CN101168731A

CN101168731A - 一种甲基对硫磷降解菌及其酶制剂的制备方法

Info

Publication number: CN101168731A
Application number: CNA2007100129826A
Authority: CN
Inventors: 徐慧; 李慧; 张颖; 韩斯琴; 史荣久; 倪志龙; 杨伟超; 张忠泽; 陈冠雄
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2008-04-30

Abstract

本发明涉及一种甲基对硫磷降解菌及其酶制剂的制备方法，属于生物高技术领域。甲基对硫磷降解菌株为类志贺邻单胞菌，液体酶制剂生产工艺为斜面种→摇瓶种子液→种子发酵罐→发酵罐→收集菌体→机械破碎细胞→收集上清→(NH₄)₂SO₄分级沉淀→HEPES缓冲液悬浮→透析→粗酶液产品。也可进一步精制为易于保存和运输的酶干粉制剂，在上述粗酶液生产工艺基础上再添加以下工艺步骤：DEAE－Sephadex－A50阴离子柱层析→CM Sepharose Fast Flow阳离子柱层析→透析→冷冻干燥→酶干粉产品。液体粗酶制剂直接施用可使农作物中有机磷农药残留量降低90％以上，洗涤果蔬可去除表面残留98％左右；采用酶干粉制剂按一定比例稀释后施用可使农药残留量降低95％以上。该酶制剂产品解决了农业生产中农药残留超标问题。

Description

一种甲基对硫磷降解菌及其酶制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种甲基对硫磷降解菌及其酶制剂的制备方法，属于生物高技术领域，是利用微生物的技术降解化学农药，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与深加工及家庭用蔬菜水果农残去除清洗。

背景技术

六六六、DDT等化学农药的使用大大促进了现代农业的发展，为农业产品产量和质量的提高作出了重要的贡献，并极大提高了农业生产的劳动效率和机械化程度。然而，这些人工合成并释放到环境中去的农用化学物质对人类健康和生态环境带来了巨大的潜在风险，农药大量使用引起的农产品中农药残留超标，严重影响了人民的身体健康及农产品的出口创汇。随着人民生活水平的提高和环境保护意识的增强，全社会对农药残留带来的直接危害和潜在影响越来越关注，人们迫切需要无农药残留清洁的绿色无公害农产品。但从目前我过的农业生产形式和人口状况来看，以停止农药使用降低农业产量为代价的无公害生产模式是行不通的，农药作为控制病虫害的有效手段还将继续在农业生产中发挥巨大的作用。另外，一些菜农片面追求经济效益，施用高毒、高残留农药，导致农药残留量严重超标。据2000年国家质检总局数据，全国47.5％的蔬菜农药残留超标。

如何解决农业生产中的这个两难问题成为科学家们关注的热点。

农药残留微生物降解技术是一种新型原位生物修复技术。它利用微生物种类繁多、代谢类型极为丰富等生物多样性原理与特点，通过筛选高效农药残留降解菌株，并经现代化工业大规模发酵制成菌剂，利用微生物所产生的酶类应用于农药残留的降解，达到清除土壤、水体、农产品中有机污染物的目的，并以此为核心技术，与其他配套技术相组合，建立一套生产体系，生产绿色、无公害农产品。这种技术可以克服物理、化学处理修复难度大、成本高，还会有二次污染的缺陷。

有机磷农药主要是含磷的有机化合物，大部分是磷酸酯类和酰胺类化合物，具有杀虫效率高、防治范围广、成本低等特点，是目前应用最为广泛的一类农药，主要包括品种有对硫磷(1605)、甲基对硫磷、敌敌畏、二甲硫吸磷、乐果、敌百虫、马拉硫磷等。剧毒，易分解。目前已报道的能够降解有机磷农药的细菌种属主要有假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、产碱菌属等。研究内容也较深入，包括降解菌株的获得、降解酶的分离纯化、降解酶基因的克隆以及降解菌的田间应用等。通过微生物菌剂治理田间有机磷农药污染也有相关的专利，但通过制备酶制剂去除农药残留还未见成熟报道，特别是家庭用去除农残的酶制剂洗涤用品一直没有性价比较合适的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种甲基对硫磷降解菌及其酶制剂的制备方法，针对目前农业生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解酶制剂，使用本制剂可以使田间喷洒的甲基对硫磷降解90％以上，洗涤果蔬可去除表面残留98％左右，且生产成本和使用成本均较低。使用该降解菌剂可在农作物的生长过程中正常使用化学农药甲基对硫磷进行虫害防治，从而保证农产品中甲基对硫磷残留含量符合绿色食品要求。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种甲基对硫磷降解菌，该菌株为革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)，主要生物学特性为G^-，菌体为短杆状，极生鞭毛；兼性厌氧，氧化发酵葡萄糖产酸；氧化酶、过氧化氢酶试验阳性；能够利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、果糖；不利用甘露糖、乳糖、木糖，不能水解淀粉。能利用为甲基对硫磷为唯一碳源和氮源进行生长，将其彻底矿化为CO₂和水及简单的无机化合物。在实验室条件摇瓶实验中，甲基对硫磷降解率达95％以上。该菌的最适产酶条件为pH值为7.0，温度30℃。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

本发明使用上述甲基对硫磷降解菌生产液体粗酶液制剂的工艺为：斜面种→摇瓶种子液→10L发酵罐→收集菌体→机械破碎细胞→收集上清→(NH₄)₂SO₄分级沉淀→HEPES缓冲液悬浮→透析→粗酶液产品。具体实施步骤为：

1)将甲基对硫磷降解菌斜面种接种于LB培养基中，振荡培养至对数生长期；

按质量百分数计，LB培养基配方如下：酵母膏0.5％，NaCl1％，蛋白胨1％，余量为水；

2)将上述培养好的菌液按10％体积接种量转入发酵罐，培养至对数生长期；按质量百分数计，发酵罐所用培养基配方为：葡萄糖0.8％，(NH₄)₂SO₄1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄0.05％，NaCl0.01％，CaCO₃0.3％，酵母膏0.02％，余量为水，pH7.2-7.5；

3)发酵罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：(0.6-1.2)，搅拌速度为180-240转/分钟，培养温度为28-33℃，发酵时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；

4)将上述培养好的菌液离心收集菌体，沉淀悬浮于PBS(40mmol/L，pH7.0)缓冲液中，机械法破碎菌体，离心收集上清，20％～80％质量浓度(NH₄)₂SO₄分级沉淀，收集80％质量浓度(NH₄)₂SO₄沉淀，溶于HEPES缓冲液(20mmol/L，pH7.5)，并对上述缓冲液透析16-18小时(用蒸馏水或去离子水透析)，以除去硫酸铵，得到粗酶液，分瓶包装成为液体酶制剂。

PBS缓冲液配制方法如下：800ml水中溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa₂HPO₄，0.24gKH₂PO₄，用HCl调节pH至7.4，加水定容到1L。

1mol/L的HEPES缓冲液配制方法如下：

将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH(6.8-8.2)，然后用水定容至100ml。使用时，加水稀释到需要的浓度即可。

使用上述的粗酶液精制酶干粉制剂的工艺为：粗酶液→DEAE-Sephadex-A50阴离子柱层析→CM Sepharose Fast Flow阳离子柱层析→透析→冷冻干燥→酶干粉产品。详细实施步骤为：

1)将粗酶液用DEAE-Sephadex-A50阴离子柱进行层析纯化，层析柱用HEPES缓冲液(20mmol/L，pH7.5)彻底平衡后，用蠕动泵上样，速度为1.0ml/min；再用HEPES缓冲液(20mmol/L，pH7.5)洗脱，速度为1.0ml/min，测定洗脱组分在OD₅₉₅和OD₄₁₀处吸光值；合并含甲基对硫磷水解酶(MPH)活性的组分，用蒸馏水或去离子水透析。

2)将上述纯化液再经过CM Sepharose Fast Flow阳离子柱层析纯化，层析柱用MOPS缓冲液(20mmol/L，pH7.0)彻底平衡后，用蠕动泵上样，速度为1.0ml/min；再用0～lmol/L NaCl梯度洗脱液(MOPS缓冲液，20mmol/L，pH7.0)洗脱，速度为1.0ml/min，测定洗脱组分在OD595和OD410处吸光值；合并含MPH活性的组分，并对蒸馏水或去离子水透析后，进行冷冻干燥；得到酶干粉制剂。

10×MOPS缓冲液(10倍浓度MOPS缓冲液，即200mmol/L)配制方法如下：将41.2g[2-(N-玛琳代)丙磺碱，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶于800mL经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的50mmol/L乙酸钠液中，用2mol/LNaoH调整pH至7.0，加入20mL经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的0.5mol/LEDTA(pH8.0)，再加经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水至总体积为1000mL过滤除菌，避光室温保存。使用时，加水稀释到需要的浓度即可。乙酸钠液、EDTA或水的DEPC处理过程是：分别在灭菌的乙酸钠液、EDTA或水中加入终体积浓度为0.1％的DEPC，37℃温浴12小时，高压蒸汽灭菌(121℃，25min)，使DEPC分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。

本发明中，接种量是指占培养基的体积百分比。

本发明中，水是指蒸馏水或去离子水。

本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了一种化学农药甲基对硫磷降解菌，实验室生物降解实验结果表明，对甲基对硫磷降解率达到95％以上。

2、使用该发明生产的农药残留降解酶制剂具有性价比高，使用方便，去除农残彻底的优点，适合在全国果茶粮油生产出口基地或绿色食品生产基地大面积推广使用，也适合家庭去除农残水果蔬菜洗涤。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要意义，可大大降低生产和使用过程中的工作量，降低生产和使用成本。使用该酶制剂可以在农作物正常生长过程中正常使用有机磷农药防治虫害从而保证农产品中甲基对硫磷残留含量符合绿色食品要求。此外，该菌为革兰氏阴性菌，在田间的存活时间适当，不会影响以后农药的使用效果。

3、盆栽试验表明，采用本发明生产的液体酶制剂直接施用于农作物，可使作物中甲基对硫磷残留量降低90％以上；采用固体酶干粉制剂按一定比例稀释后施用可使农药残留量降低95％以上。本发明成功解决了农业生产中有机磷农药残留超标问题，既充分发挥了有机磷农药在植物虫害防治中的高效快速作用，又可以生产出绿色环保的农产品。液体粗酶液制剂洗涤果蔬可去除表面农药残留98％左右，对保障人民生命健康具有重要的作用。

4、本领域中，公知的革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌只是一种病原菌(如引起腹泄等)，本发明将革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌用于甲基对硫磷降解菌，其酶制剂性价比较高，易大规模推广使用。

附图说明

图1为革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌在含甲基对硫磷固体平板上的生长情况。

具体实施方式

实施例1

采集中国科学院沈阳生态站连续10年施用甲基对硫磷的大豆田表层土壤。取10g土壤，加入90ml蒸馏水，制作土壤悬液，以10％的体积比例接入甲基对硫磷唯一碳源的无机盐培养基中(甲基对硫磷浓度为100mg/L)，无机盐培养基的配方为(均为质量比)：NH₄NO₃0.2％，KH₂PO₄0.3％，K₂HPO₄0.15％，CaCl₂0.001％，MgSO₄·7H₂O0.2％，FeSO₄·7H₂O0.001％，余量为水，pH7.0-7.2，30℃，200rpm富集培养5天，用第一次的富集培养液按10％的体积比例接入相应的培养基中，同时甲基对硫磷浓度提高至200mg/L，在同样的条件下培养，同样用第二次富集培养液以10％的体积比例接入相应的培养基中，甲基对硫磷浓度升高至300mg/L，依次循环5次，直至甲基对硫磷浓度升高至500mg/L。取最终富集培养液稀释涂平板，30℃，培养3天，发现部分菌落周围有黄色水解圈，挑取单菌落。液体摇瓶实验复证降解性能，选取降解能力较强的菌株接种试管斜面。经16SrDNA序列分析，与Plesiomonas shigelloides ATCC14029同源性为100％(GenBank登录号X74688)，因此可认为与其为同一菌株，该菌株为革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌，革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌也可以通过ATCC在中国的代理商(如：北京中原公司)进行商业购买。主要生物学特性为G^-，菌体为短杆状，极生鞭毛；兼性厌氧，氧化发酵葡萄糖产酸；氧化酶、过氧化氢酶试验阳性；能够利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、果糖；不利用甘露糖、乳糖、木糖，不能水解淀粉。该菌的最适产酶条件为pH值为7.0，温度30℃。

如图1所示，革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌在含甲基对硫磷固体平板上的生长情况。

实施例2

取实施例1中或市购革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌的斜面接种于200mlLB培养基中，按质量百分数计，LB培养基配方如下：酵母膏0.5％，NaCl1％，蛋白胨1％，余量为水；恒温振荡培养至对数期，获得种子液，准备接种小型发酵罐。发酵罐10L，投料量为8L，培养基配方为(均为质量比)：葡萄糖0.8％，(NH₄)₂SO₄1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄0.05％，NaCl0.01％，CaCO₃0.3％，酵母膏0.02％，余量为水，PH7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至35℃后，将上述培养好的摇瓶种子液按照10％体积接种量转入发酵罐，培养至对数生长期；发酵罐的培养过程中，搅拌速度为220转/分钟，无菌空气的通气量为1：0.8，培养温度为28-33℃，发酵时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。

实施例3

将上述实施例2中培养好的发酵液3000g离心10分钟离心收集菌体，沉淀悬浮于PBS(40mmol/L，pH7.0)缓冲液中，PBS缓冲液配制方法如下：800ml蒸馏水中溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa₂HPO₄，0.24gKH₂PO₄，用HCl调节pH至7.4，加水定容到1L。机械法破碎菌体，12000g离心10分钟，收集上清。20％～80％质量浓度(NH₄)₂SO₄分级沉淀，收集80％质量浓度(NH₄)₂SO₄沉淀，溶于HEPES缓冲液(20mmol/L，pH7.5)，并对上述缓冲液透析16-18小时(用蒸馏水或去离子水透析)，以除去硫酸铵，得到粗酶液，回收率为97.8％分瓶包装成为液体酶制剂。

1mol/L的HEPES缓冲液配制方法如下：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH(6.8-8.2)，然后用水定容至100ml。使用时，加水稀释到需要的浓度即可。

实施例4

将上述实施例3中的粗酶液用DEAE-Sephadex-A50阴离子柱进行层析纯化，层析柱用HEPES缓冲液(20mmol/L，pH7.5)彻底平衡后，用蠕动泵上样，速度为1.0ml/min；再用HEPES缓冲液(20mmol/L，pH7.5)洗脱，速度为1.0ml/min，测定洗脱组分在OD₅₉₅和OD₄₁₀处吸光值；合并含甲基对硫磷水解酶(MPH)活性的组分，用蒸馏水或去离子水透析；将上述纯化液再经过CM Sepharose FastFlow阳离子柱层析纯化，层析柱用MOPS缓冲液(20mmol/L，pH7.0)彻底平衡后，用蠕动泵上样，速度为1.0ml/min；再用0～1mol/LNaCl梯度洗脱液(MOPS缓冲液，20mmol/L，pH7.0)洗脱，速度为1.0ml/min，测定洗脱组分在OD₅₉₅和OD₄₁₀处吸光值；合并含MPH活性的组分，并对蒸馏水或去离子水透析后，进行冷冻干燥；得到酶干粉制剂，回收率为50.4％。该酶热稳定性比较高，55℃、15min处理后酶活保持稳定，最适反应pH为9.0，最适反应温度在10℃左右。动力学分析表明其对甲基对硫磷的米氏常数(K_m)为2.09mmol/L，最大反应速度(V_max)为13.02μmol/L.min。

应用例1

在实验室条件下，应用实施例3中的液体酶制剂通过液体摇瓶实验显示出对其他几种有机磷农药也具有较强的降解作用(见表1)，处理时按实施例1中无机盐培养基体积的1％加入粗酶液。

表1.革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌对有机磷农药的降解

农药品种	甲胺磷		甲基对硫磷		毒死蜱
农药品种	甲胺磷		甲基对硫磷		毒死蜱		处理方式	对照	处理	对照	处理	对照	处理
农药浓度(mg/L)	92	48	223	10	207.2	166	处理方式	对照	处理	对照	处理	对照	处理
农药浓度(mg/L)	92	48	223	10	207.2	166	降解率	51.5		95.5		19.9

应用例2

实验室盆栽实验，种植作物韭菜，共设置3个处理，对照、液体酶制剂处理组和固体酶制剂处理组，每个处理3个重复。在喷洒甲基对硫磷1周后，取实施例3和实施例4中的液体酶制剂处理组和固体酶制剂按使用方法要求施用，液体酶制剂兑200倍水稀释喷洒，施用剂量为1kg/亩；固体酶制剂施用量为30g/亩，用水稀释为200升喷洒，2-3天后，采集作物叶片样品，采用气相色谱法测定农药残留含量(由中国科学院沈阳应用生态研究所分析测试中心和绿色食品检定中心测定)(见表2)。从表2可以看出，固体酶制剂处理效果要好于液体酶制剂，但固体酶制剂造价较高，因此从性价比的角度讲，液体粗酶液制剂更易于推广使用。

表2生物降解酶制剂盆栽实验数据

处理方式	对照	液体酶制剂处理组	固体酶制剂处理组
处理方式	对照	液体酶制剂处理组	固体酶制剂处理组	农药浓度(mg/L)	5.8	0.58	0.29
降解率		90	95	农药浓度(mg/L)	5.8	0.58	0.29

应用例3

考察实施例3中的液体酶制剂在洗涤水果蔬菜过程中的农残去除效果。取300ml粗酶液制剂用水稀释至3000ml，调整pH值约为7.0，温度为30-35℃。加入农药喷雾处理后过夜的样品，缓慢搅拌处理一定时间，取出，清水洗涤后，晾干，保鲜袋封存，同时设空白对照(不经过任何处理，用以确定样品的本底残留)和阴性对照(经过农药喷雾处理的样品，用清水处理)。处理的果蔬品种为于黄瓜和小青菜，处理时间30分钟，处理结束后取黄瓜表皮和菜叶测定农药残留(见表3)。

表3液体粗酶制剂去除小青菜、黄瓜表面农药残留的效果

果蔬品种	黄瓜		小青菜
果蔬品种	黄瓜		小青菜		处理方式	对照	处理	对照	处理
农药浓度(mg/L)	1.9	0.019	8.4	0.126	处理方式	对照	处理	对照	处理
农药浓度(mg/L)	1.9	0.019	8.4	0.126	降解率	99		98.5

Claims

1.一种甲基对硫磷降解菌，其特征在于，该菌株为革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌。

2.一种甲基对硫磷降解菌的酶制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)将革兰氏染色阴性的类志贺邻单胞菌斜面种接种于LB培养基中，振荡培养至对数生长期；

2)将上述培养好的菌液按10％体积接种量转入发酵罐，培养至对数生长期，按质量百分比计，发酵罐所用培养基配方为：葡萄糖0.8％，(NH₄)₂SO₄1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄0.05％，NaCl0.01％，CaCO₃0.3％，酵母膏0.02％，余量为水，pH7.2-7.5；

3)发酵罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分钟，培养温度为28-33℃，发酵时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；

4)将上述培养好的菌液离心收集菌体，沉淀悬浮于40mmol/L的PBS缓冲液中，机械法破碎菌体，离心收集上清，20％～80％质量浓度(NH₄)₂SO₄分级沉淀，收集80％质量浓度(NH₄)₂SO₄的沉淀，将其溶于20mmol/L的HEPES缓冲液，并对上述HEPES缓冲液透析16-18小时，以除去硫酸铵，得到粗酶液，分瓶包装成为液体酶制剂。

3.按照权利要求2所述的甲基对硫磷降解菌的酶制剂的制备方法，其特征在于，将粗酶液精制酶干粉制剂，具体步骤如下：

1)将所述的粗酶液用DEAE-Sephadex-A50阴离子柱进行层析纯化，层析柱用20mmol/L的HEPES缓冲液彻底平衡后，用蠕动泵上样，速度为1.0ml/min；再用20mmol/L的HEPES缓冲液洗脱，速度为1.0ml/min，测定洗脱组分在OD₅₉₅和OD₄₁₀处吸光值；合并含甲基对硫磷水解酶活性的组分，用蒸馏水或去离子水透析；

2)将上述纯化液再经过CM Sepharose Fast Flow阳离子柱层析纯化，层析柱用20mmol/L的MOPS缓冲液彻底平衡后，用蠕动泵上样，速度为1.0ml/min；再用0～1mol/LNaCl梯度洗脱液洗脱，洗脱液为20mmol/L的MOPS缓冲液，速度为1.0ml/min，测定洗脱组分在OD₅₉₅和OD₄₁₀处吸光值；合并含甲基对硫磷水解酶活性的组分，并用蒸馏水或去离子水透析后，进行冷冻干燥；得到酶干粉制剂。