抗性。
将每种菌株接种在包含1mM精氨酸的2ml的CM液体培养基中并在30℃下培养大约10小时，然后以105、104、103、102和101的顺序进行稀释。将如此制备的每种稀释物在包含0M或0.8M腐胺的CMA平板(在1升基础上，1％葡萄糖，1％聚胨，0.5％酵母提取物，0.5％牛肉膏，0.25％NaCl，0.2％尿素，1.8％琼脂，1mM精氨酸，pH 6.8)上点样(spot)，并在30℃下培养48小时以比较菌株之间的生长差异。
结果，菌株显示两种不同的生长模式。如图2中所显示的，NCgl2522基因缺失菌株在高浓度腐胺的条件下不生长，而NCgl2522基因增强菌株在相同条件下生长。该结果显示，与亲本菌株相比，在高浓度腐胺的条件下KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522的细胞生长增加是由增加的输出腐胺的能力——其由于NCgl2522基因的增强——引起的。结果，NCgl2522的引入和增强对于高浓度腐胺的发酵是必需的。
实施例6：通过将NCgl2522引入大肠杆菌中的腐胺发酵
为了确定当谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522在具有腐胺生物合成途径的野生型大肠杆菌菌株W3110中表达时，腐胺产量是否增加，将表达speC——其为腐胺合成酶——的载体或表达NCgl2522的载体引入W3110。
为了制备表达speC的载体，使用W3110染色体作为模板和SEQ IDNO:34和35的引物对扩增大约2.1kb的speC基因片段(参见表10)。该PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，然后将期望大小的带洗脱并纯化。包含Trc启动子的pSE280载体(Invitrogen)用NcoI和EcoRI处理，然后将speC PCR产物融合-克隆入该载体内。在融合克隆中使用 HDCloning Kit(Clontech)。所得质粒命名为pSE280-speC。
为了制备表达NCgl2522的载体，使用pSE280作为模板和SEQ ID NO:36和37的引物对获得Trc启动子片段，并且使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032染色体作为模板和SEQ ID NO:38和39的引物对获得NCgl2522片段。这些PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，然后将期望大小的带洗脱并纯化。将Trc启动子片段和NCgl2522片段融合-克隆入用HindIII处理的pcc1BAC中。所得质粒命名为pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522。
[表10]
将质粒pSE280-speC或pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522转化入W3110。使用2×TSS溶液(Epicentre)进行转化入大肠杆菌。将引入pSE280-speC的大肠杆菌铺板并在包含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板(在1升基础上，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g Nacl，2％琼脂)上培养，用于菌落形成。将引入pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522的大肠杆菌铺板并在包含氯霉素(35μg/ml)的LB平板上培养，用于菌落形成。检测如此获得的菌株的腐胺生产力。
具体而言，将W3110、W3110pSE280-speC和W3110pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522分别接种在LB、LA和LC平板上并在37℃培养24小时，然后接种在25ml效价培养基(在1升基础上，2g(NH4)2PO4，6.75g KH2PO4，0.85g柠檬酸，0.7g MgSO4·7H2O，0.5％(v/v)痕量元素，10g葡萄糖，3g AMS，30g CaCO3)中并在37℃下培养24小时。1L痕量金属溶液包含5M HCl、10gFeSO4·7H2O、2.25gZnSO4·7H2O、1g CuSO4·5H2O、0.5g MnSO4·5H2O、0.23gNa2B4O7·10H2O、2g CaCl2·2H2O和0.1g(NH4)6Mo7O2·4H2O。
测量每个培养物中的腐胺浓度，结果在下面的表11中显示。
[表11]
如表11中所显示的，与引入有腐胺生物合成酶speC的W3110pcc1BAC-pSE280-speC相比，在引入有NCgl2522的W3110pcc1BAC-P(trc)-NCgl2522中观察到高腐胺产量。
该结果表明NCgl2522蛋白在大肠杆菌中也具有输出腐胺的能力。
本发明人发现进行将NCgl2522另外引入具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物KCCM11138P的转座子中以增强谷氨酸棒状杆菌菌株的NCgl2522活性，并因此腐胺可以以高产率生产，这归因于增加的输出腐胺的能力，并且他们命名该菌株为谷氨酸棒状杆菌CC01-0510，并且在2013年3月8日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11401P。
基于以上描述，本领域技术人员应当理解，其它具体的实施方式可以用于实践本发明而不背离本发明的技术理念或基本特征。就这一点而言，以上描述的实施例仅用于说明性目的，并且本发明不意欲被这些实施例所限制。本发明的范围应当理解为包含源自权利要求书或其等价概念——而不是以上详细描述——的意义和范围的所有变形或修改形式。
本发明的效果
具有本发明的提高的腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物被修饰以与其内源活性相比，具有增强的输出细胞内腐胺的NCgl2522活性，这导致增加的腐胺的细胞外输出和增加的腐胺抗性。
进一步，当NCgl2522在包含本发明的腐胺合成途径的大肠杆菌中表达时，发现细胞外腐胺的量增加。因此，谷氨酸棒状杆菌衍生的NCgl2522可应用至具有腐胺生产力的微生物，其可以用于有效生产腐胺。

Claims (10)

1.具有腐胺生产力的微生物，其被修饰为与内源活性相比，具有增强的蛋白质活性，所述蛋白质是由SEQ ID NO:21或23表示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物进一步被修饰为与内源活性相比，具有减弱活性的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和参与谷氨酸输出的蛋白质NCgl1221，并被修饰为与内源活性相比，具有增强的鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性。
3.根据权利要求2所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)是由SEQ ID NO:29表示的氨基酸序列，所述参与谷氨酸输出的蛋白质NCgl1221是由SEQ ID NO:30表示的氨基酸序列，和所述鸟氨酸脱羧酶(ODC)是由SEQ ID NO:33表示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物进一步被修饰为与内源活性相比，具有增强活性的乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)。
5.根据权利要求4所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)分别是由SEQ ID NO:25、26、27和28表示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物的乙酰转移酶NCgl1469活性与内源活性相比进一步被减弱。
7.根据权利要求6所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述乙酰转移酶NCgl1469是由SEQ ID NO:31或32表示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物是埃希氏杆菌属或棒状杆菌属。
9.根据权利要求8所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
10.生产腐胺的方法，包括以下步骤：
(i)培养权利要求1到9中任一项所述的具有腐胺生产力的微生物以获得细胞培养物；和
(ii)从所述培养的微生物或所述细胞培养物回收腐胺。
CN201480017057.0A 2013-03-20 2014-02-25 用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法 Active CN105492593B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130030020 2013-03-20
KR10-2013-0030020 2013-03-20
KR1020140017243A KR101607741B1 (ko) 2013-03-20 2014-02-14 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR10-2014-0017243 2014-02-14
PCT/KR2014/001509 WO2014148743A1 (ko) 2013-03-20 2014-02-25 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105492593A CN105492593A (zh) 2016-04-13
CN105492593B true CN105492593B (zh) 2019-08-09

Family

ID=51758636

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480017057.0A Active CN105492593B (zh) 2013-03-20 2014-02-25 用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法

Country Status (12)

Country Link
US (2) US10221433B2 (zh)
EP (1) EP2977443B1 (zh)
JP (1) JP6297134B2 (zh)
KR (1) KR101607741B1 (zh)
CN (1) CN105492593B (zh)
AU (1) AU2014238707B2 (zh)
BR (1) BR112015018599B1 (zh)
HU (1) HUE048852T2 (zh)
MY (1) MY172080A (zh)
RU (1) RU2665825C2 (zh)
TW (2) TWI632238B (zh)
WO (1) WO2014148743A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101607741B1 (ko) 2013-03-20 2016-03-31 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
EP3135757B1 (en) 2014-04-25 2019-02-20 CJ Cheiljedang Corporation Diamine-producing microorganism and method for producing diamine using same
EP3135758B1 (en) 2014-04-25 2021-12-29 CJ Cheiljedang Corporation Diamine-producing microorganism and method for producing diamine using same
CN106459888B (zh) * 2014-04-25 2019-12-24 Cj第一制糖株式会社 用于产生腐胺的微生物和使用其产生腐胺的方法
KR101773135B1 (ko) 2015-05-08 2017-08-30 씨제이제일제당 주식회사 1,4-디아미노부탄의 정제방법
KR101813759B1 (ko) * 2015-06-24 2018-01-02 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법
KR101735935B1 (ko) * 2015-07-20 2017-05-16 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법
JP6663757B2 (ja) * 2016-03-11 2020-03-13 日清ファルマ株式会社 ポリアミン高含有酵母及びその製造方法
KR101871037B1 (ko) 2016-03-15 2018-06-26 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산 방법
KR101941775B1 (ko) 2017-06-14 2019-01-24 씨제이제일제당 (주) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
KR101937569B1 (ko) * 2017-06-14 2019-01-11 씨제이제일제당 (주) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
KR102011394B1 (ko) * 2017-07-19 2019-10-22 씨제이제일제당 주식회사 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101010433A (zh) * 2004-07-15 2007-08-01 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 1,4－丁二胺的生物化学合成
CN101679964A (zh) * 2008-04-10 2010-03-24 韩国科学技术院 具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用其生产腐胺的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR920000933B1 (ko) 1989-07-28 1992-01-31 삼성전관 주식회사 평면 방전형 칼라 방전 표시 패널
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
JP4479283B2 (ja) 2004-03-04 2010-06-09 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100882259B1 (ko) 2006-10-12 2009-02-09 주식회사 코캣 탈질, 탈황, 함산소 화합물 제조를 위한 탄화수소 기질의선택산화 방법
RU2355759C1 (ru) * 2007-08-14 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА
KR100930203B1 (ko) 2008-01-28 2009-12-07 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR20120003634A (ko) 2010-07-05 2012-01-11 현대위아 주식회사 차륜용 회전 지지 장치
KR101348461B1 (ko) * 2010-12-08 2014-01-08 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
CN103492553B (zh) 2011-02-22 2018-06-12 巴斯夫欧洲公司 用于生产尸胺的方法和重组微生物
ES2655764T3 (es) * 2012-01-11 2018-02-21 Cj Cheiljedang Corporation Microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada de producción de putrescina y un procedimiento para producir putrescina utilizando el mismo
US9290771B2 (en) * 2012-01-20 2016-03-22 Cj Cheiljedang Corporation Recombinant microorganism having an enhanced ability to produce putrescine and a method for producing putrescine using the same
KR101607741B1 (ko) * 2013-03-20 2016-03-31 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
CN106459888B (zh) * 2014-04-25 2019-12-24 Cj第一制糖株式会社 用于产生腐胺的微生物和使用其产生腐胺的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101010433A (zh) * 2004-07-15 2007-08-01 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 1,4－丁二胺的生物化学合成
CN101679964A (zh) * 2008-04-10 2010-03-24 韩国科学技术院 具有腐胺高产能力的突变微生物以及使用其生产腐胺的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Improving putrescine production by corynebacterium glutamicum bu fine-tune ornithine transcarbamoylase activity using a plasmid addiction system;Jens Schneider et al.;《Appl Microbiol Biotechnol》;20120228;第169-178页 *
MFS超家族转运蛋白结构与分子机制的研究;孙林峰等;《生命科学》;20111130;第1052-1056页 *
Putrescine production by engineered corynebacterium glytamicum;Jens Schneider et al.;《Appl Microbiol Biotechnol》;20100727;第859-868页 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2014238707A1 (en) 2015-07-23
WO2014148743A1 (ko) 2014-09-25
MY172080A (en) 2019-11-13
US20190136274A1 (en) 2019-05-09
TW201441367A (zh) 2014-11-01
US11053524B2 (en) 2021-07-06
EP2977443A4 (en) 2016-09-07
TW201623617A (zh) 2016-07-01
JP2016514466A (ja) 2016-05-23
JP6297134B2 (ja) 2018-03-20
BR112015018599A2 (pt) 2017-08-22
US10221433B2 (en) 2019-03-05
HUE048852T2 (hu) 2020-08-28
EP2977443B1 (en) 2020-04-08
RU2015142261A (ru) 2017-04-26
TWI657142B (zh) 2019-04-21
KR20140115244A (ko) 2014-09-30
CN105492593A (zh) 2016-04-13
RU2665825C2 (ru) 2018-09-04
EP2977443A1 (en) 2016-01-27
BR112015018599B1 (pt) 2022-12-13
US20170002386A1 (en) 2017-01-05
TWI632238B (zh) 2018-08-11
AU2014238707B2 (en) 2017-08-31
KR101607741B1 (ko) 2016-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105492593B (zh) 用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法
AU2016203949B2 (en) Recombinant Microorganism Having Improved Putrescine Producing Ability And Method For Producing Putrescine By Using Same
CN104245921B (zh) 可利用木糖的棒状杆菌微生物和利用其产生l-赖氨酸的方法
TWI632237B (zh) 用於製造腐胺或鳥胺酸之微生物及使用該微生物製造腐胺或鳥胺酸之方法
TWI688649B (zh) 用於製造腐胺之微生物及使用該微生物製造腐胺之方法
KR101493586B1 (ko) 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
TWI650416B (zh) 用於製造二胺之微生物及使用該微生物製造二胺之方法
RU2696504C2 (ru) Микроорганизм для продуцирования диамина и способ получения диамина с его использованием

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant