CN104560815A - 一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌菌株UTM115，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年9月18日，保藏编号为CGMCC？No.9680。本发明菌株UTM115可以用于有机固体废弃物生物的降解，特别是用于含偶氮化合物的有机固废的处理，对治理城乡有机固体废弃物的污染有益。

Description

一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及有机固体废弃物处理领域，具体地说，涉及一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
城乡有机固体废弃物中特别是印染行业的废弃物常含有某些偶氮化合物，采用目前的工艺很难去除。利用微生物处理含偶氮有机废弃物是易操作低成本的方法，从而引起人们的广泛关注。采用微生物处理含有有害有机化合物污染的污泥，使其减量化、无害化和资源化。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种常见的土壤微生物类群，能分泌多种酶并运用于生化反应过程中。将具有偶氮还原酶活性及果胶酶等多种耐高温生物质水解酶的地衣芽孢杆菌运用于相关污泥的减量化和无害化处理具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌及其应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌菌株UTM115，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2014年9月18日，保藏编号为CGMCC No.9680。
所述菌株UTM115分离自云南腾冲温泉采集的底泥样本，利用驯化培养基(葡萄糖3g、淀粉2.5g、蛋白胨2g、牛肉膏2g、硫脲0.04g、偶氮染料0.1g、KH2PO40.05g、NH4Cl 0.2g、NaHCO30.1g、MgSO4·7H2O0.06g、MnSO4·7H2O 0.006g、FeCl3·6H2O 0.003g、CaCl2·2H2O 0.006g、水1000ml)在40℃，经多代富集驯化、定向筛选得到。
所述菌株UTM115为革兰氏阳性、细胞0.8×(2.0～3.5)μm、直杆状、单生、芽孢椭圆型、近中生，孢囊膨大；在含葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5g、琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.0)上菌落光滑正园、扁平微突、蛋壳黄色、生长迅速，35～50℃培养24小时后菌落直径约3mm，最适生长温度40～70℃。硝酸盐还原阳性、接触酶阳性、氧化酶阳性、VP实验阳性。
本发明还提供了用于克隆所述菌株16S rRNA的引物：
F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；
R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。
利用上述引物经PCR扩增该菌株的16S rRNA序列(如SEQ IDNo.1所示)，将获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示UTM115菌株的16S rRNA序列与Bacillus licheniformis的相似性最高，为99.7％，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。
利用通用引物UP-1S:5’-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3’和UP-2Sr:5’-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3’经PCR扩增该菌株的gyrB基因序列(如SEQ ID No.2所示)，将获得的序列提交到NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示UTM115菌株的gyrB基因序列与Bacillus licheniformis相似性最高，结合所述菌株的细胞形态及生理生化特性为鉴定该菌株的次要特征。确定该菌株为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。
进一步地，所述菌株具有偶氮还原酶、果胶酶和β-(1,4)-木糖苷酶活性。偶氮还原酶、果胶酶和β-(1,4)-木糖苷酶的编码基因分别如SEQ ID No.3～SEQ ID No.5所示。
本发明还提供了含有述菌株的菌剂。
进一步地所述菌剂的制备方法为：
1)将所述菌株接种于培养基中，进行发酵培养，得到发酵液；
2)将发酵液直接分装成为液体菌剂，或将发酵液经脱水干燥得到菌粉剂。
更进一步地，所述步骤1)具体为：
(1)将所述菌株接种于培养基中，35-45℃温度下，100～250转/分钟摇瓶培养1～2天得到摇瓶种子液；
(2)将摇瓶种子液按0.01～1％接种量接种至含有LB液体培养基的种子罐中培养；培养温度35～45℃、通气量为1：0.2～0.5(v/v)、转速100～400转/分钟，培养时间1～2天，得到种子罐种子液。
(3)将上述种子液按0.1～1％接种量接种至含有LB液体培养基的发酵罐中进行培养；培养温度35～45℃、通气量为1：0.3～0.6(v/v)、转速60-200转/分钟，培养时间1～2天，当OD600≥2时停止培养，得到发酵液。
作为优选，所述培养基为含葡萄糖蛋白胨的液体培养基，包括：葡萄糖5g、蛋白胨15g、酵母膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH为7.0。
本发明还进一步提供了所述菌株或所述菌剂在处理含偶氮化合物的有机固体废弃物中的应用。
其中，所述有机固体废弃物包括城市生活污水厂的下水污泥、生活垃圾、餐厨垃圾、动物尸体或畜禽粪便，碳氮比为10～50:1、含水量为45％～65％。
进一步地，所述应用具体为：
1)将相当于总物料湿重0.01％～1％的菌剂接种于有机固体废弃物中，混合均匀进行堆肥好氧发酵；
2)好氧堆肥发酵12～20天，其间保持通气，保持氧气含量为8～15％，间隔4～5天翻堆1次；
3)当含水量低于40％，同时温度不再升高时停止通气，发酵终止，堆体中的有机物减量约85％，容积减量约60％，原物料中的偶氮化合物降低；
4)剩余物料或焚烧或填埋或过筛分装成生物肥料。
本发明的有益效果在于：
本发明菌株UTM115可以用于有机固体废弃物生物的降解，特别是用于含偶氮化合物的有机固废的处理，对治理城乡有机固体废弃物的污染有益。
附图说明
图1为本发明所述UTM115菌株的系统进化树。
图2为本发明所述UTM115菌株的显微镜照片。
图3为好氧堆肥发酵用的发酵槽。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1地衣芽孢杆菌UTM115的分离与鉴定
取约1克温泉底泥样品置于装有多粒玻璃珠及50ml无菌水的250ml三角瓶中。40℃、恒温摇床上震荡1小时，然后静置30分钟。在无菌条件下吸取上清液1ml，接至装有50ml已灭菌的富集培养基(葡萄糖2.5g、淀粉2.5g、蛋白胨2g、牛肉膏2g、硫脲0.4g、偶氮染料0.1g、KH2PO40.05g、NH4Cl 0.2g、NaHCO30.1g、MgSO4·7H2O 0.6g、MnSO4·7H2O 0.006g、FeCl3·6H2O 0.003g、CaCl2·2H2O 0.006g、水1000ml)中，40℃震荡培养3天，转速220转/分钟。取培养3天的菌液1ml，加入到装9ml无菌水的试管中，以梯度稀释法配制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的稀释度，分别取0.1ml涂布于含偶氮化合物作为唯一碳源的选择培养基平板上(Na2HPO44.5g、KH2PO42.5g、MnSO4·7H2O 0.003g、FeSO4·7H2O 0.02g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl20.05g、NH4Cl 0.5g、0.001g偶氮化合物、琼脂15g，蒸馏水1000ml)。40℃培养4～5天后，挑取较大的单菌落进行纯化。
以本发明菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA基因序列，引物为(27f)：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸90秒，30个循环，72℃延伸10分钟。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No:1所示。获得的16S rRNA基因序列通过EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/)进行比对，与菌株Bacilluslicheniformis的相似性最高，同源性为99.7％。如图1所示的基于UTM115菌株及其相关菌株的16S rRNA基因序列，利用Mega5.0系统进化软件构建的系统进化树(最大似然法)，说明其系统进化关系与地衣芽孢杆菌最近。利用通用引物UP-1S:5’-GAA GTC ATC ATGACC GTT CTG CA-3’和UP-2Sr:5’-AGC AGG GTA CGG ATG TGCGAG CC-3’经PCR扩增该菌株的gyrB基因，测序结果见序列表SEQID No:2获得的序列提交到NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示UTM115菌株的gyrB基因序列与Bacilluslicheniformis相似性最高，结合菌株的形态学特征(如图2所示的UTM115细胞的显微形态)及生理生化特征，把该菌株鉴定为Bacilluslicheniformis，命名为UTM115，并于2014年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。分类命名为Bacillus licheniformis，保藏号为CGMCC No.9680。
实施例2菌株UTM115偶氮还原酶活性检测及其基因序列
将UTM115菌种先接入装有40ml LB培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、水1000ml)的250ml三角瓶中，40℃培养24h，获得新鲜菌种。以5％的接种量将活化好的菌株分别接入多个装有50ml液体培养基的250L三角瓶中，并将适量的活性红染料(1％的染料水溶液经0.25μm微孔滤膜过滤)加入到三角瓶中。起始浓度为50mg/L，每隔3小时测菌体湿重和脱色率，共测24小时。每次测定时，从三角瓶中取2ml培养液，6000转/分钟离心10分钟，取上清液用分光光度计测定在600nm波长下的OD值。并以不接菌的染料培养基为对照，计算脱色率。以表示菌株对染料的脱色能力。脱色率＝(A-B)/A×100％(A为不接种菌液的OD值，B为接种菌液的OD值)。根据脱色率判断偶氮还原酶的活性。经测定，UTM115菌株脱色率为94.2％，表明其具有较强的偶氮还原酶活性。
根据偶氮还原酶基因设计的引物azo-f:5’-AAT GAC CGT ACAGCT GAA GAA G-3’和azo-r:5’-TTG AGC GTC GTC AGG AACAG-3’，并以本发明菌株UTM115DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约0.5kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码偶氮还原酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No:3。
实施例3菌株UTM115果胶酶活性检测及其相关基因序列
将UTM115斜面活化菌株接种到发酵培养基中(葡萄糖5g、蛋白胨15g、酵母膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH7.0)，40℃，200转/分钟培养24小时，发酵液以4000转/分钟离心10分钟，收集菌体并将菌体置于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，用超声波破碎仪(600W)，工作时间5秒，间隔时间5秒，连续20次进行细胞破碎，离心获得上清液，即获得粗酶液。果胶酶活性采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定。取0.4ml 1％的果胶溶液(用pH4.0 0.2mol的Na2HPO4及0.1mol的柠檬酸缓冲液配制)加入到25ml具塞试管中，并在50℃水浴中平衡5分钟后加入0.1ml经适当稀释的粗酶液，在50℃水浴中反应30分钟，加入1.5mlDNS和1.5ml蒸馏水终止反应。在对照组中加入灭活的粗酶液(100℃煮沸10分钟灭活)0.1ml。沸水浴5分钟、冷却、定容至25ml，在550nm处比色，测定反应体系中半乳糖醛酸的量以确定果胶酶的活性。经测定，UTM115菌株能够水解果胶，形成半乳糖醛酸，具有果胶酶活性。
根据芽孢杆菌果胶酶基因设计的简并引物pect-f:5’-CTG GCTGTA ATT CGCA-3’和pect-r:5’-GGT ACA GTC GCT GCT T-3’，并以本发明菌株UTM115DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸60秒，35个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约1.5kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码果胶酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No:4。
实施例4菌株UTM115β-(1,4)-木糖苷酶活性检测及其相关基因序列
β-(1,4)-木糖苷酶活性测定反应体系为200μl，内含10μl 20mmol/L底物对硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX，Sigma)、185μl 100mmol/L pH6.0的邻苯二甲酸氢钾-咪哇缓冲液、5μl适量稀释实施例3中所提取粗酶液，于65℃反应5分钟，然后加入600μL 1mol/L的Na2CO3溶液终止反应并显色,用分光光度计测定其在410nm的吸收值。经测定UTM115菌株能够水解木糖苷键，具有木糖苷酶的活力。
根据β-(1,4)-木糖苷酶基因保守序列设计的简并引物xylo-F1:5’-ACC GGG ATA TCT CAG G-3’和xylo-R1:5’-GCA ATA TAG CGGAAC C-3’，并以本发明菌株UTM108DNA为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸60秒，30个循环，72℃延伸10分钟，通过电泳检测得到约0.5kb大小的核苷酸片段，测序并将在NCBIGeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，获得该序列片段编码β-(1,4)-木糖苷酶基因，其基因序列见序列表SEQ ID No:5。
实施例5菌株UTM115液体菌剂及菌粉剂的制备
从4℃保存的本发明菌株UTM115斜面挖菌苔接种至装有40mlLB液体培养基的250ml三角瓶中，35～45℃培养1～2天，摇床转速100-250转/分钟。此为摇瓶种子液。
将摇瓶种子液按0.01～1％接种量接种至含有LB液体培养基的种子罐中培养。培养温度35～45℃、通气量为1：0.2～0.5(v/v)、转速100～400转/分钟，培养时间1～2天。此为种子罐种子液。
将上述种子液按0.1～1％接种量接种至含有LB液体培养基的发酵罐中进行培养。培养温度35～45℃、通气量为1：0.3～0.6(v/v)、转速60-200转/分钟，培养时间1～2天。当OD600≥2时停止培养。此为此为发酵菌液。
发酵液直接分装成为液体菌剂，发酵液经脱水干燥得菌粉剂。
实施例6利用菌株UTM115的菌剂处理印染厂污泥
印染厂污泥30吨(含水量83.1％),水分调理剂25吨(含水量30.5％)和55升UTM115菌剂，用装载机拌充分拌合，移入发酵槽中进行堆肥好氧发酵，此混合物水分约59.2％。发酵过程中用鼓风机供气使氧气含量约为10％左右，期间每隔4～5天翻抛一次。不加UTM115菌剂为对照组。发酵周期20天。计算剩余物料的偶氮染料残留见表1。
表1 偶氮染料残留(芳香胺ppm)(HPLC)
组别 发酵0天 发酵10天 发酵20天
对照组 202.5 117.3 61.3
实验组 202.5 55.6 5.2
由表1可知，本发明所述UTM115菌株具有降解偶氮染料的能力。
实施例7利用菌株UTM115制备生物肥料
400kg猪粪与200kg经粉碎后玉米秸秆及实施例5制备的UTM115菌剂1L混合拌均。此混合物碳氮比约为23:1，含水率约为59％。于发酵槽中进行好氧发酵(发酵槽结构如图3所示)。发酵过程中，鼓风机供气使堆体氧气含量约10％左右。发酵期间每隔4～5天以倒槽的方式翻抛一次。当翻抛后堆体温度不再回升，停止供气、终止发酵并迅速将物料散开，使温度降低至室温，得到棕色发酵粉末，此过程约25天。棕色发酵粉末经过筛得生物肥料。以不加发酵液进行对照。本试验接种UTM115菌剂后，物料发酵周期缩短，发酵所得的生物肥料的腐熟度提高。表2是两组肥料对小麦发芽的影响：
表2 UTM115菌剂制备生物肥料发芽指数(小麦)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌株UTM115，其特征在于，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年9月18日，保藏编号为CGMCC No.9680。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株具有偶氮还原酶、果胶酶和β-(1,4)-木糖苷酶活性。
3.用于克隆权利要求1或2所述菌株16S rRNA的引物，其特征在于，所述引物为：
F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；
R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。
4.含有权利要求1或2所述菌株的菌剂。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的制备方法为：
1)将权利要求1或2所述菌株接种于培养基中，进行发酵培养，得到发酵液；
2)将发酵液直接分装成为液体菌剂，或将发酵液经脱水干燥得到菌粉剂。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述步骤1)具体为：
将权利要求1或2所述菌株接种于培养基中，35-45℃温度下，100～250转/分钟摇瓶培养1～2天得到摇瓶种子液；
将摇瓶种子液按0.01～1％接种量接种至含有LB液体培养基的种子罐中培养；培养温度35～45℃、通气量为1：0.2～0.5(v/v)、转速100～400转/分钟，培养时间1～2天，得到种子罐种子液；
将上述种子液按0.1～1％接种量接种至含有LB液体培养基的发酵罐中进行培养；培养温度35～45℃、通气量为1：0.3～0.6(v/v)、转速60-200转/分钟，培养时间1～2天，当OD600≥2时停止培养，得到发酵液。
7.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述培养基为含葡萄糖蛋白胨的液体培养基，包括：葡萄糖5g、蛋白胨15g、酵母膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH为7.0。
8.权利要求1或2所述菌株或权利要求4-7任一项所述菌剂在处理含偶氮化合物的有机固体废弃物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述有机固体废弃物为城乡生活污泥、餐厨垃圾、畜禽粪便、作物秸秆和印染行业的有机固体废弃物中的一种或两种以上的混合物；所述有机固体废弃物的碳氮比为10～50:1、含水量为45％～65％。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：
1)将相当于总物料湿重0.01％～1％的菌剂接种于有机固体废弃物中，混合均匀进行堆肥好氧发酵；
2)好氧堆肥发酵12～20天，其间保持通气，保持氧气含量为8～15％，间隔4～5天翻堆1次；
3)当含水量低于40％，同时温度不再升高时停止通气，发酵终止，原物料中的偶氮化合物降低；
4)剩余物料或焚烧或填埋或过筛分装成生物肥料。
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