JP6663757B2 - ポリアミン高含有酵母及びその製造方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
酵母に突然変異処理を施すこと、及び
突然変異処理された酵母を、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される1種以上のポリアミンを該突然変異処理前の酵母に対する生育抑制濃度以上の濃度で含有する培地で培養すること、
を含む方法を提供する。
また本発明は、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される1種以上のポリアミンを高濃度で含有するポリアミン高生産性酵母選択用培地を提供する。
さらに本発明は、ポリアミン生産性及びポリアミン耐性が向上した酵母変異株を提供する。
さらに本発明は、上記酵母変異株を培養することを含む、ポリアミンの製造方法を提供する。
(1)親酵母株
市販のパン酵母(Saccharomyces cerevisiae、野生株)を、酵母変異株の親株として使用した。
酵母株の液体培養は、YMPD培地(3g/Lイーストエキス、3g/Lモルトエキス、5g/Lペプトン、30g/Lグルコース)を使用し、5mLのYMPD培地に菌体を接種して、30℃、150rpmで振とう培養した。また、平板培養には2%となるように寒天を加えて作製したYMPD寒天培地を用いた。
親株の生育が抑制されるポリアミン濃度を求めた。ポリアミンは、スペルミジン又はスペルミンを用いた。スペルミジン三塩酸塩又はスペルミン四塩酸塩をそれぞれ100mMから2倍希釈系列(100mM〜0.625mM)で添加したYMPD液体培地を96ウェルプレートに200μLずつ分注した。各ウェルに一昼夜培養した酵母培養液を2μLずつ接種し、30℃で24時間静置培養した。各ウェルの酵母の生育の有無を目視による濁度に基づいて評価し、スペルミジン及びスペルミンそれぞれについての親株の生育が抑制される濃度を調べた。各ポリアミンを添加した液体培地中での親株の生育性は以下の通りであった:スペルミジン 12.5mMでやや抑制、25mMで抑制;スペルミン 0.625mMで抑制。
一昼夜培養した酵母培養液1.5mLを3,000rpm、5分間遠心分離し、菌体を回収した。得られた菌体を10mL超純水で洗浄した後、15mL超純水に懸濁して、予め70%エタノールに漬けて殺菌したマグネチックスターラーを入れたφ9cmシャーレに流し入れた。紫外線の光源には、殺菌ランプ(GL15、15W、主波長253.7nm、東芝)を用いた。光源直下から30cmの距離に菌懸濁液を入れたシャーレを置き、蓋を開けてスターラーで撹拌しながら45秒間紫外線を照射した。紫外線照射した菌懸濁液を、3、4又は5mMスペルミン添加YMPD寒天培地に1枚あたり500μL塗抹し、30℃で3〜5日間培養した。培養後の培地1枚あたり数個〜数100個程度のコロニーが生育した。生育の良い大きめのコロニーを釣菌し、YMPD寒天培地に塗抹してストックした。3mMスペルミン添加培地から48株、4mMスペルミン添加培地から11株、5mMスペルミン添加培地から2株の合計61株を得た。
上記(4)で取得したポリアミン高生産性酵母変異株のうち、3mMスペルミン添加培地で生育した1027−3−18株は、液体培地中での増殖性がよくポリアミン量が親株(野生株)の約2倍であった。この1027−3−18株に対し、上記(4)と同様の手順で2回目の突然変異処理を行い、紫外線照射した菌懸濁液をスペルミン6mM添加YMPD寒天培地に1枚あたり1mL塗抹し、30℃で3〜5日間培養した。培養後の培地1枚あたり数10個程度のコロニーが生育した。生育の良い大きめのコロニーを釣菌して36株(株番号S61〜S636)の変異株を得た。これらの株について、後述する参考例1記載の手順に従ってポリアミン量を測定した。
取得した変異株のうち、スペルミジン及びスペルミン含量の高い株を選択して、シングルコロニーアイソレーションの後、YMPD寒天培地で5回継代してからグリセロールストックを調製して−80℃で冷凍保存した。グリセロールストックは、2mL容凍結用チューブに滅菌した15%グリセロールを入れ、ここに培養した菌苔をディスポーザブル白金耳でかき取って加え懸濁して調製した。各グリセロールストックを平板培養し、生育したコロニーを接種して液体培養した後、菌株のポリアミン量を測定し、ポリアミン高生産性が維持されていたものをポリアミン高生産性酵母変異株として取得した(表8)。
酵母培養物を遠心分離して菌体を回収し、超純水で2回洗浄した後、総量が0.5mLとなるように超純水を加えて菌液を調製した。得られた菌液から0.2mLを採取し、含まれる菌体の乾燥重量を測定した。次いで、該菌体を乾物換算で5〜10質量%程度となるように水に懸濁して、ポリアミン量測定用の試験溶液を調製した。
試験溶液0.2mLをスクリューキャップ付き褐色試験管に採り、0.2M HClO4 4.8mLを加えて混和した後、100℃、10分間加熱処理した。流水で冷却後、2,000rpm、3分間遠心分離して得た上清を0.45μmフィルターで濾過した。共栓付褐色試験管に濾液0.2mLと0.2M HClO4 0.8mL(又は標準溶液1mL)を採り、飽和Na2CO3水溶液 0.5mL、1%ダンシルクロライド・アセトン溶液1mLを加えてよく混和した後、遮光して45℃の水浴中に1時間静置した。次いで、10%プロリン水容液0.5mLを加えて十分に撹拌後、暗所で10分間静置した。これにトルエン2mLを加えて250rpm、10分間振とうした後、分離した上層1mLを採り、褐色ナスフラスコを用いて40℃の水浴中で減圧濃縮した。残渣にアセトニトリル1mLを加えて溶解したものをHPLC用試料とした。
得られたHPLC用試料を下記条件にてHPLC分析にかけ、標準試料のピーク面積から検量線を作成してプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンをそれぞれ定量した。標準試料には、プトレスシン二塩酸塩、スペルミジン三塩酸塩、スペルミン四塩酸塩(いずれもSIGMA)を0.2M HClO4に各1ppmとなるように溶解したものを用いた。
<HPLC条件>
装置:日立HPLC L−7000シリーズ
カラム:CAPCELL PAK C18 3μm(4.6×100mm)(資生堂)
検出:Ex.365 nm;Em.510nm
カラム温度:35℃
流速:1.0mL/min
試料インジェクション量:10μL
溶離液A:10mM 酢酸アンモニウム
溶離液B:アセトニトリル
グラジエント:A 50%(0min)−10%(15min)−10%(25min)−50%(25.1min)−50%(35min)
Claims (6)
- ポリアミン高生産性酵母の製造方法であって、
サッカロマイセス属酵母に突然変異処理を施すこと、
該突然変異処理された酵母を、2mM以上のスペルミンを含有する培地で培養すること、及び
該培地上に形成されたコロニーの菌体中ポリアミン量を測定し、該突然変異処理前と比べてポリアミン量の向上している株を、ポリアミン高生産性酵母変異株として取得すること、
を含む、方法。 - 2mM以上のスペルミンを含有する、ポリアミン高生産性サッカロマイセス属酵母選択用培地。
- 2mM以上のスペルミン存在下で増殖能を有し、200mg/100g菌体(乾物換算)以上のポリアミンを含有する、サッカロマイセス属酵母変異株。
- サッカロマイセス・セレビシエS631株(NITE P−02199)、サッカロマイセス・セレビシエS635株(NITE P−02200)及びサッカロマイセス・セレビシエSS208株(NITE P−02201)からなる群より選択される、請求項3記載の酵母変異株。
- 請求項3又は4記載の酵母変異株を培養することを含む、ポリアミンの製造方法。
- 培養した前記酵母変異株からポリアミンを分離することをさらに含む、請求項5記載の方法。
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