CN101210228A - 一种降解纤维素的地衣芽孢杆菌及其在秸秆发酵中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够有效分解植物纤维的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ws－6，经鉴定其属于地衣芽孢杆菌，是益生菌的一种。该菌种可直接用于饲料添加剂生产的、能有效降解纤维素，更有利于动物的吸收和转化，有效提高了饲料的利用率，明显改善动物机体内环境，属四级人畜安全微生物，能有效降解青、黄贮饲料中的纤维素，可广泛用于秸秆发酵领域。

Description

一种降解纤维素的地衣芽孢杆菌及其在秸秆发酵中的应用

发明领域

本发明涉及微生物发酵及其产物酶领域。具体的说，本发明涉及一种降解纤维素的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及其在秸秆发酵中的应用。

背景技术

纤维素酶是指能降解纤维素的一类酶的总称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。目前研究和生产中采用的纤维素产生菌种大多是木霉、曲霉和青霉等，因为能分解晶体纤维素的真菌均能或多或少地分泌纤维素酶，所以纤维素酶的真菌来源还是比较广泛的。某些细菌也能分解纤维素，产生纤维素酶，但由于分泌的纤维素酶量低，且多属胞内酶或粘附在细胞壁上，难以进行工业化生产。现在纤维素酶已被广泛地应用于食品、饲料加工纺织、洗衣、农业等多个领域中。

饲料加工业是农业的一个重要组成部分。全球每年要生成6亿多吨饲料，生产的饲料90％用来喂养家禽、猪和反刍动物，10％是宠物和鱼类的饲料。一方面纤维素酶被加入到反刍动物和单胃动物的饲料中作为一种补充；另一方面纤维素酶备用在纤维素物质的预处理，如谷物的去壳、青贮饲料的处理等，从而提高反刍动物和单位动物的消化能力。

通过国内外有关本领域研究的检索，主要涉及到以下文献：

“能降解天然纤维素的地衣芽孢杆菌GXN151的分离鉴定及其一个纤维素酶基因(ce15A)的克隆和测序分析”，首次报道地衣芽孢杆菌能降解结晶纤维素及从该种细菌中克隆到纤维素酶基因。(刘永生、冯家勋、段承杰等)(1中国科学院沈阳应用生态研究所，2广西大学分子遗传学研究所，3广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室)

“一种葡聚糖酶基因和地衣芽孢杆菌”(专利号：01134381)涉及到EGW O 39地衣芽孢杆菌菌株(Bacilluslicheniformis)产生的β-1，3-1，4-葡聚糖酶对β-葡聚糖的β-1，3和β-1，4键都有高效的分解作用，能提高大麦、小麦等饲料粮利用率，节约饲料粮，在啤酒生产中降低啤酒生产中过滤的困难，提高原料利用率发明(设计)人：王建华，吴子林，腾达，张帆。

目前，国内外大多数地衣芽孢杆菌用来生产蛋白酶、淀粉酶，但对纤维素有特效分解作用的地衣芽孢杆菌，现有的研究工作主要针对分离得到的地衣芽孢杆菌纤维素酶基因的克隆和表达，而在其在生产应用中的研究较少，尤其是在青、黄贮饲料制作的研究较少，关于产纤维素酶并在低pH条件下生长稳定、可直接应用于青、黄贮饲料，对植物纤维有较好降解作用的还未见报道。本发明所述的地衣芽孢杆菌在青、黄贮饲料发酵中，对植物纤维有较好的降解效果，有较大得应用价值。

发明内容

针对目前国内外有关本领域的研究现状，在秸秆发酵中，尤其是青、黄贮饲料制作领域，添加剂多是一些产酸菌或直接添加纤维素酶制剂，但由于其条件因素的多变性，酶活很难维持较高水平，且易失活，在发酵过程中对纤维素的降解十分有限。本发明提供了一种降解纤维素的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)及其在秸秆发酵中的应用。

本发明具体提供了一种新型的、耐低pH、兼性厌氧、能有效降解植物纤维素的益生菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及其在秸秆发酵中的应用。

由于新疆广阔的盐碱地蕴藏着丰富的微生物。研究新疆极端微生物不仅有助于扩大极端微生物资源库，也有利于新疆特殊环境微生物的开发和利用，从而为工业生产提供高活性高稳定性的酶来源。本发明从新疆乌苏地区的青贮窖中取样，筛选出一种能有效降解纤维素的细菌，并具有良好的热稳定性和在低pH条件下稳定性，兼性厌氧，属人畜安全四级微生物，可直接作为添加剂，为该菌株的纤维素酶的开发应用奠定了理论基础。

本发明根据新疆的地理环境的特殊性，从新疆典型的青贮窖青贮料中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，编号为ws-6，从而提供了一株纤维素酶产生菌，具有有效降解纤维素的优良特性，经微生物学分类与鉴定，属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

依照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of SystematicBacterio-logy》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对ws-6菌株进行形态学测定，生理生化检测确定ws-6菌株为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中的成员。16SrDNA同源分析、系统发育分析结果都表明ws6菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，以下简称B.licheni ws-6。该菌株培养温度30-50℃，最适培养温度35-40℃；优先生长于LB培养基表面，且菌落呈淡黄色，不透明，边缘不整齐，中间呈褶皱、隆起。显微观测呈长杆状，具圆端，成对排列，运动，周生鞭毛，中生芽孢，但芽孢形成率较低，且芽孢椭圆形，孢囊不膨大，繁殖方式为二等分裂。格兰氏染色呈阳性。并在2-7％NaCl中均能生长。接触酶反应呈阳性，能氧化葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸，可水解酪朊、明胶、淀粉。

该菌株产外泌型纤维素酶，在秸秆发酵中对纤维素有明显的降解作用，比对照粗纤维降解率提高10％。该菌株在发酵中和其余产酸菌等有良好的共生作用，在pH4-5条件下，生长良好。该菌株在优化后的产酶培养基条件下，最适酶解作用温度为40℃，底物浓度0.1g/ml，发酵液上清酶活达到1300mu/ml。具有良好的热稳定性在30℃～50℃范围内均能生长，在2-7％NaCl中均能生长。

本发明通过B.licheni ws-6发酵获得具有特性较高活性的纤维素酶。本产品已具备规模工业化生产能力，通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，发酵酶活达1300mu/ml。

本发明建立菌种筛选、鉴定、保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。

一.菌种筛选：从新疆乌苏的青贮窖青贮饲料中取样，取一定量的样品用无菌水洗，并吸取一定量的悬液涂布于含有羧甲基纤维素的LB平板上。

两到三天后对单个菌落进行分离，然后平板用刚果红(1g/L)染色约一小时，再用氯化钠(1mol/L)脱色。脱色后观察有无透明圈，通过菌落大小与透明圈的比值进而筛选出了具有较强分解纤维素能力的菌株。

二.菌种鉴定

A.生理生化检测

根据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of SystematicBacterio-logy》)第九版及Sneath et al.(1986)and Nielsen et al.(1995)等人的方法，对菌株的形状、大小、生理生化反应进行检测，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其生物学特性如表1所示：

表1：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)生物学特性

测定项目	结果	测定项目	结果	测定项目	结果
						形状	长杆状，具圆端，成对排列	耐盐范围(％)	在2-7％NaCl中均能生长	葡萄糖	+
运动性	运动，周生鞭毛	温度范围(℃)	在30℃～50℃范围内均能生长	水解明胶	+
						孢子	中生芽孢，芽孢椭圆形，孢囊不膨大	接触酶		阿拉伯糖	+
革兰氏	阳性	水解淀粉	+	水解酪氨酸	+
						pH范围	4到8均能生长	木糖	+	甘露醇产酸	+

B.16SrDNA序列分析

利用细菌16SrRNA的通用引物：引物及具体的序列分析。

引物序列：上游引物XJ1为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物XJ2为5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

本发明的地衣芽孢杆菌(Baciilus licheniformis)其16S rRNA序列与Bacilluslicheniformis ATCC14580进行BLAST比对分析，其同源性为99％。

通过以上的生理生化检测、16SrRNA同源分析、系统发育分析及相关分析，各项实验结果都可以表明ws-6菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的成员，从而可以精确的将本发明的ws-6菌株分类为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，也建立了分类鉴定微生物的一种可靠、准确的途径。

经GenBank中的Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn)比对和生理生化检测表明其是一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

三.菌种保藏：以脱脂牛奶为保护剂，真空冷冻干燥，安培管液氮保存。

四.菌种活化：先用70％的酒精棉擦拭安培管顶，将顶部烧热，用无菌棉签沾灭菌水，顶部擦一圈，敲开顶部。用无菌水溶解菌块，吸取菌悬液在LB培养基上，37℃培养，或平板划线分离复壮。

五.菌种复壮：在测定酶活性前，确定了一套保持产酶特性稳定菌株筛选的流程。

本发明还提供了产酶培养基(重量百分比)：1％酵母膏、1％蛋白胨、10.5％NH₄NO₃、1％羧甲基纤维素钠、0.1％KH₂PO₄、0.05％KCL、0.0004％MnSO₄、0.00017％ZnSO₄、0.0002％CoCl2、0.05％MgSO₄，PH：5.5-6.0，121℃灭菌20min。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

A、定向筛选到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该菌种是一株能够有效分解植物纤维的细菌，经鉴定其属于地衣芽孢杆菌，是益生菌的一种。是一种可被直接用于饲料添加剂生产的菌种、能有效降解纤维素，更有利于动物的吸收和转化，有效提高了饲料的利用率，明显改善动物机体内环境，属四级人畜安全微生物，能有效降解青、黄贮饲料中的纤维素，可广泛用于秸秆发酵领域。

B、该菌株产外泌型纤维素酶，在秸秆发酵中对纤维素有明显的降解作用，比对照粗纤维降解率提高约10％。

C、该菌株在发酵中和其余产酸菌等有良好的共生作用，在pH4-5条件下，生长良好。

D、该菌株在优化后的产酶培养基条件下，发酵液上清酶活达1300mu/ml。

E、具有良好的热稳定性，在30℃～50℃范围内均能生长，在2-7％NaCl中均能生长，在青、黄贮饲料的制作中有很好的应用价值。

附图简要说明：

图1显示为B.licheni ws-6在32℃的生长曲线；

图2显示为B.licheni ws-6产酶及最大酶活曲线；

图3显示为B.licheni ws-6在作用温度40℃，时间20min的不同底物酶活曲线。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量百分比。

实施例1：菌种的分离

1：取一定量的样品用无菌水洗，并吸取一定量的悬液涂布于含有羧甲基纤维素的LB平板上。

2：两到三天后对单个菌落进行分离，然后平板用刚果红(1g/L)染色约一小时，再用氯化钠(1mol/L)脱色。

3：脱色后观察有无透明圈，通过菌落大小与透明圈的比值进而初步筛选出六株具有分解纤维素能力的菌株。

4：初步发酵产酶研究，通过发酵液上清和破壁后上清，8000rpm，5min，取上清，3，5-二硝基水杨酸显色(DNS法)初步确定其产酶属胞内还是胞外，发现两株胞内，一株胞内外均有，三株产胞外酶。

5：用含有羧甲基纤维素的LB液体培养基，30℃，100rpm，在8小时后，每隔两小时取样一次，8000rpm，5min，取上清，用羧甲基纤维素为底物，DNS法测定各自在OD530nm条件下的吸光值，最终筛选出一株酶活较高，属胞外酶的芽孢菌株，命名为ws-6。

6：对ws-6进行了一系列的生理、生化以及16SrDNA的测定，确定为一株地衣芽孢杆菌。

实施例2：菌株B.licheni ws6生长特性

1：用LB液体培养基培养，先设四个温度梯度，分别为30℃，40℃，50℃，60℃，按1％的接菌量，100rpm，隔两小时取样一次，λ540nm条件下测OD值。结论在30-50℃能生长。60℃停止生长，在30℃到40℃之间生长迅速。进而设三个梯度，分别为30℃、35℃、40℃，确定其最适生长温度在35-40℃。

2：通过LB固体培养基穿刺培养观察，在穿刺管中各处均有生长，该菌株属兼性厌氧菌。

3：用LB液体培养基培养，设培养基在pH为4，5，6，7，8，按1％的接菌量，100rpm，隔两小时取样一次，λ540nm条件下测OD值，结论：pH值4.0到5.0左右生长良好，pH8.0时也有生长。

实施例3：菌株B.licheni ws-6的酶活特性

1：按1％的接种量接种，以含羧甲基纤维素的LB液体培养基为初步发酵培养基，100rpm，37℃，每两小时取样一次，8000rpm，5min，取上清以羧甲基纤维素为底物，用DNS显色法，测得其产酶最佳时间为36到38小时。

2：设四个梯度，分别为30℃，40℃，50℃，60℃，测得最适作用温度为40℃(方法同上)，时间为20min，酶活约为1300mu/ml。

3：设四个梯度，pH为3，4，5，6，7，测得最适底物pH在4-5之间(方法同上，底物浓度0.1g/ml。

实施例4：B.licheni ws-6产酶培养基的优化

在原有基本培养基的基础上，对其氮源、碳源作了进一步的优化，通过正交试验和极差分析，最终确定了其产酶培养基为(以下按重量百分比计)：1％酵母膏、1％蛋白胨、10.5％NH₄NO₃、1％羧甲基纤维素钠、0.1％KH₂PO₄、0.05％KCL、0.0004％MnSO₄、0.00017％ZnSO₄、0.0002％CoCl₂、0.05％MgSO₄，PH：5.5-6.0，121℃灭菌20min。验证酶活较原来提高30％左右。

实施例5：B.licheni ws-6在青贮试验中的应用效果研究

1：对玉米秸秆纤维的分解作用

检验结果报告

结论：在添加此株地衣芽孢杆菌后，粗纤维比对照有明显降低。

2：在放置数日检测：

地衣芽孢杆菌的检出：丙酸盐实验

根据地衣芽孢杆菌的特性：只有地衣芽孢杆菌才能利用丙酸盐作为碳源，使培养基(simmons培养基)由绿色变为蓝色。

检测其在放置一月左右仍有活菌。

3：和其于的有机酸产生菌及野生有益菌有良好的共生作用。

实施例6：纤维素酶活力测定方法

依照中华人民共和国农业行业标准饲料添加剂纤维素酶活力的测定-分光光度法(NY/T 912-2004)

1、纤维素酶活力单位

在37℃，PH为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1ūmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

2、原理

纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。

3、试剂与溶液

除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T 6682中规定的二级水。

3.1氢氧化钠溶液，浓度c(NaOH)为200g/L

称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100ml。

3.2乙酸溶液，浓度c(CH₃COOH)为0.1mol/L

吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。

3.3乙酸钠，浓度c(CH₃COONa)为0.1mol/L

称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml。

3.4乙酸-乙酸钠缓冲液，浓度c(CH₃COOH-CH₃COONa)为0.1mol/L，PH为5.5

称取三水乙酸钠23.14g加入冰乙酸1.70ml，再加水溶解，定容至2000ml，测定溶液的pH，如果pH偏离5.5，再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.5。

3.5葡萄糖溶液，浓度c(C₆H₁₂O₆)为10.0mg/ml。

称取无水葡萄糖1.000g，加乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，定容至100ml。

3.6羧甲基纤维素钠溶液，浓度为8.0g/ml

羧甲基纤维素钠(sigmaC5678)0.80g，加入80ml乙酸-乙酸钠缓冲液，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100ml。羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀，4℃避光保存，有效期为3d。

3.7 DNS试剂

称取3，5-二硝基水杨酸3.15g(化学纯)，加水500ml，搅拌5秒，水浴至45℃，然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液，同时不停搅拌，直至溶液清澈透明。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g，苯酚2.50g和无水亚硫酸酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直至加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。贮存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月。

4标准曲线的绘制

吸取缓冲液(3.4)4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。

分别吸取葡萄糖溶液(3.5)1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml、6.00ml和7.00ml，分别用缓冲液(3.4)定容至100ml，配制成浓度为0.10mg/ml-0.70mg/ml葡萄糖标准溶液。

分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml(做2个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5ml DNS试剂(3.7)，电磁震荡3s，沸水浴加热5min。然后，用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。

以葡萄糖浓度为Y轴，吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。

5试样溶液的制备

固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛(孔径为0.25mm)，按照附录A中建议的称样量称取试样2份，精确至0.001g。加入40ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液(3.4)。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液(3.4)定容至100ml。在4℃条件下避光保存24h。摇匀，取出30ml-50ml，上离心机离心3min。吸取5.00ml上清夜，再用缓冲溶液(3.4)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04U/ml-0.08U/ml之间)。

液体样品可以直接用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(3.4)进行稀释、定容(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04U/ml-0.08U/ml之间)。如果稀释后酶液的pH偏离5.5，需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节校正至5.5，然后再用缓冲溶液(3.4)做适当稀释定容。

6测定步骤

吸取10.0ml，羧甲基纤维素钠溶液(3.6)，37℃平衡10min。

吸取10.0ml，经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。

吸取2.00ml，经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂(3.7)，电磁震荡3s，然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6)，37℃保温30min，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁震荡3s。以标准空白样(参见7)为空白对照，在540nm出检测吸光度AB.

吸取2.00ml，经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡)，电磁震荡3s，37℃精确保温30min。加入5ml DNS试剂(3.7)，电磁震荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁震荡3s。以标准空白样(参见7)为空白对照，在540nm出检测吸光度AE.

7试样酶活力的计算

试样酶活力的计算按式(1)、式(2)计算。

$\mathrm{XD}=\frac{[(\mathrm{AE}--\mathrm{AB})*K+C0]*1000}{M*t}$

式中：

XD——试样稀释液的纤维素酶活力，单位为酶活力单位每毫升(U/ml)；

AE——酶反应液的吸光度；

AB——酶空白样的吸光度

K——标准曲线斜率

Co-标准曲线的截距；

M-葡萄糖的摩尔质量M(C6H12O6)＝180.2g/mol；

t-酶解反应时间，单位为分钟(min)；

1000-转化因子，1mmol＝1000umol

XD值应在0.04U/ml-0.08U/ml，之间，如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定

X＝XD×Df

式中：

X-试样纤维素酶的活力，单位为酶活力单位每克(U/g)

Dt-试样的总稀释倍数。

酶活力的计算保留3位有效数字

7重复性

保留3位有效数字同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0％，二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留3位有效数字)。

Claims (6)

1.一种具有降解植物纤维素的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ws-6。

2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ws-6，其特征在于，在菌种活化培养中，该菌株生长温度范围是30-50℃，能够分别在浓度为2％-7％的NaCl、pH4-8的条件下生长。

3.如权利要求2所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ws-6，其特征在于发酵中，菌株最适培养温度35-40℃，最适pH4-5条件下生长，并优先生长于LB培养基表面，该菌株产外泌型纤维素酶，最适酶解作用温度为40℃，底物浓度0.1g/ml。

4.如权利要求3所述的LB培养基表面，其特征在于，LB培养基表面按重量百分比1％酵母膏、1％蛋白胨、10.5％NH₄NO₃、1％羧甲基纤维素钠、0.1％KH₂PO₄、0.05％KCL、0.0004％MnSO₄、0.00017％ZnSO₄、0.0002％CoCl₂、0.05％MgSO₄组成。

5.一种如权利要求1所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ws-6在秸秆发酵中应用。

6.如权利要求5所述地衣芽孢杆菌ws-6在在秸秆发酵中的应用，其特征在于，其菌种发酵液上清酶活达到1300mu/ml，在秸秆发酵中对纤维素有明显的降解作用，比对照粗纤维降解率提高10％。

Images