CN101165170A - 一种阿特拉津除草剂降解菌及其菌剂制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种阿特拉津除草剂降解菌及其菌剂制备方法，属于生物高技术领域，是利用微生物的技术降解化学除草剂，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与深加工。所用菌株为阴沟肠杆菌，菌剂生产工艺为斜面种→摇瓶种子液→种子罐→发酵罐→产品。本发明针对目前农业生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解菌剂，降解菌剂直接施用可使农作物中阿特拉津残留量降低87％以上，解决了农业生产中农药残留超标问题，可生产出无毒无公害的绿色农产品，从而可大幅增加农产品价值。菌剂制品价格低廉，易大面积推广应用。

Description

一种阿特拉津除草剂降解菌及其菌剂制备方法

技术领域

本发明涉及一种阿特拉津除草剂降解菌及其菌剂制备方法，属于生物高技术领域领域，是利用微生物的技术降解化学除草剂，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与深加工。

技术背景

六六六、DDT等化学农药的使用大大促进了现代农业的发展，为农业产品产量和质量的提高作出了重要的贡献，并极大提高了农业生产的劳动效率和机械化程度。然而，这些人工合成并释放到环境中去的农用化学物质对人类健康和生态环境带来了巨大的潜在风险，农药大量使用引起的农产品中农药残留超标，严重影响了人民的身体健康及农产品的出口创汇。随着人民生活水平的提高和环境保护意识的增强，全社会对农药残留带来的直接危害和潜在影响越来越关注，人们迫切需要无农药残留清洁的绿色无公害农产品。但从目前我国的农业生产形式和人口状况来看，以停止农药使用降低农业产量为代价的无公害生产模式几乎是行不通的，农药作为控制病虫害的有效手段还将继续在农业生产中发挥巨大的作用。另外，一些菜农片面追求经济效益，施用高毒、高残留农药，导致农药残留量严重超标。据2000年国家质检总局数据，全国47.5％的蔬菜农药残留超标。

如何解决农业生产中的这个两难问题成为科学家们关注的热点。

农药残留微生物降解技术是一种新型原位生物修复技术。它利用微生物种类繁多、代谢类型极为丰富等生物多样性原理与特点，通过筛选高效农药残留降解菌株，并经现代化工业大规模发酵制成菌剂，利用微生物所产生的酶类应用于农药残留的降解，达到清除土壤、水体、农产品中有机污染物的目的，并以此为核心技术，与其他配套技术相组合，建立一套生产体系，生产绿色、无公害农产品。这种技术可以克服物理、化学处理修复难度大、成本高，还会有二次污染的缺陷。

阿特拉津属于均三氮苯类除草剂，三氮苯类除草剂开发较早，1952年合成了第一个三氮苯类除草剂阿特拉津，1957年商品化。我国从20世纪80年代初开始使用阿特拉津，近年来使用面积不断扩大，每年用量平均以20％的速度递增。在我国，阿特拉津是北方旱田主要作物玉米、高粱、果茶园等常用除草剂。低剂量长期接触阿特拉津会对人体的免疫和神经系统健康造成威胁，对人类17β-雌二醇和性激素与其受体结合产生影响，因此均被美国环保局列为可疑致癌物质及内分泌干扰物质。人们在发现了阿特拉津的危害之后，就一直致力于寻找能够降解或矿化阿特拉津的微生物，直至1993年，世界上才有不同的实验室相继报道了降解阿特拉津的纯菌株或混合培养物。但对于采用微生物菌剂对阿特拉津污染环境进行综合治理，目前尚未见比较成熟的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种阿特拉津除草剂降解菌及其菌剂制备方法，针对目前农业生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解菌剂，使用本菌剂可以使阿特拉津除草剂降解87％以上，且生产成本和使用成本均较低。使用该降解菌剂可在农作物的生长过程中正常使用化学除草剂阿特拉津进行草害防治，从而保证农产品中阿特拉津残留含量符合绿色食品要求。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种阿特拉津降解菌，该菌株为革兰氏染色反应阴性的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，主要生物学特性为G^-，菌体为杆状，周生鞭毛；兼性厌氧，37℃时发酵葡萄糖产酸产气；柠檬酸盐试验、过氧化氢酶试验、V.P.试验阳性；明胶液化缓慢；氧化酶试验、M.R.试验、吲哚试验阴性；能够利用木糖、蔗糖和甘露醇，不能水解淀粉；能够利用KNO₃和(NH₄)₂SO₄作为氮源。能利用阿特拉津为唯一碳源和能源进行生长，将其彻底矿化为CO₂和水及简单的无机化合物。在实验室条件摇瓶实验中，阿特拉津除草剂降解率达87％以上。该菌的最适生长pH为7.0～7.2，最适生长温度为30℃。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

使用上述阿特拉津降解菌生产菌剂的工艺为：斜面种→摇瓶种子液→种子罐→发酵罐→产品(包装剂型为液体菌剂或采用玉米芯粉吸附分装成固体菌剂)。

详细实施步骤为：

1)将阿特拉津降解菌斜面种接种于肉汤培养基摇瓶中，按质量百分数计，肉汤培养基配方如下：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH7.0-7.2，振荡培养至对数生长期；

2)将上述培养好的菌液按10％体积接种量转入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用培养基配方为(均为质量比)：葡萄糖1-2％，(NH₄)₂SO₄1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄0.05％，NaCl0.01％，蛋白胨0.05％，余量为水，pH7.0-7.2；

3)将种子液按照5-15％体积接种量转入发酵罐培养，发酵罐所用培养基与种子罐相同；

4)在种子罐和发酵罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶(0.6-1.2)，搅拌速度为180-240转/分钟，培养温度为30-35℃，发酵时间为24-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体制剂或采用玉米芯粉吸附分装成固体菌剂。

本发明中，接种量是指占培养基的体积百分比。

本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了一种化学除草剂阿特拉津降解菌，实验室生物降解实验结果表明，对阿特拉津降解率达到87％以上。

2、使用该发明生产的农药残留降解菌剂具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国果茶粮食生产出口基地或绿色食品生产基地大面积推广使用，特别是我过北方玉米、高粱大面积种植区。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要意义，可大大降低生产和使用过程中的工作量，降低生产和使用成本。使用该降解菌剂可以在农作物正常生长过程中正常使用化学除草剂阿特拉津防治草害从而保证农产品中阿特拉津残留含量符合绿色食品要求。此外，该菌为革兰氏阴性菌，在田间的存活时间适当，不会影响以后农药的使用效果。

3、田间试验表明，采用本发明生产的降解菌剂直接施用于农作物，可使作物中阿特拉津残留量降低85％以上。本发明成功解决了农业生产中农药阿特拉津残留超标问题，既充分发挥了阿特拉津在植物草害防治中的高效快速作用，又可以生产出绿色环保的农产品。

4、本领域中，公知的革兰氏染色阴性的阴沟肠杆菌只是一种病原菌(如引起腹泄等)，本发明将革兰氏染色阴性的阴沟肠杆菌用于三氮苯类除草剂阿特拉津降解菌，其酶制剂性价比较高，易大规模推广使用。

具体实施方式

实施例1

采集中国科学院沈阳生态站连续12年施用阿特拉津的玉米田表层土壤。取10g土壤，加入90ml蒸馏水，制作土壤悬液，以10％的体积比例接入阿特拉津唯一碳源的无机盐培养基中(阿特拉津浓度为5mg/L)，无机盐培养基的配方为(均为质量比)：NH₄NO₃0.2％，KH₂PO₄0.3％，K₂HPO₄0.15％，CaCl₂0.001％，MgSO₄·7H₂O0.2％，FeSO₄·7H₂O0.001％，pH7.0-7.2，28℃，120rpm富集培养12hrs，富集培养三次。用第三次的富集培养液按10％的体积比例接入相应的培养基中，同时阿特拉津浓度提高至10mg/L，在同样的条件下培养，富集三次。同样用第三次培养液以10％的体积比例接入相应的培养基中，阿特拉津浓度升高至20mg/L，富集三次后，获得混合培养物。取最终富集培养液稀释度涂平板，挑取单菌落。摇瓶实验复证降解性能，选取降解能力较强的菌株接种试管斜面。经16Sr DNA序列分析，与Enterobacter cloacae ATCC13047同源性高达100％(GenBank登录号AJ251469)，因此可认为与其为同一菌株，革兰氏染色阴性的阴沟肠杆菌也可以通过ATCC在中国的代理商(如：北京中原公司)进行商业购买。主要生物学特性为G^-，菌体为杆状，周生鞭毛；兼性厌氧，37℃时发酵葡萄糖产酸产气；柠檬酸盐试验、过氧化氢酶试验、V.P.验阳性；明胶液化缓慢；氧化酶试验、M.R.试验、吲哚试验阴性；能够利用木糖、蔗糖和甘露醇，不能水解淀粉；能够利用KNO₃和(NH₄)₂SO₄作为氮源。

实施例2

取实施例1中或市购革兰氏染色阴性的阴沟肠杆菌的斜面接种于200ml肉汤培养基中，按质量百分数计，肉汤培养基配方如下：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，余量为水，pH7.0-7.2，恒温振荡培养至对数期，获得菌液，准备接种种子罐。种子罐500L，投料量为400L，培养基配方为(均为质量比)：葡萄糖1-2％，(NH₄)₂SO₄ 1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄0.05％，NaCl0.01％，蛋白胨0.05％，pH7.0-7.2。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至35℃后，将上述培养好的摇瓶菌液按照10％体积接种量转入种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分钟，无菌空气的通气量为1∶0.8。将达到对数期的种子液按10％体积接种量转入发酵罐培养，发酵罐所用培养基与种子罐相同。发酵罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的发酵罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的发酵罐温度控制在30-35℃，培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.8-1.0，搅拌速度为240转/分钟，发酵时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体制剂或采用玉米芯粉吸附分装成固体菌剂。

应用例1

在实验室条件下，应用实施例2中的液体降解菌剂，按1％体积接种量接种于实施例1的无机盐培养基中，通过摇瓶实验显示出对阿特拉津具有较强的降解作用，对另一种典型的三氮苯类除草剂西玛津也具有一定的降解效果(见表1)。

表1.革兰氏染色阴性的阴沟肠杆菌对阿特拉津和西玛津的降解

农药品种	阿特拉津		西玛津
					处理方式	对照	处理	对照	处理
农药浓度(mg/L)	8.9	1.3	8.5	5.6
					降解率	85		34

应用例2

田间小区实验，设2m×2m玉米种植小区3块，其中1个小区为对照，1个小区为液体菌剂处理组，一个小区为固体菌剂对照，1个小区为固体菌剂处理组。在喷洒除草剂阿特拉津1周后，将实施例2中的液体降解菌剂和固体降解菌剂按使用方法要求施用，液体降解菌剂兑100倍水稀释喷洒，固体菌剂直接施入土壤施用剂量均为2kg/亩，2-3天后，采集小区土壤样品，采用高效液相色谱法测定农药残留含量(由中国科学院沈阳应用生态研究所分析测试中心和绿色食品检定中心测定)。从表2可以看出，液体菌剂处理效果要好于固体菌剂，这可能与该菌株的生长特性有关。

表2生物降解菌剂田间实验数据

处理方式	对照	液体菌剂处理组	固体菌剂处理组
				农药浓度(mg/L)	1.2	0.15	0.28
降解率		87	76

Claims (2)

1.一种阿特拉津除草剂降解菌，其特征在于，该菌株为革兰氏染色阴性的阴沟肠杆菌。

2.一种阿特拉津除草剂降解菌的菌剂制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)将革兰氏染色阴性的阴沟肠杆菌的斜面种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；

2)将上述培养好的菌液按5-15％体积接种量转入种子罐，培养至对数生长期，按质量百分比计，种子罐所用培养基配方为：葡萄糖1-2％，(NH₄)₂SO₄1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄0.05％，NaCl0.01％，蛋白胨0.05％，余量为水，pH7.0-7.2；

3)将种子液按照5-15％体积接种量转入发酵罐培养，发酵罐所用培养基与种子罐相同；

4)在种子罐和发酵罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分钟，培养温度为30-35℃，发酵时间为24-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶，或包装瓶分装成液体制剂，或采用玉米芯粉吸附分装成固体菌剂。