CN105802874B - 一种高效降解阿特拉津的混合菌及发酵培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够高效降解阿特拉津的伯克霍尔德氏菌和丛毛单胞菌，通过响应面优化设计获得了高密度细胞培养的混合发酵培养基配方及培养方法，具体为一种高效降解阿特拉津的混合菌及该混合菌的发酵培养方法。该发明是使用能够高效降解阿特拉津的伯克霍尔德氏菌和丛毛单胞菌，通过响应面优化设计获得了高密度细胞培养的发酵培养基配方：蔗糖6.72g，葡萄糖6.75g，豆粕粉6.34g，磷酸氢二钾0.6g，磷酸二氢钾2.5g，七水硫酸镁0.3g，氯化钠0.4g，酵母粉3g，蒸馏水1L，pH7.0‑7.5。利用培养的混合菌液进行土壤修复试验，7天内200mg·L‑1的阿特拉津降解完全。本发明为该混合菌的开发提供了高密度发酵培养配方及方法。

Description

一种高效降解阿特拉津的混合菌及发酵培养方法
技术领域
本发明涉及能够高效降解阿特拉津的伯克霍尔德氏菌和丛毛单胞菌，通过响应面优化设计获得了高密度细胞培养的混合发酵培养基配方及培养方法，具体为一种高效降解阿特拉津的混合菌及该混合菌的发酵培养方法。
背景技术
阿特拉津，又名莠去津(阿特拉津atrazine，阿特拉津)，其特点是含有苯环、结构稳定、水溶性低、吸附系数小、残效期长。目前，由于长期广泛的使用，给环境造成了严重的污染。因此，研究阿特拉津的降解具有重要意义。
在以往的研究中发现在自然界中存在着大量的具有很强适应能力微生物，它们通过各种代谢途径把各类农药完全矿化或降解成无毒的成分，同时又不会对环境造成破坏。
目前，已有多种阿特拉津降解菌种被分离。通过分子生物手段对分离菌种进行鉴定发现，阿特拉津降解的细菌主要有不动杆菌属、土壤杆菌属、节杆菌属等。国外的报道证明假单胞菌属和节杆菌对阿特拉津的矿化有重要作用。李慧等利用一种革兰氏阴性阴沟肠杆菌制成菌剂，可以使阿特拉津降解87％以上。有专利将阴沟肠杆菌发酵获得固体或液体的阿特拉津降解菌剂，发酵液菌数达10亿/mL以上(专利号：200710012981.1)；专利2014108397298(申请号)公布了产脲节杆菌Arthrobacterureafaciensliulou(CGMCCNo.9667)修复污染土壤及保护作物免受阿特拉津药害的使用方法。
使用微生物制剂降解阿特拉津的研究有所进展，但是使用的多为单种菌种，对于几种微生物共同培养降解阿特拉津的研究还很少。
发明内容
本发明的目的在于针对上述存在的问题，提供一种高效降解阿特拉津的混合菌，为伯克霍尔德氏菌和丛毛单胞菌的混合菌；以及一种共同培养降解阿特拉津的混合发酵方法，具体为一种伯克霍尔德氏菌和丛毛单胞菌的最优混合发酵方法。
一种高效降解阿特拉津的混合菌，为伯克霍尔德氏菌和丛毛单胞菌的混合菌。
本发明涉及的菌种为：
伯克霍尔德氏菌为伯克氏菌属，LH-ZY01，拉丁文名称：Burkholderia sp.，2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No.M 2012536，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，该菌为革兰氏阴性杆菌，富有运动性及好氧性短杆状的细菌。在保存培养基上培养形成较小的圆形菌落，黄色。
丛毛单胞菌(Comamonas sp.)A2，分离自农药下水道污泥(Yang et al.,2008)：革兰氏阴性杆菌，不形成芽孢，好氧菌。在保存培养基上形成较小的圆形菌落，白色至浅黄色。在2010年“Biodegradation”杂志中进行了公开和记载。
上述两种菌种经分离纯化后接种到斜面培养基上，于4℃条件下保存。保存培养基配方LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5，制成斜面培养基。
一种高效降解阿特拉津的混合菌的发酵培养方法，具体步骤为：将伯克霍尔德氏菌和丛毛单胞菌分别制备成种子液，按10％接种量等比例共同接种到发酵培养基中，摇床30℃、180r/min，培养24h，得到发酵液。
所述的发酵培养基配方为：蔗糖6.72g，葡萄糖6.75g，豆粕粉6.34g，磷酸氢二钾0.6g，磷酸二氢钾2.5g，七水硫酸镁0.3g，氯化钠0.4g，酵母粉3g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5。
所述的种子液的制备方法为：
将固体斜面上的菌种，各挑取一环分别接种到液体种子培养基中，摇床30℃、180r/min，培养18h。液体种子培养基配方为：葡萄糖5g，酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5。
本发明的有益效果为：
本发明通过优选菌种，得到了优良菌种的混合菌，并通过优化发酵培养基配方和发酵方法，为该混合菌的开发提供了高密度发酵培养配方及方法，并对液体种子培养基配方等进行创新，获得发酵液的总菌数为102亿/mL，其中伯克霍尔德氏菌菌数为62亿/mL，丛毛单胞菌菌数为40亿/mL。
灭菌土和自然土中添加降解菌液后3d的降解率分别为63.8％和61.9％，而7d后降解率可达100％，具体可见试验例7。因此该菌液在土壤修复中具有较强的阿特拉津降解能力，显示其具有较大的土壤修复潜力和应用价值。
总之，本发明使用能高效降解阿特拉津的两种菌种进行共培养，并且得到了能使两种菌共同良好生长的优化配方和培养方法，为高效降解阿特拉津复合微生物研究提供了重要的理论与实践意义。
附图说明
图1为试验例4的最陡爬坡试验结果；
图2蔗糖与豆粕粉交互影响响应面；
图3豆粕粉与葡萄糖交互影响响应面；
图4蔗糖与葡萄糖交互影响响应面。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。
试验例1：菌种保存
酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7-7.5。制成固体斜面，将伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)LH-ZY01和丛毛单胞菌(Comamonas sp.)A2分别保存于斜面上。
试验例2：种子液的制备
将固体斜面上的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)LH-ZY01.和丛毛单胞菌(Comamonas sp.)A2各挑取一环分别接种到液体种子培养基中，摇床30℃、180r/min，培养18h。
液体种子培养基配方为：葡萄糖5g，酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH7-7.5。
试验例3：Plackett-Burman试验优化发酵培养配方
试验选用了7个成分的高低水平进行显著影响效应分析，如表1。用Plackett-Burman设计12组试验，如表2。同时各试验组中均含有基础盐为：磷酸氢二钾0.6g，七水硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠0.4g，蒸馏水1L，pH7-7.5。将两种菌的种子液按10％接种量等比例共同接种到以下12组培养基中，摇床30℃、180r/min，培养24h。600nm下分光光度计测量OD值，试验均设立3个平行。
表1 分析因素及水平
表2 分析方案及试验结果
由表2可以看出，不同培养基组成对发酵结果有比较显著的影响。运用Minitab软件对表2进行回归分析，获得以下回归方程：OD＝-4.10+0.5547葡萄糖+0.7193蔗糖+0.0597淀粉+0.318蛋白胨+0.390酵母粉+1.292豆粕粉+0.043氯化铵。可以看出，在这7个因素的主效应中，豆粕粉、蔗糖和葡萄糖为影响最为显著的因素。
试验例4：最陡爬坡试验优化发酵培养配方
选用Plackett-Burman试验中显著影响因素葡萄糖，蔗糖，豆粕粉进行最陡爬坡试验，组合如表3。同时各组合中含有以下成分：磷酸氢二钾0.6g，七水硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠0.4g，酵母粉3g，蒸馏水1L，pH7-7.5。将两种菌的种子液按10％接种量等比例共同接种到以下8组培养基中，摇床30℃、180r/min，培养24h。600nm下分光光度计测量OD值，试验均设立3个平行。
表3 分析方案
得到最陡爬坡试验结果如图1所示，由图1可见试验组4的OD值最高，所以以试验组4的水平作为响应面试验的中心点，即蔗糖7g/L，葡萄糖6g/L，豆粕粉5g/L，进行下一步的响应面实验。
试验例5：响应面试验优化发酵培养配方
显著因素以中心点为零水平，用Minitab软件设计试验，进行15组试验，如表4。同时各组中含有基础盐为：磷酸氢二钾0.6g，七水硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠0.4g，酵母粉3g，蒸馏水1L，pH7-7.5。将两种菌的种子液按10％接种量等比例共同接种到以下培养基中，摇床30℃、180r/min，培养24h。600nm下分光光度计测量OD值，试验均设立3个平行。
表4 分析方案及试验结果
得到蔗糖与豆粕粉交互影响响应面如图2所示，豆粕粉与葡萄糖交互影响响应面如图3所示，蔗糖与葡萄糖交互影响响应面如图4所示，由图2至图4可以看出，葡萄糖、蔗糖、豆粕粉三因素对两种菌的混合培养影响都比较显著，两两因素间仍存在比较明显的交互作用。从响应面图可以判断出，最佳点落在试验考察的区域内。通过对获得的回归方程分别求一阶偏导获得三种培养基组分的最佳配方为：蔗糖6.72g/L，葡萄糖6.75g/L，豆粕粉6.34g/L。
试验例6：发酵液计数
以最佳发酵培养基配方进行发酵计数试验，于发酵培养24h后，10倍稀释法进行平板计数。使用平板培养基为：葡萄糖10g，酵母粉5g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7-7.5。
表5 计数试验结果统计
试验例7：混合菌对阿特拉津的土壤修复试验
为验证本发明混合菌对阿特拉津降解效果，及菌液施入土壤后的存活情况，土壤中添加阿特拉津，土壤为未处理和经过灭菌处理、加入或不加入降解菌液，定时取样，采用高效液相色谱法检测阿特拉津降解情况。同时，通过10倍稀释法，计数添加了菌液的土样中混合菌的存活数量。采取对照平行试验。
试验方法步骤：
①阿特拉津喷施液的准备：除草剂阿特拉津为山东侨昌化学有限公司产品，有效成分含量38％，悬浮剂。土壤中按照200mg·L-1的阿特拉津浓度添加。
②试验土壤取自麦田土，简单处理：晒干，碾碎，过0.2mm的筛，去除大块儿杂质，160℃干热灭菌2h或不经灭菌处理。
③将实验室培养24h的降解菌菌液按照2mL/kg土的用量添加到试验组2、4中，搅拌均匀。
④土壤修复试验共计4组，每组设2平行。
土壤修复试验设计如表6，具体实施如下：1组为灭菌土喷施①所述的阿特拉津喷施液(200mg·L-1)但没有添加降解菌剂；2组为灭菌土喷施①述阿特拉津喷施液(200mg·L-1)但添加降解菌剂；3组为自然土喷施①所述的阿特拉津喷施液(200mg·L-1)但没有添加降解菌剂；4组为自然土壤喷施①述阿特拉津喷施液(200mg·L-1)但添加降解菌剂。
处理好的土壤分别盛放在花盆中。将各试验组置于室温培养，于处理3d和7d后分别取样，利用高效液相色谱法，测定各处理中阿特拉津的残留量；同时计数添加了菌液的土样中混合菌的存活数量。期间适时浇水，防止土壤干燥。
表6 土壤修复体系设计
注：“+”表示加入该试剂，“□”表示没有加入该试剂或者菌液
各处理土样经高效液相色谱法检测，结果列于表7。可以看出：灭菌土中没有添加降解菌液的土壤中3d和7d后阿特拉津的残留量没有变化(第1组)；没有提前经过灭菌的自然土中如果没有添加菌剂，3d后经土壤自然菌群降解，阿特拉津的降解率为11.6％，7d后平均降解率只有12.4％，可以看出随着时间的延长阿特拉津的降解情况依然不明显；灭菌土和自然土中添加降解菌液后3d的降解率分别为63.8％和61.9％，而7d后降解率可达100％(第2、4组)。因此该菌液在土壤修复中具有较强的阿特拉津降解能力，显示其具有较大的土壤修复潜力和应用价值。
表7 液相检测阿特拉津残留情况
通过土壤取样计数得到每克土壤中的菌数，对比不同时间的总菌数可以看出，菌液施入土壤后7天，在土壤中可以维持生长活力。说明该菌剂可以适应土壤环境，并发挥修复作用。
表8 修复菌剂在土壤中的存活情况
注：表中的编号与表6中相对应。

Claims (7)

1.一种降解阿特拉津的混合菌，为伯克霍尔德氏菌和丛毛单胞菌(Comamonas sp.)A2的混合菌；
伯克霍尔德氏菌为伯克氏菌属，LH-ZY01，拉丁文名称：Burkholderia sp.，2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No.M2012536，该菌为革兰氏阴性杆菌，富有运动性及好氧性短杆状的细菌，在保存培养基上培养形成较小的圆形菌落，黄色。
2.根据权利要求1所述的降解阿特拉津的混合菌，其特征在于，将伯克霍尔德氏菌接种到斜面培养基上，于4℃条件下保存；保存培养基配方LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5，制成斜面培养基。
3.根据权利要求1所述的降解阿特拉津的混合菌，其特征在于，将丛毛单胞菌接种到斜面培养基上，于4℃条件下保存；保存培养基配方LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5，制成斜面培养基。
4.一种降解阿特拉津的混合菌的发酵培养方法，具体步骤为：将伯克霍尔德氏菌和丛毛单胞菌(Comamonas sp.)A2分别制备成种子液，按5～10％接种量等比例共同接种到发酵培养基中，摇床30℃、180r/min，培养24h，得到发酵液；
伯克霍尔德氏菌为伯克氏菌属，LH-ZY01，拉丁文名称：Burkholderia sp.，2012年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No.M 2012536，该菌为革兰氏阴性杆菌，富有运动性及好氧性短杆状的细菌，在保存培养基上培养形成较小的圆形菌落，黄色。
5.根据权利要求4所述的降解阿特拉津的混合菌的发酵培养方法，其特征在于，所述的发酵培养基配方为：蔗糖6.72g，葡萄糖6.75g，豆粕粉6.34g，磷酸氢二钾0.6g，磷酸二氢钾2.5g，七水硫酸镁0.3g，氯化钠0.4g，酵母粉3g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5。
6.根据权利要求4所述的降解阿特拉津的混合菌的发酵培养方法，其特征在于，所述的种子液的制备方法为：将固体斜面上的菌种，各挑取一环分别接种到液体种子培养基中，摇床30℃、180r/min，培养18h。
7.根据权利要求6所述的降解阿特拉津的混合菌的发酵培养方法，其特征在于，液体种子培养基配方为：葡萄糖5g，酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5。
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