CN101892182A - 一株地衣芽孢杆菌及其在促进纤维素降解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌及其在促进纤维素降解中的应用。本发明提供了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J15CGMCC No.3905。发酵地衣芽孢杆菌J15得到的发酵液即本发明的纤维素降解酶制剂。地衣芽孢杆菌J15可用于降解纤维素，也可用于在制备堆肥。本发明利用纤维素分解菌降解秸秆，不仅提高了秸秆的营养价值和利用价值，而且具有营养价值高、可再生、对环境友好、能耗最小等优点。将纤维素分解菌接种于高温堆肥，能够显著提高堆肥化过程中纤维素酶的含量，促进纤维素的降解，促进堆肥腐熟，提高堆肥质量。

Description

一株地衣芽孢杆菌及其在促进纤维素降解中的应用

技术领域

本发明涉及一株地衣芽孢杆菌及其在促进纤维素降解中的应用。

背景技术

我国是农业大国，每年产生的秸秆在6亿吨以上，如何处理农作物秸秆是大多数农区面临的一个难题，大量的废弃秸秆如果不及时处理，不仅会影响正常耕作，而且也成了病虫害繁殖的场所。随着秸秆农作物单产提高，秸秆总量迅速增加，多数地区集中出现秸秆焚烧的现象，大面积焚烧秸秆，不仅造成了极大的环境污染，而且浪费了宝贵的生物资源。全国各省区主要作物秸秆总量见表1。

表1全国各省区主要作物秸秆总量(万吨)

省区	秸秆总量	省区	秸秆总量	省区	秸秆总量
						北京	4.31	江苏	44.74	广东	17.95
天津	2.91	浙江	18.21	广西	13.07
						河北	38.04	安徽	21.90	海南	1.74
山西	12.87	福建	9.06	四川	54.65
						辽宁	18.99	江西	16.37	贵州	11.16
吉林	28.97	山东	68.33	云南	14.35
						黑龙江	28.62	河南	53.55	西藏	0.86
内蒙古	13.09	湖北	30.55	陕西	17.43
						青海	1.56	宁夏	3.19	新疆	14.54
上海	3.38	湖南	27.10	甘肃	12.43

目前处理含纤维素原料的方法主要有酸水解法、高压蒸汽处理法、焚烧法和生物法等。前三种方法能耗高，且易造成二次污染。

将农作物秸秆和畜禽粪便进行高温好氧堆肥是符合我国国情的资源化、稳定化和无害化农业固体有机废弃物的有效利用方式之一。大量的研究表明，这些有机废弃物的主要有机成分是纤维素，因而在这一过程中，高温纤维素分解菌是最关键、最活跃的生物因素。筛选高效的高温纤维素分解菌，并添加到堆肥中，能够有效地达到提高高温堆肥的效率、腐化程度和质量的目的。

有机废物堆肥具有悠久的历史，早在几个世纪以前，农村中就将秸秆、落叶、野草和动物粪便等堆积一起，使其发酵制作成肥料。但是，真正对堆肥技术进行科学的探讨则始于20世纪初。但是，这些研究主要集中在工艺参数、物质变化和堆肥化过程中条件的控制(如温度、通风量、氧气、C/N等)方面。直到半个多世纪前，国外才开始关于堆肥接种剂的研究。而我国则是在20世纪90年代才开始对微生物在堆肥中的作用和机制进行研究。

目前很多研究者认为真菌降解纤维素的效果要好于细菌，因此，在菌剂的研究中，也多以真菌为主。但是，在好氧堆肥过程中，细菌凭借强大的比较面积，可以快速将可溶性底物吸收到细胞中，其数量要比放线菌和真菌多得多。2009年，万水霞等研究了自然堆肥状态下微生物群落的动态。结果表明，在堆肥过程中，细菌总数的变化趋势是高-低-高，在堆肥过程中细菌总数始终占优势地位。认为在起始期、高温期、降温期可以补充适合的微生物菌种来达到提温、维持高温、分解纤维素等目的。

在高温期，当温度上升到60℃时，真菌几乎完全停止活动，仅为嗜热性放线菌和细菌活动。芽孢杆菌能够生成很厚的孢子壁以抵抗高温、辐射和化学腐蚀，对冷、热、干燥及食物不足都有很强的耐受力，一旦周围环境改善，它们又将恢复活性。Abdennaceur等研究表明：在堆肥初期，嗜温细菌最为活跃，而在高温期，优势菌主要为芽孢杆菌属(Bacillus)，如：枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus.licheniformis)和环状芽孢杆菌(Bacillus.circulans)。Tiquia采用16S and 18S rDNA T-RFLP研究了堆肥期间细菌和真菌的群落多样性，结果表明，细菌的多样性要高于真菌，尤其是在堆肥高温期，细菌群落多样性增加，而真菌群落多样性降低，但在低温阶段，情况恰好相反。

1936-1938年，彭家元和陈禹平从堆肥中分离筛选出好热性纤维素分解菌，并扩大培养后制成菌剂，称为平元菌剂，作为堆肥的接种剂。于婷乔等从堆肥、牛粪、秸秆堆腐物中分离出4株纤维素分解菌。选取其中纤维素酶活力较高的三株菌进行堆肥实验。将FDQ1+FDQ2和FDQ1+FDQ3菌株等比例混合进行牛粪与鸡粪混合堆肥。结果表明，接种菌种的实验组纤维素分解率较对照分别提高95.12％和78.61％。说明接种纤维素分解混合菌剂能有效促进堆肥中有机质转化，提高纤维素分解率，提高堆肥品质。王伟东等以麦秸堆下的土壤和麦秸堆肥为材料，将筛选到菌系进行淘汰和不同系之间的组配，最终筛选构建了一组木质纤维素分解菌复合系。并在以牛粪、鸡粪和麦秸为材料的堆肥化过程中，接种该复合菌系。结果表明，接种菌能够有效促进堆肥化过程中纤维素、半纤维素和木质素的分解。目前研究的接种剂，多为混合菌剂，且是在堆肥初期进行接种主要目的是通过使高温期提前，延长高温期达到提升堆肥质量的目的。而关于在堆肥高温期接种纤维素分解菌细菌，促进堆肥高温期纤维素降解国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株地衣芽孢杆菌及其在促进纤维素降解中的应用。

本发明提供的菌株，名称为纤维素分解菌J15，属于地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)，已于2010年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo.3905。

本发明还保护一种制备纤维素降解酶制剂的方法，是发酵纤维素分解菌J15，得到的发酵液即为纤维素降解酶制剂。所述发酵的温度可为55～60℃。所述方法制备得到的酶制剂可以降解如下底物中的至少一种：滤纸、羧甲基纤维素钠、脱脂棉和水杨素。所述方法制备得到的酶制剂可为滤纸酶和/或纤维素酶和/或脱脂棉酶和/或β-葡萄糖苷酶。制备的酶制剂为滤纸酶和纤维素酶时，所述发酵的温度具体为55℃。制备的酶制剂为脱脂棉酶和β-葡萄糖苷酶时，所述发酵的温度具体为60℃。

用所述方法制备得到的纤维素降解酶制剂也属于本发明的保护范围。

纤维素分解菌J15可应用于降解纤维素。所述纤维素具体可为秸秆。

纤维素分解菌J15可用于制备堆肥。

本发明利用纤维素分解菌降解秸秆，不仅提高了秸秆的营养价值和利用价值，而且具有营养价值高、可再生、对环境友好、能耗最小等优点。将纤维素分解菌接种于高温堆肥，能够显著提高堆肥化过程中纤维素酶的含量，促进纤维素的降解，促进堆肥腐熟，提高堆肥质量。

附图说明

图1为纤维素分解菌J15筛选过程中降解滤纸条的效果图；左一为对照管，其余管皆为试验管。

图2为纤维素分解菌J15的16S rDNA鉴定电泳图；1：marker；2-4：PCR产物。

图3为不同碳源对产酶能力的影响。

图4为不同培养温度对产酶能力的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

每分钟由底物生成1mol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

蛋白胨纤维素培养基(PCS培养基)：NaCl 0.5％，CaCO₃0.2％，纤维素(新华滤纸)0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，蒸馏水100mL；自然pH。纤维素细菌合成培养基(复筛培养基)：NaCl 6g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，KH₂PO₄0.5g，CaCl 0.1g，K₂HPO₄2.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，酵母膏1.0g，滤纸条一片，蒸馏水1000mL；pH 7.0～7.5。纤维素固体培养基：NaCl 6g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，KH₂PO₄0.5g，CaCl 0.1g，K₂HPO₄2.0g，(NH₄)₂SO₄2.0g，酵母膏1.0g，2％的琼脂，2％羧甲基纤维素钠，蒸馏水1000mL；pH 7.0～7.5。肉膏蛋白胨培养基(富集培养基)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL；pH7.5。

实施例1、纤维素分解菌J15的分离和鉴定

一、纤维素分解菌J15的分离

取5g高温期(60℃～65℃)堆肥样品加入到100mL PCS培养基中，在60℃下静止培养。当滤纸条被降解时，将原菌种以10％(体积百分含量)的量接种到新鲜的PCS培养基中，进行纤维素分解菌的初筛。选取降解效果好的菌种增殖进行复筛。将增殖后培养液倍比稀释，接种到纤维素细菌培养基中，以空白管的培养基作为对照，对滤纸条降解效果好的的样品管进行菌种的分离。当菌种降解滤纸条时间稳定后，将进行培养液稀释，稀释率为10^-1、10^-2、10^-3和10^-4，在纤维素固体培养基平板上均匀涂布，超净台内吹干，每个浓度3个重复，60℃温箱内培养48h，用接种针挑去单个菌落划线进行分离纯化，最终获得高效耐高温的纤维素分解菌J15。纤维素分解菌J15筛选过程中降解滤纸条的效果图见图1。

二、纤维素分解菌J15的鉴定

1、菌落形态特征

菌落呈圆形，菌落湿润，表面光滑，乳白色，不透明，边缘整齐。

2、16S rDNA序列分析

将纤维素分解菌J15培养液收集后，提取基因组DNA，作为模板进行PCR。

正向引物：5′-AAACAGCTATGACCATGTTCA-3′；

反向引物：5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′。

PCR反应体系(50μL)：5μLTaq酶缓冲液；1μLTaq酶；1μLdNTP；1μL正向引物1；1μL反向引物；1μL模板DNA；ddH₂O 40μL。

PCR反应条件：①95℃预变性10min；②95℃变性2min；③42℃退火30s；④72℃延伸4s；⑤设置循环数(②-④)35；⑥72℃延伸25min。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳图见图2，显示单一条带。

回收PCR产物送至北京奥科生物技术有限公司进行测序。PCR产物为822bp，序列如序列表的序列1所示。采用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件将测序结果在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，确定菌种信息。结果表明，纤维素分解菌J15属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，同源性达到99％。

将纤维素分解菌J15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3905。

实施例2、不同碳源下纤维素分解菌J15的产酶效果

每种培养基设置三个重复，每项酶活测定重复进行三次，结果取平均值。

一、配制各种碳源的培养基

分别配制各种碳源的培养基：NaCl 0.5％，CaCO₃0.2％，碳源0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，蒸馏水100mL；pH7.0。所用的碳源分别为羧甲基纤维素(CMC)、麸皮、脱脂棉、滤纸、葡萄糖或蔗糖。

二、制备粗酶液

分别将纤维素分解菌J15接种于各种碳源的培养基(OD600＝8.0)，55℃培养7天，将培养液8000r/min离心20min，获得粗酶液。

三、测定酶活力

1、各项酶活力的检测方法(DNS法)

(1)脱脂棉酶活测定(降解脱脂棉(C₁))

①在4支刻度试管内分别加入50mg脱脂棉和1.5mL 0.05M pH5.0的柠檬酸缓冲液；在1号管内再加入1.5mL DNS溶液，作为对照；

②所有试管在45℃水浴中预热5-10min，然后加入待测粗酶液；45℃水浴24h；

③取出试管，立即向2、3、4号管内加入1.5mL DNS溶液以终止反应；

④利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，对照标准曲线，计算酶活力。

(2)纤维素酶活测定(CMC酶活)(降解羧甲基纤维素钠(C_X))

①在4支刻度试管内分别加入含0.51％羧甲基纤维素钠的0.05M pH5.0柠檬酸缓冲液；在1号管内再加入1.5mL DNS溶液，作为对照；

②所有试管在50℃水浴中预热5-10min，然后加入1.5mL待测粗酶液；45℃水浴0.5h；

③取出试管，立即向2、3、4号管内加入1.5mL DNS溶液以终止反应；

④利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，对照标准曲线，计算酶活力。

(3)滤纸酶活测定(降解滤纸)

①在4支刻度试管内分别加入1.5mL待测粗酶液和1.5mL 0.05M pH4.5柠檬酸缓冲液；在1号管内再加入1.5mL DNS溶液，作为对照；

②所有试管在50℃水浴中预热5-10min，然后各加入50mg滤纸条(1×6cm)(底物)；45℃水浴1h；

③取出试管，立即向2、3、4号管内加入1.5mL DNS溶液以终止反应；

④利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，对照标准曲线，计算酶活力。

(4)β-葡萄糖苷酶活测定(降解水杨素)

①在4支刻度试管内分别加入含0.51％水杨素的0.05M柠檬酸缓冲液(pH5.0)；在1号管内再加入1.5mL DNS溶液，作为对照；

②所有试管在50℃水浴中预热5-10min，然后加入1.5mL待测粗酶液；45℃水浴0.5h；

③取出试管，立即向2、3、4号管内加入1.5mL DNS溶液以终止反应；

④利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，对照标准曲线，计算酶活力。

2、检测结果

采用不同培养基得到的粗酶液的各项酶活的测定结果见图3和表2。

表2各种碳源培养条件下测得的粗酶液的酶活力(U)

除了葡萄糖，其它纤维素碳源均能不同程度的促进纤维素分解菌J15产纤维素酶类的能力。结果表明，纤维素分解菌J15分泌的纤维素酶为诱导型，而葡萄糖无法诱导纤维素酶的产生。诱导酶是指，只有在环境中存在诱导剂时，它们才开始合成，一旦环境中没有了诱导剂，合成就终止。诱导酶型的纤维素酶，不同碳源对其的合成具有显著影响。采用以脱脂棉为碳源，纤维素分解菌J15的产酶能力最强，粗酶液的酶活力最高(达30U)。采用CMC、滤纸或麸皮为碳源，J15菌株的产酶能力次之。以蔗糖为碳源，纤维素分解菌J15的产酶能力相对较低。即脱脂棉的诱导效果最好，其它碳源的诱导效果则没有明显差异。

实施例3、不同温度下纤维素分解菌J15的产酶效果

在PCS培养基内接种纤维素分解菌J15的菌液(OD600＝8.0)，分别于不同温度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)下培养7d，将培养液8000r/min离心20min，获得粗酶液。

检测粗酶液的各项酶活，方法同实施例2的步骤三。每种温度设置三个重复，每项酶活测定重复进行三次，结果取平均值。

结果见图4和表3。

表3各种温度培养条件下测得的粗酶液的酶活力(U)

纤维素分解菌J15产酶的最适温度为55～60℃。培养温度在45～60℃范围内，随着温度的升高，产酶能力增加。培养温度在60～70℃范围内时，随着温度的升高，产酶能力减少。产滤纸酶和产CMC的酶最适培养温度为55℃，产脱脂棉和产β-葡萄糖苷酶的最适培养温度为60℃。当培养温度达到70℃时，粗酶液各项酶活均显著降低，接近培养温度为45℃时的酶活力。结果表明：纤维素分解菌J15的耐受温度为65℃，当温度高于65℃时，菌的生长能力和产酶能力均大幅下降。粗酶液的脱脂棉酶活力和滤纸酶活力在最适温度下可达20U以上，显著高于CMC酶活力和β-葡萄糖苷酶活力。

实施例4、纤维素分解菌J15对不同处理的秸秆的降解效果

实验设置三个重复，酶活检测重复测定三次，结果取平均值。

一、秸秆预处理

采用四种不同的方法预处理秸秆，酸处理、碱处理和氨水处理均设置三种剂量。

1、酸(H₂SO₄)预处理

酸预处理Ⅰ：将玉米秸秆置于0.2％H₂SO₄水溶液(1g∶10mL)中，室温常压浸泡24h，用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

酸预处理Ⅱ：将玉米秸秆置于0.5％H₂SO₄水溶液(1g∶10mL)中，室温常压浸泡24h，用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

酸预处理Ⅲ：将玉米秸秆置于1.0％H₂SO₄水溶液(1g∶10mL)中，室温常压浸泡24h，用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

2、碱(NaOH)预处理

碱预处理Ⅰ：将玉米秸秆置于0.5％NaOH水溶液(1g∶10mL)中，室温常压浸泡24h，用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

碱预处理Ⅱ：将玉米秸秆置于1.0％NaOH水溶液(1g∶10mL)中，室温常压浸泡24h，用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

碱预处理Ⅲ：将玉米秸秆置于2.0％NaOH水溶液(1g∶10mL)中，室温常压浸泡24h，用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

3、氨水(NH₃·H₂O)预处理

氨水预处理Ⅰ：将玉米秸秆置于2.0％氨水水溶液(1g∶10mL)中，室温常压浸泡24h，用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

氨水预处理Ⅱ：将玉米秸秆置于5.0％氨水水溶液(1g∶10mL)中，室温常压浸泡24h，用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

氨水预处理Ⅲ：将玉米秸秆置于10.0％氨水水溶液(1g∶10mL)中，室温常压浸泡24h，用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱中烘干至恒重。

4、酸化汽爆预处理

称取15g玉米秸秆粉，置于500mL三角瓶中，加入1％(体积百分含量)硫酸水溶液(1g∶10mL)，混匀；将瓶口密封，置于高压锅内，121℃汽爆2h，高压锅降温至90℃时，取出后冷却至室温；用水冲洗至pH＝6.5～7.0，然后于80℃恒温干燥箱，烘干至恒重。

二、纤维素分解菌J15对不同处理的秸秆的降解效果

降解率＝(培养前秸秆的质量-培养7天后秸秆的质量)÷培养前秸秆的质量×100％。

分别将未进行任何预处理的玉米秸秆以及步骤一的1至3中各预处理后的玉米秸秆粉碎过40目筛，得到预处理后的秸秆粉；将步骤一的4预处理后的玉米秸秆粉直接过40目筛，得到预处理后的秸秆粉。配制如下培养基：NaCl 0.5％，CaCO₃0.2％，预处理后的秸秆粉0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.4％，蒸馏水100mL；pH7.0。接种J15菌株至培养基中(OD600＝8.0)，55℃静置培养7天，测定培养液中秸秆的降解率。结果见表4。

表4J15对各种预处理秸秆的降解效果

纤维素分解菌J15对不同预处理的玉米秸秆均能降解；几种预处理中，酸化汽爆预处理降解效果最好(达到36.8％)，其次是酸预处理，然后氨水预处理和碱预处理。降解效果最好是未经预处理的玉米秸秆。结果表明：纤维素分解菌J15能够有效降解未经预处理的玉米秸秆，不存在为提高降解率预处理玉米秸秆所带来的环境污染问题。

实施例5、纤维素分解菌J15在制备堆肥中的应用

实验设置三个重复，各项指标检测重复测定三次，结果取平均值。

一、原料准备

鸡粪：基本性质见表5。秸秆：基本性质见表5，粉碎过4mm筛。培养J15菌株，使其有效活菌数的浓度达到10⁹cfu·mL^-1，即为J15菌剂。

表5鸡粪和秸秆的基本参数

堆肥原料	总碳/％	全氮/％	C/N	含水率/％
					鸡粪	29.26	2.24	13.06	42.82
秸秆	46.71	0.68	68.69	16.43

二、堆肥的制备

堆肥甲(CK)：在鸡粪中添加秸秆，调节C/N(碳元素质量/氮元素质量)在25-30之间，调节水分在55％左右，充分混合均匀，得到混合物甲；将混合物甲装入发酵反应罐中；控制通风量为每天通风2次、每次30min，每3d翻堆一次；自装入发酵反应罐开始，每隔3天取样进行步骤三的检测(加入发酵反应罐前作为第0天，每过24小时计1天)。

堆肥乙(T_0.5％)：在鸡粪中添加秸秆，调节C/N(碳元素质量/氮元素质量)在25-30之间，调节水分在55％左右，充分混合均匀，得到混合物甲；将混合物甲装入发酵反应罐中，堆肥反应温度达到50℃时，加入J15菌剂，使其质量百分含量为0.5％；控制通风量为每天通风2次、每次30min，每3d翻堆一次；自装入发酵反应罐开始，每隔3天取样进行步骤三的检测(加入发酵反应罐前作为第0天，每过24小时计1天)。

三、纤维素分解菌J15对堆肥过程中各项指标的测定方法

1、对堆肥过程中总有机碳量(TOC)的影响

称取5.0g样品，在烘箱内105℃烘8-10h，称重后转入马弗炉中，550℃灼烧5h。通过灼烧前后样品的质量差计算得到粗灰分的质量百分含量，然后换算为有机碳总量(有机碳总量＝(100-粗灰分的质量百分含量)/1.8)。堆肥过程中，TOC的变化见表6。

表6堆肥过程中TOC的变化(％)

取样时间(天)	0	3	6	9	12
						CK	90.17	105.07	99.10	88.69	86.39
T0.5％	90.17	102.41	92.36	87.36	73.30

接种J15菌剂能够显著促进TOC的降低。CK和T_0.5％的TOC含量是呈现先上升后下降的趋势，添加J15菌剂的T_0.5％下降的幅度更大。在试验进行的第6天(P＜0.01)、第9天(P＜0.05)T_0.5％与对照组相比，差异显著。

2、对堆肥过程中C/N的影响

采用凯式定氮法测定全氮量。根据总有机碳量和全氮量计算C/N。

堆肥过程中，C/N的变化见表7。

表7堆肥过程中C/N的变化(％)

取样时间(天)	0	3	6	9	12
						CK	25.97	37.15	25.10	23.21	15.02
T0.5％	25.97	29.91	29.26	19.57	10.57

Morel等建议采用T＝(终点C/N)/(初始C/N)来评价腐熟度，认为当T值小于0.6时，堆肥达到腐熟。CK和T_0.5％的T值分别为0.57和0.40，均小于0.6。在整个堆肥过程中CK和T_0.5％处理的C/N是呈下降趋势。堆肥结束后堆肥的C/N一般降为15～20。堆肥结束时，CK和T_0.5％的C/N均降到20以下，因此可以认为堆肥已经腐熟。T_0.5％的T值低于CK。J15菌剂能促进堆肥腐熟。

3、对堆肥过程中各种酶活的影响

采用土壤酶活测定方法(参考文献：章家恩.生态学常用实验研究方法与技术.北京：化学工业出版社，2007，162-169.)。

(1)纤维素酶活

步骤二的样品与水按1∶10(g∶mL)比例混合振荡30min后，3000rpm离心10min，取上清液过滤，即为堆肥浸提液。然后按如下步骤测定堆肥浸提液的酶活：

①在4支刻度试管内分别加入含0.51％羧甲基纤维素钠的0.05M pH5.0柠檬酸缓冲液；在1号管内再加入1.5mL DNS溶液，作为对照；

②所有试管在50℃水浴中预热5-10min，然后加入1.5mL堆肥浸提液；45℃水浴0.5h；

③取出试管，立即向2、3、4号管内加入1.5mL DNS溶液以终止反应；

④利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，对照标准曲线，计算酶活力。

堆肥过程中，纤维素酶活变化见表8。

表8堆肥过程中纤维素酶活性的变化(U)

取样时间(天)	0	3	6	9	12
						CK	12.62	12.35	13.00	20.24	25.49
T0.5％	12.62	8.36	35.85	27.46	23.96

结果显示，在堆肥过程中CK的纤维素酶活性是逐渐上升的趋势，并且在高温期后期(第6天之后)大幅增加，并于第12天达到最大值(25.49U)。而T_0.5％处理的纤维素酶活性则是呈现先上升，后下降的趋势，并在堆肥的第6天达到高峰(35.85U)，随后开始下降，在第12天为23.96U，略低于CK。接种J15菌剂能够显著提高纤维素酶活性，从而促进纤维素的降解。

(2)β-葡萄糖苷酶活

步骤二的样品与水按1∶10(g∶mL)比例混合振荡30min后，3000rpm离心10min，取上清液过滤，即为堆肥浸提液。然后按如下步骤测定堆肥浸提液的酶活：

①在4支刻度试管内分别加入含0.51％水杨素的0.05M柠檬酸缓冲液(pH5.0)；在1号管内再加入1.5mL DNS溶液，作为对照；

②所有试管在50℃水浴中预热5-10min，然后加入1.5mL堆肥浸提液；45℃水浴0.5h；

③取出试管，立即向2、3、4号管内加入1.5mL DNS溶液以终止反应；

④利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，对照标准曲线，计算酶活力。

堆肥过程中，β-葡萄糖苷酶活性的变化见表9。

表9堆肥过程中β-葡萄糖苷酶活性的变化(U)

取样时间(天)	0	3	6	9	12
						CK	7.60	6.41	7.16	19.20	10.33
T0.5％	7.60	8.47	20.43	11.46	9.97

在堆肥过程中，CK和T_0.5％处理的β-葡萄糖苷酶活性均是先上升后降低，T_0.5％的β-葡萄糖苷酶在堆肥的第6天达到最大值，CK的β-葡萄糖苷酶在第9天达到最大值，滞后3天。CK和T_0.5％两处理的峰值分别为19.20U和20.43U，差异不显著。T_0.5％处理的β-葡萄糖苷酶活性在第6天达到最大值，与纤维素酶活性同时达到峰值，而CK的β-葡萄糖苷酶活性峰值则在第9天出现，较纤维素酶活性的峰值提前3天，这说明加入J15菌剂可以加速有机物料的矿化，使得蔗糖的分解高峰提前。

(3)蛋白酶酶活

原理：酪蛋白酸钠在蛋白酶的水解作用下，分解为酪氨酸，释放的数量和速度与酶活性之间存在线性关系。

试剂的配制：

①2％酪蛋白酸钠水溶液：将10g酪蛋白酸钠溶于50℃蒸馏水中，充分搅拌溶解后，稀释至500mL。

②15％三氯乙酸水溶液：75g三氯乙酸(TCA)溶于300mL蒸馏水中，然后稀释至500mL。

③碱性试剂：A液(NaOH-NaCO₃)溶液：将50g无水NaCO₃溶于60mL NaOH(1mol/L)溶液中，用蒸馏水稀释至1000mL；B液(1％酒石酸钾钠)：将1g酒石酸钾钠溶于20mL蒸馏水中，充分搅拌溶解后，用蒸馏水稀释至100mL；C液(0.5％硫酸铜)：将0.5g硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)溶于20mL蒸馏水中，充分搅拌溶解后，用蒸馏水稀释至100mL；将A液、B液、C液按100∶2∶2(体积比)的比例混合，得到碱性试剂。

④33％福林试剂：167mL福林(Folin)试剂用蒸馏水稀释至500mL。此溶液不稳定，需现用现配，且保存于4℃。

⑤酪氨酸标准溶液(500μg/ml)：50mg酪氨酸溶于Tri s缓冲液中，充分搅拌溶解后，用缓冲液定容至100mL。

实验步骤：

①制作酪氨酸标准曲线

分别吸取0、1、2、3、4、5mL酪氨酸标准溶液于试管内，然后加入Tris缓冲液补充体积为5mL，加入7.5mL碱性试剂，混匀后，室温下静止15min，在加入5mL福林试剂，然后在700nm处比色测定，制作标准曲线。

②按如下步骤测定步骤二的堆肥样品的酶活：

取1g堆肥鲜样于20mL离心管内，加入5mL Tris缓冲液(50mmol/mL)，再加入25mL 2％酪蛋白酸钠水溶液；50℃水浴2h；加入25mL 15％三氯乙酸水溶液，充分混匀；1000rpm离心10min(离心后上清液应立即进行分析，即使保存在4℃下，也只能存放5h)；取5mL上清液于25mL试管内，加入7.5mL碱性试剂，混匀后，室温静置15min；加入5mL 33％福林试剂，过滤得到滤液，静置1h后，在700nm处比色测定。不加堆肥鲜样的作为空白对照。根据比色测定值，对照标准曲线，得到滤液中酪氨酸的浓度。

蛋白酶活性[μg酪氨酸/(g.2h)]＝CV/dwt。

式中，C为滤液中酪氨酸的浓度；V为滤液的体积；dwt为1g堆肥鲜样的干重。

堆肥过程中蛋白酶活性的变化见表10。

表10堆肥过程中蛋白酶活性的变化(μg酪氨酸/(g.2h))

取样时间(天)	0	3	6	9	12
						CK	1778.53	2458.45	3894.33	1880.83	1295.76
T0.5％	1778.53	3305.42	4509.83	2876.41	2177.51

在堆肥过程中，CK和T_0.5％处理的蛋白酶活性先上升后下降的趋势，并且均在第6天达到最大值，分别为3894.33μg酪氨酸/(g.2h)和4509.83μg酪氨酸/(g.2h)。T_0.5％处理的蛋白酶活性在整个堆肥过程中均要高于CK，并且在堆肥的第12天，两组蛋白酶活性差异显著(P＜0.01)。接种J15菌剂能够显著提高堆肥蛋白酶活性。

(4)脱氢酶酶活

原理：脱氢酶与三苯基四唑氯化物反应，所生成的红色三苯甲臢与脱氢酶的活性在一定范围内呈线性关系。

试剂的配制：

①TTC溶液：3g 2，3，5-三苯基四唑氯化物(TTC)溶于80mL蒸馏水中，充分搅拌溶解后，稀释至100mL。

②TPF标准溶液(100μg/mL)：将100mg三苯甲臢(TPF)溶于80mL甲醇中，充分溶解后，用甲醇定容至100mL，取10mL此溶液，用甲醇稀释至100mL。

实验步骤

①制作TPF标准曲线

分别吸取0、5、10、15、20mL TPF标准溶液于100mL容量瓶内，用甲醇稀释定容至100mL，混匀后，在485nm处比色，绘制TPF标准曲线。

②按如下步骤测定步骤二的堆肥样品的酶活：取10g堆肥鲜样与0.1g CaCO₃混匀；称取6g混合样于玻璃试管内；每管中加入1mL TTC溶液和2.5mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，盖上试管塞；37℃水浴培养24h；加入10mL甲醇，摇动1min；用塞有脱脂棉的漏斗过滤，用甲醇洗涤玻璃试管，将试管内样品全部转移至漏斗中；用甲醇冲洗漏斗内混合样，直至棉塞上红色消失为止；用甲醇定容滤液至100mL；以甲醇作为空白对照，在485nm处比色测定。根据比色测定值，对照标准曲线，得到滤液中TPF的浓度(含量)。

脱氢酶活性(μgTPF/g)＝CV/dwt

式中：C为滤液中TPF含量；V为滤液的体积(100mL)；dwt为6g堆肥样品的干重。

堆肥过程中的脱氢酶活性变化见表11。

表11堆肥过程中的脱氢酶活性变化(μgTPF/g)

取样时间(天)	0	3	6	9	12
						CK	205.01	225.97	224.12	269.66	206.89
T0.5％	205.01	196.89	255.30	361.24	240.24

CK和T_0.5％处理过氧化氢酶活性值在整个堆肥发酵过程中均是先上升后下降，并在堆肥的第9天达到最大值，分别为269.66μgTPF/g和361.24μgTPF/g，且差异显著(P＜0.05)。在堆肥第3天，CK的脱氢酶活性要高于T_0.5％处理，在添加J15菌剂后，T_0.5％处理的脱氢酶活性开始明显升高，并在整个堆肥后期(6-12天)均要高于CK。J15菌剂能够显著提高堆肥脱氢酶活性。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一株地衣芽孢杆菌及其在促进纤维素降解中的应用

 

<130>CGGNARY102396

 

<160>1

 

<210>1

<211>822

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

 

<400>1

catgcaagtc gagcggaccg aagggagctt gctcctttag gttagcggcg gacgggtgag    60

taacacgtgg gcaacctgcc ctgcagactg ggataacttc gggaaaccgg agctaatacc    120

ggataacacc gaaaaccgca tggttttcgg ttgaaaggcg gcttttagct gtcactgcag    180

gatgggcccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg    240

tagccgacct gagagggtga ccggccacac tgggactgag acacggccca aactcctacg    300

ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg    360

agcgaagaag gtcttcggat cgtaaagctc tgttgtcagg gaagaacaag taccgttcga    420

acagggcggt accttgacgg tacctgacga ggaagccacg gctaactacg tgccagcagc    480

cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg    540

cggttcctta agtctgatgt gaaatctcgc ggctcaaccg cgagcggcca ttggaaactg    600

gggaacttga gtgcaggaga ggggagcgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag    660

atgtggagga acaccagtgg cgaaggcggc ttctctggcc tgtaactgac gctgaggcgc    720

gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccactgccgt aaacgatgag    780

tgctaagggt aagagggtat ccaccccttt aggggcggca tc                       822

Claims (10)

1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)纤维素分解菌J15CGMCC No.3905。

2.一种制备纤维素降解酶制剂的方法，是发酵地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)纤维素分解菌J15CGMCC No.3905，得到的发酵液即为纤维素降解酶制剂。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为55～60℃。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述酶制剂降解如下底物中的至少一种：滤纸、羧甲基纤维素钠、脱脂棉和水杨素。

5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述酶制剂为滤纸酶和/或纤维素酶和/或脱脂棉酶和/或β-葡萄糖苷酶。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述酶制剂为滤纸酶和纤维素酶时，所述发酵的温度为55℃；所述酶制剂为脱脂棉酶和β-葡萄糖苷酶时，所述发酵的温度为60℃。

7.权利要求2至6中任一所述方法制备得到的纤维素降解酶制剂。

8.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)纤维素分解菌J15CGMCC No.3905在降解纤维素中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述纤维素为秸秆。

10.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)纤维素分解菌J15CGMCC No.3905在制备堆肥中的应用。

Images